Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá khả năng ứng dụng hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella SPP. để phát hiện Salmonella trong thực phẩm

và đánh giá khả năng sử dụng phức hợp hạt từ- kháng thể phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng các phương pháp kết hợp phân tách miễn dịch từ IMS và nuôi cấy.. Sự kết hợp giữa kỹ thuậ

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Thời gian tiến hành: từ 19/1/2015-14/6/2015 Đề tài đƣợc tiến hành tại phòng Hóa Miễn dịch-Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.

VẬT LlỆU

Các loại thiết bị và máy móc chính đƣợc sử dụng:

 Hệ thống tinh chế protein AKTA explore, Amersham

 Hệ thống máy đọc Elisa, Thermo

 Máy điện di Mini Protean, Biorad

 Máy ly tâm lạnh 5804R, Eppendorf

 Cân phân tích 04 số lẻ AB-204S, Mettler Toledo

 Máy đo pH Sevencompact, Mettler Toledo

 Máy trộn mẫu HulaMixer, Invitrogen

 Ống nghiệm thủy tinh 20 ml

 Que cấy vòng, que cấy thẳng

 Cột sắc ký Hitrap Protein A 1ml (17-0402-01, GE Healthcare)

2.2.2 Các loại môi trường và hóa chất

 Hóa chất dùng cho tinh chế, định lƣợng:

 Hóa chất dùng cho điện di:

 Hóa chất dùng để cộng hợp:

 Các môi trường nuôi cấy, phân lập và phát hiện:

 Môi trường tiền tăng sinh: nước peptone đệm (BPW, BD)

 Môi trường tăng sinh chọn lọc: Rappaport Vassiliadis (RV, BD)

 Môi trường thạch dinh dưỡng: Tryptose Soy Agar (TSA, BD)

 Các môi trường thạch chọn lọc: Hektoen (HE, BD), Xylose lysine deoxycholate (XLD, BD), và thạch màu Salmonella Chromogenic agar (SCA, Conda)

 Các môi trường dùng cho các thử nghiệm sinh hóa để kiểm tra Salmonella

Các loại hóa chất sử dụng đều đạt mức độ phân tích

2.2.3 Vật liệu thí nghiệm 2.2.3.1 Hạt từ và kháng huyết thanh thỏ nhóm O đa giá Salmonella

 Carboxylic acid MyOne đường kớnh 1 àm (65011, Invitrogen)

 Salmonella O Antiserum Poly A (225341, BD Difco)

 Salmonella O Antiserum Poly B (225351, BD Difco)

 Các chủng Salmonellla đại diện cho các nhóm Salmonella đƣợc sử dụng trong đề tài đƣợc liệt kê nhƣ trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Tên và nguồn gốc các chủng Salmonella đƣợc sử dụng

Nhóm Chủng đại diện Nguồn gốc

A S Paratyphi A Viện Pasteur Tp HCM B S Typhimurium ATCC 14028

C1 S Choleraesuis ATCC 12011 C2 S Newport Viện Pasteur Tp HCM

E1 S Anatum Viện Pasteur Tp HCM

E4 S Senftenberg Viện Pasteur Tp HCM

Tất cả các mẫu thực phẩm đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc cung cấp bởi Viện Y tế Công cộng Tp Hồ Chí Minh và Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh, bao gồm các nhóm mẫu nhƣ sau: a) Mẫu không qua xử lý nhiệt:

 Thịt tươi sống và các sản phẩm từ thịt: thịt heo tươi, thịt gà tươi, lạp xưởng tươi, nem chua

 Trứng: trứng gà, trứng vịt, trứng vịt lộn, trứng vịt muối, trứng vịt bắc thảo, trứng cút

 Hải sản: Cá hồi, tôm, mỡ cá

 Rau và các sản phẩm từ thực vật: Rau mồng tơi, cải ngọt, legum, hành tây, nấm bào ngƣ, phấn hoa, mật ong, sữa ong chúa b) Mẫu qua xử lý nhiệt:

 Sản phẩm từ thịt: chả lụa, thịt nguội, chà bông heo, thịt viên, lạp xưởng, chà bông gà, bò viên, khô bò

 Hải sản: tôm viên, tôm hấp, cá viên, chả cá hấp

 Bánh và các sản phẩm liên quan chất béo ngọt: kem tươi, bánh kem, bánh flan, yaourt, creamypudding, bánh trung thu, bánh mì ngọt, bánh mì mặn, rau câu trái cây, jelly uống, thạch dừa

 Nước chấm: xốt gia vị, xốt tartar, nước chấm, nước chấm tam thái tử, nước mắm, tương đen, tương ớt

 Gia vị: đường cát, bột ngọt, hạt nêm

 Sản phẩm hỗn hợp (rau và thịt): cháo ếch, cháo tôm, mì, mì và bún gạo, mì gói, mì ngũ cốc, sủi cảo hành, sủi cảo cải, sủi cảo cải thảo, sủi cảo hẹ, canh thịt khổ qua, thịt đông cô viên, sủi cảo tôm, rau sấy

PHƯƠNG PHÁP

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

2.3.2 Phương pháp ngưng kết kháng thể với vi khuẩn

 Các chủng vi khuẩn Salmonella đại diện cho các nhóm A, B, C1, C2, D, E1, E4 (Bảng 2.2) đƣợc nuôi cấy 18-24 giờ trên TSA

