Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu khả năng phấn tích Furan trong một số thực phẩm xử lý nhiệt

Trong nghiên cứu này, nội chuẩn đồng vị furan-d4 được sử dụng để phân tích furan trong một số thực phẩm qua xử lý nhiệt bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ kết hợp với headspace..

TỔNG QUAN

Giới thiệu về furan

Furan là một ete dạng vòng, dạng lỏng trong suốt, không màu, dễ bay hơi và dễ cháy, có điểm sôi gần với nhiệt độ phòng

Công thức phân tử : C 4 H 4 O Nhiệt độ sôi : 31,3 °C Khối lượng phân tử : 68,07 g/mol Điểm nóng chảy: -85,6 °C

Hình 2.1 : Công thức cấu tạo furan [1]

2.1.2 Nguồn gốc hình thành furan trong thực phẩm

Nguồn gốc hình thành furan từ quá trình chế biến thực phẩm có xử lý nhiệt có thể đi từ phản ứng Maillar giữa axit amin và đường khử (hình 2.2); quá trình oxy hóa chất béo của các axit béo không bão hòa hoặc từ acid ascorbic [2] (hình 2.3)

2.1.3 Hàm lƣợng furan có trong thực phẩm theo một số nghiên cứu

Năm 2004, Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ (FDA) đã tiên phong trong việc kiểm soát furan trong thực phẩm chế biến có xử lý nhiệt được đựng trong lọ hoặc lon Với 334 loại thực phẩm, đa số thực phẩm cho trẻ em, trẻ sơ sinh và các thực phẩm khác (các loại rau đóng hộp, trái cây, thịt và cá, nước sốt mì ống, nước uống dinh dưỡng, bia và cà phê), kết quả kiểm tra cho thấy hàm lượng furan trong rau quả cao nhất, đặc biệt là đậu, bí và khoai tây [4] Không những vậy, hằng năm, FDA đều tiến

4 hành lấy mẫu thực phẩm để kiểm tra furan và kết quả phân tích được cập nhật liên tục trên trang web của FDA

Sau khi FDA công bố kết quả phát hiện furan trong thực phẩm, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) cũng tiến hành lấy mẫu để phân tích furan.Từ năm 2004 đến 2010, trong 5050 mẫu thực phẩm được lấy để phân tích furan ở 20 quốc gia thuộc Chõu Âu Hàm lượng furan cao nhất được tỡm thấy trong cà phờ từ 45 àg/kg – 3660 àg/kg; sữa bột cho trẻ sơ sinh là 3,2 àg/kg và thức ăn trẻ em đúng hộp là 49 àg/kg [5]

Hình 2.2 : Quá trình hình thành furan từ amino acid, cacbohydrate và chuỗi acid béo không bão hòa [3]

AMINO ACIDS (serine, cysteine, alanine, threonine, and aspartic acid)

SR = Strecker reaction MR = Maillard reaction LO = lipid oxidation (according to Perez & Yaylayan 2004) acetaldehyde glycolacetaldehyde aldol condensation

CARBOHYDRATES (including ascorbic acid) aldotetrose derivatives

Hình 2.3 : Quá trình hình thành furan từ đường, acid ascorbic và acid béo [4]

4-hydroxy-2-butenal oxidized fatty acid

2.1.4 Tiêu chuẩn furan trong thực phẩm

Về tiêu chuẩn cho phép hàm lượng furan có trong thực phẩm chưa được quy định ở Việt Nam và cả thế giới, vấn đề này đang được nghiên cứu

Dựa trên kết quả phân tích toàn diện về sự phơi nhiễm furan với con người, EFSA đã tính toán hàm lượng furan phơi nhiễm trong ăn uống ở các độ tuổi từ 0,02 - 0,59 àg/kg thể trọng mỗi ngày, trung bỡnh khoảng 0,19 àg/kg thể trọng [5] Ngoài ra, theo kết quả phân tích năm 2009 của Viện dinh dưỡng quốc gia Đan Mạch, lượng furan qua đường ăn uống vào cơ thể đối với người lớn 15-75 tuổi (n = 4692), trung bỡnh là 33,5 àg/ngày và đối với trẻ em 4-6 tuổi (n35) trung bỡnh là 1,1 àg/ngày [6]

Hình 2.4 : Lượng furan vào cơ thể qua đường ăn uống ở người lớn [6]

Hình 2.5 : Lượng furan vào cơ thể qua đường ăn uống ở trẻ em [6]

Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký khí

2.2.1 Sơ lƣợc về sắc ký khí

Sắc ký khí là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất dễ bay hơi, được sử dụng rộng rãi và phổ biến hiện nay vì nhiều lý do: khả năng tách các hợp chất dễ bay hơi ra khỏi nhau, định tính và định lượng chúng Sắc ký khí được ứng dụng rộng rãi từ phòng thí nghiệm đến công nghiệp đặc biệt trong lĩnh vực phân tích thực phẩm, dược phẩm, môi trường và dầu khí Đối tượng có thể phân tích bằng sắc ký khí tương đối đa dạng: các loại khí thải trong công nghiệp, dung môi hữu cơ, thuốc trừ sâu, kháng sinh, tinh dầu…

Tùy loại hợp chất phân tích, tính chất và yêu cầu mà sử dụng sắc ký khí với các loại đầu dò khác nhau

2.2.1.1 Các thông số cơ bản của sắc ký a Thời gian lưu t R

Chất tan trong hỗn hợp mẫu sẽ được lưu giữ trên pha tĩnh trong cột sắc ký với thời gian nhất định, gọi là thời gian lưu Thời gian lưu được tính từ khi mẫu được nạp vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải ra khỏi cột và đạt nồng độ cực đại.

