3.1.Kh os te cd ctnhsinhh ce aS. boulardii 3.1.1. Quans thnhth id ith , vith
N mmen S. boulardii được nuôi trên môi trường th ch Sabouraud, sau thời gian u
36h 379C. Sau thời gian ủ, tỉ n hành kiểm tra các đặc điểm hình thái củan m men
S. bouladii và ghi nhận được:
P ith : trang sữa, tròn nh n, b ng lỗi,c vòng đồng tâm, đường k nh dao động
trong khoảng 1 — 3 mm.
Vi th : hình trứng, elip, nảy chéi 1 ph a (hình 3.1).
3.1.2. Kh os tdu ng cong sinh trư nge aS. boulardii
T t cả vi sinh vật điều kiện nuôi c y tinh đều gồm 4 pha là pha lag, pha log, pha
cân b ng và pha suy vong. T y vào mục đ ch sử dụng ma chúng ta sẽ dừng nuôi c y
nmmen thời điểm th ch hợp. Vì th , việc xác định đường cong sinh tru ng của chúng là y ut r t cần thi t.
12
11
10
—@— log CFU/ml
Mật độ S. boulardii (log CFU/ml) Ww
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
Th ¡gian (gi )
Hình 3.2. Đường cong sinh tru ng cua S. boulardii trên môi trường Sabouraud.
Hình 3.2 thé hiện:
Pha lag k o dai trong khoảng 12 giờ đầu khảo sát. giai do n nay, n m men dang
th ch nghi với môi trường Sabouraud, mật độ thu được khoảng 8,33 (log CFU/ml).
Pha log k o dài khoảng 24 giờ (từ 12 giờ đ n 36 gid). Lúc này, n m men đã th ch
nghỉ được với môi trường. Do đ ,n m men sẽ sinh trư ng, phát triển m nh và đ t cực đi thời điểm 36 giờ với mật độ thu được 10.45 (log CFU/ml).
Pha cân b ng k o dải từ thời điểm 36 giờ đ n 60 giờ khảo sát. Giai do n này,t bao dần đi vao tr ng thái cân b ng động nên mật độ giảm và mức n định.
Như vy,1! ktqu thu nh ndu c,m c ấch thu sinh kh in m men S. boulardii d toch ph mvig ivab ử toàn ho tt nh, ch ng tụi ch n th i đi m lờn men thu nh nsinh kh ilath li m 36 gi .
3.2. Kh os td ctnh probioticc an m men S. boulardii Chung n m men S. boulardii là chung vi sinh vật lành t nh (không phải chung vi
sinh vật gây bệnh). thường được sử dung như nguồn vi sinh vat probiotic (Sanders và Klaenhammers, 2001). Tuy nhiên, đặc t nh probiotic thé hiện khác nhau các chỉ tiêu kiểm tra. B ¡ vậy, trước khi sử dụng, chúng ta cần phải đánh giá các đặc t nh probiotic của n . Chúng tôi đã ti n hành một s th nghiệm in vitro về các đặc tnh probiotie ph hợp với con người gồm: khả năng chịu axit trong dịch d dày
nhân t o, chịu mu i mật, khả năng t o các hợp cht kháng khu n và giảm cholesterol.
3.2.1. Kh năng chu pH th p
Hau h t các probiotic sử dụng cho người hiện nay đều được đưa vao cơ thé thông
qua đường tiêu h a. Với giá tri pH th p (khoảng từ 2 — 3) của dịch vi được ti t ra
mỗi ngày dit o ra sự cảntr lớn đ ivớis lượng lợi khu n vào ruột (Charteris c.s., (1998)). Do d , dé là một sản ph m probiotic thì chủng probiotic phải chịu được môi trường khắc nghiệt của pH th p.
