(Luận văn) nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris thu thập và sưu tầm từ việt nam, trung quốc và nhật bản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - Lê Thị Xuân lu an va n NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM ĐÔNG TẦM TỪ VIỆT NAM, TRUNG QUỐC VÀ NHẬT BẢN p ie gh tn to TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS THU THẬP VÀ SƯU oa nl w d Chuyên ngành: Quản lý bảo vệ tài nguyên rừng ll u nf va an lu Mã số: 60.62.68 oi m z at nh LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP z m co l gm @ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PSG TS PHẠM QUANG THU an Lu n va Hà Nội, 2010 ac th si ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành chương trình đào tạo cao học trường Đại học Lâm nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức học vào thực tiễn, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học khả tổng hợp phân tích vấn đề tác giả tiến hành thực Luận văn tốt nghiệp cao học Trong trình thực hoàn thiện luận văn, tác giả nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ đóng góp cán Phòng nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại học – Trường lu Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình bạn bè đồng nghiệp Tác giả xin chân thành an cảm ơn ủng hộ, giúp đỡ Đặc biệt tác giả muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới va n PGS TS Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học tận tình tn to quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi truyền đạt kiến thức quý báu suốt Luận văn hoàn thiện sở tham khảo nhiều tài liệu có liên quan p ie gh trình thực nl w ý kiến đóng góp nhiều nhà chun mơn nỗ lực tác giả Tuy nhiên oa khả năng, điều kiện thời gian hạn chế, chủ đề nghiên cứu hồn tồn nên d luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót Tác giả mong nhận ý kiến đóng lu u nf hồn thiện va an góp, xây dựng nhà khoa học bạn bè đồng nghiệp để Luận văn ll Xin chân thành cảm ơn! oi m z at nh Hà Nội, tháng năm 2010 z m co l gm @ Tác giả an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa……………………………………………………………………… i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vii Danh mục hình vii Đặt vấn đề Chương Tổng quan nghiên cứu .3 lu 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước an va 1.2 Tình hình nghiên cứu nước 15 n 1.3 Nhận xét đánh giá từ cơng trình nghiên cứu ngồi nước 19 gh tn to Chương Mục tiêu, đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 21 ie 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .21 p 2.2 Đối tượng nghiên cứu .21 nl w 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 d oa 2.3.1 Sưu tập, phân lập lưu trữ nguồn gen chủng nấm Cordyceps an lu militaris 21 va 2.3.2 Đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết .21 u nf 2.3.3 Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng nấm 21 ll 2.3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi môi trường dịch thể 22 m oi 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 z at nh 2.4.1 Dụng cụ, thiết bị môi trường dinh dưỡng 22 2.4.2 Phương pháp sưu tập, phân lập lưu trữ nguồn gen chủng nấm z gm @ Cordyceps militaris 22 2.4.2.1 Sưu tập nguồn gen 22 l m co 2.4.2.2 Phân lập chủng nấm từ mẫu Cordyceps militaris thu thập Việt Nam 22 an Lu 2.4.2.3 Tốc độ sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris .23 n va ac th si iv 2.4.2.4 Lưu trữ bảo quản nguồn giống 23 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết 24 2.4.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 24 2.4.3.2 Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng nhiệt độ khơng khí đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 24 2.4.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 25 lu 2.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng độ pH môi trường đến sinh trưởng phát an va triển hệ sợi 25 n 2.4.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chủng nấm 25 to 25 ie gh tn 2.4.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chủng nấm thu p 2.4.