 Kháng huyết thanh kháng Salmonella đa giá OMA và OMB (BD Difco)

Bảng 2.2: Chủng gốc sử dụng ngƣng kết và công thức kháng nguyên

Chủng Salmonella Nhóm Kháng nguyên O Kháng nguyên H pha 1 pha 2

 Nhỏ 1 giọt mỗi loại kháng huyết thanh lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn và trộn đều Quan sát sau 5 phút, hiện tƣợng ngƣng kết xảy ra nếu xuất hiện các hạt Trường hợp không có ngưng kết thì toàn bộ dung dịch sẽ có màu trắng sữa

2.3.3 Phương pháp tinh chế kháng thể đặc hiệu kháng Salmonella bằng sắc ký ái lực qua cột Hitrap-Protein A

Kháng thể đƣợc tinh chế bằng kỹ thuật sắc kí ái lực miễn dịch sử dụng protein A

Protein A của vi khuẩn Staphylococcus aureus sẽ gắn trên hạt gel Khi dung dịch có chứa kháng thể đi qua, kháng thể sẽ đƣợc giữ lại Phần không bám đƣợc rửa và thu lấy kháng thể bằng cách sử dụng đệm pH thấp

Hình 2.2: Vị trí liên kết của kháng thể vào protein A, G, L và lectin [18]

 Đệm Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,5 M; pH=7,5

 Cột Hitrap-Protein A 1 ml (17-0402-01, GE Healthcare)

 Kháng huyết thanh kháng Salmonella đa giá OMA và OMB (BD Difco)

Ti ế n hành (tinh chế riêng lẽ cho từng loại kháng huyết thanh):

 Cho dung dịch kháng huyết thanh qua cột Hitrap-Protein A

 Rửa cột sắc ký bằng dung dịch đệm Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH=7,5 cho đến khi dịch rửa không còn protein (OD280=0)

 Đẩy kháng thể bám trên cột bằng dung dịch glycine 0,1 M, pH=2,5 (đến khi dịch ra có OD280=0) Thu phần kháng thể này và bảo quản ở 4 0 C cho đến khi sử dụng

 Cân bằng cột với dung dịch Tris-HCl 10 mM, pH=7,5 Bảo quản cột ở 4 0 C để sử dụng cho các lần tinh chế sau

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%-SDS (Kiểm tra độ tinh khiết của kháng thể)

Phân tử IgG có trọng lƣợng 150 kDa gồm có hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ, liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfid (-S-S-) (Hình 2.3) Mỗi chuỗi nặng có trọng lƣợng phân tử khoảng 50 kDa và mỗi chuỗi nhẹ có trọng lƣợng phân tử khoảng 25 kDa Khi xử lý kháng thể với -mercaptoethanol, ta sẽ thu đƣợc 2 băng chuỗi nặng và chuỗi nhẹ

Hình 2.3: Phân tử IgG đƣợc xử lý với β-mercaptoethanol [50]

 Đổ gel phân tích có nồng độ acrylamid 12%-SDS Chờ cho gel polymer hóa đông lại Đặt lƣợc vào gel để tạo các giếng Đổ gel tụ chụm có nồng độ acrylamid 4%-SDS Khi gel đông lấy lƣợc ra và lắp gel vào bình điện di

 Cho dung dịch đệm vào bình điện di

 Cho mẫu IgG sau tinh chế (phần 2.3.3) đã xử lý với xanh glycerol- SDS và

 Đậy nắp bình điện di Lắp nguồn điện Chạy điện di ở 110V, 90mA trong 2 giờ

 Khi vạch xanh đến đáy thùng Tắt nguồn Nhuộm với dung dịch Comassive

Tẩy bằng dung dịch tẩy

2.3.5 Phương pháp Bradford (xác định nồng độ kháng thể)

 Dung dịch BSA chuẩn: pha trong đệm PBS (dải nồng độ đi từ 0 – 16g/ml)

 Dung dịch BSA chuẩn và dung dịch IgG sau tinh chế (phần 2.3.3) đƣợc ủ với dung dịch Bradford trong 5 phút tại nhiệt độ phòng

 Đo hấp phụ quang của các dung dịch tại bước sóng 595 nm

 Dựng đường chuẩn dựa trên lượng BSA chuẩn và độ hấp phụ của nó

 Dựa trên đường chuẩn xác định nồng độ của dung dịch IgG chưa biết

 Dùng phần mềm KC4 để tính hàm lƣợng kháng thể có trong mẫu

2.3.6 Phương pháp gắn kháng thể vào hạt từ nhờ carbodiimide

Hạt từ mang nhóm carboxyl có thể đƣợc gắn đồng trị vào nhóm -amin của kháng thể bằng phương pháp carbodiimide (Hình 2.4) Chất xúc tác EDC (ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide) phản ứng với nhóm carboxyl trên bề mặt hạt từ tạo thành dạng trung gian O-acylisourea Dạng trung gian có thể phản ứng với nhóm amine của phân tử kháng thể tạo thành một liên kết amide bền

Hình 2.4: Phản ứng cố định kháng thể vào hạt từ mang nhóm carboxyl [55]

 Kháng thể sau tinh chế OMA, OMB (phần 2.3.3)