12
Ễ
= 10 o ` —
©
S8
ES 6 —s— pH 2,5
=
= =#=pH 3
ưì 4 S =< pH 5,6 (đii ch ng)
®& 2
=
0
0 30 60 90 120
Th igian (ph t)
Hình 3.3. Khả nang s ng sót của S. boulardii trong môi trường nuôi c y với các giá
trị pH khác nhau theo thời gian
Từ hình 3.3 cho th y môi trường nuôi c y pH 2 và 2.5 ảnh hư ng r t lớn đ n khả
năng s ng sót của S. boulardii. Tuy nhiên môi trường nuôi c y pH 3, S. boulardii
có thé th ch nghỉ vas ngs t được.
S liệu phụ lục 2 cho th y, trong môi trường nuôi c y với pH 2, với mật độ n m
men ban dau là 8,43 + 0,1 (log CFU/ml), sau 30 và 60 phút s lượngt bào sụt giảm
nhanh ch ng d t tương ứng với 6,98 + 0,12 và 4,22 + 0,15 (log CFU/ml). T i thời
điểm 90 phút va 120 phút, n m men S. boulardii ch t hoàn toàn. Kha năng s ng sót
của S. boulardii khi xử lý môi trường với giá trị pH 2,5 cho k t quả không khác biệt so với môi trường pH 2 (p>0,05). Khi giá tri pH cua môi trường nuôi c y tăng lên 3,
khả năng s ng của S. boulardii c giảm nhưng vẫn duy trì mức 6,02 + 0,03 (log CFU/ml) thời điểm 120 phút. So với nghiệm thức đ i chứng pH 5,6, s lượng nmmen ndinh mức 9,18 + 0,1 tới 9,25 + 0,06 tới thời điểm 60 phút. Tuy nhiên tới thời điểm 90 phút, s lượng t bàon mmenc xu hướng tăng và tỉ p tục phát triển đ n 120 phút khảo sát (9,61 + 0,07 (log CFU/ml)).
K t quả thực nghiệm cho k t quả tương đồng với báo cáo của Fietto và c.s., (2004):
chủng S. boulardii có khả năng chịu đựng được pH 2 đ n 1 giờ. Điều này có liên quan đ nsự s ng còn của Š. boulardiikhin đi quad dày để đ n được k t tràng.
Ngoài ra, nghiên cứu cua Ashraf và c.s., (2009) ghi nhận môi trường nuôi c yt 1 pH 2 được xem là giá tri sàng lọc cho đặc t nh probiotic của các chung được sử
dụng làm probiotic. Mặc d_ tới thời điểm 90 phút và 120 phút, toàn bột bào n m
men được khảo sát ch t hoàn toàn. Nhung sự tiêu h a thức ăn trong môi trường axit
d dày chỉ k o dai khoảng 1 giờ (Blanquet-Diot, Denis, Chalancon, Chaira, Cardot
& Alric, 2012). Do vậy, một lần nữa khang định k t quả nghiên cứu cua Ashraf va
c.s., (2009) hoàn toàn đúng với n m men S. boulardii.
Khả năng s ng sót của S. boulardii không còn thời điểm 90 phút tr đi với môi trường nuôi e y pH 2 và 2,5 c thể được giải th ch như sau: khi môi trường xung quanht bào d ng pH th p dẫn đ n pH nội bào th p, sự khác biệt pH màng giảm đáng ké và làm giảm động lực bom proton. Do đ ,t bào không thé t ng hợp ATP
do m t đi khuynh độ điện h a. Bên c nh d , quá trình axit hóa bên trong t bào
cũng làm giảm ho t động của nhiều enzyme nh y cảm với axit và dẫn đ nr ilo n
quá trình sinh t ng hợp DNA và protein (Guchte c.s., (2002)). Ngoài ra, theo
Presser và c.s., (1997), hiện tượng tồn t i nhiều anion khong lién k t cua cac axit hữu co cũng c thé gây ra việc liên k t ngẫu nhiên của nhiều phân tử diễn ra bên
trongt bào, ảnh hư ng nghiêm trọng đ nho t động sinh lý cuat bao.
K t qua này cho th y, n m men S. boulardii c kha nang s ng được trong môi
trường pH th p (pH = 2). Điều nàyc ý nghĩa r t quan trọng đ i với các vi sinh vật
probiotic vì mu n phát huy tác dung, chúng phải th ch ứng được với môi trường trong đường d dày — ruột, nơi mà độ pHr tth p.
