PH NMOD UDtvnd Trong v n dé dinh dưỡng của con người, việc tăng cường sức khỏe hệ th ng tiêu hh a thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp r t hữu
PH NMOD UT NG QUAN TÀI LIEUNói về lịch sử của probiotic, chúng ta không thé không nhac d n Elie Metchnikoff
(1845-1916), một nhà khoa học công tác t i viện Pasteur Paris và đã từng nhận giải Nobel Y Học (1908) vì khám phá của ông về quá trình thực bào Ong n i ti ng với những nghiên cứu tiên phong trong lĩnh vực miễn dịch học và là người đầu tiên đã đưa ra liệu pháp chữa trị b ng các vi khu n lactic Probiotic bắt nguồn từ ngôn ngữ HyL pc nghĩa là vì sự s ng (for life) và ngày nay được d ng để gọi những vi sinh vậtc liên quan đ n những hiệu quả có lợi trên con người và động vat.
Packer là người đầu tiên đã sử dụng thuật ngữ probiotic theo ý nghĩa gần với định nghĩa được ch p nhận ngày nay Ông định nghĩa: Probiotic là những sinh vật và những ch t góp phần vào sự cân b ng hệ vi sinh vật đường ruột, nhưng ch t trong định nghĩa của Parker t ¡ mang ý nghĩa bao quát gồm cả ch t kháng sinh Fuller sau d đã cải ti n định nghĩa probiotic của Parker và định nghĩa | i: Probiotic là phần b sung vào thực ph m những vi sinh vats ng,t o những ảnh hư ng có lợi trên động vật chủ b ng cách cải thiện sự cân b ng hệ vi sinh vật đường ruột của vật chu
(Fuller, 1989) Sau đ , một định nghĩa tương tự về probiotic đã được đưa ra b i Havenaar và c.s., (1992): Probiotic là một hoặc hỗn hợp vi khu n có thé ton t i duoc khi dua vao co thé động vật hoặc con người và t o nên những tac động có ích trên vật chủ b ng cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật của vật chủ Gần đây hơn, một định nghĩa khác về probiotic cũng được đưa ra: Probiotic là những vi sinh vật s ng mà khi được tiêu thụ một lượng thích hợp, sẽ t o nên những hiệu quả t t trên sức khỏe của cơ thé chủ (Guarner và c.s., 1998).
C théni probiotic c rt nhiều lợi ch d i với sức khỏe, cũng dic rt nhiéu những nghiên cứu xung quanh các san ph m probiotic Sau đây là những lợi ch với sức khỏe con người:
— Kim hãm sự phát triển của các vi khu n, virus,n m có h 1, có khả năng chịu được axitd dày, mu i mật, có khả năng xâm chi m đường ruột, bám vào màng nhây ruột do đ h nch sự có mặt của vi sinh vật có h 1.
— Giúp phân giải các ch t hữu co phức t p có trong thức ăn thành những hợp ch t đơn giản và dễ tiêu h a hơn.
— Phòng và chữa một s bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét d dày.
— Ngăn chặn ung thư đường ruột, ung thư ruột k t Người ta th y r ng hiện tượng đột bi n xảy ra trong cáct bào ruột k t có thé gây ra ung thư và các amin thơm dị vòng hình thành trong quá trình ch bi n thức anc thể là tác nhân tiềm tang gây ung thư ruột k t Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh r ngvácht bào của vi khu n lactic có thể gan k t các amin dị vòng Ngoài ra, các vi sinh vật đường ruột có thể t o ra butyrate, một axit hữu cot ora ruột k t có tác dụng ức ch ho tt nh gây độc của nhiều hợp ch ttrongt bào ruột k t người (Abrahamse và c.s., 1999).
— R tnhiều nhà nghiên cứu dé xu t các ch ph m probiotic có tác dụng giảm cholesterol hiệu quả Tuy nhiên, co ch_ của hiệu ứng này vẫn chưa giải thích chắc chan Có hai giả thuy t để giải th ch eơch Mộttrongs đ là vi khu n có thé gắn hoặc k t hop cholesterol trực ti p vào mang t bào Thứ hai, enzyme thủy phân mu i mật k t hợp với mu i mật mà có nhiều kha năng k t hợp phân hủy cholesterol.
— Làm thay đ ic u trúc của vi sinh vật đường ruột theo hướng c_ lợi cho vật chủ Từ đ tăng khả năng miễn dịch và giảm phản ứng viêm.
C rt nhiéu cách giải th ch khác nhau về co ch_ tác động, nhưng hau h t các tài liệu về probiotic dé cập tới 3 khac nh chủ y u:
— Thứ nh t là lo i trừ vi sinh vật gây h 1b ng cách c nh tranh dinh dưỡng và vitr bam.
— Thứ hai là tác dung đ i khang với vi khu n gay h 1.
— Thứ ba là điều chỉnh sự miễn dịch của cơ thé vật chủ (Steiner, 2006).