 Ủ 1 ml dung dịch hạt từ (7-12 x 10 9 hạt từ) với 100àl EDC 10 mg/ml ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, hút bỏ dịch nổi dùng nam châm DynaMag-2

 Thờm 100 àg khỏng thể OMA và 100 àg OMB sau tinh chế ỏi lực (phần 2.3.3), ủ 4 giờ ở nhiệt độ phòng

 Rửa hạt từ sau cộng hợp bằng đệm PBS-0,1% Tween 20

 Huyền phù lại trong 1 ml PBS-0,1% Tween 20-0,1% BSA, bảo quản ở 4 0 C

2.3.7 Phương pháp xác định hiệu suất cộng hợp kháng thể vào hạt từ

Hiệu suất cộng hợp được tính dựa trên tổng lượng kháng thể trước khi cộng hợp trừ cho tổng lượng kháng thể không gắn trong nước nổi sau cộng hợp (được xác định bằng phương pháp Bradford như phần 2.3.5) Hiệu suất gắn được tính như sau: với A1: lượng kháng thể trước khi gắn A2: lượng kháng thể còn trong nước nổi

2.3.8 Phương pháp ngưng kết phức hợp hạt từ kháng thể với vi khuẩn

 Các chủng vi khuẩn Salmonella đại diện cho các nhóm A, B, C1, C2, D, E1, E4 đƣợc nuôi cấy 18-24 giờ trên TSA

 Phức hợp hạt từ gắn kháng thể (phần 2.3.6)

 Cho 1 thể tích hạt từ sau cộng hợp tương ứng 10 6 hạt trên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn và trộn đều Quan sát sau 5 phút, hiện tƣợng

39 ngưng kết xảy ra khi hình thành phức hợp hạt từ tại tâm dung dịch Trường hợp không có ngƣng kết thì toàn bộ dung dịch sẽ có màu nâu

2.3.9 Phương pháp đếm khuẩn lạc (xác định mật độ vi khuẩn)

 Các chủng vi khuẩn Salmonella đƣợc nuôi cấy 18-24 giờ trên TSA

Dung dịch NaCl 0,9% vô trùng đƣợc gây nhiễm với chủng vi khuẩn (ống 10 0 )

Dự đoán mật độ vi khuẩn bằng cách đo quang ở bước sóng 600 nm Theo lý thuyết, OD600 khoảng 0,8 ứng với lƣợng vi khuẩn 1-2x10 8 CFU/ml Sau đó, dung dịch ban đầu này sẽ đƣợc pha loãng bậc 10 tạo thành các dung dịch với độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 10 -7 Cách pha loãng nhƣ sau: lấy 1 ml mẫu cần pha loãng cho vào ống nghiệm chứa 9 ml đệm NaCl 0,9% (Hỡnh 2.5) Chọn 2-3 độ pha loóng liờn tiếp, cấy trải 100àl lờn thạch TSA và đếm khuẩn lạc (lặp lại 2 lần cho mỗi mật độ) Lật ngƣợc và ủ các hộp thạch ở 37 0 C trong 18-24 giờ Chọn các hộp thạch có số khuẩn lạc 25-250 để tính kết quả Mật độ vi khuẩn ban đầu đƣợc tính nhƣ sau:

C: mật độ vi sinh vật ban đầu (cfu/ml) N: tất cả các khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn nᵢ: số đĩa đếm tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa (trường hợp này là 0,1ml) fᵢ: độ pha loãng tương ứng

Hình 2.5: Sơ đồ pha loãng

2.3.10 Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)

 Dịch vi khuẩn (vi khuẩn đƣợc chuẩn bị trong NaCl 0,9% hay mẫu thực phẩm đƣợc tăng sinh trong BPW)

 Phức hợp hạt từ-kháng thể

Hình 2.6: Các thiết bị sử dụng trong phương pháp IMS a) Nam châm DynaMag-2 b) Máy ủ lắc HulaMixer a) b)

 Lắc xoáy dung dịch hạt từ-kháng thể Salmonella cho đến khi cặn phân tán đều Hút 1 ml dịch vi khuẩn vào từng eppendorf 1,5 ml và thêm 2 l dịch phức hợp hạt từ-kháng thể vào (tương ứng 10 7 hạt) Trộn đều bằng máy HulaMixer trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

 Đặt các eppendorf vào giá mẫu của nam châm DynaMag-2, để yên 3 phút cho hạt từ tập trung vào thành ống Hút bỏ nước nổi

 Thêm 1 ml đệm rửa, trộn đều bằng máy HulaMixer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

 Đặt các eppendorf vào giá mẫu của nam châm DynaMag-2, để yên 3 phút cho hạt từ tập trung vào thành ống Loại bỏ đệm rửa sử dụng nam châm DynaMag-2 (lặp lại bước rửa 3 lần)

 Hoàn nguyờn phức hợp hạt từ-vi khuẩn trong 100 àl đệm PBS-0,1% Tween 20

 Phức hợp hạt từ-vi khuẩn được cấy trực tiếp lên môi trường thạch chọn lọc hay nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc

2.3.11 Phương pháp nuôi cấy chuẩn phát hiện Salmonella trong thực phẩm ISO

 Môi trường tiền tăng sinh nước peptone đệm

 Môi trường tăng sinh chọn lọc Rappaport-Vassiliadis

 Môi trường thạch chọn lọc XLD hoặc HE

 Môi trường thử nghiệm sinh hóa

 Kháng huyết thanh chẩn đoán

 Tiền tăng sinh: cho 25g mẫu đồng nhất vào túi ủ mẫu vô trùng, thêm 225 ml môi trường PBW, ủ 18-20 giờ ở 37 0 C