Diện tích peak và chiều cao peak sắc ký là những đại lượng phụ thuộc trực tiếp vào hàm lượng của từng chất trong hỗn hợp mẫu Do đó, hai thông số này được sử dụng để định lượng chất trong mẫu bằng phương pháp so sánh với diện tích hoặc chiều cao peak của đỉnh chuẩn.

Sự lưu giữ là điều kiện cần thiết đầu tiên để có thể tách các cấu tử trong hỗn hợp ra khỏi nhau Đặc trưng cho khả năng lưu giữ là đại lượng hệ số dung lượng K’:

K’ tùy thuộc vào bản chất của chất tan, bản chất của hai pha tĩnh và động, đặc tính của cột Khi K’ càng lớn, tR càng lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài và khi đó mũi sắc ký có khả năng bị tù do chất phân tích ở lại trong cột lâu Nếu K’ nhỏ thì các peak ra nhanh và gần nhau

Khoảng K’ lý tưởng là từ 2÷5, đối với một hỗn hợp phức tạp thì có thể chấp nhận K’ từ 1÷20 d Số đĩa lý thuyết của cột (N)

Số đĩa lý thuyết của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột Khi số đĩa lý thuyết của cột càng lớn và bề rộng mũi phân tích (W b ) càng nhỏ thì mũi sắc ký càng nhọn Khi chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng tách của cột càng cao e Hệ số chọn lọc (α)

Hệ số chọn lọc là đại lượng đặc trưng cho khả năng phân tách của hệ thống sắc ký đối với các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp chất khảo sát

Khi α khác 1 càng nhiều thì sự tách của hai chất càng rõ Hệ số chọn lọc α thay đổi khi thành phần pha động thay đổi hay khi thay đổi pha tĩnh

 f Độ phân giải (R s ) Độ phân giải được dùng để đánh giá khả năng tách hai mũi sắc ký gần nhau Để hai mũi kế nhau tách hoàn toàn thì Rs ≥ 1.5

Trong đó: t R 1 là thời gian lưu của cấu tử thứ nhất

9 t R 2 là thời gian lưu của cấu tử thứ hai

W 1 là bề rộng đáy của mũi sắc ký thứ nhất W 2 là bề rộng đáy của mũi sắc ký thứ hai α là độ chọn lọc của cột sắc ký cho hai cấu tử 1 và 2

2.2.1.2 Thiết bị sắc ký khí (GC) a Thiết bị sắc ký khí

Gas chromatography equipment consists of: carrier gas (1), sample injector (2), chromatography column (3), detector (4), and a data processor (5) for controlling and processing the data.

Hình 2.6 : Thiết bị sắc ký khí [11]

Sắc ký khí có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như:

 Đầu dò bắt giữ điện tử (Electron Capture Detector - ECD)

 Đầu dò ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector - FID)

 Đầu dò độ dẫn nhiệt (Thermal Conductivity Detector - TCD)

 Đầu dò ion hóa phát xạ (Thermionic Ionization Detector - TID)

 Đầu dò quang hóa ngọn lửa (Flame Photometric Detector - FPD)

 Đầu dò khối phổ (Mass Spectrometry Detector - MSD)

Các tính chất cần có của một đầu dò:

 Có khả năng cho tín hiệu với nhiều loại hợp chất

 Rẻ tiền và dễ sử dụng

Hiện nay, đầu dò khối phổ đang được ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh và định lượng chính xác b Nguyên tắc hoạt động

Mẫu được tiêm vào buồng tiêm mẫu Tại đây, mẫu được hóa hơi trước rồi theo dòng khí mang đi vào cột sắc ký Dựa vào khả năng tương tác của cấu tử với pha tĩnh, các chất sẽ được tách ra khỏi nhau và được ghi nhận sau khi ra khỏi cột bởi đầu dò

2.2.1.3 Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) a Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ

Là phương pháp thường được dùng trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh chính xác Ngoài thời gian lưu đặc trưng, chất phân tích còn được xác nhận bằng khối phổ của nó Đây là thế mạnh của GC-MS

Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ bao gồm thiết bị sắc ký khí và đầu dò khối phổ:

 Thiết bị sắc ký khí bao gồm khí mang (1), buồng tiêm mẫu (2), cột sắc ký (3)

 Khối phổ bao gồm: buồng ion hóa − ion source (4), nguồn tạo ion − Filament (5), bộ chuyển ion − Lens (6), tứ cực − Quadrupole (7), đầu dò khối phổ − MS detector (8), bộ điều khiển và xử lý dữ liệu − Data Proccessor (9)

Hình 2.7: Thiết bị sắc ký khí với đầu dò khối phổ [11] b Nguyên tắc hoạt động

Phương pháp phân tích furan

Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) và các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu để xác định các điều kiện thích hợp cho việc phân tích furan trong các loại mẫu thực phẩm khác nhau và các thông số ảnh hưởng đến kết quả phân tích trên cả hai thiết bị sắc ký khí khối phổ liên hợp không gian đầu GC/MS-HS và sắc ký khí khối phổ liên hợp giải hấp nhiệt rắn GC/MS-SPME (xem bảng tổng hợp 2.1).