C nh tranh lo i trừ là đặc t nh đ u tranh sinh ton điển hình của vi sinh vật Hình thức c nh tranh lo 1 trừ thường thy_ các vi sinh vật ruột là c nh tranh vi tr bám d nh Các vi sinh vat probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, kh a chặt các vi tr thụ cảm và ngăn can sự bám d nh của các vi sinh khác như E coli, Salmonella,
Mots n m men probiotic như Saccharomyces cereviese, Saccharomyces boulardii không chic nh tranh vị tr bám của các vi khu n khác mà còn gắn k t các vi khu n c roi (phan lớn là vi khu nc h i) thông qua các cơch thụ cảm mannose và đ y chúng ra khỏi vi tr bám d nh trên niêm m c ruột ( Czerucka va Rampal, 2002) Tuy nhiên, c nh tranh dinh dưỡng là hình thức c nh tranh kh c liệt nh t vì sự sinh sôi với một s lượng lớn của một chung vi sinh vật nào d la một sự đe dọa nghiêm trọng đ i với các loài khác về nguồn cơ ch t cho sự phát triển.
Hơn nữa, với c nh tranh lo 1 trừ, các vi sinh vat probiotic còn san sinh các ch t kim hãm vi khu n như lysozyme, hydrogen peroxide, lactoferrin cũng như một s axIf hữu cơ khác Các ch t nay gây tác động x u tới vi khu n gây h i chủ y u do sự giảm pH th p trong ruột (Conway, 1996).
Phản ứng miễn Cạnh tranh chất dinh đưỡng: Cạnh tranh loại trừ: các dịch được kích các sinh vat probiotic cạnh sinh vat probiotic khóa thich va hoat tinh tranh với các vi sinh vat gay chat cac vi tri thu cam do khang thể cua vật bệnh các chat đinh đưỡng quan đó loại trừ được các vi sinh chủ tăng lên trọng vật gây bệnh
Mang chan: nơi các sinh Gay bệnh: các vi sinh vật Cac vi sinh vat probiotic cu vat probiotic chiếm giữ gây bệnh va chất độc của ngụ và nhân lên trong ruỘt. các thụ cam trên be mặt chúng bám vào niêm mac ngăn cản sự bám dính và ruột, độc tố được loại trir và các thụ cảm trên ruột và phát triển của các vi sinh vật pha hủy chúng gây bệnh
Ruột là co quan miễn dịch lớn nht người và động vậtc vú Giữa hệ vi sinh vật trong ruột và hệ th ng miễn dịchc m i tương tác đặc th Khả năng miễn dịch thể dich và miễn dich t bào của hệ th ng miễn dịch đường ruột bi ảnh hư ng r t lớn b 1 sự cân b ng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999) Thông qua tương tác với hệ th ng miễn dịch ruột, các probiotic c thé điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chung gi ng hoặc các loài vi khu n probiotic (Dugat và c.s., 1999) Tuy nhiên, cơch tác động của probiotic đ ¡ với việc nâng cao ch t lượng miễn dịch vẫn còn chưa hiểu bi t day đủ.
Khái niệm về prebiotic đã được dé cập trong khoảng hơn 10 năm tr 1 i đây, trong d prebiotic được định nghĩa là một thành phan thực ph m không bị tiêu h a,c tác động t ch cực đ n cơ thé thông qua sự k ch thchc chọn lọc mộts lo ivi khu n s ng trong ruột k t (ruột già), và quad gia tăng sức khỏe cho cơ thé.
Prebiotic ban đầu được định nghĩa là các thành phần thực ph m không tiêu h a được mà ảnh hư ng một cách thuận lợi đ n vật chủ b ng cách k ch th ch chọn lọc sự tăng tru ng các ho t động của một hoặc mộts h nch của vi khu n trong ruột kt,quađ nâng cao sức khỏe vật chủ (Gibson và c.s., 1995).
TH C NGHIEM 2.1.Dadi mv th igian thực hi nDadi m: phòng thí nghiệm Bộ môn Cong nghệ Sinh hoc, Khoa kỹ thuật Hóa hoc, Trường D i Học Bách Khoa Tp.HCM.
Th i gian: thang 01 năm 2015 đ n tháng 06 năm 2015.
2.2 Vật lí u 2.2.1 itu ng nghiền c u D I1 tượng nghiên cứu là Saccharomyces boulardii.
Vi sinh vật chỉ thị E coli, Salmonella sp.
2.2.2 Vatliuv h ach t 2.2.21 Thì fb v d nợc
Thi tb e Tu m e Noih ptiệttr ng e May quang ph e Cân điện tử e Máy ly tam e May vortex e lúc y e Knhhiễn vi e pHk e Máy đo độ m
D nge Các dụng cụ thí nghiệm d ng trong các phòng thí nghiệm vi sinh như: ng nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, que c y, que trải,c c thủy tinh, giá đỡ ng nghiệm bình tam giác và ng đong, v.v
" Dung d ch Natri alginate (2.0, 2.5, 3.0 va 3.5 %) Natri alginate 20-35 g
= Nw cmu isinh lý (0,9% NaCl) NaCl 9,0g
= Mu i mật (Simulated Intestinal Fluid: SIF) Chu n bị như Gildas va c.s., (2009)
" Cac héa ch t khác Thu c nhuộm Crystal violet, Safranin.
= Môitrư ng Sabouraud: d ng để nuôi c ychủng Saccharomyces boulardii.
Glucose 40g Peptone 20g Nước c t 1000ml pH 5,6
= Môi trư ng Sabouraud — Agar: Môi trường Sabouraudb sung 2% agar để phan lập va giữ gi ng.