 Tăng sinh chọn lọc: hút 0,1 ml dung dịch sau tiền tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RV, ủ ở 42 0 C trong khoảng 18-20 giờ

 Phân lập: từ môi trường tăng sinh chọn lọc, dùng que cấy vòng ria lên môi trường thạch chọn lọc XLD và HE Ủ hộp thạch ở 37 0 C trong 18-24 giờ

Quan sát khuẩn lạc có trên đĩa thạch Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ là

Salmonella trên mỗi đĩa thạch cấy ria lên thạch sinh dƣỡng TSA ủ 18-24 giờ ở 37 0 C

 Xác nhận lại bằng các thử nghiệm sinh hóa, ủ 18-24 giờ ở 37 0 C

 Khẳng định bằng ngƣng kết với kháng huyết thanh

2.3.12 Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD hoặc HE

 Môi trường tiền tăng sinh PBW

 Hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella

 Môi trường thạch chọn lọc XLD hoặc HE

 Môi trường thử nghiệm sinh hóa

 Kháng huyết thanh chẩn đoán

 Tiền tăng sinh: cho 25g mẫu đồng nhất vào túi ủ mẫu vô trùng, thêm 225 ml môi trường PBW, ủ 18-20 giờ ở 37 0 C

 Thực hiện IMS nhƣ phần 2.3.10

 Cấy ria 20 àL dịch hoàn nguyờn trờn mụi trường XLD hoặc HE Ủ ở 37 0 C trong 18-24 giờ Quan sát khuẩn lạc có trên đĩa thạch Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ là

Salmonella trên mỗi đĩa thạch cấy ria lên thạch TSA ủ 18-24 giờ ở 37 0 C

 Xác nhận lại bằng các thử nghiệm sinh hóa, ủ 18-24 giờ ở 37 0 C

 Khẳng định bằng ngƣng kết với kháng huyết thanh

2.3.13 Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS tăng sinh trong môi trường chọn lọc RV

 Môi trường tiền tăng sinh PBW

 Hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella

 Môi trường tăng sinh chọn lọc RV

 Môi trường thạch chọn lọc XLD hoặc HE

 Môi trường thử nghiệm sinh hóa

 Kháng huyết thanh chẩn đoán

 Tiền tăng sinh: cho 25g mẫu đồng nhất vào túi ủ mẫu vô trùng, thêm 225 ml môi trường PBW, ủ 18-20 giờ ở 37 0 C

 Thực hiện IMS nhƣ phần 2.3.10

 Phức hợp hạt từ-vi khuẩn đƣợc cho vào 10 ml RV, ủ ở 42 0 C trong 18-24 giờ

Lấy 1 vòng loop cấy ria dịch hoàn nguyên trên môi trường XLD hoặc HE Ủ ở 37 0 C trong 18-24 giờ Quan sát khuẩn lạc có trên đĩa thạch Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella trên mỗi đĩa thạch cấy ria lên thạch dinh dƣỡng TSA ủ 18-24 giờ ở 37 0 C

 Xác nhận lại bằng các thử nghiệm sinh hóa, ủ 18-24 giờ ở 37 0 C

 Khẳng định bằng ngƣng kết với kháng huyết thanh

Hình 2.7: Kỹ thuật ria trên thạch [14]

2.3.14 Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS cấy trực tiếp trên thạch màu SCA

Cơ chế hiện màu của các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch màu dùng để phát hiện Salmonella hãng Pronadisa nhƣ sau:

 Thành phần 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-caprylate (Magenta-caprylate) trong môi trường cho phép sự phát hiện của enzym esterase Magenta- caprylate bị esterase thủy phân tạo 5-bromo-6-chloro-3-hydroxyindole và chất này bị oxi hóa tạo tủa 5,5’-bromo-6,6’-dichloroindigo có màu đỏ hồng

Sự hiện diện của enzym này ở Salmonella dẫn đến sự tạo thành khuẩn lạc màu đỏ hồng magenta trong suốt

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

CỘNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG

SALMONELLA SPP Để đánh giá khả năng ứng dụng của hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella spp tự chế tạo để phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm, trước hết chúng tôi tiến hành cộng hợp kháng thể lên hạt từ sử dụng các điều kiện đã đƣợc tối ƣu nhƣ nghiên cứu trước trên các lô kháng huyết thanh thương mại cũng như lô hạt từ khác [2] Thí nghiệm này đƣợc thực hiện nhằm tạo ra hạt từ phục vụ cho đề tài đồng thời đánh giá độ lặp lại của phương pháp tạo hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella spp Các giai đoạn của quá trình tạo hạt từ đƣợc tóm tắt nhƣ hình 3.1

Hình 3.1: Các giai đoạn tạo hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella

Hiện nay có hơn 2600 kiểu huyết thanh Salmonella nhƣng chỉ khoảng 10 kiểu huyết thanh thường gây ra ngộ độc thực phẩm: S Typhimurium, S Derby và S

Heidelberg (nhóm B); S Enteriditis (nhóm D); S Anatum và S Senftenberg (nhóm E); S Virchow, S Montevideo và S Infantis (nhóm C1); S Newport và S Hadar (nhóm C2-C3) [10],[16],[28]