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm chủng nấm thu nl w 26 d oa 2.4.5 Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi môi trường dịch thể an lu .26 va 2.4.5.1 Phương pháp xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể .26 u nf 2.4.5.2 Phương pháp xác định tốc độ lắc trình ni cấy 27 ll 2.4.5.3 Phương pháp xác định thời gian thu hoạch 27 m oi 2.4.5.4 Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy .28 z at nh 2.4.5.5 Phương pháp sản xuất bột nấm Cordyceps militaris 28 Chương Kết nghiên cứu 29 z gm @ 3.1 Sưu tập, phân lập lưu trữ nguồn gen chủng nấm Cordyceps militaris 29 3.1.1 Sưu tập chủng nấm từ Trung Quốc Nhật Bản 29 l m co 3.1.2 Kết phân lập mẫu nấm Cordyceps militaris thu thập Việt Nam 30 an Lu n va ac th si v 3.1.2.1 Đặc điểm hình thái giải phẫu mẫu nấm thu thập Việt Nam 30 3.1.2.2 Kết phân lập chủng nấm thu thập Việt Nam 34 3.1.2.3 Đặc điểm hình thái hệ sợi chủng nấm thu thập Việt Nam 35 3.1.3 Tốc độ sinh trưởng chủng nấm nuôi cấy khiết .36 3.1.4 Lưu trữ bảo quản nguồn giống 38 3.2 Đặc điểm sinh học hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy khiết 40 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 40 lu 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ khơng khí đến sinh trưởng nấm an va .43 n 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng nấm 44 to 3.2.5 Tổng hợp nhân tố sinh thái tối ưu cho sinh trưởng nấm 47 ie gh tn 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng hệ sợi 46 p 3.3 Nghiên cứu hoạt tính chủng nấm thu .48 nl w 3.3.1 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chủng nấm Cordyceps d oa militaris 48 an lu 3.3.2 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm chủng nấm thu 51 va 3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi môi trường dịch thể 54 u nf 3.4.1 Xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể thu sinh khối hệ sợi 54 ll 3.4.2 Xác định tốc độ lắc q trình ni cấy 58 m oi 3.4.3 Xác định thời gian thu hoạch 61 z at nh 3.4.4 Thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy 63 3.4.5 Quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris .65 z TÀI LIỆU THAM KHẢO m co l PHỤ LỤC gm @ Kết luận 67 an Lu n va ac th si vi Danh mục bảng Bảng 3.1: Tổng hợp chủng nấm Cordyceps militaris thu thập Việt Nam .35 Bảng 3.2: Tốc độ sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris môi trường nhân tạo .38 Bảng 3.3: Sinh trưởng chủng nấm sau thời gian lưu trữ bảo quản 38 Bảng 3.4: Kết xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm 41 Bảng 3.5: Kết xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm 43 Bảng 3.6: Kết xác định độ ẩm tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm 45 lu Bảng 3.7: Kết xác định pH môi trường tối ưu cho sinh trưởng nấm 46 an n va Bảng 3.8: Tổng hợp nhân tố sinh thái tối ưu cho sinh trưởng nấm 48 Bảng 3.10: Kết so sánh khả kháng nấm Fusarium oxysporum 52 gh tn to Bảng 3.9: Kết so sánh khả kháng khuẩn nấm Cordyceps militaris 49 ie Bảng 3.11: Kết xác định môi trường dịch thể nhân sinh khối hệ sợi tối ưu 55 p Bảng 3.12: Kết xác định tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm .58 nl w Bảng 3.13: Sinh khối hệ sợi nấm sau khoảng thời gian nuôi khác .61 d oa Bảng 3.14: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác 63 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vii Danh mục hình Hình 1.1: Nấm C militaris nuôi trồng thử nghiệm Viện KHLNVN………… 19 Hình 3.1: Hệ sợi Cordyceps militaris CM 30 Hình 3.2: Hệ sợi Cordyceps militaris F1010 30 Hình 3.3: Hệ sợi Cordyceps militaris F1012 30 Hình 3.4: Hệ sợi Cordyceps militaris F1080 30 Hình 3.5: Nấm Cordyceps militaris HL1 32 Hình 3.6: Nấm Cordyceps militaris HL2 32 Hình 3.7: Nấm Cordyceps militaris HL22 32 lu Hình 3.8: Nấm Cordyceps militaris HL34 33 an n va Hình 3.9: Bào tử vơ tính Cordyceps militaris HL34 33 Hình 3.12: Nấm C.militaris HL35 34 gh tn to Hình 3.11: Bào tử hữu tính C militaris HL34 .33 ie Hình 3.13: BT hữu tính C.militaris HL35 .34 p Hình 3.14: BT hữu tính C.militaris HL35 34 nl w Hình 3.15: Hệ sợi Cordyceps militaris HL2 36 d oa Hình 3.16: Hệ sợi Cordyceps militaris HL22 36 an lu Hình 3.17: Hệ sợi Cordyceps militaris HL34 36 va Hình 3.18: Hệ sợi Cordyceps militaris HL35 36 u nf Hình 3.19: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm chủng Cordyceps militaris .37 ll Hình 3.20: Sinh trưởng hệ sợi sau thời gian