" Moitru ng LB Tryptone 10g Cao n m men 5g NaCl 5g
" DmPBS NaCl 8g KCI 02g Na›HPOx 12H20 | 44g KH2PO4 0,2g
=" D m photphat 0,IM NaH2PO4 5,17g Na2zHPO,4 809g Nước c t 1000ml pH 7
Qua các nghiên cứu về probiotic, các phương pháp nh m cai thiện những đặc t nh vnc cũng như tăng kha năng s ng s t của lợi khu n trong san ph m probiotic,chúng tôi đã chọn lựa và thi tk mộts th nghiệm như sau:
Gi ngn mmen Saccharomyces boulardii
Tang sinh gi ng S boulardii (trên môi trường Sabouraud)
Thu sinh kh it bàon m men S boulardii (ly tâm)
Khảo sát đặc t nh sinh học
Quan sát hình thái đ i thé, vi thé
Khảo sát đường cong sinh trư ng probiotic x4
Vig ib ng phương pháp s y
Khao sat kha nang chiu pH th p
Khả năng chịu mu 1 mật
Khả năng kháng vi khu n kiếm định
Khả năng chịu nhiệt độ cao Khả năng bám d nh phun Đánh giá ch ph m sau s y
Khảo sát néng độ Natri alginate
Khao sátt lệ ph 1 trộn Maltodextrin Khảo sát ảnh hư ng của prebiotic FOS
Khảo sát ảnh hư ng nhiệt độ không kh đầu vào Đánh giá khả năng cải thiện hay bảo toàn đặc t nh probiotic vas lượng n m men S boulardii trong điều kiện kỹ
2.3.1 cnghiéne uti nd 2.3.1.1 Kh os td ctnhsinhh c
- Kiém trat nh thuần và hình d ng n m men S boulardii.
- Khao sát đường cong sinh tru ng của n m men S boulardii nh m chon thời điểm thu nhận sinh kh ¡ cao nh t dé sử dụng cho các th nghiém sau. e Quan sath nh thỏi vith , ọ ith
- Quan sát vi thé n m men b ng phương pháp c y trải Hút Iml gi ng n m men S. boulardii từ ng nghiệm đã ho t hóa cho vào ng nghiệm chứa s n 9m] nước mu i sinh lý dah p khử tr ng để tỉ n hành pha loãng mẫu ra các nồng độ từ 101 đ n 107.
Hút 0,Iml dung dịch các độ pha loãng ph i vào đĩa petri chứa s n môi trường Sabouraud-agar đã h p khử trùng, ti n hành trải đĩa, đem ủ 32-372C từ 2- 3 ngày chờ khu n[ c mọc lên Quan sát và mồ ta vi thé (khu n1 c) clan m men
- Quan sat d 1 thé n m men b ng k nh hién vi Thuc hién tiéu ban giọt ép từ canh trường trong các môi trường Sabouraud lỏng có gi ng n m men đã tăng sinh Sau khi có tiêu bản giọt ép, thực hiện quan sát d 1 thén m men S boulardii.
- Dinh lượng ch t lượng gi ng b ng phương pháp c y trải Hut I ml dịch lên men và ti n hành pha loãng mẫu ra các nông độ 10°! đ n 107 Hút 0,1ml từ các độ pha loãng trên ti n hành c y trải trên đĩa petri, dem ủ 32-37°C chờ khu n1 c mọc lên.
Ghi nhận k t quả b ng cách d ms lượng khu nl e mọc trên dia Petri các nồng độ khác nhau Áp dụng công thức để tính toán:
Trong đ :n-S khu nl ctrung bình đ m được trên t t cả các đĩa Petri cùng một độ pha loãng. v - Thể tích dịch mẫu đem c y (0,1ml).
(Nguyễn Đức Lượng c.s., 2006) e Kh ửo sỏt du nợ cong sinh rư ngc an m men S boulardii.
- Nhân gi ngc p ltừ ng th ch nghiêng sang ng nghiệm chứa 10ml dịch môi trường Sabouraud, ủ trong 24h 37°C.
- Tin hành nhân gi ng c p 2 từ ng nhan gi ng c p 1 sang bình tam giác chứa 100ml dịch môi trường Sabouraud (thé tch c y 10%),ủ 372C Sau mỗi 3h nuôi c y, tỉ n hành c y trải để đ ms lượngn m men (CFU/ml).
- Vé đường cong sinh tru ng. e Thu sinh kh it bào.
- Chun bị các ng falcon vô trùng, cân falcon Hút gi ng vào falcon ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, d bỏ dich môi trường, sau đ rửa b ng nước mu i sinh lý và tỉ p tục ly tâm, tỉ n hành rửa 2-3 lần nữa Sau đ úp ngược ng ly tâm trên gi y lọc cho ráo Dem cân falcon chứa sinh kh It bào, suy ra kh i lượng sinh kh ¡ thu được mỗi falcon Thu phan sinh kh i t bàobámli đáy ng ly tâm để sử dụng cho thí nghiệm vi gói tỉ p theo.
2.3.1.2 Kh os td c tinh probiotic
- Kiểm tra khả năng ch ng chịu của n m men S boulardii trong các điều kiện cực đoan của pH th p, mu i mật và kha năng kháng | i các vi khu n kiểm định. e Kh osátkh năng! nt ic an m men S boulardii trong môi tru ng pH th p.