Kháng huyết thanh thương mại O-poly A (OMA) và O-poly B (OMB) của hãng BD có đặc tính ngƣng kết với các nhóm Salmonella nhƣ sau:

- OMA ngƣng kết với Salmonella nhóm A, B, D, E, L

- OMB ngƣng kết với Salmonella nhóm C1, C2, F, G, H

Tiến hành kiểm tra khả năng ngƣng kết của kháng huyết thanh với các chủng vi khuẩn:

- Kháng huyết thanh OMA sẽ đƣợc kiểm tra khả năng phản ứng với các chủng vi khuẩn gồm: S Typhimurium (nhóm B), S Enteritidis (nhóm D1), S Anatum (nhóm E1), S Senftenberg (nhóm E4)

- Kháng huyết thanh thương mại OMB sẽ được kiểm tra khả năng phản ứng với các chủng vi khuẩn S Newport (nhóm C2-C3)

Kết quả cho thấy các kháng huyết thanh có khả năng ngƣng kết với các chủng trên Do đó để có thể phát hiện đƣợc tất cả các chủng Salmonella gây bệnh, cả hai loại kháng thể này sẽ đƣợc sử dụng để phủ lên hạt từ

Hình 3.2: Phản ứng ngưng kết kiểm tra kháng huyết thanh thương mại

48 Tiếp theo chúng tôi tiến hành tinh chế riêng kháng thể từ kháng huyết thanh OMA, OMB bằng cách cho 3 ml kháng huyết thanh qua cột Hitrap-protein A Kháng thể sẽ gắn lên protein A trên cột Rửa phần không bám trên cột Rửa giải phần kháng thể bám trên cột bằng dung dịch glycine 0,1 M; pH 2,5 (Hình 3.3) Để tránh trường hợp kháng thể chƣa kịp bám vào cột bị theo dòng đệm đi ra ngoài, phần không bám sẽ đƣợc tinh chế lại bằng cách cho qua cột lần 2

Hình 3.3: Tinh chế kháng thể kháng OMA qua cột Hitrap-protein A (lần 1)

Hàm lượng kháng thể sau tinh chế được xác định bằng phương pháp Bradford.

Theo kết quả định lƣợng, 3 ml OMA sau tinh chế thu đƣợc 5,9 mg kháng thể, 3 ml OMB sau tinh chế thu đƣợc 6,87 mg kháng thể

Bảng 3.1: Kết quả tinh chế kháng huyết thanh OMA và OMB

Lƣợng IgG thu đƣợc (mg) sau tinh chế

Lần 2 (cho phần không bám ở lần 1 qua cột) 1,16 mg 0,21 mg

3.1.2 Kiểm tra kháng thể sau tinh chế Độ tinh khiết của kháng thể sau tinh chế được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% - SDS Kết quả cho thấy sau giai đoạn tinh chế ái lực bằng cột Hitrap protein A, kháng thể đạt độ tinh khiết khá cao, phần lớn các protein tạp khác đã bị loại (Hình 3.4)

Hình 3.4: Điện di SDS-PAGE 12% kiểm tra kháng thể trước và sau tinh chế

Giếng 1: Kháng huyết thanh đa giá Salmonella không xử lí -mercaptoethanol Giếng 2: Kháng thể sau tinh chế không xử lí với -mercaptoethanol

Giếng 3: Thang chuẩn Giếng 4: Kháng thể sau tinh chế có xử lí với -mercaptoethanol Giếng 5: Kháng huyết thanh đa giá Salmonella có xử lí -mercaptoethanol

Do dưới tác động của pH thấp trong quá trình tinh chế, hoạt tính của kháng thể có thể bị ảnh hưởng nên tôi tiến hành kiểm tra lại hoạt tính ngưng kết của kháng thể

50 trước khi cộng hợp lên hạt từ Kết quả cho thấy kháng thể sau tinh chế vẫn có khả năng ngƣng kết với các chủng Salmonella đại diện của các nhóm B, C, D và E (Bảng 3.2)

Bảng 3.2: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau tinh chế

Nhóm Chủng đại diện Kháng thể Phản ứng ngƣng kết

B S Typhimurium Kháng OMA sau tinh chế

C2 S Newport Kháng OMB sau tinh chế

3.1.3 Cộng hợp kháng thể sau tinh chế lên hạt từ:

Kháng thể đƣợc cộng hợp đồng trị vào hạt từ theo các thông số đã đƣợc nhóm chúng tôi nghiên cứu tối ưu trước đó [2]:

- Dựng hạt từ mang nhúm –COOH cú đường kớnh 1 àm (Invitrogen) (7,0- 12,0x10 9 hạt/ml)

- Lƣợng khỏng thể dựng cộng hợp là 100 àg OMA và 100 àg OMB /1 ml hạt Thực hiện cộng hợp theo qui trình (phần 2.3.6) Kết quả cho thấy tất cả kháng thể đều cộng hợp lên hạt từ với hiệu suất là 100%

3.1.4 Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp lên hạt từ

Hoạt tính của kháng thể sau khi cộng hợp lên hạt từ đƣợc kiểm tra bằng phản ứng ngƣng kết trên lam kính với các chủng Salmonella thuộc các nhóm B, C, D và E Hạt từ không phủ kháng thể kháng Salmonella đƣợc xem là chứng âm Kết quả cho thấy hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella vẫn có khả năng tóm bắt tất cả các chủng