lưu trữ bảo quản 39 m oi Hình 3.21: C.militaris HL2 sau 06 tháng cất giống 40 z at nh Hình 3.22: C.militaris CM sau 21 tháng cất giống 40 Hình 3.23: Sinh trưởng hệ sợi nấm mơi trường dinh dưỡng khác 42 z gm @ Hình 3.24: Sinh trưởng hệ sợi nấm thang nhiệt độ khơng khí khác .44 Hình 3.25: Sinh trưởng nấm thang độ ẩm khơng khí khác .46 l m co Hình 3.26: Sinh trưởng nấm pH môi trường khác 47 Hình 3.27: Khả kháng khuẩn chủng nấm Cordyceps militaris 50 an Lu Hình 3.28: Khả kháng khuẩn chủng Cordyceps militaris 51 n va ac th si viii Hình 3.29: Khả kháng nấm F oxysporum nấm Cordyceps militaris 53 Hình 3.30: Khả kháng nấm F oxysporum nấm Cordyceps militaris 54 Hình 3.31: Chủng CM nuôi cấy môi trường dịch thể 56 Hình 3.32: Sinh khối hệ sợi nấm môi trường dịch thể khác .57 Hình 3.33: Chủng Cordyceps militaris Việt Nam 57 Hình 3.34: Chủng Cordyceps militaris Sưu tầm 57 Hình 3.35: Sinh khối hệ sợi nấm tốc độ lắc khác 59 Hình 3.36: Thời gian lắc liên tục .61 Hình 3.37: Thời gian lắc cách nhật 61 lu Hình 3.38: Sinh khối khơ hệ sợi thời gian thu hoạch khác .62 an n va Hình 3.39: Hệ sợi nấm trước thu hoạch 63 Hình 3.41: Hệ sợi nấm C militaris sấy khô 65 gh tn to Hình 3.40: Thời gian sấy khơ hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác 64 p ie Hình 3.42: Bột nấm C militaris 65 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Đơng trùng hạ thảo (cịn gọi Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) loài nấm ký sinh sâu non nhộng sâu trưởng thành số loại côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành số lồi trùng nằm đất mặt đất bị nấm ký sinh Sợi nấm xâm nhiễm hút chất dinh dưỡng thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, nấm hình thành thể nhú lên khỏi mặt đất gốc dính liền vào thân sâu Người ta thường đào lấy xác lu an sâu nấm để làm thuốc Vì mùa đơng nấm ký sinh sâu, mùa hạ mọc thành n va nấm nên có tên đơng trùng hạ thảo (ĐTHT) tn to Loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link đối tượng nghiên cứu đề gh tài, nấm ký sinh giai đoạn nhộng côn trùng, mùa hạ mọc thành nấm p ie số tác giả gọi Nhộng trùng thảo Nấm Cordyceps militaris loài nấm w đánh giá cao giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin thành phần hoá oa nl học thể nấm Đây hợp chất có khả ức chế hoạt động trình d sinh tổng hợp tế bào ung thư Tác dụng kìm hãm tế bào ung thư lu an vú, ung thư phổi, ung thư máu nhiều nhà khoa học như: Yoo H.S et al., u nf va 2004 [33]; Ahn Y.J et al., 2000 [16]; Kim G.Y đồng tác giả (2006) [22] nghiên cứu phát Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ ll oi m thảo dùng để điều trị chứng rối loạn nhịp lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm z at nh thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu sinh dục viêm gan B mạn tính Nấm Cordyceps militaris Nan J.X đồng tác giả (2001) chứng z minh có hiệu chữa trị bệnh rối loạn chức gan Ngoài nấm cịn có tác @ gm dụng chống viêm kìm hãm oxy hố lipit lipoprotein Khơng l lồi nấm Cordyceps militaris cịn phát có hàm lượng dinh dưỡng cao: m co giàu vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1, có hàm giá trị lồi nấm Cordyceps militaris vô quý giá an Lu lượng protein cao (40,69%), nhiều nguyên tố khoáng Zn, Se, Cu Như n va ac th si Hiện loài nấm Cordyceps militaris phát nước Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Quốc Việt Nam nước có nhiều nét tương đồng với khu hệ nấm Qua điều tra sơ Phòng nghiên cứu Bảo vệ thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam phát lồi nấm có mặt vùng núi cao Việt Nam Nấm Cordyceps militaris tự nhiên khó tìm, xuất theo mùa, mặt khác giá trị Đông trùng hạ thảo nhiều người biết đến tâm nhu cầu khai thác lồi lớn Vì vậy, việc nhân ni gây trồng nhân tạo thành cơng lồi nấm có ý nghĩa vơ to lớn việc bảo tồn phát triển loài Đây loài nấm không dễ phân lập nhân lu nuôi môi trường nhân tạo, nhân nuôi thành công không an n va biết đặc điểm sinh học chúng Nghiên cứu đặc điểm sinh học loài định đến thành bại việc ni trồng thể nấm nhân tạo Chính lý đề tài tiến hành “Nghiên cứư đặc điểm sinh học p ie gh tn to nấm Cordyceps militaris sở khoa học quan trọng xem yếu tố w chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link thu oa