- Chung n m men S boulardii được nuôi c y trên môi trường Sabouraud.
- Ly tam dịch nuôi c y S boulardii sau 36h với t c độ 4000 vòng/phút trong 15 phút.
- Thu sinh kh i, rửa s ch 2 lần với nước mu i sinh lý.
- B sung 100ul dịch huyền ph vào 10ml dung dịch Sabouraud điều chỉnh pH các mức khảo sát (2,0; 2,5; 3,0), ủ 37°C Mẫu d i chứng sử dụng môi trường
- Theo thời gian theo dõi (0, 30, 60, 90, 120 phút), xác định % t bào n m men tồn t iso với mật độ t bao n m men ban đầu.S t bao xác định b ng phương pháp e Kh osátkh năng !† nt ic an m men S boulardii trong mdi tre ng mu im † MRS 0,3%.
- Chung n m men S boulardii được nuôi c y trên môi trường Sabouraud.
- Ly tam dịch nuôi c y S boulardii sau 36h với t c độ 4000 vòng/phút trong 15 phút.
- Thu sinh kh i, rửa s ch 2 lần với nước mu i sinh lý.
- B sung 100ul dịch huyền ph vào 10ml dung dịch MRS 0.3% mu i mật và mẫu đ ¡chứng không b sung mu i mật, ủ 375C.
- Theo thời gian theo dõi (0giờ, Igiờ, 2giờ), xác định % t bào n m men tôn t i so với mật đột bảo n m men ban dau S t bào xác định b ng phương pháp đ m giỏn ti p khu nèẽ c trờn mụi trường Sabouraud agar. e Kh osátkh năng kháng vì khu nki m đ nh
Ho tt nh kháng khu n được xác định b ng phương pháp duc lỗ.
C yn mmenS boulardii vào ng nghiệm chứa mỗi trường Saubourd lỏng, ủ 37C trong 24 giờ Ly tâm, thu nhận dịch n i.
- _ Điều chỉnh pH của dung dich thu nhận về pH 6,5.
- Môi trường LB — Agar đĩa được phủ lên I lượng vi khu n chỉ thị sao cho nông độ vi khu n chỉ đ t 108 CFU/ml Các chủng vi khu n chỉ thị gồm:
- - Đục các lỗ gi nge đường k nh 5 mm trên môi trường.
- =B sung 100 pl dung dịch nuôi c y chung S boulardii đã chu nbị trên vào gi ng th ch.
- Sau 24h quan sát vòng khang khu nt o thành Ho tt nh kháng khu n được tnhb ng đường k nh vòng kháng khu n AD.
AD = D—d (mm) với D: đường k nh vòng vô khu n (mm) d: đường k nh lỗ th ch (mm)- _ Thực hiện 3 lần lập | i. e Kh osátkh năng chu nhỉ td caoc an m men S boulardii
- Chung n m men S boulardii được nuôi c y trên môi trường Sabouraud.
- Ly tâm dịch nuôi c y n m men S boulardii sau 36 giờ Thu sinh kh i, rửa 2 lần với nước mu i sinh lý.
- B sung 100 ul huyền phùt bào vào ng nghiệm chứa 10 ml dung dịch Peptone pH 6.5.
- Các ng nghiệm này được ủ l5 phút các nhiệt độ 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70°C.
- Mau d i chứng cũng khảo sát các nhiệt độ 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70°C nhưng không ti n hành ủ.
- Thực hiện thí nghiệm 3 lần lặp | i.
Theo d ¡mật đột bào n m men S boulardii (log CFU/ml) sau khi xử lý nhiệt. e Kh osatkh năng bảm d nh vào niềm m cru tdu ng tiêu h ac an m men S. boulardn
Chu nb n m men: N m men S boulardii được nuôi c y thuần trong môi trường
Chu nb v tli u bám dnh: các mẫu ruột gà tươi rửa các đo n ruột non 3 lần với đệm PBS sao cho t t cả các vi sinh vật không còn trên bề mặt niêm m c ruột Rửa 1 lần với môi trường Sabouraud.
Ti n hành th bam d nh: phù dịch t bào đã chu nbị trên lên trên bé mặt niêm m c ruột U 90 phút trong tủ m (37°C) Rửa mẫu ruột lần 1 b ng nước mu i sinh lý 0,9% Rửa mẫu ruột 3 lần b ng đệm PBS Thu | y dịch rửa của cả 3 lần và trộn đều. Đms lượng t bao trong dich rửa để xác định khả năng bám d nh cua chủng nghiên cứu.
2.3.2 Vig ib ng phương ph ps y phun
* Mục đch:t och ph mvi g i từ vật liệu vi g 1 lựa chon b ng phương pháp s y phun nh m bảo toàn kha năng s ng và ho t tnh probiotic cua n m men S. boulardii.
T QUÁ VÀ THẢO LUẬN3.1.Kh os te cd ctnhsinhh ce aS boulardii 3.1.1 Quans thnhth id ith , vith
N mmen S boulardii được nuôi trên môi trường th ch Sabouraud, sau thời gian u
36h 379C Sau thời gian ủ, tỉ n hành kiểm tra các đặc điểm hình thái củan m men
S bouladii và ghi nhận được:
P ith : trang sữa, tròn nh n, b ng lỗi,c vòng đồng tâm, đường k nh dao động trong khoảng 1 — 3 mm.