T cácd li utrén, chúng tôi K tlu nr ng môi trwư ng nuôic ypH2và 22c nh hư ngr tl nd nkh năng s ng sótc aS. boulardii. Tuy nhiên n m men này hoàn toàn ch u đựư c môi írw ng nHÔic y pH 3su tth i gian 120 phút kh o sát.
3.2.2. Kh năng chu mu ¡ mật Mu i mật là mu 1 natri của các axit mật va chúng được t ng hợp từ cholesterol.
Mu i mật được t o thành trong gan, t ch trữ trong túi mật và vận chuyển qua ng mật đ n ruột non khi thực ph m được chuyển qua. Mu i mật là steroid được sử dụng dé nhũ h a lipid. Khi thực ph m được chuyển qua ruột, mu i mật nhũ h a mỡ
vah p thu chúng qua thành ruột non.
Trong môi trường ruột, dich mat và các enzyme tiêu h a tác động lên hệ vi sinh vật đường ruột. Trong d , dịch mật là y ut quan trọng nh t. Coch tác động của dịch mật d i với n m men là phan chia lớp đôi lipid khi màng ti p xúc với dich mật, từ
d làm m t đi sự nguyên v n của màng và hình thành hỗn hợp chuỗi phân tử. Trong dịch mật thì mu I1 mật là thành phan ch nh tac động lên n m men (Prieto va c.s.,
2004).
Ngoài ra, các chuyén động của ruột cũng anh hu ng tới khả năng cư trú của n m
men trong ruột. N ut bào n m men không bám được vào niêm m c ruột thì các
lo i chuyển động ruột sẽ nhanh ch ng dao thải chúng ra ngoài. Do đ , chủng probiotic cho người phải c kha năng kháng | i mu i mật để chúng c thé sinh tru ng, phát triển cũng như các ho t động trao đ ich t n định trong ruột non của
vật chủ.
D i với sinh lý co thé người, nông độ mật 0.3% được xem là nông độ trung bình hiện diện ruột non (Baron và c.s., 1997). Với nồng độ mật là 0,3%, chúng tôi ti n
hành khảo sat kha năng chịu đựng mu 1 mật của chung S. boulardii.
ray i)
= Muối mật
= Đối chứng
Mat độ 6. bowlardii [Log(CFU/ml)| â FN WwW kw OA ơlI Ow Ww
0 1 2
Thời gian (giờ)
Hình 3.4. Khả năng s ng sót của S. bowlard trong môi trường cób sung mu i mật
theo thời gian.
Từ hình 3.4 cho th y: sức s ng của n m men S. boulardii không bi ảnh hư ng
nồng độ mu i mật 0,3% vac xu hướng tăng nh. thời điểm ban dau là 9,21 + 0,12 (log CFU/ml), mật độ của S. boulardii gần như không đi thời điểm 1 giờ (9,22 + 0,16 (log CFU/ml)) vac tăng thời điểm 2 giờ (9,31 + 0,14). So sánh k t
quả của nghiệm thức cób sung mu i mật với nghiệm thức d i chứng (môi trường
MRS không b_ sung mu ¡ mật) hoàn toàn không có sự khác biệt về mặt th ng kê
(p>0.05) (phụ lục 3).
K t quả nay cũng ph hợp với k t quả nghiên cứu của Graff và c.s., 2008, các ch ph m sinh học hay probiotic sử dụng b ng đường u ng this lượng t bào lợi
khu n phải s ngs t trong đường tiêu hóa của vật chủ để t o ra các hiệu ứng có lợi của chúng và phải c khả năng chịu đựng được nồng độ mật lên đ n 1 hoặc 2%. Vì vậy, trong thực t hiéu qua của probiotic là phụ thuộc không chỉ vào liều lượng sử dụng, mà còn vào s lượng lợi khu n tồn t ¡ được thông quad dày - ruột để đ t
được k t tràng.