nl thập sưu tầm từ Việt Nam, Trung Quốc Nhật Bản ” nhằm góp phần bảo d tồn, nghiên cứu ứng dụng phát triển bền vững lồi Đơng trùng hạ thảo q an lu Thành cơng đề tài có ý nghĩa lớn nghiên cứu khoa học y loại nấm thần dược ll u nf va học nước nhà, đặc biệt sở để tiếp tục nghiên cứu quy trình ni trồng nhân tạo oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 60 Hình 3.35 mơ rõ sinh trưởng hệ sợi chủng nấm cho trọng lương lượng khô cao cơng thức CT2, nghĩa điều kiện lắc 120 vịng/phút cho sinh khối hệ sợi nấm lớn Các chủng nấm HL22, HL34, HL35 có xuất xứ Việt Nam cho sinh khối thấp so với chủng lại thí nghiệm thời gian ni cấy Lắc khâu quan trọng q trình ni nấm mơi trường dịch thể ni tĩnh hồn tồn nấm có khả sinh trưởng bề mặt dịch thể, hệ sợi nấm có bề mặt phía đóng băng kín bề mặt khơng có dịch, dùng dịch để làm giống lu an hút dịch đưa sang mơi trường nấm khó mọc khơng có sợi Việc lắc nhằm n va cắt đứt sợi nấm cịn non trộn lẫn mơi trường dịch thể thứ tn to làm cho hệ sợi sinh trưởng khắp thể tích bình không gh bề mặt, thứ hai hút dịch thể đảm bảo lượng hệ sợi để mọc p ie mơi trường mới, thứ ba không tạo hội cho nấm mọc che kín bề mặt w dịch thể oa nl Lý ta không lắc liên tục 24/24giờ, mà nên lắc cách nhật kinh nghiệm d cho thấy sau cấy sợi nấm vào môi trường dịch thể nên để 5- ngày tuỳ theo lu an chủng mọc nhanh hay chậm cho hệ sợi nấm bắt đầu mọc mơi trường dịch thể u nf va sau tiến hành lắc cấy nấm sợi nấm chưa mọc môi trường mới, đem lắc làm sợi nấm ngập nước chìm hẳn vào dịch ll oi m thể, nấm bị ướt mọc khó chậm Q trình lắc cần phải có thời gian z at nh để tĩnh cho sợi nấm bị cắt đứt mọc môi trường dịch thể Như nhân sinh khối nấm môi trường dịch thể để sinh khối hệ sợi z l gm thời gian ngày lắc ngày để tĩnh @ nấm đạt hiệu cao nên lắc với tốc độ 120vịng/phút điều kiện 25 oC, với m co Dưới hình ảnh minh hoạ thí nghiệm lắc liên tục (24/24 giờ) lắc cách nhật (lắc tốc độ 120vòng/phút với ngày để tĩnh ngày lắc) chủng an Lu nấm Cordyceps militaris Việt Nam (Hình 3.36, Hình 3.37) n va ac th si 61 Hình 3.36: Thời gian lắc liên tục Hình 3.37: Thời gian lắc cách nhật lu 3.4.3 Xác định thời gian thu hoạch Trọng lượng khô hệ sợi sau thu hoạch khoảng thời gian nuôi an va n cấy môi trường dịch thể sau 12 ngày, 16 ngày, 20 ngày, 24 ngày 28 ngày tn to trình bày Bảng 3.13 mơ qua Hình 3.38 p ie gh Bảng 3.13: Sinh khối hệ sợi nấm sau khoảng thời gian nuôi khác Sinh khối hệ sợi (gram) HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 0.226 0.209 0.685 0.595 0.480 0.480 0.397 0.391 0.887 0.812 0.598 0.708 0.417 0.453 0.611 1.091 1.005 0.880 0.988 oa 12 ngày HL2 nl w Chủng /thời gian 0.178 16 ngày 0.638 0.291 20 ngày 1.065 24 ngày 1.132 0.517 0.553 0.781 1.142 1.039 0.918 1.062 28 ngày 1.144 0.523 0.577 0.802 1.153 1.064 0.938 1.086 0.453 d ll u nf va an lu oi m z at nh Kết bảng cho thấy chủng nấm Cordyceps militaris sinh trưởng môi trường dịch thể PD với thời gian 28 ngày nuôi cấy Tuy z gm @ nhiên thời gian đầu 12, 16 , 20 ngày tốc độ sinh trưởng nấm nhanh thể sinh khối hệ sợi nấm tăng nhanh chóng điều thấy rõ Hình 3.38 m co l an Lu n va ac th si 62 Trọng lượng khô hệ sợi (gram) 12ngày 16ngày 20ngày 24ngày 28ngày 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 HL2 HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 lu Chủng nấm an n va Hình 3.38: Sinh khối khơ hệ sợi thời gian thu hoạch khác tn to Ngồi Hình 3.38 cho ta thấy rõ sinh khối hệ sợi nấm chia làm loại rõ gh rệt loại sinh trưởng nhanh chủng HL2, CM, F1010, F1012, F1080 loại sinh p ie trưởng chậm chủng HL22, HL34, HL35 Đối với chủng nấm sinh trưởng w nhanh ngày đầu 16 – 20 ngày nấm tăng nhanh rõ rệt, sau 24 ngày oa nl sinh khối hệ sợi tăng tăng khơng đáng kể Hình 3.38 cho thấy sinh khối d hệ sợi nấm sau 20 ngày, 24 ngày 28 ngày sinh khối hệ sợi chủng gần lu an xấp xỉ Mặt khác hệ sợi nấm sau 20 ngày trắng khoẻ sau 24 u nf va ngày hệ sợi dần chuyển sang màu ngà vàng da cam dấu hiệu già hệ sợi nấm Những chủng nấm sinh trưởng chậm sau 20 ngày hệ sợi nấm ll oi m tăng nhanh 24 ngày, từ 24 – 28 ngày sợi nấm sinh trưởng chững lại z at nh hệ sợi chuyển từ màu trắng sang màu ngà đến vàng da cam Như xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm phù