Vi th : hình trứng, elip, nảy chéi 1 ph a (hình 3.1).
3.1.2 Kh os tdu ng cong sinh trư nge aS boulardii
T t cả vi sinh vật điều kiện nuôi c y tinh đều gồm 4 pha là pha lag, pha log, pha cân b ng và pha suy vong T y vào mục đ ch sử dụng ma chúng ta sẽ dừng nuôi c y nmmen thời điểm th ch hợp Vì th , việc xác định đường cong sinh tru ng của chúng là y ut r t cần thi t.
Mật độ S boulardii (log CFU/ml) Ww
Hình 3.2 Đường cong sinh tru ng cua S boulardii trên môi trường Sabouraud.
Pha lag k o dai trong khoảng 12 giờ đầu khảo sát giai do n nay, n m men dang th ch nghi với môi trường Sabouraud, mật độ thu được khoảng 8,33 (log CFU/ml).
Pha log k o dài khoảng 24 giờ (từ 12 giờ đ n 36 gid) Lúc này, n m men đã th ch nghỉ được với môi trường Do đ ,n m men sẽ sinh trư ng, phát triển m nh và đ t cực đi thời điểm 36 giờ với mật độ thu được 10.45 (log CFU/ml).
Pha cân b ng k o dải từ thời điểm 36 giờ đ n 60 giờ khảo sát Giai do n này,t bao dần đi vao tr ng thái cân b ng động nên mật độ giảm và mức n định.
Như vy,1! ktqu thu nh ndu c,m c ấch thu sinh kh in m men S boulardii d toch ph mvig ivab ử toàn ho tt nh, ch ng tụi ch n th i đi m lờn men thu nh nsinh kh ilath li m 36 gi
3.2 Kh os td ctnh probioticc an m men S boulardii Chung n m men S boulardii là chung vi sinh vật lành t nh (không phải chung vi sinh vật gây bệnh) thường được sử dung như nguồn vi sinh vat probiotic (Sanders và Klaenhammers, 2001) Tuy nhiên, đặc t nh probiotic thé hiện khác nhau các chỉ tiêu kiểm tra B ¡ vậy, trước khi sử dụng, chúng ta cần phải đánh giá các đặc t nh probiotic của n Chúng tôi đã ti n hành một s th nghiệm in vitro về các đặc tnh probiotie ph hợp với con người gồm: khả năng chịu axit trong dịch d dày nhân t o, chịu mu i mật, khả năng t o các hợp cht kháng khu n và giảm cholesterol.
3.2.1 Kh năng chu pH th p
Hau h t các probiotic sử dụng cho người hiện nay đều được đưa vao cơ thé thông qua đường tiêu h a Với giá tri pH th p (khoảng từ 2 — 3) của dịch vi được ti t ra mỗi ngày dit o ra sự cảntr lớn đ ivớis lượng lợi khu n vào ruột (Charteris c.s., (1998)) Do d , dé là một sản ph m probiotic thì chủng probiotic phải chịu được môi trường khắc nghiệt của pH th p.
= =#=pH 3 ưì 4 S =< pH 5,6 (đii ch ng) ®& 2
Hình 3.3 Khả nang s ng sót của S boulardii trong môi trường nuôi c y với các giá trị pH khác nhau theo thời gian
Từ hình 3.3 cho th y môi trường nuôi c y pH 2 và 2.5 ảnh hư ng r t lớn đ n khả năng s ng sót của S boulardii Tuy nhiên môi trường nuôi c y pH 3, S boulardii có thé th ch nghỉ vas ngs t được.
S liệu phụ lục 2 cho th y, trong môi trường nuôi c y với pH 2, với mật độ n m men ban dau là 8,43 + 0,1 (log CFU/ml), sau 30 và 60 phút s lượngt bào sụt giảm nhanh ch ng d t tương ứng với 6,98 + 0,12 và 4,22 + 0,15 (log CFU/ml) T i thời điểm 90 phút va 120 phút, n m men S boulardii ch t hoàn toàn Kha năng s ng sót của S boulardii khi xử lý môi trường với giá trị pH 2,5 cho k t quả không khác biệt so với môi trường pH 2 (p>0,05) Khi giá tri pH cua môi trường nuôi c y tăng lên 3, khả năng s ng của S boulardii c giảm nhưng vẫn duy trì mức 6,02 + 0,03 (log CFU/ml) thời điểm 120 phút So với nghiệm thức đ i chứng pH 5,6, s lượng nmmen ndinh mức 9,18 + 0,1 tới 9,25 + 0,06 tới thời điểm 60 phút Tuy nhiên tới thời điểm 90 phút, s lượng t bàon mmenc xu hướng tăng và tỉ p tục phát triển đ n 120 phút khảo sát (9,61 + 0,07 (log CFU/ml)).
K t quả thực nghiệm cho k t quả tương đồng với báo cáo của Fietto và c.s., (2004): chủng S boulardii có khả năng chịu đựng được pH 2 đ n 1 giờ Điều này có liên quan đ nsự s ng còn của Š boulardiikhin đi quad dày để đ n được k t tràng.