Prieto và c.s., (2004) báo cáo r ng, nguyên nhân mu i mật có thé gây h i cho các vi sinh vật là do chúng ngăn cản nhiều cơch bên trongt bào bao gồm gây ra hiện
tượng stress mức độ gen như quá trình sinh t ng hợp mang hay trong quá trình sửa chữa DNA của vi sinh vật.
Đề giải thích cho khả năng kháng được mu i mật clan m men và một s chung vi khu n lactic, Cotter và c.s., (2003) báo cáo r ng: n m men và vi khu n có nhiều cách để điều khiến và ho t động chuyên biệt dé lo i bỏ những tác nhân gây stress t bào. Các tiểu phan của hệ th ng ATPase FOF1 nội mang giúp đ y nhanh quá trình
bơm proton từt bào ch tb I1 lực d y proton. Ngoài ra, một s chủng vi khu n có
được những hệ th ng chuyên biệt dé lo i thay mật (Begley và c.s., 2005). Sau khi nhận được tín hiệu từ màng do các thụ thé của Histidine Protein Kinase (HPK) dẫn truyền (Stock và c.s., 2000), operon 2CRS cho ph p vi khu n nhận bi t một cách
nhanh ch ng và đáp tng! 1 sự thay d i trong môi trường. Hon th nữa,n m men và mots dong vi khu n có những enzyme làm bi n d ic u trúc của mu I1 mật. Các
enzyme thủy phân mu i mật (Bile Salt Hydrolase: BSH) thông thường là những
enzyme nội bào xúc tác quá trình thủy phân các liên k t amide giữa steroid và chuỗi bên amino axit. Với những co ch nêu trên có thể chưa lat t cả các cơch xảy ra
t bao n m men va vi khu n lactic, tuy nhiên cũng đã giải th ch được nguyên nhân xảy ra hiện tượng kháng mu 1 mật.
K tqu thực nghỉ m cho k tlunr ng:t bào n m men S boulardiic kh năng kháng du cn ngã mu im † là 0,3%.
3.2.3. Kh năng kh ng vi khu nki md nh
Một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tiềm nang probiotic của một chủng
vi sinh vật là kha năng t o ra các hợp ch tc t nh kháng khu n trong quá trình sinh
tru ng và phát triển nh m tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh khác (Quách Đức T nh,
2013). K t quả khảo sát khả năng kháng khu n của S. boulardii theo phương pháp khu ch tán trên th ch được trình bày trong bang 3.1 và hình 3.5.
Bang 3.1. Khả nang kháng khu n của S. boulardii d ng tự do Ch ng Dư ngknh v ngkh ng khu n(mm)
Salmonella sp. E. coli S. boulardii 17,67 + 0,16 1533 +04
Hình 3.5. Ho t tính khang khu n của S. boulardii với các vi khu n chỉ thị
Tus liệu bảng 3.1 cho th y: S. boulardiic khả năng khang Salmonella sp. và
E. coli. Co ch liên quan tới kha năng kháng khu n của S. boulardii c thé được
giải th ch do khả năng sinh ra các enzyme trong quá trình lên men sẽ ức ch hoặc vô hiệu h a được độc t enterotoxicity của E. coli (Dias và c.s., 1995). Ngoài ra, n m menc hữu ch trong việc: k ch ho t một s_ enzyme trong nh m disaccharidaza (surcraza, lactaza, matltaza) lam tăng khả năng tiêu h a đường đa (Buts và c.‹s., 1986), trung hòa một s lo i độc ft của vi khu n (Castagliuolo và c.s., 1998), k t
dnh mots vi khu n gây bệnh c roi bám vào biéu mô ruột nhờ các thụ quan
mannose va lo 1 chúng ra ngoài theo phan (Czerucka và c.s., 2002), k ch th ch hệ
miễn dich va tăng cường sản xu t IgA (Qamar và c.s., 2001).
K t quả này cũng ph hợp với các báo cáo về khả năng sinh bacteriocin và các hợp ch t tương tự bacterocin của chủng S. boulardii nh m ngăn chặn sự phát triển của
các chủng c h inhư Salmonella sp. (16mm), E. coli (15mm) (V. V. Jothi và c.s., 2012). Dod , ch ng S. boulardiic ti m năng probiotic cao.
