Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực ở staphylococcus aureus của cao chiết tô mộc (Caesalpina sappan L.)

-

NGUYỄN BẢO NGHI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH BIOFILM VÀ ĐỘC LỰC Ở STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA CAO CHIẾT TÔ MỘC

MASTER THESIS

HO CHI MINH CITY, 7th 2022

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 13 tháng 07 năm 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1 TS Huỳnh Ngọc Oanh (Chủ tịch)

2 TS Hoàng Mỹ Dung (Thư kí) 3 TS Nguyễn Tiến Dũng (Phản biện) 4 TS Phan Thị Huyền (Phản biện) 5 TS Nguyễn Thị Lệ Thủy (Ủy viên)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Bảo Nghi MSHV: 1970509

Ngày, tháng, năm sinh: 13/03/1997 Nơi sinh: Thừa Thiên-Huế Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực ở Staphylococcus aureus của cao chiết Tô mộc (Caesalpina sappan L.)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực của cao chiết Tô mộc ở S

aureus với các nội dung như sau :

- Đánh giá khả năng ức chế S aureus của cao chiết Tô mộc

- Đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của cao chiết trên S aureus - Đánh giá khả năng làm giảm độc lực của S aureus bằng cao chiết

- Đánh giá con đường ức chế điều hòa sự hình thành biofilm và giảm độc

lực ở S aureus của cao chiết

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/09/2021

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/06/2022

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): 1 TS Nguyễn Thị Lệ Thủy

2 PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

LỜI CẢM ƠN

Luận văn là bước ngoặc quan trọng trong hành trình 2 năm học tập cao học Đây là nơi vận dụng những kiến thức đã học vào trong thực hành nghiên cứu thực tế, là một nền tảng và kỹ năng cần thiết để một học viên nâng cao trình độ và kinh nghiệm trong lĩnh vực Công nghệ sinh học

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Trường đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, đặc biệt là cô PGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã giúp đỡ, chỉ bảo trong suốt thời gian làm luận văn

Tiếp theo là lời cảm ơn chân thành đến Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này Cảm ơn tập thể các anh chị thuộc phòng Công nghệ sinh học Y dược, đặt biệt là sự hỗ trợ hết mình, tận tình hướng dẫn và sự đồng hành của chị TS Nguyễn Thị Lệ Thủy trong khoảng thời gian này

Cảm ơn các bạn, anh, chị trong lớp cao học đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ những buồn vui và giúp đỡ trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, đã luôn yêu thương, động viên, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cũng như là chỗ dựa vững chắc trong suốt thời gian học tập

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 07 năm 2022

Nguyễn Bảo Nghi

TÓM TẮT

Nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính ức chế biofilm và độc lực ở S aureus của

2 loại cao chiết Tô mộc với 2 dung môi khác nhau là dichloromethane và methanol, được kí hiệu tương ứng là TMA và TMB Ghi nhận được khả năng ức chế vi khuẩn của hai cao chiết tương đương nhau với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 125 g/mL Dựa trên tỉ lệ MBC/MIC ≤ 4, các cao chiết này được xem là hợp chất diệt khuẩn Đánh giá khả năng ức chế hình thành

biofilm của các cao chiết cho thấy tại giá trị MIC khả năng hình thành biofilm của S

aureus chỉ còn 20% so với không xử lí ở cả 2 mốc thời gian khảo sát là 24 và 48 giờ

Ở nồng độ thấp hơn (1/2 MIC), mức độ biofilm hình thành khi được xử lí với hai loại cao chiết giảm với khoảng 50% biofilm hình thành Ở nồng độ 1/5 MIC, khả năng ức chế thấp hơn với hơn 80% biofilm được hình thành Kết quả đánh giá thành phần trong chất nền biofilm cho thấy sự thay đổi chính khi được xử lí với cao chiết Tô mộc là sự giảm DNA ngoại bào (eDNA), dẫn đến cấu trúc biofilm bị ảnh hưởng Nguyên nhân của việc thiếu hụt eDNA trong chất nền biofilm có liên quan đến sự tác động

của các cao chiết lên yếu tố SigB Mức độ biểu hiện gen sigB ở các nhóm được xử lí

với cao chiết Tô mộc cho thấy giảm đáng kể so với đối chứng không xử lí

Ở phần đánh giá khả năng ức chế độc lực trên S aureus, ghi nhận được sự

ức chế lan tỏa khuẩn lạc, giảm khả năng phân giải máu delta, giảm hoạt tính lipase và giảm hình thành sắc tố khi được xử lí với các cao chiết TMA và TMB ở nồng độ xử lí 1/2 MIC và 1/5 MIC Đánh giá biểu hiện gen cho thấy tác động chính của các

cao chiết là lên gen sigB, hld và psm Như vậy, dựa trên kết quả đánh giá biofilm cũng như độc lực trên S aureus, các cao chiết có khả năng ức chế hình thành biofilm

và giảm độc lực chủ yếu dựa vào tác động lên yếu tố điều hòa SigB So sánh giữa 2 cao chiết cho thấy, hiệu quả ức chế của TMA được ghi nhận hiệu quả hơn TMB ở

cùng nồng độ xử lí trên biofilm lẫn độc lực

SUMMARY

This study investigated the activity of inhibition in biofilm formation and

virulence in Staphylococcus aureus of Caesalpina sappan L extracts The plant was

extracted into two different solvents, dichloromethane and methanol, denoted as

TMA and TMB, respectively The result showed that the minimum inhibitory

concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) values of both extracts were 125 g/mL, which means that these extracts were considered as bacteriocides based on the ratio of MBC/MIC≤ 4 According to the biofilm inhibition results, both TMA and TMB extracts exhibited great activity when the biofilm

formation in S aureus was reduced to around 20% at 24h and 48h time points At 1/2

MIC, the formation of biofilm decreased to 50% as treated with both extracts at surveyed times The inhibition at 1/5 MIC values was lower, by 80 percent at both extracts and time points The main change in the extracellular component in biofilm was extracellular DNA (eDNA) when treated with the extracts, leading to the disruption of biofilm structure The effect of the extracts on the SigB factor was the main cause of the eDNA shortage in biofilm structure There was an extensive

decrease in gene expression of sigB in the treated groups, making it clearly different

from the control group

In terms of the virulence inhibition in S aureus, either TMA or TMB dedicated

the inhibitory activities on colony spreading, -hemolysis, lipase secretion, and staphyloxanthin formation when treated at 1/2 MIC and 1/5 MIC values The evaluation of gene expression revealed that the main effects of the extracts were on

the sigB, hld, and psm genes Thus, based on the results of inhibition of biofilm and virulence in S aureus, the key target of the bioactivity of C sappan L extracts was

the SigB factor when they affected the biofilm formation as well as the virulence expression As compared, the inhibitory effect of TMA was found to be more effective than that of TMB at the same concentration of treatment on biofilm and

virulence formation

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Lệ Thủy và PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Các nội dung nghiên cứu, kết quả đều là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong bảng biểu phục vụ cho phân tích, nhận xét, đánh giá được tác giả thu thập từ các nguồn tài liệu khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo Luận văn là một phần của đề tài thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM Luận văn được cấp toàn bộ kinh phí và thực hiện tại phòng CNSH Y dược (Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM) Do đó, kết quả luận văn thuộc sở hữu của Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM

Nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về luận văn của mình Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về Staphylococcus aureus 3

1.2 Khả năng gây bệnh và độc tố liên quan của S aureus 3

1.3 Tình trạng kháng kháng sinh của S aureus 5

1.4 Cơ chế kháng kháng sinh của S aureus 7

1.4.1 Cơ chế kháng kháng sinh nội sinh 7

1.4.2 Cơ chế kháng kháng sinh thu nhận 8

1.5 Sự hình thành và vai trò của màng sinh học đối với S aureus 10

1.5.1 Giới thiệu về biofilm và vai trò với S aureus 10

1.5.2 Quá trình hình thành biofilm và các yếu tố độc lực 12

1.5.3 Các con đường điều hòa liên quan đến sự hình thành biofilm 16

1.5.3.1 Các yếu tố điều hòa chính liên quan đến sự hình thành biofilm và độc lực ở S aureus 16

1.5.3.2 Các yếu tố điều hòa khác liên quan đến sự hình thành biofilm 20

1.5.4 Các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm S aureus 22

1.6 Ứng dụng dược liệu trong ức chế hình biofilm ở vi khuẩn 23

1.7 Giới thiệu về cây Tô Mộc 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Cao chiết Tô mộc 28

2.1.2 Chủng vi khuẩn nghiên cứu 28

2.1.3 Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Đánh giá khả năng ức chế S aureus của cao chiết Tô mộc 29

2.2.2 Đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của cao chiết Tô mộc 31

2.2.3 Xác định con đường ức chế biofilm của cao chiết tiềm năng 31

2.2.3.1 Xác định thành phần EPS trong biofilm 32

2.2.3.2 Xác định eDNA và protein trong biofilm 32

2.2.3.3 Kiểm tra sự biểu hiện của gen liên quan đến sự hình thành biofilm 33 2.2.4 Đánh giá tác động của cao chiết Tô mộc lên độc lực của S aureus 35

2.2.4.1 Đánh giá khả năng tan huyết 35

2.2.4.2 Đánh giá khả năng ức chế lan tỏa khuẩn lạc (colony spreading) của cao chiết Tô mộc 36

2.2.4.3 Đánh giá khả năng phân giải lipid 37

2.2.4.4 Đánh giá khả năng sinh sắc tố 38

2.2.4.5 Đánh giá biểu hiện gen độc lực 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Đánh giá khả năng ức chế S aureus của cao chiết Tô mộc 40

3.2 Đánh giá khả năng ức chế và cơ chế tác động của cao chiết Tô mộc lên sự hình thành biofilm của S aureus 41

3.2.1 Khả năng ức chế hình thành biofilm của các cao chiết Tô mộc 41

3.2.2 Đánh giá các thành phần biofilm sau khi được xử lí với cao chiết 43

3.2.3 Kết quả đánh giá hiểu hiện gen liên quan đến hình thành biofilm 45

3.3 Kết quả đánh giá khả năng ức chế độc lực và cơ chế tác động của cao chiết Tô mộc lên S aureus 49

3.3.1 Kết quả đánh giá hiện tượng liên quan đến độc lực ở S aureus 49

3.3.2 Đánh giá biểu hiện gen liên quan độc lực ở MW2 53

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Kiến nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 68