Ngoài ra, nghiên cứu cua Ashraf và c.s., (2009) ghi nhận môi trường nuôi c yt 1 pH 2 được xem là giá tri sàng lọc cho đặc t nh probiotic của các chung được sử dụng làm probiotic Mặc d_ tới thời điểm 90 phút và 120 phút, toàn bột bào n m men được khảo sát ch t hoàn toàn Nhung sự tiêu h a thức ăn trong môi trường axit d dày chỉ k o dai khoảng 1 giờ (Blanquet-Diot, Denis, Chalancon, Chaira, Cardot
& Alric, 2012) Do vậy, một lần nữa khang định k t quả nghiên cứu cua Ashraf va c.s., (2009) hoàn toàn đúng với n m men S boulardii.
Khả năng s ng sót của S boulardii không còn thời điểm 90 phút tr đi với môi trường nuôi e y pH 2 và 2,5 c thể được giải th ch như sau: khi môi trường xung quanht bào d ng pH th p dẫn đ n pH nội bào th p, sự khác biệt pH màng giảm đáng ké và làm giảm động lực bom proton Do đ ,t bào không thé t ng hợp ATP do m t đi khuynh độ điện h a Bên c nh d , quá trình axit hóa bên trong t bào cũng làm giảm ho t động của nhiều enzyme nh y cảm với axit và dẫn đ nr ilo n quá trình sinh t ng hợp DNA và protein (Guchte c.s., (2002)) Ngoài ra, theo
Presser và c.s., (1997), hiện tượng tồn t i nhiều anion khong lién k t cua cac axit hữu co cũng c thé gây ra việc liên k t ngẫu nhiên của nhiều phân tử diễn ra bên trongt bào, ảnh hư ng nghiêm trọng đ nho t động sinh lý cuat bao.
K t qua này cho th y, n m men S boulardii c kha nang s ng được trong môi trường pH th p (pH = 2) Điều nàyc ý nghĩa r t quan trọng đ i với các vi sinh vật probiotic vì mu n phát huy tác dung, chúng phải th ch ứng được với môi trường trong đường d dày — ruột, nơi mà độ pHr tth p.
T cácd li utrén, chúng tôi K tlu nr ng môi trwư ng nuôic ypH2và 22c nh hư ngr tl nd nkh năng s ng sótc aS boulardii Tuy nhiên n m men này hoàn toàn ch u đựư c môi írw ng nHÔic y pH 3su tth i gian 120 phút kh o sát.
3.2.2 Kh năng chu mu ¡ mật Mu i mật là mu 1 natri của các axit mật va chúng được t ng hợp từ cholesterol.
Mu i mật được t o thành trong gan, t ch trữ trong túi mật và vận chuyển qua ng mật đ n ruột non khi thực ph m được chuyển qua Mu i mật là steroid được sử dụng dé nhũ h a lipid Khi thực ph m được chuyển qua ruột, mu i mật nhũ h a mỡ vah p thu chúng qua thành ruột non.
Khả năng bám d nh của S boulardii trên biểu mô ruột D itu ng S lw ng ban dau S lu ng bám dínhD itu ng S lw ng ban dau S lu ng bám dính(log CFU) (log CFU) S boulardii 10,45 9,12
Với s lượngt bao n m men sử dụng ban dau là 10,45 log (CFU), sau khi ti n hành kiểm tra kha năng bám d nh của ching, k tquả bang 3.2 ghi nhận được: mặc d sau quá trình rửa với PBS,s lượngt bào S boulardii c giảm so với ban đầu (từ
10,45 giảm còn 9,12), nhưng n m men S boulardii c khả nang bám d nh t t vào niêm m c ruột đường tiêu h a Nhờ đ , chúng được sử dụng như một biotherapeutic để ngăn chặn bệnh tiêu chảy (Surawicz và c.s., 1989 và 2000) N m men có kha năng s ng và phát triển trong môi trường tương tự như trong đường tiêu hóa của lợn và gia cầm.
TmlIiktqu kh o sát các d c di m probiotic c ach ngn m men S boulardii cho th y ch ng S boulardii c kh năng t nt i trong môi tru ng pH 2 trong 60 ph t, môi tre ng ch a0,3% mu im 1c kh năng khang 1 i Salmonella sp va E. coli, chu du c nhỉ td cao lént i 70°C, c kh năng bam d nh t t vào niémm c ru tdu nợ tiêu h a, vac đ ctnh an toàn sinh h c Nh ng đi u này r t thích h p d danh giá S boulardii la ch ng n m men c tỉ m năng trong vic s dng làm probiotic V im cdchb ov t baon m men S boulardii, b o toàn du c các dc t nh probiotic và tang kh năng s ngs tc ach ng trong các đi uki n cực doanc a kUthu ts y phun, các ti n hành kh o sat thongs s y phun,nngd v tli uvig i, vatyl prebioticph h ps lành ng bu cti p theo.