hợp cho chủng nấm sau: chủng z mọc nhanh chủng HL2, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012, chủng F1080 @ gm thời gian thu hoạch hệ sợi nấm tốt 20 ngày kể từ ngày cấy nấm Chủng m co 24 ngày l HL22, chủng HL34, chủng HL35 cịn lại mọc chậm thời gian thu hoạch tốt an Lu n va ac th si 63 Nghiên cứu xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm vào thời gian phù hợp tốt cho suất cao điều quan trọng Vì sinh trưởng nấm nói riêng sinh vật nói chung có thời gian định Sợi nấm sinh trưởng đến chừng mực bị già yếu, sinh trưởng chậm, khả đề kháng để lâu làm thời gian mà suất hệ sợi khơng tăng, dẫn đến hiệu kinh tế thấp tăng thêm chi phí sản xuất Nếu lúc thu hoạch hệ sợi sử dụng hệ sợi làm giống sợi nấm khơng đạt u cầu cho sinh trưởng chậm, sợi nấm bị vàng dễ bị thoái hoá giống Thời điểm thu hoạch hệ sợi làm giống tốt lúc hệ sợi nấm trắng, bơng khoẻ (Hình 39) lu an n va p ie gh tn to d oa nl w va an lu Hình 3.39: Hệ sợi nấm trước thu hoạch u nf 3.4.4 Thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy ll Hệ sợi nấm sau thu hoạch sấy khô nhiệt độ thấp 300C, 350C, 400C m oi có quạt gió đến độ ẩm tương đối sản phẩm sấy đạt 10 – 12%, thời gian sấy z at nh khô hệ sợi nấm chủng trình bày Bảng 3.14 z Bảng 3.14: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác @ HL34 HL35 CM 96 56 50 72 48 40 72 48 40 72 48 40 96 60 52 F1010 F1012 96 56 48 F1080 80 48 40 96 56 48 an Lu HL22 m co HL2 l 30oC 35 oC 40 oC Thời gian sấy khô hệ sợi (giờ) gm Chủng /NĐ sấy n va ac th si 64 Từ kết Bảng 3.14 cho thấy thời gian để sấy nấm thang nhiệt độ sấy khác khác rõ rệt Kết cho thấy nhiệt độ 30oC thời gian làm khô hệ sợi lâu nhiều (từ 72 -96 giờ) so với sấy nhiệt độ 35 (48 – 60 giờ) 40 oC (40 – 52 giờ) Ở thang nhiệt độ 400C sợi nấm khô nhanh so với nhiệt độ 350C khơng đáng kể, điều thấy rõ Hình 3.40 Trong chủng nấm thí nghiệm thời gian sấy kết cho thấy rõ thời gian sấy nhóm chủng nấm sinh trưởng nhanh chủng HL2, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012 chủng F1080 nhiều thời gian so với nhóm chủng sinh trưởng chậm lu chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 Điều lý giải hệ sợi nấm an n va chủng sinh trưởng nhanh thường có hệ sợi dầy so với nhóm chủng tn to sinh trưởng chậm 35 độ C 40 độ C 120 100 w Thời gian sấy (giờ) p ie gh 30 độ C 60 HL2 u nf va an lu 20 d 40 oa nl 80 HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 ll oi m Chủng nấm z at nh Hình 3.40: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác Sợi nấm sau thu hoạch rửa qua nước sấy khô z @ điều kiện 300C thời gian 72 – 96 không đảm bảo chất lượng sợi nấm l gm đơi có xuất hiện tượng nấm tạp xâm nhiễm Để đảm bảo an tồn cho nấm khơng nên sấy nhiệt độ cao, sợi m co nấm tươi mà đem sấy nhiệt độ cao không đảm bảo lượng nước an Lu bay hoàn toàn thường dẫn đến hệ sợi nấm giòn dễ vỡ vụn Mặt khác đối n va ac th si 65 tượng sấy hệ sợi nấm, có chứa nhiều thành phần hố học q ví dụ vitamin, axit amin nhiều thành phần khác có cấu trúc cácbon… sấy nhiệt độ cao phá vỡ cấu trúc thành phần làm ảnh hưởng đến tính chất thành phần dễ dẫn đến làm hỏng tác dụng quý báu vốn có nấm Với kết thời gian sấy nấm hợp lý 35 oC - 40 oC tốt 35oC lý sau: thời gian sấy đảm bảo sợi nấm không bị nhiễm tạp, thời gian sấy không lâu nhiệt độ không cao đảm bảo độ an toàn chất lượng sợi nấm 4.4.5 Quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris lu Nguyên liệu: Giống nấm, môi trường dinh dưỡng PDA, mơi trường dịch PD an n va Quy trình: Từ nguồn giống nấm lưu trữ bảo quản, cấy truyền sang môi trường khoẻ, cấy truyền sang môi trường dịch PD hấp khử trùng, nuôi nhiệt độ gh tn to dinh dưỡng cho nấm sinh trưởng, sau 10 - 15 ngày cấy, sợi nấm mọc bông, trắng ie 25oC với tốc độ lắc 120 vòng/phút Sau 20 – 24 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu p chuyển từ màu trắng sang màu ngà, tiến hành thu hoạch nl w Sợi nấm lọc qua rây, rửa qua hệ sợi nước sau tiến hành d oa sấy hệ sợi nấm nhiệt độ 35oC thời gian 48 – 60 giờ, tuỳ chủng nấm mà an lu thời gian sấy khác nhau, đến độ ẩm khơng khí đạt 10 -12% dừng sấy Tiến hành va nghiền đóng gói kín, bảo quản điều kiện mát Sản phẩm thu hoạch ll u nf mơ qua hình ảnh Hình 3.40 Hình 3.41 