Hiện nay, các thiết bị được sử dụng phổ biến để phân tích furan trong thực phẩm bao gồm Sắc ký khí ghép khối phổ kết hợp với headspace (GC/MS-HS) Phương pháp này được FDA và EFSA sử dụng rộng rãi để định lượng furan Ngoài ra, Sắc ký khí ghép khối phổ kết hợp với siêu chiết phá rắn (GC/MS-SPME) và Sắc ký khí ghép với đầu dò ngọn lửa (GC/FID) kết hợp với headspace cũng được ứng dụng trong phân tích furan.

Giới hạn phỏt hiện furan của GC/MS-HS nhỏ hơn 1 àg/kg ( trờn mẫu cà phờ và thực phẩm cho trẻ em), còn giới hạn phát hiện của GC/MS-SPME có thể đạt được ng/kg [4]

Như vậy, thiết bị GC/MS-SPME cho độ nhạy cao hơn phương pháp GC/MS-HS Tuy nhiên, phương pháp dùng thiết bị GC/MS-HS vẫn đáp ứng đủ độ nhạy để phát hiện được furan trong thực phẩm Ngoài ra, kết quả phân tích furan mà FDA, ESFA công bố, đa số đều sử dụng thiết bị GC/MS-HS [6][15][16], một số ít sử dụng GC/MS-SPME Điều này chứng tỏ GC/MS-HS là thiết bị phân tích furan phổ biến và ưa chuộng hơn

2.3.2 Điều kiện headspace, SPME, sắc ký, khối phổ

Việc sử dụng headspace lấy mẫu là phương pháp thích hợp nhất để phân tích các hợp chất rất dễ bay hơi [4][6][15][16]

Bên cạnh đó, kỹ thuật headspace dùng để lấy mẫu phân tích furan có nhiều thuận lợi như kỹ thuật lấy mẫu headspace rất phổ biến, được trang bị ở nhiều phòng thí nghiệm Mẫu ở dạng khí được đưa vào máy sắc ký tại buồng tiêm Các thông số ảnh hưởng khi phân tích furan bằng headspace là nhiệt độ và thời gian ủ mẫu [4][6][15][16] Do đó, khi sử dụng kỹ thuật này, việc khảo sát nhiệt độ và thời gian ủ mẫu là cần thiết Theo phương pháp phân tích furan của FDA, nhiệt độ ủ mẫu mà FDA đưa ra là ở 80°C/30 phút (2004) [15] , còn EFSA là 60°C/30 phút [6] Tuy

16 nhiên, theo một số nghiên cứu, việc gia nhiệt trong lúc ủ mẫu có thể hình thành furan trong quá trình phân tích Senyuva và Goekmen (2005) [4] cho biết có sự hình thành của furan trong thực phẩm chưa qua chế biến khi phân tích GC/MS-HS, ngay cả khi ủ nhiệt độ thấp 40°C Mặt khác, Castle và Crews (2005) lại cho rằng, nhiệt độ ủ mẫu từ 40- 60°C không có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành furan [3][4] Năm 2006, FDA đã ban hành sửa đổi phương pháp phân tích furan, nhiệt độ ủ mẫu giảm xuống từ 80°C/30 phút (2004) xuống còn 60°C/30 phút (2006) để giảm lượng furan hình thành trong quá trình phân tích đối với thực phẩm nhiều béo [16] Như vậy, qua những dẫn chứng trên, furan được hình thành trong quá trình phân tích Do đó, đa số phương pháp phân tích furan dùng kỹ thuật lấy mẫu headspace đều chọn nhiệt độ ủ mẫu là 60 0 C, ở nhiệt độ này lượng furan được hình thành do phân tích không đáng kể (xem bảng tổng hợp 2.1)

Kỹ thuật SPME sử dụng sợi fiber để hấp phụ mẫu rồi giải hấp tại buồng tiêm Sợi Carboxen-polydimethylsiloxane (CAR-PDMS) được dùng trong phân tích furan, tuổi thọ của nó phụ thuộc vào số lần hấp phụ Nhiệt độ và thời gian ủ mẫu là 40°C/15 phút, còn nhiệt độ và thời gian giải hấp là 230°C/3 phút Sau khi giải hấp, sợi fiber phải được gia nhiệt 280-300°C để làm sạch và tránh nhiễm chéo SPME giúp đưa nhiều chất phân tích vào thiết bị, cho giới hạn phát hiện thấp, nhưng ít phổ biến do chỉ có ở những phòng thí nghiệm lớn.

Về điều kiện sắc ký và khối phổ để phân tích furan, FDA và EFSA đưa ra điều kiện sắc ký và khối phổ rất rõ ràng, nhiều bài báo cũng đã áp dụng điều kiện này để phân tích Đa số sử dụng cột sắc ký PLOT-Q, thành phần là divinylbenzen polystyrene, hiệu quả để tách các phân tử nhỏ dễ bay hơi [4][6][14][15][16][18] Để định danh và định lượng furan, đầu dò khối phổ (MS) là lựa chọn tốt nhất Trong đó, chế độ SCAN dùng để định danh và SIM dùng cho định lượng Để khẳng định chắc chắn furan có trong mẫu

17 cần có đủ các ion 29, 39, 68 Đồng thời, tỉ lệ diện tích ion 39/68 dao động trong khoảng ± 10% [15][16] (xem hình 2.11)

2.3.3 Nội chuẩn sử dụng trong phân tích furan

Cả hai phương pháp phân tích furan trong thực phẩm là GC/MS-HS và GC/MS- SPME đều sử dụng nội chuẩn đồng vị furan_d4[6][14][15][16][17][18][19][20][21] Với kỹ thuật đầu dò khối phổ, nội chuẩn đồng vị được ưa chuộng sử dụng hơn Ngoài ra, việc sử dụng nội chuẩn trong phân tích đem lại kết quả chính xác hơn