Bảng 2.2 Trình tự mồi của các gen độc lực ở S aureus dùng trong đánh giá mức độ

biểu hiện gen bằng phương pháp qPCR 39

Bảng 3.1 Giá trị MIC và MBC của cao chiết Tô mộc trên các chủng S aureus 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình hình thành biofilm 14

Hình 1.2 Tổng quan các con đường điều hòa chính trong quá trình hình thành biofilm ở S aureus 17

Hình 1.3 Con đường điều hòa cảm ứng mật độ agr 19

Hình 1.4 Mô tả thân, lá, ruột và trái ở cây Tô mộc 26

Hình 2.1 Mô tả thí nghiệm xác định MIC 30

Hình 3.1 Khả năng ức chế hình thành biofilm ở S aureus 42

Hình 3.2 Kết quả nhuộm WGA kiểm tra EPS trong lớp biofilm thu nhận ở 24 và 48 giờ sau khi được xử lí với các cao chiết Tô mộc 43

Hình 3.3 Tỷ lệ protein ngoại bào trong lớp bioflm giữa các nhóm xử lí cao chiết Tô mộc so đối chứng không xử lý ở các mốc thời gian 24 và 48 giờ 44

Hình 3.4 Kết quả đánh giá eDNA trong lớp biofilm giữa nhóm được xử lí với cao chiết Tô mộc và đối chứng ở các mốc 24 và 48 giờ tại nồng độ khác nhau 45

Hình 3.5 Kết quả đánh giá biểu hiện gen liên quan đến hình biofilm ở S aureus sau 48 giờ xử lí với cao chiết Tô mộc tại 1/5 MIC 46

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Agr: accessory gene regulator AIP: autoinducing peptide BSA: bovine serum albumin CFU: colony forming unit

CHIPS : Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, protein ức chế khả năng hóa ứng động tế bào của S aureus

eDNA : extracellular DNA

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Axit EPS: exopolysaccharide

MBC: minimum bactericidal concentration MIC: minimum inhibitory concentration

MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, S aureus kháng methicillin

MSCRAMMS : Microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, các thành phần bề mặt vi sinh vật nhận biết các phân tử kết dính trong chất nền của vật chủ

PBP: Penicillin-binding protein, protein gắn penicilin PBP PBS: đệm phosphate Buffered Saline

PIA: polysaccharide intercellular adhesin, polysaccharide kết dính gian bào PSM: Phenol-soluble modulins

PVL: Panton-Valentine leucocidin

QS: Quorum sensing, cảm ứng mật độ vi khuẩn

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction Sar: Staphylococcal accessory regulator

TTBS: Tris-Tween-Buffer-Saline TSB: Tryptic Soy Broth

TSST-1 : Toxic shock syndrome toxin -1, độc tố hội chứng sốc nhiễm độc -1

VRSA: Vancomycin-resistant S aureus, S aureus kháng vancomycin

WGA: wheat germ agglutinin

MỞ ĐẦU

Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng) thuộc nhóm vi khuẩn

Gram dương Chúng thường hiện diện trên bề mặt da của cơ thể người, là một vi khuẩn gây bệnh cơ hội khi hệ miễn dịch vật chủ bị yếu đi, hay trong quá trình phẫu thuật sử dụng các thiết bị y tế xâm lấn, hoặc do các vết thương hở Một khi xâm nhiễm vào trong cơ thể vật chủ, chúng gây ra các bệnh như nhiễm trùng da và mô mềm nhẹ, viêm nội tâm mạc nhiễm trùng, viêm tủy xương, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi có nguy cơ gây tử vong [1] Với sự xuất hiện của các chủng đa kháng kháng sinh, việc

điều trị các bệnh nhiễm trùng liên quan đến S aureus trở nên khó khăn do phải kéo

dài thời gian cũng như gia tăng chi phí điều trị các bệnh liên quan, trở thành một gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân cũng như cho cộng đồng [2, 3] Bên cạnh đó, việc hình

thành biofilm trên S aureus giúp cho chúng tăng khả năng chống chịu với điều kiện

stress môi trường sống và các thuốc điều trị hiện nay, khiến việc tái nhiễm các tác nhân này xảy ra liên tục Ngoài ra, việc hình thành màng sinh học (biofilm) trên các dụng cụ y tế cũng như trong quá trình xâm nhiễm vào vật chủ khiến cho việc xử lý loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây bệnh này trở nên khó khăn [4] Đồng thời, trong quá trình hình thành biofilm, các tác nhân gây bệnh này cũng tiết ra các chất điều hòa trong quá trình xâm nhiễm, có tác dụng như ngoại độc tố Các yếu tố độc lực này giúp vi khuẩn xâm nhập vào vật chủ, phá vỡ lá chắn miễn dịch của vật chủ, xâm nhập mô, gây nhiễm trùng huyết và gây ra các hội chứng do độc tố tiết ra như nhiễm trùng máu, chứng sốc nhiễm độc, hội chứng da có vảy và viêm dạ dày ruột [5, 6] Hiện nay, vẫn

chưa có phương pháp điều trị hiệu quả đối với việc nhiễm trùng biofilm do S aureus

gây ra [3]

Nhiều phương pháp trị liệu thay thế thuốc kháng sinh đã và đang được nghiên cứu trong cuộc chiến chống lại tác nhân gây bệnh liên quan đến biofilm như vaccine, ứng dụng nano, CRISPRi, v.v [7] Một trong những hướng nghiên cứu được quan tâm là phát triển các chất/hợp chất từ dược liệu có khả năng ức chế quá trình hình thành biofilm và các tín hiệu điều hòa sự hình thành biofilm liên quan tới mật độ vi khuẩn (quorum sensing - QS) [8] Khoảng 47% các loại thuốc mới có nguồn gốc từ

các nguồn nguyên liệu tự nhiên, cung cấp nhiều loại chất hóa học và chiết xuất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh [9] Có nhiều bằng chứng cho thấy các chất chiết xuất từ thực vật, phân đoạn, hoạt chất từ thực vật có khả năng được phát triển như các tác nhân ngăn chặn hoặc liệu pháp chống lại nhiễm trùng do biofilm [8, 9]

Việt Nam là nước có trữ lượng dồi dào nguồn thực vật cũng như các bài thuốc

dân gian điều trị các bệnh nhiễm trùng Trong đó Tô mộc (Caesalpinia sappan L.)

được biết đến trong bài thuốc dân gian có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, tẩy giun sán, kháng nấm, v.v [10] Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh được tiềm năng kháng khuẩn của Tô mộc ở các cao chiết thô và hợp chất phân lập được [11, 12] Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh, nhu cầu cấp thiết để phát triển các liệu

pháp điều trị hiệu quả nhiễm trùng do tác nhân là S aureus và tiềm năng hoạt tính

sinh học từ Tô mộc, là cơ sở để thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực ở Staphylococcus aureus của cao chiết Tô mộc”

Với mục đích trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết Tô mộc

- Đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của cao chiết trên S aureus - Đánh giá khả năng làm giảm độc lực của S aureus bằng cao chiết

- Đánh giá con đường ức chế điều hòa sự hình thành biofilm và giảm độc

lực ở S aureus của cao chiết

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Staphylococcus aureus

S aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng, được bác sĩ phẫu thuật Alexander Ogston

phát hiện lần đầu tiên vào năm 1880 tại Aberdeen, Scotland, được phân lập từ những

bệnh nhân bị lở loét S aureus thuộc chi Staphylococcus, Firmicutes, là khuẩn gram

dương, kích thước khoảng 0,8µm Chúng có hình dạng “chuỗi nho” khi quan sát dưới kính hiển vi, sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí; và phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37◦C, pH 7,4 [13] Trên đĩa thạch máu, khuẩn lạc có dạng tròn, dày và sáng với đường kính khoảng 1-2 mm Hầu hết chúng có khả năng ly giải máu, hình thành các vòng máu bị phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc khi được nuôi cấy trên đĩa thạch máu Chúng không sinh bào tử cũng như không có các tiên mao để di chuyển, tuy nhiên chúng sở hữu lớp nhầy, có khả năng tạo ra chất màu màu vàng sáng, và có thể phân giải mannitol Về mặt sinh hóa, chúng cho phản ứng dương với các thử nghiệm coagulase huyết tương, deoxyribonuclease và lên men đường lactose [14]

1.2 Khả năng gây bệnh và độc tố liên quan của S aureus

S aureus là một trong những tác nhân gây bệnh chính trong nhiễm trùng bệnh

viện và cộng đồng [1] Quá trình nhiễm trùng S aureus bao gồm năm giai đoạn, đó

là: (1) tiếp xúc với vi khuẩn, (2) nhiễm trùng tại chỗ, (3) lan truyền toàn thân và /

hoặc nhiễm trùng huyết, (4) nhiễm trùng di căn và (5) nhiễm độc tố S aureus thường

cư trú ở vùng da và không gây nhiễm trùng trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng nếu không xuất hiện các điều kiện thuận lợi như vết thương hở Quá trình xâm nhiễm đến lây nhiễm xảy ra dưới một số yếu tố như nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch bị suy yếu, quá trình phẫu thuật, sử dụng các thiết bị y tế xâm lấn và các bệnh chuyển hóa mạn tính Các mụt nhọt ở da phát triển và xuất hiện khi vi khuẩn này xâm nhập vào trong da từ vị trí xâm nhiễm Điều này có thể phát tán mầm bệnh hơn nữa và dẫn đến các biểu hiện lâm sàng khác nhau của các bệnh nhiễm trùng khu trú như mụn nhọt, viêm

mô tế bào, bệnh chốc lở hoặc nhiễm trùng vết thương S aureus có thể xâm nhập vào

máu và lây lan đến các cơ quan khác nhau gây nhiễm trùng huyết Sự lây lan qua đường huyết này có thể dẫn đến viêm nội tâm mạc, viêm tủy xương, viêm thận, viêm

khớp nhiễm trùng và các áp xe ngoài màng cứng Ngoài nhiễm trùng máu, các hội

chứng khác có thể xảy ra do ngoại độc tố của S aureus là hội chứng sốc nhiễm độc,

hội chứng da có vảy và viêm dạ dày ruột do ngộ độc thực phẩm [5]