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình 3.41: Hệ sợi C militaris khơ Hình 3.42: Bột C militaris n va ac th si 66 Quy trình sản xuất Bột nấm Cordyceps miltaris tóm tắt qua Sơ đồ sau: Giống lưu trữ bảo quản PDA, 25oC Lưu trữ Cất giống 10 -15ngày nuôi bảo quản giống Nước cất vô trùng Giống sản xuất lu an n va tn to Dịch PD, 25oC p ie gh 120 vòng/phút Sản xuất hệ sợi (Nhân sinh khối) Bột nấm Nghiền ll m Sợi nấm khô u nf 48 – 60 va an lu Sấy 35oC d oa nl w Thu hoạch Đóng gói oi Cordyceps militaris z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 67 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết thu thập mẫu nấm có nguồn gốc Việt Nam phân lập mẫu xác định nấm Cordyceps militaris sưu tầm chủng nấm Cordyceps militaris bao gồm chủng Trung Quốc chủng Nhật Bản Như tiến hành nghiên cứu chủng nấm Cordyceps militaris có kí hiệu sau: Chủng HL2, chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012 chủng F1080 - Có 4/8 chủng sinh trưởng nhanh mơi trường dinh dưỡng nhân tạo bao gồm lu chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 chủng F1080 với tốc độ 104,66; an n va 122,02; 107,64; 105,08 µm/giờ, 4/8 chủng nấm sinh trưởng chậm môi trường HL34, chủng HL35 chủng sưu tầm Nhật Bản chủng F1012 với tốc độ sinh gh tn to nhân tạo có chủng thu thập Việt Nam chủng HL22, chủng ie trưởng đạt 69,95; 71,92; 79,37 80,36µm/giờ Chủng CM cho sinh trưởng nhanh p nl w - Khả lưu trữ giống nấm Cordyceps militaris nước cất vô trùng, băng kín d oa bảo quản tủ lạnh 4oC đảm bảo chất lượng nấm thời an lu gian 17 tháng va Điều kiện tối ưu cho chủng nấm Cordyceps militaris sinh trưởng điều u nf kiện nuôi cấy khiết là: ll - Chủng HL2: Môi trường dinh dưỡng N10 (PDA + 10% Nhộng tằm), nhiệt độ từ m oi 15 -25oC, độ ẩm khơng khí 85% pH = 5,0 z at nh - Chủng HL22, HL34: Mơi trường PDA có bổ sung 10 - 20% Nhộng tằm Ở 20oC, độ ẩm 80 – 85% pH = 6,0 z 20oC, độ ẩm 80 – 85% pH = 5,0 – 6,5 l gm @ - Chủng HL35: Cả công thức môi trường N10; N20; PDA; P10; P20, nhiệt độ ẩm 80 -85% pH = 4,5; 6,5 m co - Chủng CM: Môi trường PDA có bổ sung 10% Nhộng tằm, nhiệt độ 20 – 25oC, độ an Lu - Chủng F1010: Môi trường PDA N10, nhiệt độ 25oC, độ ẩm 85% pH = 6,5 n va ac th si 68 - Chủng F1012: Môi trường N10, nhiệt độ 15 – 25oC, độ ẩm 85% pH = 5,0 – 5,5 - Chủng F1080: Môi trường dinh dưỡng P20; PDA; N10; N20, nhiệt độ 20 -25oC, độ ẩm 80 -85% pH = 6,5 Cả chủng nấm Cordyceps militaris có hoạt tính sinh học thơng qua: - Khả kháng khuẩn Bacillus subtilis Trong chủng CM có khả kháng mạnh với đường kính vịng ức chế 22,50, chủng HL2, chủng F1012, chủng F1080 có đường kính vịng ức chế khoảng 17,33 -19,00 mm, chủng lại gồm chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35, chủng F1010 khả kháng thấp vòng ức chế từ 12,50 – 15,00 mm lu - Khả kháng nấm Fusarium oxysporum Kết cho thấy chủng nấm an n va Cordyceps militaris có khả kháng tốt, mạnh chủng CM đường kính F1012 có đường kính vịng ức chế 20,67 – 23,00 mm Các chủng HL22, chủng gh tn to vòng ức chế 25,00 mm, chủng HL35, chủng HL2, chủng F1010, chủng ie HL34, chủng F1080 khả kháng thấp với đường kính khoảng 17,33 p – 18,33 mm nl w Điều kiện tối ưu để nhân sinh khối hệ sợi nấm là: d oa - Môi trường dinh dưỡng dịch thể tối ưu để nhân nuôi sinh khối hệ sợi nấm môi an lu trường PD (20g Glucoza/lít + 200g khoai tây/lít) Chủng CM có xuất mầm thể va điều kiện nuôi cấy 25oC môi trường dịch thể PD u nf - Tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris ll mơi trường dịch thể 120 vịng/phút điều kiện 25oC với thời gian lắc ngày oi m để tĩnh ngày z at nh - Thời gian thu hoạch nấm tốt chủng HL2, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012, chủng F1080 20 ngày kể từ ngày cấy nấm Chủng HL22, chủng z gm @ HL34, chủng HL35 mọc chậm thời gian thu hoạch tốt 24 ngày - Sấy khô sản phẩm hệ sợi nấm tốt nhiệt độ từ 35 – 40oC, tốt m co l 35oC thời gian 48 – 60 - Quy trình sản xuất bột nấm: Giống nấm cấy truyền môi trường PDA, an Lu sau 10 -15 ngày tuổi tiếp tục cấy vào môi trường dịch PD, nuôi 25oC với tốc độ n va ac th si 69 lắc 120 vòng/phút Sau 20 -24 ngày thu hoạch hệ sợi, sấy nhiêt độ 35oC thời gian 48 – 60 đến độ ẩm 10 -12% dừng sấy, nghiền đóng gói, sản phẩm cuối bột nấm Cordyceps militaris