Sự phân mảnh của nội chuẩn đồng vị furan_d4 bởi nguồn ion hóa (EI), năng lượng 70eV thành các ion 72, 42 (xem hình 2.12)

Hình 2.11 : Phổ khối của furan

Hình 2.12 : Phổ khối của furan_d4

18 Bảng 2.1 : Một số nghiên cứu phân tích furan trong thực phẩm Nền mẫu

Nhiệt độ & thời gian ủ (4) Điều kiện GC-MS

Nước ép, bánh, dầu ăn, sữa …

GC/MS-HS Nước cất 80 0 C/30 phút Cột: HP-PlotQ

(15m x 0,32mm I.D x 20àm film) Chương trình nhiệt :

50 0 C,10 0 C/phút->225 0 C(12,5 phút) Ion ghi nhận: 39,68 furan

GC/MS-HS Dung dịch

Sốt cà chua, thực phẩm đóng hộp và cà phê

GC/MS-HS Nước cất 60 0 C/15 phút Cột: HP-PlotQ

Ion ghi nhận: 39,68 furan 42,72 furan_d4

(trên nền mẫu sốt cà chua) Bánh , khoai tây chiên, cà phê, sữa, nước ép …

GC/MS-HS Dung dịch

>260 0 C(2,5 phút) Ion ghi nhận: 39,68 furan 42,72 furan_d4

Thực phẩm đóng hộp (nước ép, rau , nước chấm…), thực phẩm

GC/MS-HS Nước cất 35 0 C/60 phút Cột: CP-PoraBOND Q

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) cho trẻ em và cà phê

42,72 furan_d4 Nước ép, mứt đóng hộp, sữa bột cho trẻ em

GC/MS-HS Nước cất

Ion ghi nhận: 39,68 furan 42,72 furan_d4

Thực phẩm cho trẻ em

GC/MS-SPME (fiber CAR-PDMS)

(60m x 0,25mm I.D x 0,5àm film) Chương trình nhiệt :

Ion ghi nhận: 39,68,69 furan 42,72 furan_d4

Cà phê GC/MS-SPME

25 0 C/15 phút Cột: SGE BPX-VOL

35 0 C (2phút),20 0 C/phút->230 0 C Ion ghi nhận: 39,68 furan

Thực phẩm (đậu , thịt, khoai tây, gạo )

GC/MS-SPME (fiber CAR-PDMS)

Nước cất 25 0 C/30 phút Cột: HP-INNOWAX

30 0 C(0,1phút),2 0 C/phút->40 0 C(3 phút), 12 0 C/phút->200 0 C(2 phút) Ion ghi nhận: 39,68,69 furan 42,72 furan_d4

2.3.4 Kỹ thuật xử lý mẫu

Do furan dễ bay hơi nên dễ bị mất trong bảo quản, đồng nhất và xử lý mẫu Vì vậy, mẫu đem phân tích furan cần được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 0 C để tránh mất furan có trong mẫu Ngoài ra, việc đồng nhất mẫu cần được tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ lạnh Đối với mẫu rắn cần thêm nước lạnh vào trong khi tiến hành đồng nhất [4]

Mẫu được cân trực tiếp vào lọ headspace Dung môi thêm vào mẫu được sử dụng là nước cất [14][15][17][21] hoặc dung dịch nước muối [6][16][18][20]

Năm 2004, phương pháp phân tích furan của FDA ban hành đã sử dụng nước cất để thêm vào mẫu [15] Nhưng đến năm 2006, FDA đã sửa đổi và ban hành lại phương pháp, đã thay thế nước cất bằng dung dịch nước muối bão hòa với mục đích ngăn cản sự lên men hình thành ethanol, chất này đồng rửa giải với furan hoặc furan_d4 [16] Becaski (2005) nhận thấy, việc thêm muối làm tín hiệu furan tăng gấp đôi, đồng nghĩa tăng độ nhạy [22] Cùng nhận xét trên, Shao Ping Nie (2013) cho rằng việc thêm muối ở hàm lượng này làm tăng độ đáp ứng về diện tích peak furan Tác giả đã nghiên cứu việc thêm muối NaCl vào mẫu ở các hàm lượng khác nhau, kết quả cho thấy ở nồng độ 1g NaCl/10ml nước được thêm vào mẫu là tối ưu [18] Không những vậy, Ali Sarafraz-Yazdi (2012) đã giải thích, muối được thêm vào làm giảm tính tan của hầu hết các hợp chất hữu cơ trong dung dịch nước nên các phân tử chất phân tích đi ra khỏi nền mẫu dễ dàng hơn [23] Như vậy, qua những ý kiến trên, việc sử dụng dung dịch NaCl thêm vào mẫu có nhiều ưu điểm hơn nước cất.