Các bệnh nhiễm trùng do S aureus nghiêm trọng trên lâm sàng là nhiễm trùng

huyết, viêm nội tâm mạc nhiễm trùng, nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng xương và nhiễm trùng phổi Các nhiễm trùng lâm sàng khác là áp xe ngoài màng cứng, viêm màng não, hội chứng sốc nhiễm độc và nhiễm trùng đường tiết niệu [6]

S aureus sở hữu nhiều yếu tố độc lực Các yếu tố độc lực này giúp vi khuẩn

xâm nhập vào vật chủ, phá vỡ lá chắn miễn dịch của vật chủ, xâm nhập mô, gây nhiễm trùng huyết và gây ra các hội chứng do độc tố tiết ra [5] Dựa trên cơ chế hoạt động và vai trò trong quá trình phát bệnh, các yếu tố độc lực của tụ cầu vàng được phân loại và trình bày trong Bảng 1.1 [5]

Bảng 1.1 Phân loại một số độc tố và đặc điểm của chúng trong quá trình xâm nhiễm

của S aureus

Giúp bám vào mô vật chủ

Các thành phần bề mặt vi sinh vật nhận biết các phân tử kết dính trong chất nền của vật chủ

(MSCRAMM)

Các protein bề mặt của vi khuẩn tương tác với các thành phần của tế bào chủ như collagen, fibronectin và fibrinogen, do đó, thúc đẩy quá trình bám vào mô chủ Protein A của Staphylococcus (SPA), protein bám fibronectin A và B, protein bám collagen và yếu tố kết cụm (clumping factor) A và B thuộc nhóm yếu tố này Các yếu tố này cũng tham gia vào quá trình lẩn trốn hệ thống miễn dịch của vật chủ

Phá vỡ/ trốn tránh hệ thống miễn dịch

Polysaccharide microcapsule

Chống lại sự thực bào và tiêu diệt bởi các tế bào thực bào đa nhân

Protein A Liên kết với phần Fc của kháng thể, ngăn cản quá trình opsonin hóa, hoạt động như siêu kháng nguyên và hạn chế phản ứng miễn dịch của vật chủ

Panton-Valentine leukocidin (PVL)

PVL được tìm thấy trong hầu hết các MRSA lây nhiễm trong cộng đồng (CA-MRSA) PVL thuộc nhóm protein tạo lỗ trên màng Nó bao gồm hai thành phần protein (LukS-PV và LukF-PV) hoạt động cùng nhau như các tiểu đơn vị và tạo thành các porin trên màng tế bào của tế bào chủ, dẫn đến rò rỉ các thành phần bên trong và làm chết tế bào

Độc tố alpha (alpha toxin hay alpha hemolysin)

Đây là ngoại độc tố vi khuẩn đầu tiên được xác định, là nguyên nhân tạo lỗ trên màng tế bào, dẫn đến rò rỉ và làm chết tế bào

Protein ức chế khả năng hóa ứng động

Một loại protein ngoại bào có khả năng bám vào chất nền của tế bào chủ, protein huyết tương và phân tử kết dính tế bào nội mô ICAM-1 Ngoài vai trò kết dính và xâm nhập, nó còn có hoạt động điều hòa miễn dịch

Proteases, lipases, Staphylokinase, nucleases,

hyaluronatelyase, phospholipase C và

metalloproteases (elastase)

Những enzym ngoại bào này gây tổn thương mô, giúp cho tế bào vi khuẩn thâm nhập vào bên trong vật chủ

Gây độc tố

Độc tố ruột (enterotoxin)

S aureus tạo ra rất nhiều độc tố ruột là những ngoại độc tố

mạnh ở đường tiêu hóa Ngộ độc thực phẩm do

Staphylococcus là tình trạng nhiễm độc do tiêu thụ thực phẩm

có chứa một lượng lớn độc tố ruột đã được hình thành trước Độc tố hội chứng

sốc nhiễm độc -1 (Toxic shock syndrome toxin -1 - TSST-1)

TSST-1 và một số độc tố ruột được gọi là siêu kháng nguyên độc tố gây sốt TSST-1 gây ra hội chứng sốc nhiễm độc, đặc biệt ở phụ nữ đang trong thời kỳ kinh nguyệt

Độc tố gây bong tróc A và B (Exfoliative toxins A and B)

Là các serine protease nhận biết và thủy phân một cách chọn lọc các protein liên kết trong da ETs gây ra hội chứng da vảy tụ cầu, một bệnh chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh

1.3 Tình trạng kháng kháng sinh của S aureus

Cùng với sự phát triển của nền y học, S aureus cũng như các nhóm vi khuẩn

khác luôn biến đổi nhanh chóng để chống trả lại và là nguyên nhân hàng đầu của các bệnh nhiễm trùng liên quan trong bệnh viện Fleming phát hiện penicillin những năm

1940 và mở ra kỷ nguyên của các chất kháng sinh trong việc điều trị các bệnh nhiễm

trùng [15] Vào thời điểm đó, các bệnh liên quan đến S aureus đã được kiểm soát tốt

nhờ vào thuốc kháng sinh, tuy nhiên với việc sử dụng rộng rãi penicillin ở những năm 1950, đã dẫn đến sự xuất hiện của các chủng tụ cầu vàng kháng lại loại kháng sinh

này Chủng S aureus kháng lại Penicillin có thể tạo ra enzym penicillinase phân giải

vòng β-lactam, giúp cho chúng có thể kháng lại penicillin [16] Sau đó, các nhà khoa học đã phát triển một loại penicillin bán tổng hợp kháng lại với enzym phân giải penicillin tên là methicillin Sau khi được sử dụng trong điều trị năm 1959, methicillin đã kiểm soát hiệu quả chủng tụ cầu vàng kháng penicillin, tuy nhiên, chỉ sau 2 năm, nhà khoa học người Anh Jevons đã báo cáo về sự xuất hiện của chủng kháng lại kháng

sinh thế hệ mới này (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) [17] Khả năng kháng lại methicillin của các chủng S aureus là do sự hiện diện của gen mecA

mã hoá cho protein gắn penicillin PBP2a hay PBP2’, là một enzym chịu trách nhiệm cho các liên kết chéo peptidoglycan trên thành tế bào và enzym này có ái lực thấp với

vòng β –lactam dẫn đến việc kháng lại các kháng sinh họ này Gen mecA nằm trong yếu tố nhiễm sắc thể (Staphylococcal Cassette Chromosome mec - SCCmec) ở các chủng S aureus kháng với methicillin [18] Các chủng MRSA nhanh chóng trở thành

tác nhân gây bệnh xuất hiện phổ biến trên thế giới, bao gồm Châu Âu, Hoa Kỳ, Bắc Châu Phi, Trung Đông và Đông Nam Á [19] Dựa trên nguồn gốc lây nhiễm, MRSA được chia thành 2 loại: MRSA nhiễm trong bệnh viện (Hospital-acquired MRSA, viết tắt HA-MRSA) và MRSA nhiễm trong cộng đồng (Community-acquired MRSA, viết tắt CA-MRSA) Tại Trung Quốc, HA-MRSA chiếm hơn 50,4 % Ngoài ra, theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh (CDC) của Mỹ, tỷ lệ tử vong của các bệnh nhân nhiễm trùng MRSA cao hơn hẳn bệnh suy giảm miễn dịch AIDS, Parkinson và các vụ án mạng gộp lại [20]

Fluoroquinolones được giới thiệu đầu tiên để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm vào những năm 1980, tuy nhiên, vì có phổ kháng vi khuẩn Gram dương nên chúng đồng thời được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra bởi phế cầu pneumococci và tụ cầu staphylococci Kháng quinolone ở

S aureus xuất hiện nhanh chóng, nổi bật hơn ở các chủng kháng methicillin Kết quả

là, việc sử dụng fluoroquinolon làm thuốc điều trị tụ cầu đã giảm hiệu quả đáng kể Kháng fluoroquinolone phát triển do đột biến trên nhiễm sắc thể ở đích tác động của kháng sinh như topoisomerase IV hoặc DNA gyrase, hoặc do các kênh bơm xuyên

màng (efflux pump) [21] Ngoài ra, đã ghi nhận sự xuất hiện của các chủng S aureus kháng trung gian với glycopeptide và S aureus kháng vancomycin (VRSA) trong

cộng đồng [22]

Một số loại thuốc kháng sinh mới đã được phát triển gần đây để chống lại MRSA và đang trong các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng khác nhau, bao gồm ceftaroline, ceftobiprole, dalbavancin, oritavancin, iclaprim và delafloxacin [23]

Nhiễm trùng liên quan đến S aureus kháng kháng sinh dẫn đến kéo dài thời gian nằm

viện cũng như tăng nguy cơ tử vong, gây nên gánh nặng kinh tế cho ngành y tế, với

tổng giá trị chi phí bệnh viện liên quan đến nhiễm S aureus ước tính khoảng 450 triệu

đô la trong thập kỷ qua riêng tại Hoa Kỳ [2]

1.4 Cơ chế kháng kháng sinh của S aureus

Dựa trên các cơ chế kháng thuốc đã nghiên cứu, việc S aureus đề kháng lại

kháng sinh được chia thành 2 nhóm là: khả năng kháng kháng sinh nội sinh (intrinsic antibiotic resistance) và khả năng kháng kháng sinh thu nhận được (acquired antibiotic resistance) Kháng kháng sinh nội sinh bao gồm 3 cơ chế chính là: khả năng thấm của màng vi khuẩn, các kênh bơm đẩy thuốc trên màng và sản sinh các enzym phân huỷ thuốc (như β-lactamase) Đối với khả năng kháng kháng sinh thu nhận được có 4 cơ chế chính là: đột biến gen, thu nhận các gen kháng thuốc, kháng thuốc do sự hình thành màng sinh học (biofilm), và sự hình thành các nhóm vi khuẩn chống chịu với kháng sinh trong quần thể (persister) [3]