Salmonella thể hiện qua hình ảnh các hạt từ màu nâu co cụm tại tâm dung dịch trong khi các hạt từ đối chứng phân bố đều trong dung dịch (Hình 3.5)

Hình 3.5: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp Bảng 3.3: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp lên hạt từ

Phản ứng ngƣng kết với các loại hạt từ hạt từ-kháng thể BD hạt từ không gắn kháng thể

3.1.5 Đánh giá phức hợp hạt từ gắn kháng thể sau cộng hợp

Thí nghiệm này đƣợc thực hiện để kiểm tra khả năng tóm bắt các nhóm

Salmonella khác nhau của hạt từ-kháng thể trước khi tiến hành khảo sát khả năng ứng dụng của phức hợp hạt từ trên mẫu thực phẩm Đánh giá trên các chủng Salmonella đại diện cho các nhóm B, C, D và E nhƣ trên

52 Sử dụng 1 ml dịch vi khuẩn Salmonella ở các mật độ (10 3 , 10 2 cfu/ml) [2] Thực hiện IMS (phần 2.3.10) với 2 àl hạt từ gắn khỏng thể (tương ứng với 10 7 hạt từ) như nghiên cứu trước Cấy trải phức hợp hạt từ-vi khuẩn lên thạch TSA ở từng độ pha loãng Ủ 18-24 giờ ở 37 0 C Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa thạch

Kết quả cho thấy khi sử dụng 2 àl hạt từ gắn khỏng thể (tương ứng với 10 7 hạt từ) có khả năng tóm bắt S Typhimurium, S Enteritidis, S Anatum, S Senftenberg ở

10 2 cfu/ml, và S Newport ở 10 3 cfu/ml (Bảng 3.4) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước [2]

Các kết quả thu đƣợc từ các giai đoạn tạo phức hợp hạt từ cho thấy độ ổn định của các lô huyết thanh thương mại khác nhau, độ ổn định của vật liệu từ thương mại cũng nhƣ các xét nghiệm tạo hạt từ

Bảng 3.4: Khả năng tóm bắt các chủng Salmonella của hạt từ-kháng thể

Khuẩn lạc sau IMS và cấy trải trên XLD

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ ĐỂ PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

Hạt từ sau khi tóm bắt vi khuẩn Salmonella trong môi trường tiền tăng sinh được khuyến cáo sử dụng một trong hai phương pháp sau [14],[19]:

53 - Cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc Salmonella: áp dụng cho các mẫu chứa hệ vi sinh vật nền thấp, thời gian cho kết quả sớm hơn một ngày so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

- Tiếp tục tăng sinh chọn lọc trước khi cấy lên môi trường chọn lọc

Salmonella: giúp cải thiện sự phân lập Salmonella từ những mẫu chứa hệ vi sinh vật nền cao

Hình 3.6: Sơ đồ mô tả các bước thực hiện nuôi cấy

Trong đề tài, mẫu thực phẩm đƣợc chia thành 2 nhóm: không qua xử lý nhiệt (thường có hệ vi sinh vật nền cao) và nhóm qua xử lý nhiệt (thường có hệ vi sinh vật nền thấp) So sánh các phương pháp IMS kết hợp nuôi cấy phát hiện Salmonella với

54 phương pháp nuôi cấy chuẩn trên cả 2 nhóm mẫu (Hình 3.6) Các phương pháp được đánh giá bao gồm:

- Phương pháp IMS-XLD: sau IMS, phức hợp hạt từ-vi khuẩn sẽ được cấy ria trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD

- Phương pháp IMS-SCA: sau IMS, phức hợp hạt từ-vi khuẩn sẽ được cấy ria trực tiếp trên thạch chọn lọc SCA

- Phương pháp IMS-RV: tăng sinh chọn lọc trong môi trường RV, sau đó cấy ria trên thạch chọn lọc XLD

Các đánh giá đƣợc thực hiện dựa vào khả năng phát hiện và độ đặc hiệu của các phương pháp

3.2.1 So sánh và đánh giá phương pháp IMS cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm

Phương pháp IMS-XLD được thực hiện song song với phương pháp nuôi cấy chuẩn trên 43 mẫu thực phẩm không qua xử lý nhiệt và 77 mẫu qua xử lý nhiệt Độ đặc hiệu :

Kết quả về tỷ lệ nhiễu nền ở 2 nhóm mẫu nhƣ sau:

- Trên nền mẫu không qua xử lý nhiệt: cả 2 phương pháp có số mẫu nhiễu nền nhƣ nhau (28/43 mẫu)

- Trên nền mẫu qua xử lý nhiệt: số mẫu nhiễu nền theo phương pháp IMS- XLD là 48/77 mẫu và theo phương pháp nuôi cấy chuẩn là 47/77 mẫu

Kết quả cho thấy hầu hết các mẫu thịt tươi (thịt heo, thịt gà) và các mẫu qua chế biến có nguồn gốc từ thịt đều chứa hệ vi sinh vật nền cao

Mẫu không qua xử lý nhiệt Mẫu qua xử lý nhiệt

Thịt heo (mã số 3700) dương tính với Salmonella

Mẫu rau câu trái cây (mã số F720) âm tính với Salmonella Nuôi cấy chuẩn IMS -XLD Nuôi cấy chuẩn IMS -XLD