3.3 Vig ib ng phương ph ps y phun 3.3.1 Kh os tn ng doch tvig i Natri alginate
Natri alginate r t được sử dung trong các phương pháp vi g 1 va là một ch t mang nh mg p phan bảo vệt bao n m men và nâng cao khả năng s ng của chúng trong các điều kiện cực đoan cũng như trong s y phun (Mortazavian và c.s., 2007) Tuy nhiên, để lựa chọn nông độ alginate t 1 ưu cho việc bảo vệ, chúng tôi ti n hành 2 khảo sát bao gồm: khả năng s ng s t của S boulardii vi g i trong môi trường pH 2 và nhiệt độ cao (55 — 70°C).
3.3.1.1 Kh o sát kh năng s ng sốt c aS boulardii vi g i trong môi tru ng nudic y pH 2
So với các phương pháp vi g i như polymer h a liên k t bé mặt, ngưng tu polymer h a, tach pha đông tu, phương pháp bao, ly tam, hai phương pháp vi g 1 nhỏ giọt va t o nhũ kỹ thuật don giản, thi t bị không phức t p, chi ph th p, quá trình t oh t và n định h t không m t nhiều thời gian, năng su t vi g i cao và bảo vệ t bào t t nhưng t nh khả thi trong công nghiệp không cao so với phương pháp vi g 1s y phun (Krasaekoopt và c.s., 2003) Tuy nhiên, nh m dad ngh a các phương pháp vi g i, khảo sat dé chi nhận các thông s giới h n chịu đựng điều kiện cực đoan của t bao n m men S boulardii nhưng dam bảo t nh kinh t , kỹ thuật đơn giản, kha năng bảo vệt bảo n m ment t trong các điều kiện cực đoan, chúng tôi chọn hai phương pháp nhỏ giọt và t o nhũ Sau khi ghi nhận được các giới h n chịu đựng điều kiện cực đoan của n m men, chúng tôi sử dụng phương pháp vi g is y phun nh m bước đầut och ph m synbiotie d ng bột.
Từ hình 3.7 và 3.8 cho th yt lệ s ng sót của S boulardii tăng dần khi gia tăng
Hình 3.7 Anh hư ng của pH 2 lênt lệs ng sót của S boulardii vi gói theo phương pháp t o nhũ phương pháp vi g it o nhũ, nồng độ alginate 2 và 2,5% cho th y không bảo vệ dugc t bào trong điều kiện pH th p (hình 3.7),t lệ s ng sót của S boulardii là 0% sau 90 phút xử lý va so sánh với nghiệm thức t bào tự do,t lệ s ng sót của S. boulardii không có sự khác biệt (p>0.05) các thời điểm khảo sát Với nồng độ
3%,t lệ s ng của S boulardii được cải thiện hơn, sau 30 phút trong môi trường nuôi c y pH 2, S boulardii vẫn còn s ng S]1,67 + 5,51 (%) so với 73,38 + 1,80 (%) t bao tu do T i thoi diém khao sat 60 phút,t lệ s ng cuat bào tự do chỉ con khoảng 63,92 + 1,88 (%) trong khi t bao vi gói alginate nồng độ 3%,t lệ s ng giảm r t ít khoảng 79,61 + 1/70 (%) Thời điểm khảo sát 120 phút, với nồng độ alginate d ng vig i3%t bào n m men vẫn còn s ng khoảng 64,57 + 2,25 (%) so với t bào không vi g ila 0% Tuy nhiên, khi tăng nồng độ alginate lên 3,5%,t lệ s ng của S boulardii không c xu hướng tang; so với nghiệm thức vi gói 3%,t lệ s ng của S boulardii không có sự khác biệt (p>0.05) sau 120 phút trong môi trường nuôi c y pH 2 (64,57 + 2,25 so với 7642 + 1,43%)(s liệu ghinhận phụ lục 5).
Hình 3.8 Anh hư ng của pH 2 lént lệs ng sót của S boulardii vi g i theo phương pháp nhỏ giọt.
Với phương pháp vi g i nhỏ giọt, hình 3.8 cho th y khi tăng nông độ alginate từ 0 tới 3%, t lệ s ng củan m men S boulardii cũng được cải thiện hơn Với nồng độ alginate d ng dé vi g i là 2% đã bảo vệ được t bào n m men khi so sánh vớit lệ s ng của n m men d ng tự do trong c ng điều kiện thời điểm 90 phút, alginate nông độ 2% giúp ting t lệ s ng sót của S boulardii lên đ n 5730 + 0,89 (%) so voit bao tự do là 0 % và giúp duy trìt lệ s ng khoảng 46,60 + 1,63(%) sau 120 phút (phụ lục P6) Tuy nhiên, hiệu su t bảo vệ là th p nh t so với nồng độ 2,5 va 3% 2 nông độ nàyt lệ s ngs ttăng lênr rệt và khác biệtc ý nghĩa (p0.05) về khả năng bảo vệt bao S boulardii so với nồng độ 3% (phụ lục 6).
D 1 với kỹ thuật vi gói t o nhũ, nồng độ 3.5% sẽ làm cho việc t oh t có kích thước nhỏ tr nênkh khăn vì khi gia tăng nông độ alginate sẽ làm gia tăng độ nhớt
V inghi mth c kh ửo sỏtkh năng b ov t bào H mmenc a vi gộdi trong mụi tre ng nudi c y pH 2n ng da alginate 3% cho hiu qu bov nmmenS. boulardiit tnh † c 2 phương pháp kh o sát N ngã nay du c apd ng cho các kh o sat ti p theo.