1.4.1 Cơ chế kháng kháng sinh nội sinh

Cơ chế đầu tiên của kháng kháng sinh nội sinh liên quan đến tính thấm màng của vi khuẩn Khi tính thấm của màng tế bào bị giảm xuống, quá trình chuyển hóa năng lượng của vi khuẩn bị ảnh hưởng, do đó, sự hấp thu thuốc bị giảm, dẫn đến tình

trạng kháng thuốc Ví dụ, S aureus đề kháng với aminoglycoside là do giảm tính

thấm màng của chúng và cuối cùng dẫn đến giảm lượng thuốc hấp thụ vào [24]

Hệ thống bơm đẩy thuốc của vi khuẩn được Ball và McMurry phát hiện vào

năm 1980 khi nghiên cứu khả năng kháng tetracycline của Escherichia coli [25] Sau

đó, các học giả đã tiến hành nhiều thí nghiệm trên kênh efflux bơm chủ động này, kết quả xác nhận rằng hệ thống này là một cấu trúc sinh lý bình thường của vi khuẩn và tồn tại ở các chủng nhạy cảm với thuốc [26] Khi được cảm ứng bởi cơ chất trong môi trường trong thời gian dài, các gen mã hóa hệ thống kênh bơm efflux được kích hoạt và được biểu hiện, giúp tăng cường khả năng đào thải các thuốc kháng sinh, do đó dẫn đến tình trạng kháng thuốc Hệ thống efflux vận chuyển thuốc chủ động đóng một vai trò quan trọng trong việc đề kháng với nhiều loại kháng sinh Có ba loại kênh

protein bơm thuốc kháng sinh có trên màng tế bào S aureus: QacA, NorA và Smr

[27] Noguchi và cộng sự coi QacA là một yếu tố quan trọng của MRSA [28] Cơ chế cuối của kháng kháng sinh nội sinh liên quan đến khả năng sinh enzym phân hủy thuốc β-lactamase là một enzym xúc tác quá trình thủy phân các loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam khác nhau (bao gồm cả các kháng sinh như kháng sinh phổ rộng carbapenem), được mã hóa bởi các hệ gen của vi khuẩn và có thể chuyển nạp với nhau [29] Hiện tại, nghiên cứu cho thấy kháng sinh nhóm β-lactam có tác dụng gây chết vi khuẩn chủ yếu thông qua hai cơ chế: thứ nhất, bằng cách liên kết với protein gắn penicilin (PBP), ví dụ trong quá trình tổng hợp mucin thành tế bào, việc gắn vào các PBP này gây ức chế tổng hợp mucin thành tế bào, làm hư hại thành tế bào, và dẫn đến quá trình kéo dài vi khuẩn và sau đó là ly giải; thứ hai, bằng cách kích hoạt hoạt động enzym tự phân hủy của vi khuẩn, dẫn đến tự hủy và chết [30] MRSA tiết nhiều β-lactamase chủ yếu làm giảm tác dụng của kháng sinh thông qua

hai cơ chế trên, dẫn đến các chủng S aureus kháng methicillin Quá trình kháng được

diễn ra như sau: Đầu tiên là cơ chế thủy phân, tức là β-lactamase thủy phân và làm bất hoạt các kháng sinh nhóm β-lactam; thứ hai là cơ chế chèn ép, tức là một lượng lớn β-lactamase liên kết nhanh chóng và chắc chắn với kháng sinh ngoại bào, ngăn cản kháng sinh đến không gian nội bào, do đó kháng sinh không thể đến được vị trí đích, cuối cùng dẫn đến kháng thuốc kháng sinh [31]

1.4.2 Cơ chế kháng kháng sinh thu nhận

Đầu tiên là do đột biến gen S aureus có thể trở nên kháng thuốc do đột biến

gen làm thay đổi DNA gyrase đích hoặc giảm protein màng ngoài, do đó làm giảm sự tích tụ thuốc Ví dụ, nguyên nhân đề kháng với clindamycin và erythromycin là do methyl hóa trong ribosome [32] Việc thu nhận các gen kháng thuốc, chủ yếu hiện diện trên các plasmid thông qua quá trình tải nạp, biến nạp hay tiếp hợp, dẫn đến hình thành các vi khuẩn kháng thuốc Cơ chế kháng MRSA chủ yếu là do plasmid, hoặc sự truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid, điều đó có nghĩa là các gen kháng

thuốc của các vi khuẩn khác và S aureus có thể được chuyển qua lại với nhau Ví dụ, MRSA có thể thu nhận plasmid kháng thuốc từ Enterococcus, tiếp tục mở rộng và

tăng cường khả năng đề kháng của nó [33]

Màng sinh học vi khuẩn (biofilm) là một cấu trúc phức hợp ngoại bào bao gồm một quần thể vi sinh vật gắn liền với bề mặt của chất nền, và các vi sinh vật bên trong của nó được bao quanh bởi một chất nền polymer ngoại bào ngậm nước do chính nó tạo ra, đó là một cách bảo vệ để vi khuẩn thích nghi với môi trường sống bao quanh nó [34] Hơn nữa, đại đa số vi khuẩn trong tự nhiên tồn tại ở dạng màng sinh học, và đặc điểm nổi bật nhất của màng sinh học vi khuẩn là khả năng bám dính và kháng thuốc mạnh, cho phép vi khuẩn chống lại các phản ứng miễn dịch của vật chủ và tránh được sự tiêu diệt của kháng sinh Khả năng chống lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn cư ngụ trong biofilm có thể tăng lên gấp 1.000 lần so với trạng thái tự do [35] Do đó, việc tìm ra các phương pháp để ngăn sự hình thành màng sinh học ở vi khuẩn nói

chung và S aureus nói riêng đặc biệt được quan tâm

Ngoài ra, việc xuất hiện nhóm vi khuẩn chống chịu (persister) làm ảnh hưởng

đến sự kháng thuốc ở S aureus Vi khuẩn chống chịu là một tập hợp con của các tế

bào tương đồng về mặt di truyền nhưng không đồng nhất về mặt kiểu hình trong một quần thể vi sinh vật, phát triển chậm hoặc không hoạt động và có khả năng tồn tại ở nồng độ kháng sinh cao Các nghiên cứu ban đầu cho thấy rằng, không giống như kháng kháng sinh, khả năng chống chịu là một trạng thái sinh lý của vi khuẩn tạm thời chống lại áp lực do kháng sinh và không dẫn đến sự thay đổi kiểu gen Tuy nhiên, tuyên bố này đang gặp thách thức vì sự phát triển nhanh chóng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới thông lượng cao Khi vi khuẩn gặp phải các kích thích bên ngoài

như kháng sinh, hầu hết vi khuẩn bị tiêu diệt ngay lập tức, nhưng một tỷ lệ nhỏ vi khuẩn sẽ chống lại áp lực này bằng cách hạn chế sự phát triển hay ngừng hoạt động Khi áp lực bên ngoài biến mất, lượng vi khuẩn nhỏ này có thể trở lại phát triển bình thường; những vi khuẩn này được gọi là vi khuẩn chống chịu (persister) Sự hiện diện của các vi khuẩn chống chịu gây ra nhiều trở ngại cho việc loại bỏ hoàn toàn nhiễm trùng do vi khuẩn và ngăn ngừa nhiễm trùng tái phát [36]

1.5 Sự hình thành và vai trò của màng sinh học đối với S aureus 1.5.1 Giới thiệu về biofilm và vai trò với S aureus

S aureus có hai trạng thái: tế bào tự do và ở dạng màng sinh học với những

đặc trưng khác nhau Cấu trúc màng sinh học (biofilm) được định nghĩa là cộng đồng vi sinh không di động hình thành và phát triển trên bề mặt sinh học hay phi sinh học như trên mô vật chủ hay trên các bề mặt dụng cụ cấy ghép trong y tế, chúng gắn kết với nhau dưới một lớp nền ngoại bào và thể hiện kiểu hình khác nhau từ bề mặt màng sinh học đến sâu bên trong cấu trúc biofilm [37] Chất nền ngoại bào bao gồm các thành phần chủ yếu là polysaccharide ngoại bào (exopolysaccharide – EPS), protein và DNA ngoại bào (extracellular DNA – eDNA) Trong quá trình phát triển bên trong biofilm, vi khuẩn có thể trốn tránh sự tấn công của vật chủ và kháng lại với nồng độ thuốc kháng sinh dùng để loại bỏ vi khuẩn trôi nổi tự do, khiến cho việc nhiễm trùng gây ra do sự hình thành màng sinh học trở nên đặc biệt khó trong điều trị và loại bỏ [38]

Mặc dù màng sinh học có thể phát sinh từ một tế bào, nhưng các điều kiện môi trường khác nhau trong quần xã có thể thúc đẩy sự phát triển của các quần thể vi khuẩn riêng biệt Nồng độ oxy, chất dinh dưỡng và chất nhận điện tử có thể gây ra biểu hiện gen không đồng nhất trong suốt màng sinh học Trong mô hình màng sinh

học khuẩn lạc in vitro của nhóm staphylococci, có 4 trạng thái trao đổi chất riêng biệt

đã được phát hiện: tế bào phát triển hiếu khí, lên men, không hoạt động (bao gồm các tế bào phát triển rất chậm và tế bào chịu đựng), hoặc đã chết Các tế bào tiếp xúc với mặt phân cách giàu oxy không khí phía trên và phần giàu chất dinh dưỡng chất lỏng bên dưới đều có hoạt động về mặt trao đổi chất Tuy nhiên, phần lớn các tế bào không hoạt động và nằm trong môi trường yếm khí Ngoài ra, sự không đồng nhất về việc

biểu hiện protein bên trong màng sinh học đã được chứng minh với nhiều protein liên kết với thành tế bào Sự biểu hiện này được chứng minh là khác nhau trong các cụm tế bào bên trong màng sinh học, và trong các trường hợp, việc biểu hiện khác biệt này được hình dung trên cơ sở tế bào [39]