Tồn kiến nghị Do thời gian thực đề tài bị hạn chế đề tài dừng lại kết thử nghiệm thời gian lưu trữ bảo quản giống nấm 17 tháng Do hạn chế thời gian nghiên cứu nên kết thử nghiệm hoạt tính sinh học kháng nấm kháng khuẩn chủng Cordyceps militris thực lu loài khuẩn Bacillus subtilis loài nấm Fusarium oxysporum mà chưa thử an Kết nghiên cứu có ý nghĩa lớn cho nghiên cứu tiếp theo, đặc n va nghiệm với loài khuẩn, nấm gây bệnh cho người ie gh tn to biệt sở khoa học để ứng dụng cho giai đoạn nhân nuôi trồng thể nhân tạo Đối tượng nghiên cứu loài nấm dược liệu quý, có ý nghĩa y dược p cao, nên tiếp tục sâu nghiên cứu đáp ứng mục đích cuối tạo nl w sản phẩm thể nấm nuôi trồng nhân tạo có giá trị cao ứng dụng cho d oa ngành y học ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Doãn Diên, Phạm Thị Thùy, Nguyễn Giáng Vân, Trần Thanh Tháp, Đồng Thanh, Nguyễn Thị Bắc (1994), Kết nghiên cứu phân lập sản xuất nấm Beauveria bassiana bước đầu tìm hiểu biện pháp sử dụng nấm để phịng trừ mọt hại kho nơng sản, Hội nghị khoa học tồn quốc Cơng nghệ sinh học Hóa sinh phục vụ sản xuất ĐS, HN Đỗ Tất Lợi (1977), Những thuốc vị thuốc Việt Nam (In lần thứ 3, có lu an sửa chữa bổ sung), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội n va Trần Văn Mão (2002), Sử dụng trùng vi sinh vật có ích Tập II Sử tn to dụng vi sinh vật có ích, Trường Đại học Lâm nghiệp, Nhà xuất Nông ie gh nghiệp p Trịnh Tam Kiệt (1996), Danh mục loài nấm lớn Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội nl w oa Trịnh Tam Kiệt, Đặng Vũ Thanh, Hà Minh Trung (2001), Lớp d ASCOMYCETES, Danh lục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất lu va an Nông nghiệp, Hà Nội u nf Pham Quang Thu (2009), “Điều tra phát nấm Đông trùng hạ thảo ll Cordyceps nutans Pat Phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn m oi Động, Bắc Giang”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông z at nh nghiệp & Phát triển nông thôn, số 4, trang 91-94 z Phạm Quang Thu (2009), “Phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps @ gm gunnii (Berk) Berk Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc”, Tạp chí m co thôn, số 4, trang 96-99 l Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông an Lu n va ac th si 71 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2009), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh trưởng hệ sợi ni cấy khiết số lồi nấm ký sinh trùng”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 11, trang 97 – 102 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2009), “Phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.) Link Tại vườn Quốc gia Hồng Liên Tỉnh Lào Cai”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 9, trang 103 - 113 lu 10 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2010), Phát nấm Đông trùng hạ an thảo Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa Việt Nam” Tạp va n chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển 11 Phạm Thị Thùy, Đồng Thanh, Nguyễn Thị Bắc, Trần Thanh Tháp (1994), p ie gh tn to nông thôn, số 6, trang 127 – 130 Kết nghiên cứu sản xuất nấm côn trùng Beauveria Metarhizium để nl w phòng trừ số sâu hại trồng, Hội nghị khoa học tồn quốc Cơng d oa nghệ sinh học Hóa sinh phục vụ sản xuất đời sống, Hà Nội an lu 12 http://www.khampha24h.com u nf va 13 http://www.vast.ac.vn/index.phpoption ll 14 http://www.vietsiences.free.fr http://vietsiences.net m oi 15 http://www.yhoccotruyen.hmtedsoft.com/baocheduoc/htmdocs/dongtrungha- z Tiếng Anh z at nh thao.htm @ gm 16 Ahn Y.J., Park S.J., Lee S.G., Shin S.C., Choi D.H (2000), “Cordycepin: l selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps m co militaris against Clostridium spp.”, J Agric Food Chem., 48, 2744-2748 an Lu n va ac th si 72 17 Ajay Kumar, Pragati Saini J N Shrivastava (2009), “Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian Journal of Experimental Biology, 47, pp 57 -62 18 Duck-Hyun Cho, Yun-Man Cho, Jong-Il Lee (2000), Fruitbody Formation of Cordyceps militaris in Allomyrina dichotoma Linnaeus Annual Report of Department of biology, Division of Life and Technology, Woosuk University, Cheonju 565-800, Korea 19 Gi-Ho Sung, Nigel L Hywel-Jones, Jae-Mo