Thuyết minh lựa chọn phương pháp phân tích

Qua các nội dung đề cập ở phần tổng quan, chúng tôi chọn phương pháp GC/MS-HS để phân tích furan trong thực phẩm và đưa ra hướng nghiên cứu trong đề tài như sau:

 Xử lý mẫu : tham khảo theo tài liệu phân tích furan của FDA [6][16] Sử dụng dung môi thêm vào mẫu là dung dịch NaCl bão hòa

 Điều kiện headspace, sắc ký- khối phổ

 Điều kiện headspace: Chọn nhiệt độ và thời gian ủ mẫu là 60 0 C/30 phút

 Điều kiện sắc ký- khối phổ: tham khảo theo tài liệu [6][16]

 Phân tích định tính: Phân tích trên máy để biết được thời gian lưu của furan và nội chuẩn

 Phân tích định lượng: Lập đường chuẩn furan, tính toán lượng furan có trong mẫu

Ion định lượng 68 (furan), 72 (furan_d4) Tính toán tỉ lệ ion phụ so với ion chính đối với GC/MS-EI theo quy định của Châu Âu ( 2002/657/EC ) [6][16][24]

Bảng 2.2: Quy định về tỉ lệ ion phụ so với ion chính đối với GC/MS-EI theo quy định của Châu Âu ( 2002/657/EC ) [24]

Khoảng dao động (% ion phụ so với ion chính) GC/MS-EI

 Xác định khoảng tuyến tính

 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

 Kiểm tra độ chính xác (độ lặp lại, độ tái lập)

 Kiểm tra độ đúng (hiệu suất thu hồi)

 Tính độ không đảm bảo đo

 Nhận xét quy trình triển khai tại phòng thí nghiệm (có đạt được những yêu cầu về định trị phương pháp phân tích không?)

 Trong trường hợp xuất hiện thông số không đạt khi đánh giá quy trình, tiến hành tìm nguyên nhân gây sai số và khắc phục

 Ứng dụng quy trình để phân tích một số mẫu

 Chọn mẫu: Chọn 45 mẫu (cà phê, sữa, bánh, mứt, nước tương, bánh mì), mẫu được mua trong các siêu thị ở TP.HCM

 Tiến hành thực hiện: xử lý mẫu và phân tích mẫu theo quy trình

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH FURAN

Thiết bị và dụng cụ

3.1.1 Tủ lạnh, nhiệt độ sử dụng 4 0 C

3.1.2 Tủ đông, nhiệt độ sử dụng -20 0 C

3.1.5 Cân phân tích 4 số lẻ

3.1.8 Pipet bầu 10ml 3.1.9 Micropipet 20-200àl

3.1.10 Micropipet 100-1000àl 3.1.11 Bình định mức 10ml 3.1.12 Vial headspace 20ml 3.1.13 Hệ thống máy GC 6890 ghép khối phổ (Agilent) kết nối Headspace ComPiPal

3.1.14 Cột sắc ký : HP-Plot Q 15m x 0,32mm I.D x 20 àm film.

Hóa chất

3.2.1 Chất chuẩn furan, nồng độ 100àg/ml, độ tinh khiết 99% (Dr Ehrenstorfer)

3.2.2 Nội chuẩn furan_d4, nồng độ 100àg/ml, độ tinh khiết 99% (Dr Ehrenstorfer)

3.2.4 Dung dịch NaCl 5M : hòa tan 145g NaCl ( độ tinh khiết 99%, Merck) trong 500ml nước cất, khuấy bằng máy khuấy từ

Pha chế dung dịch chuẩn

3.3.1 Dung dịch chuẩn furan 10àg/ml : Hỳt 1ml dung dịch chuẩn furan 100àg/ml (3.2.1) vào bình định mức 10ml, dùng methanol định mức tới vạch

3.3.2 Dung dịch chuẩn furan 1àg/ml : Hỳt 1ml dung dịch chuẩn furan 10àg/ml (3.3.1) vào bình định mức 10ml, dùng methanol định mức tới vạch

3.3.3 Dung dịch nội chuẩn furan_d4 10àg/ml : Hỳt 1ml dung dịch nội chuẩn furan_d4 100àg/ml (3.2.2) vào bỡnh định mức 10ml, dựng methanol định mức tới vạch

3.3.4 Dung dịch chuẩn furan_d4 1àg/ml : Hỳt 1ml dung dịch nội chuẩn furan_d4 10àg/ml (3.3.3) vào bỡnh định mức 10ml, dựng methanol định mức tới vạch.

Điều kiện GC/MS-HS

 Nhiệt độ kim tiêm : 70 0 C 3.4.2 Điều kiện sắc ký [6][16] :

 Chương trình nhiệt : 50 0 C,10 0 C/phút->225 0 C(12,5 phút)

 Tốc độ dòng : 1,7ml/phút (khí mang Heli)

 Chế độ tiêm mẫu : không chia dòng 3.4.3 Điều kiện khối phổ [16] :

 Chế độ quét phổ : SCAN, SIM

 Thời gian quét phổ : 5,7 - 8 phút

 Ion ghi nhận : 39, 68 furan ( định lượng ion 68)

Thứ tự tiêm mẫu phân tích furan

Khi cài đặt mẫu phân tích trên máy, thứ tự tiêm mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát loạt mẫu Thứ tự tiêm mẫu hợp lý giúp tránh tình trạng mẫu bị nhiễm chuẩn, mẫu không có tín hiệu hoặc nền mẫu bẩn của mẫu trước ảnh hưởng đến mẫu sau, đảm bảo chất lượng kết quả phân tích.

Thứ tự mẫu được tiêm như sau: dung môi (dung dịch NaCl 5M)  dãy chuẩn  dung môi  mẫu thật.