Bằng cách áp dụng phương thức sống này, các vi sinh vật nằm bên dưới màng sinh học được hưởng lợi từ một số ưu điểm so với các hình thức sống phù du của chúng Chất nền ngoại bào có khả năng cô lập và tập trung các chất dinh dưỡng trong môi trường như cacbon, nitơ và photphat [40] Một lợi ích khác đối với việc sống trong màng sinh học là khả năng tránh được nhiều cơ chế thanh thải do vật chủ và các thuốc kháng sinh Ví dụ về các chiến lược thanh thải không hiệu quả liên quan đến mất hiệu quả các chất kháng khuẩn và chất tẩy hay tránh được sự thực bào vật chủ, hoặc từ các gốc tự do và protease của vật chủ Khả năng chống lại các yếu tố kháng sinh được hình thành trung gian thông qua kiểu hình không hoạt động do sự thích nghi với môi trường thiếu oxy và thiếu chất dinh dưỡng, dẫn đến mức độ trao đổi chất thấp và tốc độ phân chia tế bào được điều chỉnh hoàn toàn Môi trường stress tạo ra nhiều tế bào phát triển chậm có khả năng chống chịu với lượng kháng sinh cao nhưng cũng có một tỷ lệ tế bào chống chịu (không quá ~ 1% tổng mật độ) Những tế bào này được tìm thấy trong quần xã màng sinh học và cũng tồn tại ở sinh vật phù du trong nuôi cấy Ngoài ra, các tế bào chống chịu chứng tỏ khả năng chịu đựng nhiều loại tác nhân khác nhau, cơ chế này vốn dĩ khác với sự đề kháng, đó là việc ngăn chặn kháng sinh đánh trúng vi sinh vật mục tiêu [39]

Một trong những đặc điểm khác của biofilm là khả năng hoạt động như một rào cản khuếch tán để làm chậm sự xâm nhập của một số chất kháng khuẩn Ví dụ, các gốc Clo phản ứng (như hypochlorite, chloramines hoặc clo dioxide) trong một số chất kháng khuẩn hay chất tẩy rửa có thể bị vô hiệu hóa ở các lớp bề mặt của màng sinh học trước khi chúng có thể phân tán vào các lớp bên dưới Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy một số loại kháng sinh (oxacillin, cefotaxime và vancomycin) đã bị giảm

khả năng thấm vào trong màng sinh học của S aureus và S epidermidis [41]

Lợi ích cuối cùng đối với sự phát triển màng sinh học là khả năng phát tán vi khuẩn hoặc tách rời tế bào Các khuẩn lạc có thể tách ra dưới áp lực của lực cơ học

hoặc thông qua các đáp ứng được lập trình di truyền làm trung gian cho quá trình phát tán vi khuẩn trong màng sinh học Tương tự như tế bào ung thư di căn, các khuẩn lạc này tách rời di chuyển từ cộng đồng màng sinh học ban đầu đến các vùng chưa bị nhiễm của vật chủ, gắn kết và thúc đẩy sự hình thành màng sinh học mới Ngoài ra,

mặc dù không phải là trường hợp đối với vi khuẩn không di động như S aureus, sự

phát tán này cũng có thể được thực hiện qua sự di chuyển của các tế bào đơn lẻ, di động từ vi khuẩn bám dính Do đó, lợi thế này cho phép một quần thể nguồn vi khuẩn lâu dài có khả năng chống lại các tác nhân kháng khuẩn và phản ứng miễn dịch của vật chủ, và tạo điều kiện phát tán liên tục để thúc đẩy sự lây lan của vi khuẩn [42]

1.5.2 Quá trình hình thành biofilm và các yếu tố độc lực

Các tài liệu hiện tại mô hình hóa sự phát triển của màng sinh học của S aureus

trong ba giai đoạn: (1) bám dính, (2) tăng sinh hay hình thành màng sinh học trưởng thành, và (3) tách ra hay phân tán [43] Chu trình hình thành biofilm được thể hiện ở Hình 1.1

Giai đoạn đầu tiên là bám dính vào bề mặt Bề mặt này có thể là sinh học hay phi sinh học Điều kiện bề mặt để bám dính đóng vai trò quan trọng thông qua các thông số hóa lý khác nhau: tính kỵ nước, thành phần hóa học của vật liệu, năng lượng bề mặt, điện tích tĩnh điện, nhiệt độ, độ nhám bề mặt và trong trường hợp kết dính bề mặt sinh học: liên quan đến protein trong huyết thanh và mô Một bề mặt có thể gắn kết hoặc đẩy vi khuẩn theo các yếu tố được mô tả, trong đó tính kỵ nước được coi là quan trọng nhất Vi khuẩn có thể bám trên bề mặt sinh vật hoặc phi sinh học nhờ sự tham gia của các phân tử bề mặt vi khuẩn cụ thể, như protein bề mặt, autolysin hoặc axit teichoic làm thay đổi các đặc tính hóa lý của bề mặt vi khuẩn chứ không phải qua trung gian gắn kết nhờ vào tương tác với thụ thể trung gian nhất định [43]

Staphylococci gắn vào bề mặt sinh học như mô người là nhờ tương tác cụ thể với các yếu tố độc lực của nó Những vi khuẩn này sở hữu nhiều loại protein cố định trên bề mặt chẳng hạn như các thành phần bề mặt vi sinh vật nhận biết các phân tử chất kết dính (MSCRAMMS) MSCRAMMS được cấu trúc thành ba phần: vùng liên kết, vùng xuyên thành tế bào và phần thứ ba chịu trách nhiệm về sự gắn kết cộng hóa trị hoặc không cộng hóa trị của các protein MSCRAMM trên bề mặt vi khuẩn Những

chất kết dính này có thể liên kết với một hoặc một số protein nền khác nhau của vật chủ (fibronectin, fibrinogen, v.v.) Các liên kết cộng hóa trị được xúc tác bởi các phân loại nhận biết các mô típ LPXTG (Leu-Pro-any-Thr-Gly) Các protein bề mặt khác tham gia vào quá trình kết dính là protein Sdr (họ protein lặp lại Serin ‐ aspartate) hoặc Aap (protein liên kết tích tụ) Các liên kết không cộng hóa trị được bảo đảm bởi các protein khác như Atl Autolysin (Atl), tham gia vào quá trình luân chuyển thành tế bào, là một trong những protein phong phú nhất trên bề mặt vi khuẩn tụ cầu và có các vị trí liên kết đối với các protein chất nền của con người [44] Staphylococci được biết đến với khả năng bám dính cao trên bề mặt nhựa Axit teichoic, không tham gia

vào quá trình bám dính S aureus trên bề mặt sinh học, là những hợp chất quan trọng

hiện diện trong thành tế bào và đóng vai trò trong việc bám dính trên bề mặt nhựa nhờ sự tương tác của chúng với các polymer bề mặt Ngoài axit teichoic, hai chất kết dính khác có vai trò bám dính trên nhựa: protein bề mặt liên kết thành tế bào (Bap) liên quan đến sự kết dính với bề mặt polystyrene và SasC - một protein bề mặt liên quan đến sự gắn kết trên polystyrene không liên kết trung gian với fibrinogen, thrombospondin ‐ 1, yếu tố von Willebrand hay tiểu cầu Ngoài ra, còn có các autolysin tạo điều kiện gắn vào nhựa [45]

Giai đoạn tiếp theo là quá trình tăng sinh và trưởng thành màng sinh học, với việc sản xuất chất nền ngoại bào bao gồm exopolysaccharide (EPS), chất kết dính giữa các tế bào (PIA), axit teichoic, protein và eDNA Trong giai đoạn này, các kênh và cấu trúc có hình nấm hình thành để tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân bố chất dinh dưỡng đến các lớp sâu hơn của màng sinh học [46] Quá trình trưởng thành bắt đầu khi các tế bào vi khuẩn cảm ứng chương trình và tạo ra sự kết hợp giữa các tế bào thông qua việc sản xuất "chất nhờn" thường được gọi là chất nền ngoại bào (matrix) Ở tụ cầu khuẩn, phân tử màng sinh học kết dính được mô tả nhiều nhất là polysaccharide kết dính gian bào (PIA) hoặc poly‐N- acetylglucosamine (PNAG) và đại diện cho phần chính trong matrix của biofilm staphylococci PIA có một vai trò quan trọng trong cấu trúc màng sinh học và các bệnh nhiễm trùng liên quan đến màng sinh học Bằng cách đưa điện tích dương vào môi trường bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện tích âm, PIA hoạt động giống như một chất keo dính các tế bào lại với nhau bằng

tương tác tĩnh điện Tuy nhiên, PIA không có trong tất cả các chủng phân lập từ các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm Vì vậy, một số chất khác như protein sẽ phải đóng vai trò tương tự thay thế PIA, chẳng hạn như các protein Aap, protein liên kết chất nền ngoại bào (Embp), protein A, protein liên kết fibrinogen (FnbpA và FnbpB)

hoặc protein bề mặt S aureus G (SasG) [47]

Hình 1.1 Quá trình hình thành biofilm [43]

Các protein amyloid cũng đã được cho rằng đóng vai trò quan trọng đối với cấu trúc màng sinh học, mang lại sự ổn định cho chất nền Các sợi protein này có thể liên kết eDNA Bap - một protein bề mặt liên kết thành tế bào khác, đồng thời tham gia vào quá trình kết dính, cũng như cần thiết cho sự trưởng thành của biofilm và sự lây nhiễm trên tuyến vú bò Protein này hoạt động như một cảm biến, nó phản ứng với các điều kiện môi trường (như nồng độ canxi), và Bap cũng là một protein gắn kết (scaffold protein) tạo thành thể dính giống với amyloid ở nồng độ canxi thấp và trong điều kiện pH có tính axit Yếu tố quan trọng thứ ba của thành phần chất nền là eDNA eDNA, một phân tử polyanionic có trong chất nền màng sinh học, được mô tả như một phối tử có thể liên kết với các phân tử khác có trong chất nền như axit teichoic hoặc PIA Do đó, eDNA có vai trò trong cấu trúc màng sinh học Sự xuất hiện này dựa trên sự tham gia của quá trình chết tế bào: DNA được giải phóng từ vi khuẩn ly giải còn được gọi là eDNA, có vai trò quan trọng trong giai đoạn bám dính

ban đầu và trưởng thành của biofilm DNA ngoại bào xuất hiện thông qua quá trình

chết tế bào theo chương trình của vi khuẩn và thông qua sự biểu hiện của gen cidA

mã hóa cho holin (nhóm các protein nhỏ có nguồn gốc từ bacteriophage) chịu trách nhiệm ly giải tế bào vi khuẩn [48]