3.2.4. Kh năng ch u nhi t độ cao D với sinh vật được sử dụng làm probiotic, khả năng s ng trong ph m vi nhiệt độ
rộng c y nghĩa không nhiều khi chúng hiện diện trong đường tiêu h a của sinh vật chủ, nhưng | ir t quan trọng khi chúng ton t i trong điều kiện bảo quản. Đây là một tiêu ch về mặt kỹ thuật cần rà soát để c thể đưa ra một ch ph m sinh học.
Nh m mục đ ch kiểm tra kha năng chịu nhiệt độ cao của n m men S. boulardii
trước khi tt n hành t och ph mb ng vig 1s y phun, chúng tôi ti nhànhb_ trí
các nghiệm thức khảo sát khả năng s ng sót của chúng b ng cách tăng dần nhiệt độ
xử lý từ nhiệt độ sinh lý bình thường đ n nhiệt độ được xem là gây ch tt bao vi sinh vật nói chung (từ 37 — 70°C).
— oO J
mDLi chung m Sau 15 phút
Mật độ S. boulardii (log CFU/ml) oOo ` WwW fF UN DN DW WO
37 45 50 55 60 65 70
Nhi t độ °C)
Hình 3.6. Anh hư ng của nhiệt độ lên khả năng s ng sót của S. boulardii d ng tự do
Mật độ của S. boulardii 45 và 50°C không khác biệt so với nghiệm thức d i chứng (37°C) về ý nghĩa th ng kê (p > 0,05) sau 15 phút xử lý nhiệt. Khi nhiệt độ được tăng lên 55°C, sau 15 phút khả năng s ng sót của S. boulardii giảm từ 9,25 + 0,1 xu ng 8,19 + 0,12 (log CFU/ml). T i mức nhiệt độ 60°C, mật đột bào n m men mau đ i chứng là 9,20 + 0,16 giảm xu ng còn 6,16 + 0,08 (log CFU/ml).
nhiệt độ 65 và 70°C, kha năng s ng sót của chúng chi còn hơn 4,2 (log CFU/ml)
(hình 3.6).
Tuy nhiên, khả năng s ng sót giữa 2 nghiệm thức 65 và 70°C không c sự khác biệt nhau (p > 0,05) (4,61 + 0,33 so với 4,22 + 0,11 dog CFU/ml)) sau 15 phút khảo sát
(phụ lục 4). Những k t quả trên cũng đồng quan điểm với k t quả của Labuza, Santos và Roop (1970) , cho th y dưới tác dụng của nhiệt 65 và 70°C, cdc t bào n m men bị ch t nhanh ch ng so với nhiệt độ 60°C. Khả năng s ng s t của S.
boulardii 50, 60 va 70°C trong khoảng thời gian ngăn (t i đa 1,5 gid) lar t quan
S. bowlardii trong vi g 1 VỚI điều kiện nhiệt độ đầu vào khoảng 100°C. Từ các nghiên cứu tham khảo, chúng ta nên duy trì nhiệt độ đầu ra gần 50°C dé dam bảo sự s ng còn của S. boulardii trong vig is y phun, cũng như vẫn có thé t o ra một môi
trường khô với độ m dưới 10%.
Như v y, ch ngn m men S. boulardil là ch ngn m men chu ấư c nhỉ tả cao. V th, ch ng dư cd ngã toch ph m probiotic b ng vig is y phun. Honn a, da đ ¢ tiéu chu n lam t probiotic, ch ngn m men s d ng ph ic kh năng bam dnht t vào nêm m cdu ngtiêuh ad h tr ru ttiêu di các vì khu n gây h i.
3.2.5.Kh năngb mdnhc aS. boulardii Khả năng bam dnh vào niêm m c ruột đường tiêu hóa của t bao n m men S.
boulard là tiêu chí quan trọng khi sử dụng chúng làm sản ph m probiotic. K t qua
khảo sát khả năng này được thé hiện bảng 3.2.