3.3.1.2 Kh osátkh năng song sot c aS boulardii vi gói ở nhỉ t độ cao nông độ alginate 2 va2,5%,sosdnht lệ s ng sót của S boulardii đuợc vi gói cả 2 phương pháp với d ng tự do không có sự khác biệt (p>0.05) các giá tri nhiệt độ khảo sát (hình 3.9 và 3.10).
Hình 3.9 Anh hư ng của nhiệt độ lên tỉ lệ s ng sót của S boulardii vi gói theo phương pháp t o nhũ trong 15 phút khảo sát
Anh hu ng của nhiệt độ lên tỉ lệ s ng sót của S boulardii vi g 1 theophương pháp nhỏ giọt trong 15 phút khảo sat
Khi tăng nồng độ alginate lên 3%, ca 2 phương pháp déu cho khả năng bảo vệ hiệu qua S boulardii (hình 3.9 và 3.10).T lệ s ng sót củan m men S boulardii vì gói nghiệm thức nhiệt 55 và 60°C đ t gần 96-98% so với nghiệm thức đ i chứng khoảng 85% và 59% tương ứng theo thứ tự liệt kê (phụ lục 7 và 8).
Nhiệt độ 65°C tr lên, được xem là nhiệt độ gây ra giai đo nch tcủat bào diễn ra r tnhanh ch ng.D ivớit bào tự do, nhiệt độ 65°C,t lệ s ng giảm xu ng đáng kế chỉ còn khoảng 50,45 + 2,18 (%) và 70°C là 49,75 + 1,10 (%) Tuy nhiên với nồng độ alginate 3% đã cải thiện t lệ s ng sót của S boulardii hiệu quả với cả 2 phương pháp vi g 1(đ t khoảng 77%), (phụ lục 7 và 8).
Với kỹ thuật t o nhũ, nồng độ alginate tăng lên 3,53% cho k t quả bảo vệ S. boulardii không khác biệt (p > 0.05) so với t lệ 3% cả các nhiệt độ khảo sát (hình 3.9) Cũng gi ng như sự giải thch thí nghiệm khảo sát trong môi trường nuôi c y pH 2, khi m ng lưới c u trúc bên trong h t d t d n mật độ nh t định thì việc gia tăng nông độ alginate cũng không làm tăng thêm mật độ liên k tm ng lưới bên trong.
Như vậy, với nghiệm thức khảo sát nhiệt độ cao, chúng tôi ghi nhận được kích
Chỉ khi tăng nông độ alginate,t lỆ s ng sót của S boulardii mới được cảithiện Mandal và c.s., (2006) cho r ng: sự khu ch tán của nước sẽ chậm hơn khi nông độ alginate gia tăng và do đ giảm m i nguy cơ về nhiệt đ i vớin m men S. boulardii Nguyén nhân là do nông độ alginate cao làm giảm s lượng và chiéu dài các khoảng tr ng trong c u trúc m ng lưới liên k t (Hannoun và c.s., (1986)).
Như v y, qua kh o sat thực nghỉ m cho th yn ng d alginate 3% c th b ov hiuqu t bào n m men S boulardii nhỉ td cao và không có sự khác bit c hai phương th c vi gÓI.
Tóm Ì iv ¡2 thínghi mkh osát đi u ki n cực đoan là môi tru ng nuôi c y pH 2 và nhỉ td cao:n ngd alginate 3% cho hi uqu bov h uhi u, giúp kh năng s ng sótc at baon m men Š boulardii tăng lên đảng k sov id ngt bào tự do. Đo đ, lựa ch nn ngd alginate 3% cho các kh o sat ti p theo diukinvig i S y phun.
3.3.2 Kh o sat til ph i trộn Maltodextrin
Với mục tiêu t och ph m vừa có ho t t nh probiotic đồng thời k o dài thời gian bảo quản, gi ngn m men là S boulardii được tỉ n hành vi g i với các nông độ Natri alginate khác nhau Sau đ sử dụng nồng độ Natri alginate t i ưu để tỉ n hành
Ss y phun với mật độ gi ngb sung khoảng 10,45 (log CFU/g) Chúng tôi quy t định chon Maltodextrin làm thành phan ch t khô ch nh, ngoai rab sung thêm FOS dé tăng khả năng s ngs tcủan m men § boulardii sau s y.
Dịch s y phunn uc hàm lượng ch t khô th p sẽ gây kh khăn cho quá trình s y.
Vì chúng có thé bám dính vào thành máy s y, vón cục trong buông s y và do đ ảnh hư ng không t td n quá trình s y và hiệu su t thu hồi sản ph m (Goula và c.s
2009) Đề khắc phục nhược điểm trên, chúng tôi ti n hành ph i trộn dịch s y phun với ch t trợ s y la Maltodextrin nh m làm tăng hàm lượng vật ch t khô trong dich s y, giúp cho quá trình s y diễn ra dé dàng hơn dé nâng cao hiệu su t thu hồi san ph m.
Bảng 3.3.M i liên hệ giữat lệ Maltodextrin trong dịch s y phun và các chỉ tiêu kiểm tra.
K tqu mtd probioticvad mdv c tính trên giá tr trung binhy in=3. abc là giá tr trung bình hàng, sự sai khác kýtực nghasai bi tv m tth ng kê (p