Giai đoạn cuối của quá trình phát triển màng sinh học được đặc trưng bởi sự tách rời của các cụm màng sinh học và phát tán các cụm này đến các vị trí khác Trong giai đoạn thứ hai và thứ ba của quá trình phát triển màng sinh học, người ta cho rằng sự phá vỡ lực kết dính giữa các tế bào là cần thiết để hình thành các kênh và cấu trúc hình nấm, và cũng để tách/ phân tán màng sinh học Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng protease, nuclease và một họ protein được gọi là các modulin hòa tan phenol (Phenol-soluble modulins - PSM) đóng góp vào quá trình này Tuy nhiên, trong số các phân tử tác động được đề xuất này, cho đến nay, chỉ có PSM đã được chứng minh một cách nhất quán để tạo điều kiện cho sự trưởng thành và phân tán của

màng sinh học của tụ cầu vàng thông qua cả mô hình in-vitro và in-vivo [44] PSM là

một họ các peptit nhỏ (dài khoảng 21–44 axit amin), có cấu trúc bậc hai xoắn α, lưỡng tính và các đặc tính giống như chất hoạt động bề mặt Các peptit nhỏ hơn 20 amino axit được nhóm vào loại α và peptit axit amin dài hơn 44 được xếp vào nhóm β của PSM [45] Cơ chế chung mà PSM góp phần vào cấu trúc và phân tán màng sinh học được cho là sự phá vỡ các tương tác không cộng hóa trị (tĩnh điện hoặc kỵ nước) giữa các đại phân tử chất nền màng sinh học Quá trình phân tán biofilm liên quan đến con đường tín hiệu điều hòa cảm ứng mật độ tế bào vi khuẩn (Quorum sensing - QS) của

S aureus, được biết đến nhiều nhất là hệ điều hòa gen liên quan (accessory gene

regulator- Agr) Hệ thống này còn liên quan đến việc điều hòa các yếu tố độc lực của

S aureus Hệ thống Agr được cảm ứng bởi một phối tử ngoại bào, là một peptide cảm

ứng (autoinducing peptide - AIP), là một cảm biến về mật độ tế bào vi khuẩn, chính vì điều đó mà Agr được xem là một hệ thống điều hoà cảm nhận mật độ Trong quá trình hình thành biofilm, hệ thống cảm nhận mật độ Agr bị kìm hãm để ngăn chặn sự

biểu hiện của các yếu tố phân tán và xâm lấn của S aureus, sau đó nó được kích hoạt

trong quá trình phát tán của vi khuẩn Trong giai đoạn đầu, mật độ tế bào thấp và do đó, hoạt động cảm nhận mật độ Agr yếu, ngược lại protein của thành tế bào hoặc chất

kết dính bề mặt không bị kiểm soát và được biểu hiện rất cao Trong giai đoạn sau, hoạt động của Agr tăng lên theo mật độ tế bào và điều chỉnh các yếu tố độc lực được tiết ra như lipase, protease và hemolysin [43, 49]

1.5.3 Các con đường điều hòa liên quan đến sự hình thành biofilm

1.5.3.1 Các yếu tố điều hòa chính liên quan đến sự hình thành biofilm và độc

lực ở S aureus

Quá trình hình thành biofilm ở S aureus là sự kết hợp hài hòa của nhiều yếu

tố điều hòa liên quan từ giai đoạn bám dính đến giai đoạn cuối phát tán vi khuẩn Trong đó, 2 nhóm điều hòa lớn cũng như đóng góp trong quá trình kiểm soát hình thành biofilm và độc lực là yếu tố điều hòa gen liên quan trên Staphylococcus (Staphylococcal accessory regulator - SarA), điều hòa cảm ứng mật độ Agr và yếu tố điều hòa σB hay sigB [39, 50] Sự điều hòa các gen liên quan này được thể hiện ở Hình 1.2

σB là một yếu tố sigma thay thế được tìm thấy ở tụ cầu vàng và các vi khuẩn Gram dương khác, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng với stress của môi trường

Ở S aureus, σB được kích hoạt bằng cách truyền tín hiệu để phản ứng với nhiệt độ

cao, độ thẩm thấu cao, kháng sinh hoặc pH cực đoan SarA là một trong 11 các họ protein của Sar, nó được nghiên cứu nhiều nhất trong số các protein Sar khác Protein SarA có thể hoạt động như một chất kích hoạt hoặc chất kìm hãm quá trình phiên mã

SarA là một protein điều hòa toàn ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen ở S

aureus bao gồm nhiều gen liên quan đến quá trình sản sinh độc lực khiến cho SarA

trở thành một yếu tố độc lực chính Trong số các gen được SarA tăng cường điều hòa

có locus agr [50]

Có thể thấy được sự điều hòa của các yếu tố này thông qua từng giai đoạn của biofilm như sau: tại giai đoạn sớm hình thành biofilm, các yếu tố cần thiết là các yếu tố bám dính để vi khuẩn có thể bám trên bề mặt vật chủ hay bề mặt phi sinh học nhất

định Để làm được điều này, yếu tố sigB tăng cường hoạt động của sarA và đồng thời ức chế agr [43] Việc tăng cường hoạt động của sarA liên quan đến việc biểu hiện

các yếu tố bám dính ở biofilm không phụ thuộc PIA, bao gồm protein bám fibronectin A và B (FnBPA, FnBPB), Bap, SasG và Spa Hệ thống SarA còn đồng thời ức chế

gen icaR, giúp cho operon icaADBC hoạt động và tạo thành PIA, thành phần chính

trong chất nền biofilm [39, 43] Ngoài ra, SarA còn ức chế biểu hiện các protein ảnh hưởng đến chất nền của biofilm như protease và nuclease, giúp hạn chế việc phân huỷ eDNA và protein trong chất nền, giữ ổn định cấu trúc biofilm

Hình 1.2 Tổng quan các con đường điều hòa chính trong quá trình hình

thành biofilm ở S aureus [50]

Trong quá trình hình thành biofilm, dưới điều kiện stress từ môi trường, σB đóng góp vào cấu trúc biofilm thông qua việc điều hòa tổng hợp autolysin AtlA có mặt trên màng tế bào vi khuẩn khiến chúng tách thành các tiểu phần nhỏ là amidase (Ami) và glucosaminidase (GL), dẫn đến tình trạng tự ly giải, gây chết vi khuẩn và làm tăng cường sự có mặt của eDNA trong lớp biofilm [51] eDNA còn được hình thành thông qua sự chết theo lập trình của vi khuẩn dưới sự điều khiển của operon

cid, mã hóa cho murein hydrolase [51]

Cấu trúc biofilm còn chịu ảnh hưởng bởi mật độ tế bào bên trong nó, thông

qua 2 hệ thống cảm biến mật độ của S aureus là agr và luxS [51] Đầu tiên là hệ thống agr, hệ thống này bao gồm 2 vùng phiên mã là RNA-II và RNA-III, việc kích hoạt 2 thành phần này trên agr phụ thuộc vào các chất cảm ứng trên 2 promoter tương

ứng là P2 và P3 Quá trình hoạt động của hệ thống Agr được thể hiện ở Hình 1.3

Vùng RNAII bao gồm 4 gen là agrB, agrD, agrC và agrA Gen agrD phiên mã cho

tiền peptide tín hiệu cảm ứng ngoại bào của hệ thống Agr là peptide tự cảm ứng (Autoinducing peptide-AIP) AIP dạng hoàn chỉnh có kích thước 7-9 amino acid và chứa vòng thiolactone nằm giữa cysteine và đuôi C chuỗi amino acid Sản phẩm của

gen agrB là enzym xuyên màng endopeptidase, chịu trách nhiệm cho việc biến đổi thiolactone, cắt đuôi C và sau đó xuất bào các phân tử AIP Hai gen agrC và agrA

mã hóa cho hệ thống truyền tín hiệu 2 thành phần bao gồm cảm biến histidine kinase AgrC, một protein xuyên màng được phosphoryl hóa khi liên kết với AIP, và bộ điều hòa cảm ứng liên quan là ArgA Khi được kích hoạt bởi quá trình phosphoryl hóa phụ thuộc AgrC, AgrA liên kết với vùng promoter P2 đối với RNAII và vùng promoter P3 đối với RNAIII, cũng như các promoter kiểm soát sự biểu hiện của peptide PSMα và PSMβ Ngoài AIP, Agr cũng có thể được kích hoạt bởi nhiều chất điều chỉnh khác, chẳng hạn như SarA hoặc SrrAB, và các yếu tố môi trường như nồng độ glucose hoặc pH [52] Sự hoạt hóa của hệ thống Agr tương quan với điểm cuối của sự tăng trưởng theo cấp số nhân và bước vào giai đoạn ổn định của sự tăng trưởng, bằng việc giảm điều hòa của các gen liên quan đến protein bề mặt tế bào thay vào đó là điều chỉnh các yếu tố độc lực AgrA cảm ứng RNAIII dẫn đến bắt đầu phiên mã nhiều loại

protein độc lực [51, 52] Bản thân RNAIII cũng là 1 mRNA chứa gen hld mã hóa cho

độc lực deltatoxin (hoặc delta-hemolysin) Cơ chế chính mà RNAIII kiểm soát sự biểu hiện gen mục tiêu là bằng cách bắt cặp bazơ antisense với các vùng không dịch mã 5′ (5′ UTRs), tạo thành các mạch RNA đôi Ngoại trừ trường hợp độc tố alpha là RNAIII hoạt động như một chất hoạt hóa sau phiên mã, RNAIII thường ngăn chặn quá trình dịch mã Bằng cơ chế này, RNAIII ức chế việc sản xuất một loạt các protein chủ yếu là bề mặt, chẳng hạn như protein A và các protein khác Hơn nữa, RNAIII ngăn chặn quá trình dịch mã của protein ức chế độc tố (Rot), thuộc họ điều hòa phiên mã Sar Rot liên kết với vùng khởi động của nhiều exoprotein và độc tố, ngăn chặn quá trình phiên mã của chúng Việc ức chế Rot dẫn đến tăng cường biểu hiện các độc tố hay enzym ngoại bào (exoenzym) như độc tố ruột, alpha-toxin, leukocidin, exoenzym phân hủy vàcác protease [52] Cùng với các yếu tố độc lực được điều hòa bởi RNAIII, AgrA cũng trực tiếp tăng cường điều hòa các yếu tố modulin tan trong phenol (phenol-soluble modulin -PSM) PSMα và PSMβ Họ PSM là họ peptide độc

lực (bao gồm cả delta-toxin) thuộc nhóm Staphylococci Trong số các PSM được mã

hóa ở locus psmα của S aureus đáng chú ý nhất là PSMα3, nó có tính kháng viêm và

kiềm hóa mạnh đối với nhiều loại tế bào, bao gồm bạch cầu trung tính, đại thực bào, nguyên bào xương và hồng cầu PSM còn là các yếu tố liên đến sự phân tán biofilm như đã đề cập trước đó