Xử lý mẫu

Bảng 3.1 : Một số loại mẫu dùng trong phân tích furan

STT Tên mẫu Số mẫu Ghi chú

Thực phẩm có độ ẩm thấp

Sữa lỏng + Sữa chua + Sữa tươi

Việc lựa chọn mẫu để phân tích furan trong đề tài này được chia làm 2 nhóm : thực phẩm xử lý nhiệt có độ ẩm thấp và thực phẩm xử lý nhiệt dạng lỏng Theo quy trình xử lý mẫu của FDA (2006) [16] , EFSA [6] đối với thực phẩm có độ ẩm thấp cần được thêm dung dịch NaCl bão hòa Do đó, lượng mẫu cân đem phân tích cho từng nhóm sẽ khác nhau Ngoài ra, quy trình xử lý mẫu của FDA (2006) [16] , EFSA [6] còn khảo sát thêm trên thực phẩm qua xử lý nhiệt có hàm lượng béo cao mà trong đề tài này chưa thực hiện

Mẫu được đồng nhất rồi cho vào lọ headspace Thêm nội chuẩn furan_d4 Đối với mẫu dạng rắn thì thêm dung dịch NaCl bão hòa Furan được định lượng trên máy sắc ký khí ghép khối phổ kết hợp headspace

Mẫu được mua từ siêu thị, tiệm tạp hóa về, bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C/4giờ trước khi đem phân tích Việc lưu mẫu cũng được duy trì ở nhiệt độ này

Việc đồng nhất mẫu cần được tiến hành ngay lập tức và thao tác nhanh khi lấy mẫu

Thêm dung dịch NaCl bão hòa Thêm nội chuẩn furan_d4

29 ra khỏi tủ lạnh Mẫu sau khi đồng nhất nếu chưa phân tích cần được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C Cách thực hiện như sau :

 Thực phẩm dạng lỏng (nước tương, nước ép…): lắc đều bằng tay

 Thực phẩm dạng rắn ( hạt cà phê rang, bánh…): dùng máy xay khô để đồng nhất

 Thực phẩm dạng bột ( cà phê bột, sữa bột…): dùng muỗng trộn nhiều lần

Mẫu được cân vào lọ headspace với khối lượng như sau:

 Thực phẩm dạng lỏng: cân 5g mẫu

 Thực phẩm có độ ẩm thấp ( sữa bột, bánh…): cân 0,75g mẫu, thêm 5,5ml dung dịch NaCl bão hòa

 Thực phẩm có độ ẩm thấp, nhiều béo ( khoai tây chiên…) ( * ) : cân 0,5g mẫu, thêm 5,5ml dung dịch NaCl bão hòa

 Thực phẩm khác (mứt,…): cân 2,5g mẫu, thêm 2,5g dung dịch NaCl bão hòa

( * ) : nhóm thực phẩm này tham khảo theo quy trình xủ lý mẫu FDA (2006), không thực hiện trong đề tài.

Đường chuẩn

Đường chuẩn được lập với dãy nồng độ furan 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/g và nội chuẩn furan_d4 10 ng/g

Trong đề tài này, chúng tôi đánh giá quy trình phân tích trên hai nền mẫu là sữa bột và nước ép Do đó, đường chuẩn được lập trên nền mẫu để kết quả chính xác hơn

Ngoài ra, chúng tôi lập đường chuẩn trên nền dung môi (dung dịch NaCl bão hòa) để tính toán kết quả mẫu thực.

Tính toán kết quả

Để khẳng định chắc chắn, chính xác là có furan trong mẫu, cần phải kiểm tra:

 Tỉ lệ diện tích ion 39/68 dao động trong khoảng ± 10% (theo quy định của Châu Âu ( 2002/657/EC )) [23][24]

 Thời gian lưu peak furan trong mẫu so với chuẩn dao động ± 2% [16]

 Hàm lượng furan trong mẫu được tính toán từ đường chuẩn.

Đánh giá quy trình phân tích

3.9.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn

Xây dựng đường chuẩn thuộc khoảng tuyến tính sẽ hạn chế tối đa sai sót khi định lượng

Yêu cầu của đường chuẩn: có ít nhất 4 điểm, các điểm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính

Yêu cầu của mẫu: nồng độ mẫu cần xác định nằm trong khoảng giữa của dãy chuẩn

Tiến hành chạy chuẩn furan ở các nồng độ với nồng độ nội chuẩn cố định

Từ kết quả phân tích trên sắc ký đồ, dùng MS-Excel vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích của các peak thu được và nồng độ các chuẩn Đánh giá đường chuẩn thông qua hệ số tương quan R 2

Tiến hành chạy chuẩn furan ở các nồng độ 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/mL với nồng độ nội chuẩn cố định 10 ng/mL

3.9.2 Xác định giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD) và giới hạn định lƣợng (Limit of quantification - LOQ) [27]

Giới hạn phát hiện: là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp thử có thể phát hiện được (không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng)

Giới hạn định lượng: nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp thử có thể định lượng được với độ chính xác và độ đúng thích hợp

 Cách khảo sát LOD và LOQ trên hai nền mẫu : sữa bột và nước ép

 Phân tích mẫu trước để biết mẫu có chất phân tích hay không, chọn mẫu không có chất phân tích hoặc có chất phân tích ở hàm lượng thấp

 Dựng đường chuẩn trên nền mẫu ở nồng độ thấp

 Dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo

 Phân tích mẫu 6 lần, tính SD tương ứng a LOD 3.3SD

Trong đó SD : độ lệch chuẩn của tín hiệu đo a : độ dốc của đường chuẩn

 Phân tích mẫu 6 lần cho mỗi nền (sữa bột và nước ép)

 Dựng đường chuẩn trên 2 nền mẫu này ở nồng độ thấp

 Tính toán giới hạn phát hiện và định lượng theo phương pháp đã nêu trên

3.9.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi, độ lặp lại

Hiệu suất thu hồi và độ lặp lại cho phép đánh giá độ đúng và độ chính xác của quy trình chuẩn bị và phân tích mẫu

 Cách khảo sát hiệu suất thu hồi, độ lặp lại trên hai nền mẫu : sữa bột và nước ép