Sung, J Jennifer Luangsa-ard, lu Bhushan Shrestha and Joseph W Spatafora (2007) “Phylogenetic an classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”, Studies in va n Mycology 57, 5–59 gh tn to 20 Jae-Sung Kim, Kumar Sapkota, Se-Eun Park, Bong-Suk Choi, Seung Kim, Nguyen Thi Hiep, Chun-Sung Kim, Han-Seok Choi, Myung-Kon Kim, p ie Hong-Sung Chun, Yeal Park, and Sung-Jun Kim (2006), “A Fibrinolytic nl w Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris”, The Journal d oa of Microbiology, Vol 44, No.6 Dec 2006, p 622-631 an lu 21 Jiang-Feng Song, Chun-Quan Liu, Da-Jing Li and Bang-Quan Jin (2007) va “Optimization of cordycepin extraction from cultured Cordyceps militaris oi m 82, 1122–1126 ll u nf by HPLC-DAD coupled with uniform design”, J Chem Technol Biotechnol z at nh 22 Kim G.Y., Ko W.S., Lee J.Y., Lee J.O., Ryu C.H., Choi B.T., Park Y.M., Jeong Y.K., Lee K.J., Choi K.S., Heo M.S., Choi Y.H (2006), “Water z extract of Cordyceps militaris enhances maturation of murine bone @ gm marrow- derived dendritic cells in vitro”, Biol Pharm Bull 29, 354-360 m co l 23 Klaunig JE, Kamendulis LM (2004), “The role of oxidative stress in carcinogenesis”, Annu Rev Pharmacol 44, 239-267 an Lu n va ac th si 73 24 Lee H, Kim Y.J., Kim H.W., Lee D.H., Sung M.K., Park T (2006), “Induction of apoptosis by Cordyceps militaris through activation of caspase-3 in leukemia HL-60 cells”, Biol Pharm Bull 29, 670-674 25 Li Cui, Ming Sheng Dong, Xiao Hong Chen, Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan (20080, “A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris, a Chinese traditional medicinal mushroom”, World J Microbiol Biotechno 24, 483– 489 26 Mao X.L (2000), The macrofungi in China, Henam Technical and Science lu Publication House an va 27 Mina Masuda, Eriko Urabe, Akihiko Sakurai, Mikio Sakakibara (2005), n “Production of cordycepin by surface culture using the medicinal to gh tn mushroom Cordyceps militaris”, Enzyme Microbial Technol 39 (2006), 641–646 p ie 28 Nan J.X., Park E.J., Yang B.K., Song C.H., Ko G., Sohn D.H (2001), nl w “Antifibrotic effect of extracellular biopolymer from submerged mycelial d oa cultures of Cordyceps militaris on liver fibrosis induced by bile duct an lu ligation and scission in rats”, Arch Pharm Res 24, 327-332 u nf va 29 Patcharaporn Wongsa, Kanoksri Tasanatai, Patricia Watts and Nigel HywelJones (2005), Isolation and in vitro cultivation of the insect pathogenic ll oi m fungus Cordyceps unilateralis, Annual Report of National Center for z at nh Genetic Engineering and Biotechnology, Thailand 30 Russell R., Paterson M (2008), “Cordyceps – A traditional Chinese z medicine and another fungal therapeutic biofactory”, Phytochemistry 69 l gm @ (2008), 1469–1495 31 Sung Jae Mo (2000), Insect-born fungus of Korea, Kangwon National Univ., m co Korea an Lu n va ac th si 74 32 Tsuguo Hongo Masana Izawa (1994), Mushroom in Japan, Yama-Kei publisher, Japan 33 Yoo H.S., Shin J.W., Cho J.H., Son C.G., Lee Y.W., Park S.Y., Cho C.K (2004), “Effect of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth”, Acta Pharmacol Sin 25, 657-65 34 Wang Youwei (2007), Project of Idustrialization Development of Cordyceps militaris, Lioaninh Baoli Industrial Co., Ltd 35.Won S.Y and Park E.H (2005), “Anti-inflammatory and related lu pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of an va Cordyceps militaris” J Ethnopharmacol 96, 555- 561 n 36 Xian-Bing Mao and Jian-Jiang Zhong (2004), “Hyperproduction of tn to Cordycepin by Two-Stage Dissolved Oxygen Control in Submerged gh p ie Cultivation of Medicinal Mushroom Cordyceps militaris in Bioreactors Biotechnol” Prog 2004, 20, 1408-1413 nl w 37 http://www.jstage.jst.go.jp/article/aez/37/1/37_85/_article/-char/en d oa 38 http://www.mushroomexpert.com/cordyceps_militaris.html an lu 39 http://www.mushroomexpert.com/references.html va 40 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15870944 ll u nf 41 http://www.khoahoc.net oi m 42 http://www.Suckhoevadoisong.htm 43 http://www.vnexpres.net/vietnam/suc-khoe/2004/04/3b9d1d39) z at nh 44 http://www.ykhoa.net z 45 http://www.herbal-power.com/cordyceps.htm m co l gm @ an Lu n va ac th si