Hình 1.3 Con đường điều hòa cảm ứng mật độ agr [52]

Nói chung, sự điều hòa tăng lên của các chất độc và các exoenzym phân hủy phụ thuộc vào mật độ tế bào hay Agr và sự giảm điều hòa của các thành phần bề mặt được cho là phản ánh các yêu cầu khác nhau về thời gian đối với các yếu tố quyết định độc lực cụ thể trong quá trình vi khuẩn xâm nhiễm: khi bắt đầu xâm nhiễm, mật độ tế bào thấp và biểu hiện Agr thấp do đó làm tăng sản xuất các thành phần bề mặt cần thiết cho sự xâm chiếm ban đầu của các mô Một khi điều này được thiết lập, vi khuẩn phát triển đến mật độ tế bào cao hơn, đòi hỏi nguồn thức ăn bổ sung và tăng

cường phòng vệ khỏi sự chống trả của vật chủ, được thực hiện bằng cách điều chỉnh tăng exoenzym và độc tố phụ thuộc vào Agr Đáng chú ý, thời điểm này cũng khẳng định rằng việc sản xuất độc tố, nhiều trong số đó là tiền viêm, bị trì hoãn cho đến khi các khuẩn lạc phát triển có thể đối phó với các cuộc tấn công phản vệ của vật chủ, điều này có thể giải thích những phát hiện đặc biệt liên quan đến vai trò của Agr và

các yếu tố kiểm soát bởi Agr trong quá trình nhiễm trùng huyết do S aureus Việc

biểu hiện có kiểm soát bởi Agr của các yếu tố độc lực là quá trình tiêu tốn năng lượng, do đó ở nhiều chủng kháng kháng sinh, quá trình này phải được biểu hiện kiểm soát cân bằng, cụ thể ở nhiều chủng phân lập từ bệnh viện cho thấy sự rối loạn chức năng

của agr [52]

Trong khi hệ thống Agr không ảnh hưởng đến sự hình thành operon gen

icaADBC và sự hình thành chất kết dính giữa các polysaccharide, thì sự hiện diện của

một hệ thống đại biểu thay thế, luxS, có liên quan đến việc ngăn chặn việc sản xuất

polysaccharide liên kết tế bào ở tụ cầu thông qua quá trình điều hòa giảm của

icaADBC Có mặt ở cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, hệ thống LuxS dẫn đến

sự hình thành autoinducer II Các thể đột biến mất gen luxS và agr đều có chung đặc tính là hình thành các màng sinh học dày hơn nhưng ít độc hơn so với các chủng S

epidermidis hoang dại [51] Nghiên cứu này của Xu và cộng sự tuyên bố rằng sự phát

triển màng sinh học mỏng hơn ở các chủng LuxS dương tính là do sự điều hòa ở

operon icaADBC chứ không phải là quá trình trao đổi chất tế bào, vì không có sự

khác biệt đáng chú ý trong các mô hình tăng trưởng của các chủng dương và âm LuxS Điều này trái ngược với lý thuyết được đưa ra bởi Vendeville và cộng sự, nhóm đã quan sát thấy LuxS tham gia vào chu trình metyl được kích hoạt và do đó có thể làm thay đổi sự trao đổi chất và sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn Do đó, vai trò của LuxS hiện tại vẫn đang là sự tranh cãi [50-52]

1.5.3.2 Các yếu tố điều hòa khác liên quan đến sự hình thành biofilm

Bên cạnh các yếu tố điều hòa chính đã được đề cập là SarA, σB và Agr, còn nhiều yếu tố điều hòa khác liên quan đến PIA và eDNA Trong quá trình hình thành biofilm, dưới các điều kiện môi trường tác động cụ thể có thể ảnh hưởng đến quá

trình sinh tổng hợp PIA thông qua điều hòa trực tiếp gen ức chế icaR như là Spx hoặc Rbf hay tác động trực tiếp trên operon icaADBC như SrrAB [39]

Rbf (chất điều hòa màng sinh học) là một protein điều hòa phiên mã được tìm

thấy đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành màng sinh học ở cả S aureus và S epidermidis Mất gen rbf dẫn đến khiếm khuyết trong quá trình hình thành màng

sinh học ở điều kiện nồng độ NaCl và glucose cao, nhưng không ảnh hưởng đến

biofilm cảm ứng bởi ethanol Ngoài ra, nhiều bản sao rbf cho thấy làm tăng sự hình thành biofilm ở S aureus thông qua việc tăng sự liên kết giữa các tế bào Protein này

cũng được phát hiện là đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành màng sinh

học in-vivo Các thí nghiệm microarray cũng cho thấy rbf có thể làm giảm quá trình phiên mã icaR, phát hiện đã được xác nhận bởi các thí nghiệm qRT-PCR Do đó, có vẻ như rbf kích hoạt biểu hiện icaADBC, ít nhất là một phần, thông qua việc ức chế biểu hiện icaR [53]

Protein Spx là một chất điều hòa phiên mã phổ biến, tự nó chịu sự điều điều hòa của phức hợp proteinase ClpXP phụ thuộc năng lượng trong một số vi khuẩn Gram

dương Spx dường như hoạt động ở S aureus theo cách tương tự như Spx ở Bacillus

subtilis Spx hoạt động như một chất kích hoạt phiên mã và một chất kìm hãm Spx

liên kết trực tiếp với tiểu đơn vị α của RNA polymerase do đó có khả năng ngăn chặn sự tương tác giữa RNA polymerase và các yếu tố phiên mã khác Spx cũng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự nhận dạng promoter bởi RNA polymerase Spx là một chất điều hòa nhạy cảm với oxy hóa khử có thể kích hoạt các gen, chẳng hạn như gen mã hóa thioredoxin và thioredoxin reductase, quan trọng trong phản ứng của tế bào với

stress oxy hóa Ở S aureus, Spx đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng stress

với nhiệt độ cao và thấp, độ thẩm thấu cao và stress oxy hóa Thông qua thực nghiệm

cho thấy phiên mã icaADBC được tăng lên ở các thể đột biến spx trong khi phiên mã

icaR bị giảm Vì vậy, vai trò bình thường của Spx đối với biểu hiện ica là kìm hãm icaADBC thông qua tăng cường phiên mã icaR Chính xác cách Spx tăng cường biểu

hiện icaR vẫn chưa được biết rõ [51, 53]

SrrAB không ảnh hưởng đến gen icaR Protein SrrA được phosphoryl hóa liên kết với đoạn DNA 100 bp ngay ngược dòng của promoter icaADBC SrrAB rất

quan trọng đối với sự phát triển yếm khí và bảo vệ S aureus khỏi bị bạch cầu trung

tính giết chết trong điều kiện này

eDNA được kiểm soát thông qua quá trình tự hủy của tế bào, quá trình này thường bao gồm nhiều yếu tố liên quan, trong đó có autolysin được kiểm soát bởi σB

và hệ thống điều hòa các murein hydrolase là cid/lrg [50, 51] Quá trình chết tế bào

theo chương trình của vi khuẩn (Bacterial programmed cell death-PCD) đã được giả thuyết có liên quan đến quá trình hình thành bào tử, trao đổi gen, loại bỏ các tế bào bị hư hỏng và khiếm khuyết, kiểm soát sự lây nhiễm vi rút và hạn chế tỷ lệ đột biến tự phát có khả năng xâm chiếm quần thể Tương tự, sự chết và ly giải tế bào trong quần thể màng sinh học đã được ghi nhận đầy đủ, trong nhiều trường hợp ảnh hưởng đến cấu trúc màng sinh học và dẫn đến sự xuất hiện của các thành phần tế bào chất

bao gồm DNA bộ gen Ở S aureus, sự hiểu biết về các cơ chế phân tử kiểm soát sự

chết và ly giải trong quá trình phát triển màng sinh học chủ yếu tập trung vào các

operon cidABC và lrgAB Người ta đề xuất rằng các operon này có thể có một vai trò

quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của murein hydrolase của tụ cầu và mã hóa các protein tương tự như các holins và antiholins được mã hóa của vi khuẩn Holins và antiholins là thành viên của một gia đình lớn các protein màng có liên quan trực tiếp đến việc điều chỉnh quá trình ly giải và chết do vi khuẩn gây ra Quan trọng

là, các đột biến trong operon cid hoặc lrg dẫn đến sự thay đổi trong quá trình hình

thành màng sinh học, cho thấy rằng sự cân bằng giữa sự sống và cái chết là rất quan

trọng đối với sự phát triển của màng sinh học [51]

1.5.4 Các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm S aureus

S aureus đã tái xuất như một tác nhân gây bệnh liên quan đến lâm sàng do

khả năng kháng thuốc kháng sinh và việc sử dụng các thiết bị y tế xâm lấn ngày càng

nhiều Các ca nhiễm trùng do S aureus ở Mỹ có tỷ lệ tử vong là 25% cùng với thời

gian nhập viện, khả năng tử vong và chi phí y tế gần gấp đôi so với nhập viện do các

bệnh khác Màng sinh học của S aureus, một khi được hình thành, sẽ không còn đáp

ứng với việc điều trị kháng sinh và đáp ứng miễn dịch của vật chủ, do đó chúng là tác nhân gây bệnh của nhiều bệnh nhiễm trùng tái phát Sự hình thành màng sinh học có liên quan đến các bệnh do tụ cầu khác nhau như viêm nội tâm mạc, viêm tủy xương,

nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng mũi và biến chứng xơ nang cũng như nhiễm trùng liên quan đến cấy ghép Trong hầu hết các

trường hợp, việc hình thành màng sinh học hỗ trợ quá trình xâm nhiễm S aureus mãn

tính Sự xâm nhập của các vật liệu cấy ghép của màng sinh học gây ra bởi tụ cầu là một trong những vấn đề đặc biệt được quan tâm trong lâm sàng [4]