Nhiễu nền nhiều, Khuẩn lạc nghi ngờ

Nhiễu nền Nhiễu nền nhiều

Hình 3.7: Sự khác biệt nền mẫu của phương pháp IMS-XLD so với phương pháp

Bảng 3.5: Số lượng mẫu bị nhiễu nền của phương pháp IMS-XLD so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

Nền mẫu Số mẫu nhiễu nền (tỉ lệ %)

Nuôi cấy chuẩn IMS-XLD

Mẫu không qua xử lý nhiệt

Mẫu qua xử lý nhiệt (nw mẫu)

- Trên nền mẫu không qua xử lý nhiệt: phương pháp IMS-XLD có khả năng phát hiện Salmonella spp thấp hơn phương pháp nuôi cấy chuẩn

 Phương pháp nuôi cấy chuẩn: có 11 mẫu dương tính (7 mẫu thịt heo, 2 mẫu thịt gà, 1 mẫu thịt bò, 1 mẫu cải ngọt) và 32 mẫu âm tính với Salmonella

 Phương pháp IMS-XLD: có 7 mẫu dương tính (4 mẫu thịt heo, 1 mẫu thịt gà, 1 mẫu bò, 1 mẫu cải ngọt) và 36 mẫu âm tính với Salmonella

- Trên nền mẫu qua xử lý nhiệt: phương pháp truyền thống phát hiện 1 mẫu dương tính Salmonella spp trên nền mẫu bánh kem, trong khi IMS-XLD cho kết quả âm tính

Theo kết quả trên, ta thấy rằng phương pháp IMS-XLD không cải thiện được độ đặc hiệu và cho kết quả phát hiện Salmonella thấp hơn phương pháp nuôi cấy chuẩn

Phương pháp IMS sử dụng hạt từ gắn kháng thể đặc hiệu với Salmonella giúp tách và cô đặc vi khuẩn này từ 1ml dịch tiền tăng sinh (với hiệu suất liên kết

Salmonella vào hạt từ khoảng 20-30%), giúp tăng cơ hội phát hiện Salmonella spp trên môi trường thạch chọn lọc Tuy nhiên, khi mẫu chứa quần thể vi sinh vật nền cao, trong quá trình tiền tăng sinh các vi sinh vật này nhanh chóng đạt lượng cực đại trước, khiến cho Salmonella giảm tăng trưởng, thời gian phân chia kéo dài ra dẫn đến mật độ tế bào Salmonella thấp sau thời gian tăng sinh 18-24 giờ [22] Điều này đặc biệt nghiêm trọng trong trường hợp tế bào Salmonella còn bị tổn thương do nhiệt độ hay đông lạnh Vì vậy khi dịch tiền tăng sinh chứa lượng vi sinh vật nền cao thì các bước rửa vẫn không thể loại trừ hoàn toàn vi khuẩn bám không đặc hiệu trên bề mặt hạt từ và trên thành ống phản ứng [43] dẫn đến các trường hợp nền bị nhiễu Ngoài ra, khi sử dụng phương pháp IMS-XLD, do môi trường XLD có đặc tính chọn lọc vừa phải nên khi các vi khuẩn không đặc hiệu chiếm ƣu thế sẽ che lấp khuẩn lạc Salmonella spp gây ra hiện tượng âm tính giả Hiện tượng âm tính giả cũng có thể xảy ra trong các trường hợp tế bào Salmonella nhiễm ít và bị tổn thương nghiêm trọng Trong phương pháp

57 truyền thống, tuy lượng dịch tiền tăng sinh đưa vào bước tăng sinh chọn lọc chỉ là 0,1 ml nhƣng nhờ vào các thành phần chọn lọc, nhiệt độ ủ cao, thời gian ủ 24 giờ giúp hạn chế sự phát triển của các quần thể vi sinh vật nền đồng thời giúp vi khuẩn Salmonella tăng trưởng mạnh, tăng khả năng phát hiện chúng Các kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy phương pháp IMS-XLD có khả năng phát hiện Salmonella rất thấp phù hợp với các nghiên cứu đã đƣợc công bố [11],[15],[39]

Bảng 3.6: Kết quả phát hiện Salmonella của phương pháp IMS-XLD so với phương pháp nuôi cấy chuẩn Loại mẫu Mẫu (Mã số) Nuôi cấy chuẩn IMS-XLD

Mẫu không qua xử lý nhiệt

Mẫu qua xử lý nhiệt (77 mẫu) Bánh kem + -

3.2.2 So sánh và đánh giá phương pháp IMS qua tăng sinh chọn lọc trong RV và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm Độ đặc hiệu

Theo phương pháp IMS-RV, phức hợp từ được tăng sinh chọn lọc trong môi trường RV trước khi cấy lên XLD Phương pháp IMS-RV được thực hiện trên 43 mẫu thực phẩm không qua xử lý nhiệt và 67 mẫu qua xử lý nhiệt và so sánh với phương pháp nuôi cấy chuẩn Kết quả cho thấy phương pháp này giảm đáng kể sự phát triển của các quần thể vi sinh vật nền so với phương pháp nuôi cấy chuẩn (Hình 3.8)