 Phân tích mẫu trước để đánh giá có sự có mặt của furan hay không Lựa chọn mẫu không có furan hoặc có furan ở hàm lượng thấp

 Thêm chính xác một lượng dung dịch chuẩn furan vào trong mẫu

 Thực hiện phân tích xác định furan có trong mẫu 7 lần trong cùng một ngày So sánh lượng phân tích được và lượng thêm vào để đánh giá hiệu suất thu hồi và độ lặp lại qua %RSDr

 Tiến hành lập đồ thị tương quan giữa hàm lượng furan thêm vào với hàm lượng tìm thấy, đánh giá hệ số tương quan R 2

 Phân tích mẫu trước Tính toán kết quả trong trường hợp có furan trong mẫu

 Thêm chuẩn furan với 3 nồng độ khác nhau (10 ng/g, 50 ng/g và 100 ng/g) vào

32 mẫu sữa bột và nước ép Mẫu được phân tích theo quy trình đã nêu 7 lần liên tiếp trong một ngày

 Tính hiệu suất thu hồi, %RSDr, lập đồ thị tương quan giữa hàm lượng furan thêm vào với hàm lượng tìm thấy

3.9.4 Tính độ không đảm bảo đo của phương pháp

Mọi phép đo đều có sai số nhất định Do vậy, độ không đảm bảo đo là một phần quan trọng của kết quả đo Qua đó, phòng thí nghiệm biết chất lượng phép đo của mình và để cải tiến chất lượng theo yêu cầu Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích được đánh giá theo NORDTEST [26] dựa trên hai yếu tố ảnh hưởng đến kết quả đo: độ chụm (precision) và độ chệch (bias) của phép thử

Cách tính độ không đảm bảo đo:

 Tính độ lặp lại nội bộ phòng thí nghiệm u(Rw)

+ Thực hiện phân tích mẫu ở 3 khoảng nồng độ 10, 50, 100 ng/g, mỗi nồng độ thực hiện 7 lần

+ Tính %RSD cùa từng nồng độ

+ Tính u(Rw) = %RSD/n 0,5 (n=7) của 3 nồng độ, chọn u(Rw) có giá trị lớn nhất

 Tính độ chệch của phương pháp u(bias) bằng cách sử dụng mẫu thêm chuẩn được tính theo công thức : u bias = (RMS 2 bias + u(rec)) 1/2

+ Tính bias của 3 nồng độ, sau đó tính RMS bias = (Σ(bias) 2 /n) 1/2 + Độ không đảm bảo đo của mẫu thêm chuẩn u(rec) được ước lượng dựa trên thể tích thêm chuẩn u(vol) và độ không đảm bảo đo của chất chuẩn u(conc) u(rec) = (u(conc)% 2 + u(vol)% 2 ) 1/2

 Tính độ không đảm bảo đo tổng hợp %u = (%u 2 RW + %u 2 bias ) 1/2

 Tính độ không đảm bảo đo mở rộng U= %u x k, với hệ số bao phủ k = 2, độ tin cậy 95%

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khoảng tuyến tính của furan

Do chúng tôi chỉ mua được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ thấp 100 g/mL với thể tích ít là 1 mL Nhu cầu sử dụng dung dịch chuẩn này lại nhiều như khảo sát độ lặp lại, hiệu suất thu hồi, độ tái lặp, lập đường chuẩn để tính toán kết quả Vì vậy, khoảng tuyến tính chỉ được khảo sát trong khoảng từ 1− 200 ng/mL

Bảng 4.2 thể hiện diện tích peak của chuẩn furan ứng với các nồng độ khác nhau và tỉ lệ diện tích peak chuẩn so với nội chuẩn

Bảng 4.2: Diện tích peak Furan, Furan-d4 từ nồng độ 1 − 200 ng/mL Nồng độ chuẩn Furan (ng/mL)

Nồng độ nội chuẩn Furan_d4

Tỉ lệ nồng độ Furan/Furan_d4

Tỉ lệ (S/IS) Furan(S) Furan_d4(IS)

200 10 20 24719 9386 2,6 Đường chuẩn furan (hình 4.7) được lập trong khoảng nồng độ từ 1−200 ng/mL, biểu diễn tỉ lệ diện tích peak (S/IS) theo tỉ lệ nồng độ (furan/furan_d4) (xem thêm bảng 4.2) y = 0.1267x + 0.123 R² = 0.9982

Hình 4.7: Đường chuẩn Furan trong khoảng nồng độ 1 – 200 ng/mL

Tỉ lệ diện tích peak

41 Đường chuẩn Furan tuyến tính trong khoảng nồng độ 1−200 ng/mL với hệ số tương quan R 2 = 0,9982 So sánh với một số tác giả, đường chuẩn cũng được lập từ 0,4−

100 ng/mL [7] ; 0,5−200 ng/mL [6] ; 0,4−250 ng/mL [10] với hệ số tương quan R 2 > 0,99.

Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi

Theo sơ đồ 3.6.3, nồng độ metronidazole được thêm vào sữa bột lần lượt là 10, 50 và 100 ng/g Kết quả phân tích cho thấy hệ số biến thiên dao động từ 4,9% đến 8,1% Ngoài ra, hiệu suất thu hồi đạt từ 104% đến 111%, đảm bảo độ chính xác của phương pháp.