1.6 Ứng dụng dược liệu trong ức chế hình biofilm ở vi khuẩn

Việc điều trị thành công các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm gặp khó khăn do tình trạng kháng kháng sinh cao của vi khuẩn này Các kháng sinh hóa học tuyền thống không thể tiêu diệt hoàn toàn các tế bào vi khuẩn nằm ở vùng trung tâm của màng sinh học và dẫn đến sự xuất hiện của các chủng kháng và đa kháng thuốc, khiến tình hình tồi tệ hơn trên toàn cầu Do đó để khắc phục tình trạng kháng thuốc của quần xã vi khuẩn trong màng sinh học, các chiến lược thay thế (hạt nano, liệu pháp quang động, chất ức chế QS, v.v) và các chất kháng sinh mới đang và đã được nghiên cứu [7] Trong số các chiến lược đang được nghiên cứu, các hợp chất phân lập từ nguồn thực vật được chú ý hơn cả

Khoảng 47% các loại thuốc mới có nguồn gốc từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, chúng đã cung cấp nhiều loại chất hóa học và chiết xuất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh [8] Có nhiều bằng chứng đáng kể cho thấy các chất chiết xuất từ thực vật, phân đoạn, hoạt chất từ thực vật hoặc các chất khác từ tự nhiên có khả năng được phát triển như các tác nhân phòng ngừa hoặc liệu pháp chống lại nhiễm trùng dựa trên biofilm Thực vật là nguồn dồi dào các hợp chất thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học liên quan, trong đó các thành phần chính liên quan đến khả năng kháng khuẩn được liệt kê thành các nhóm chính là alkaloid, polyphenol, terpene, tinh dầu, nhóm đường cồn (sugar alcohol) và trên hỗn hợp cao chiết thực vật [8] Trong số các hợp chất/ chất kháng khuẩn này được báo cáo là có khả năng ức chế/ ngăn ngừa sự hình thành biofilm qua nhiều nghiên cứu tương ứng

Đầu tiên đề cập đến là nhóm alkaloid Alkaloid là một nhóm các hợp chất hóa học có trong tự nhiên có chứa cấu trúc vòng và nguyên tử nitơ và là một kho chứa cực kỳ lớn các hợp chất ứng cử viên để khám phá thuốc Alkaloid phân bố rộng và tập trung ở các loài thực vật bậc cao Hơn nữa, các Alkaloid thể hiện các hoạt tính

sinh học đáng kể có thể chống ung thư, chống vi khuẩn hoặc chống vi rút Nhiều nghiên cứu cho thấy các hợp chất/chất kháng khuẩn này có khả năng ức chế lại

biofilm Reserpine được tìm thấy nhiều trong các loài thực vật thuộc chi Rauwolfia, có tác dụng ức chế màng sinh học đối với Klebsiella pneumoniae ở mức 0,0156

mg/mL, thấp hơn 64 lần so với MIC của nó [9] Zhao và cộng sự phát hiện ra rằng

tetrandrine ức chế sự hình thành màng sinh học của Candida albicans theo vào liều lượng Tetrandrine có thể phá vỡ 60% màng sinh học C albicans trưởng thành ở 32 mg / L [54]

Polyphenol chủ yếu là chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc chống chịu sâu bệnh và xâm nhiễm của vi khuẩn Có rất nhiều nghiên cứu đã kiểm tra các đặc tính trên bằng cách đánh giá các hoạt động kháng khuẩn và ức chế tạo biofilm của polyphenol thực vật chống lại các chủng vi sinh vật khác nhau Với sự phân lập có hướng dẫn hoạt tính sinh học, Sato và cộng

sự đã phân lập được hai polyphenol kháng khuẩn từ cây mít Artocarpus

heterophyllus, được xác định là artocarpin và artocarpesin Chúng cho thấy tác dụng

ức chế tăng trưởng đối với S mutans và các liên cầu khuẩn hình thành mảng bám

khác với giá trị MIC trong khoảng 3,13-12,5 μg / mL [55] Prabu và cộng sự phát

hiện ra rằng guaijaverin, một flavonoid được phân lập từ lá cây Psidium guajava Linn (cây ổi), có khả năng ngăn chặn sự bám dính của S mutans lên bề mặt nhẵn với

sự ức chế 83,7% ở 500 μg/mL Trong khoảng 0,0078-2 mg/mL guaijaverin, quan sát thấy rằng sự ức chế khả năng bám dính, giảm từ 16 tới 0,27% [56] Ba hợp chất (techtochrysin, negletein và quercitin-3-glucoside), được phân lập từ lá của cây

Scutellaria oblonga bởi Rajendran và cộng sự đã cho thấy khả năng chống lại màng

sinh học đáng kể trong một nghiên cứu gần đây Negletein cho thấy sự giảm 83,4%,

88%, 72,3% và 87,9% màng sinh học ở S aureus, B subtilis, P aeruginosa và E

coli ở các nồng độ lần lượt là 32, 32, 64 và 64 μg/mL [57]

Terpenes là một nhóm lớn và đa dạng của hydrocacbon được tổng hợp tự nhiên trong vi sinh vật, thực vật và động vật Các hydrocacbon này có mức độ đa dạng cấu trúc cao bắt nguồn từ sự kết hợp của các đơn vị isoprene năm cacbon và được đánh giá cao vì có nhiều hoạt động chống vi khuẩn và chống lại biofilm Nagata và cộng

sự gợi ý rằng các loài thực vật macrocarpals được phân lập từ lá cây bạch đàn có hoạt

tính chống bám dính trên P gingivalis Ba trong số các macrocarpals, Macrocarpals A, B và C, có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của P gingivalis proteinase và độ bám

dính lên bề mặt của hydroxylapatite phủ nước bọt (SHA) 70-80% ở 10 μg/mL [58] Tổng số 14 diterpenes đã được phân lập từ cây này bởi Wolfender, và 5 trong số

chúng ức chế sự phát triển của màng sinh học C albicans trưởng thành với giá trị MIC là 50 μg/mL [59] Curcuma xanthorrhiza Roxb, một loại cây ăn được, đã được

sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc dân gian để điều trị nhiều loại bệnh Hoạt chất

Xanthorrhizol được thu nhận từ thân rễ, đã được chứng minh in-vitro có hoạt tính

kháng khuẩn mạnh khi được thử nghiệm chống lại các vi khuẩn gây bệnh nha khoa

khác nhau Nó có thể loại bỏ 76% màng sinh học của S mutans với sự hiện diện của

chlorhexidine gluconate trong 60 phút Ngoài ra, người ta phát hiện ra rằng casbane diterpene có hoạt tính ức chế mạnh (94,28%) đối với sự phát triển của màng sinh học ở nồng độ 250 μg/mL [60]

Dựa trên các nghiên cứu trên thế giới về khả năng ức chế/ làm giảm hình thành biofilm trên nhiều đối tượng vi khuẩn gây bệnh khác nhau, có thể thấy được tiềm năng của các nguồn dược liệu trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn hình thành biofilm Việt Nam là một nước có nguồn thực vật cũng như các bài thuốc dân gian điều trị các bệnh nhiễm trùng phong phú, do đó mục tiêu của đề tài nhằm sàng lọc một số cây dược liệu có tiềm năng kháng khuẩn cũng như ức chế hình thành biofilm,

làm giảm độc lực trên đối tượng vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong lâm sàng là S

aureus

1.7 Giới thiệu về cây Tô Mộc

Tô mộc (Caesalpinia sappan L.), có tên gọi khác là vang hay tô phượng,

được sử dụng trong một số bài thuốc Đông y Chúng được mô tả là loài thân gỗ nhỏ, cao 5-10 mét, có màu đỏ nâu ở phần lõi và trắng bên ngoài và phân bố ở khu vực Đông Nam Á Chi này bao gồm hơn 500 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [61]

Trong Đông y, cây được sử dụng để điều trị vết thương, bệnh phong, bệnh

tiểu đường, bệnh ngoài da và tiêu chảy [62] Tâm gỗ của C sappan được sử dụng làm

chất tạo màu tự nhiên cho rượu, thịt, vải, thực phẩm, đồ uống và dược phẩm Nhiều nghiên cứu cho thấy Tô mộc có các dược lý như ức chế enzym, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, kháng nấm, tẩy giun sán, bảo vệ gan, độc tế bào, chữa lành vết thương, giảm đau, chống co giật, hạ sốt, diệt côn trùng, chống co thắt và những loại khác [10] Hợp chất phân lập được ở Tô mộc được báo cáo rất đa dạng Hợp chất phân lập được ở vỏ cây và rễ chủ yếu là tannin, alkaloids, steroids, flavonoids, terpenoids [11] Ở lá bao gồm glycosides, phenols, saponins, flavonoids, tannins [12] Phần được nghiên cứu nhiều nhất là tâm gỗ, nhiều nghiên cứu đã ghi nhận được các hợp chất sau Brazilin, lupeol, linoleic acid, vanillin, friedelin campesterol, β-sitosterol, stigmasterol, episappanol, protosappanin C, (isoprotosappanin B and sappanol, Sappanchalcone, caesalpiniaphenol G, và quercetin, v.v [63-65]

Hình 1.4 Mô tả thân, lá, ruột và trái ở cây Tô mộc [10]

Nhiều nghiên cứu cho thấy tiềm năng kháng khuẩn của các cao chiết thô cũng như hợp chất thu nhận được ở Tô mộc Nghiên cứu của Kim và cs (2004) cho thấy

hiệu quả kháng khuẩn của các chiết xuất dung môi của C sappan đối với các chủng

S aureus kháng methicillin [66] Ngoài ra, theo nhóm nghiên cứu của Pratiwi và cs

[67], cao chiết ethanol từ vỏ của Tô mộc cho khả năng ức chế biofilm trên S aureus