Mẫu chƣa qua xử lý nhiệt Mẫu qua xử lý nhiệt

Thịt heo (mã số 17456) dương tính với Salmonella

Mẫu rau câu trái cây (mã số F720) âm tính với Salmonella

Nuôi cấy chuẩn IMS-RV Nuôi cấy chuẩn IMS-RV

Nhiễu nền, khuẩn lạc Salmonella có tâm đen đen

Salmonella có tâm đen Nhiễu nền Không nhiễu nền

Hình 3.8: Sự khác biệt nền mẫu của phương pháp IMS-RV so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

Kết quả về tỷ lệ nhiễu nền ở 2 nhóm mẫu nhƣ sau:

- Trên nền mẫu không qua xử lý nhiệt: phương pháp IMS-RV có số mẫu nhiễu nền thấp hơn (18/43 mẫu) so với phương pháp nuôi cấy chuẩn (28/43 mẫu)

59 - Trên nền mẫu qua xử lý nhiệt: phương pháp IMS-RV có số mẫu nhiễu nền thấp hơn (20/67 mẫu) so với phương pháp nuôi cấy chuẩn (41/67 mẫu)

Bảng 3.7: Số lượng mẫu nhiễu nền của phương pháp IMS-RV so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

Nền mẫu Số mẫu nhiễu nền (tỉ lệ %)

Nuôi cấy chuẩn IMS-RV

Mẫu không qua xử lý nhiệt

Mẫu qua xử lý nhiệt (ng mẫu)

Kết quả cho thấy phương pháp IMS-RV đã cải thiện được độ đặc hiệu và cho kết quả nhiễu nền giảm so với phương pháp nuôi cấy chuẩn trên cả nhóm mẫu chưa qua xử lý nhiệt và nhóm mẫu qua xử lý nhiệt

- Trên nền mẫu không qua xử lý nhiệt: phương pháp IMS-RV có khả năng phát hiện Salmonella spp cao hơn phương pháp nuôi cấy chuẩn

 Phương pháp IMS-RV: có 12 mẫu dương tính (8 mẫu thịt heo, 2 mẫu thịt gà, 1 mẫu thịt bò, 1 mẫu cải ngọt) và 31 mẫu âm tính với Salmonella

 Phương pháp nuôi cấy chuẩn: có 11 mẫu dương tính (7 mẫu thịt heo, 2 mẫu thịt gà, 1 mẫu thịt bò, 1 mẫu cải ngọt) và 32 mẫu âm tính với Salmonella

60 - Trên nền mẫu qua xử lý nhiệt: phương pháp nuôi cấy chuẩn phát hiện 1 mẫu dương tính Salmonella spp trên nền mẫu bánh kem, trong khi IMS-RV cho kết quả dương tính trên 1 mẫu thịt nguội

Bảng 3.8: Kết quả phát hiện Salmonella trên nền mẫu thực phẩm của phương pháp IMS-RV so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

Loại mẫu Mẫu Nuôi cấy chuẩn IMS-RV

Mẫu không qua xử lý nhiệt

Mẫu qua xử lý nhiệt (67 mẫu)

61 Các mẫu thịt tươi sống thường nhiễm nhiều quần thể sinh vật khác ngoài

Salmonella nhƣ E coli, Klebsiella, Enterobacter Trên những nền mẫu tạp nhiễm cao, quần thể vi sinh vật nền vẫn có thể lấn át sự phát triển của Salmonella trong môi trường RV gây ảnh hưởng đến khả năng phân lập và phát hiện Salmonella trên thạch chọn lọc Trên các mẫu đông lạnh, quá trình bảo quản có thể gây tổn thương các vi sinh vật trong mẫu [12], khiến việc phát hiện Salmonella với lƣợng thấp khó khăn hơn do khả năng phục hồi của Salmonella trong môi trường tiền tăng sinh sẽ kéo dài hơn bình thường Tác động này kết hợp với lượng vi sinh vật nền cao gây nên hiện tượng âm tính giả của phương pháp nuôi cấy chuẩn (Mẫu thịt heo đông lạnh, mã số 17450)

Phương pháp IMS sử dụng hạt từ gắn kháng thể đặc hiệu với Salmonella giúp tách và cô đặc vi khuẩn này từ dịch tiền tăng sinh Nhờ đó, khi đưa vào môi trường RV, lƣợng Salmonella tăng lên, đồng thời lƣợng vi sinh vật nền giảm xuống rất nhiều so với phương pháp truyền thống Vì thế, phương pháp này sẽ giúp tăng độ đặc hiệu và khả năng phát hiện Salmonella so với phương pháp nuôi cấy chuẩn Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước [39] Phương pháp IMS-RV cũng hiệu quả trong việc tập trung và phục hồi các Salmonella bị tổn thương trong quá trình bảo quản đông lạnh [12],[12] Đối với mẫu bánh kem, phương pháp truyền thống cho kết quả dương tính trong khi phương pháp IMS-RV cho kết quả âm tính Kết quả này là do mẫu bánh kem có độ béo cao, và các chất béo bao phủ bề mặt hạt từ làm hạn chế khả năng tóm bắt vi khuẩn của hạt từ và giảm tính từ của hạt dẫn đến mất hạt trong quá trình rửa [11],[12] Hiện tƣợng này cũng gặp phài khi phân tích mẫu dầu ăn và mẫu cá hồi có độ béo cao