Bảng 4.3: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trên nền sữa bột

Nồng độ 10,0 ng/g 50,0 ng/g 100 ng/g

Trung bình (x ), n=7 10,4 53,1 111 Độ lệch chuẩn (SD) 0,84 2,6 6,4

Hệ số biến thiên (%RSD r ) 8,1% 4,9% 5,8%

Hiệu suất thu hồi TB 104% 106% 111% Độ lệch thực nghiệm 4% 6% 11%

(xem thêm phụ lục 1) Hình 4.8 thể hiện tương quan giữa nồng độ furan lý thuyết thêm vào và nồng độ furan thu được theo thực nghiệm, tương quan tuyến tính với hệ số hồi qui R 2 > 0,99

Hình 4.8: Sự tương quan tuyến tính giữa các kết quả thực nghiệm và giá trị thực ở các nồng độ 10, 50, 100 ng/g trên mẫu sữa bột

 Nước ép: kết quả hiệu suất thu hồi cao, tương tự trên nền sữa bột (bảng 4.4, hình 4.9)

Bảng 4.4: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trên nền nước ép

Nồng độ 10,0 ng/g 50,0 ng/g 100 ng/g

Trung bình ( x ), n=7 11,0 51,4 112 Độ lệch chuẩn (SD) 0,68 1,6 5,0

Hệ số biến thiên (%RSD r ) 6,2% 3,1% 4,5%

Hiệu suất thu hồi TB 110% 103% 112% Độ lệch thực nghiệm 10% 3% 12%

Hình 4.9: Sự tương quan tuyến tính giữa các kết quả thực nghiệm và giá trị thực ở các nồng độ 10, 50, 100 ng/g trên mẫu nước ép

Kết quả ở bảng 4.3 và 4.4 cho thấy hiệu suất thu hồi cao trong khoảng 103–112% với hệ số biến thiên từ 3,1–6,2% Kết quả tương đồng về hệ số biến thiên và hiệu suất thu hồi với tác giả Janka Vranová [14] ở nồng độ 10, 50, 100 ng/g trong khoảng từ 103–115%

Nhận thấy rằng, hiệu suất thu hồi cao hơn 100% , có khả năng do furan sinh ra trong quá trình phân tích [4] Ngoài ra, ở nồng độ thấp từ 10–100ppb, sai số trong phân tích lớn, cụ thể là khoảng dao động hiệu suất thu hồi cho phép lớn từ 60–115% (10ppb) và 80–110% (100ppb) [27]

Độ tái lặp

Bảng 4.5: Độ tái lặp mẫu sữa bột, nước ép

Ngày thực hiện Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 1 Ngày thứ 2

Trung bình ( x ) 10,4 11,5 51,4 52,2 Độ lệch chuẩn (SD) 0,84 0,89 1,6 1,5

Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy phương pháp đã triển khai trên mẫu sữa bột và nước ép có hệ số biến thiên giữa hai ngày phân tích lệch nhau không đáng kể

4.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng furan

Do không tìm được mẫu sữa bột và mẫu nước ép không chứa furan đã được thực hiện trong đề tài Vì vậy, chúng tôi chọn mẫu sữa bột, nước ép có hàm lượng furan thấp để tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Hàm lượng furan có trong mẫu sữa bột là 1,1 ng/g và mẫu nước ép là 1,2 ng/g

Bảng 4.6: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng furan

Nền sữa bột Nền nước ép Giới hạn phát hiện (LOD) 0,80 ng/g 0,61 ng/g Giới hạn định lượng (LOQ) 2,4 ng/g 1,8 ng/g (xem thêm phụ lục 3)

Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp lần lượt là 0,61–0,80 ng/g và 1,8–2,4 ng/g So sánh kết quả này với các tổ chức uy tín như FDA và các tác giả khác thực hiện phân tích furan trên thiết bị GC/MS-HS ( xem bảng tổng hợp 2.1), kết quả này là phù hợp

Với giới hạn phát hiện này, phương pháp trên đủ độ nhạy để phân tích hàm lượng furan trong nhiều loại thực phẩm xử lý nhiệt khác nhau

4.6 Độ không đảm bảo đo Độ không đảm bảo của phương pháp được tính với k =2 và độ tin cậy 95%

Bảng 4.7: Độ không đảm bảo của phương pháp Nền mẫu Độ không đảm bảo của phương pháp U

(xem thêm phụ lục 4) Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích furan dao động khoảng 21% trên nền sữa bột và nước ép ở nồng độ từ 10–100 ng/g

Bảng 4.8: Kết quả phân tích mẫu thực

Thực phẩm qua xử lý nhiệt có độ ẩm thấp

STT Tên mẫu Kết quả

(ng/g) STT Tên mẫu Kết quả (ng/g)

1 Cà phê bột 1 4148 16 Bánh mì 1 < LOQ

2 Cà phê bột 2 2663 17 Bánh mì 2 Không phát hiện

6 Cà phê hòa tan 1 307 21 Mứt 1 3,9

7 Cà phê hòa tan 2 62,1 22 Mứt 2 3,6

8 Cà phê hòa tan 3 26,1 23 Mứt 3 4,3

9 Cà phê hòa tan 4 21,6 24 Mứt 4 4,3

10 Cà phê hòa tan 5 22,5 25 Mứt 5 7,1

Thực phẩm qua xử lý nhiệt dạng lỏng

34 Nước tương 4 5,4 42 Sữa lỏng 2 Không phát hiện 35 Nước tương 5 5,8 43 Sữa lỏng 3 Không phát hiện

36 Nước ép 1 2,1 44 Sữa lỏng 4 < LOQ

Qua khảo sát hàm lượng furan được tìm thấy trong thực phẩm chế biến nhiệt, lượng furan dao động từ không phát hiện tới vài trăm nanogam/gam Trong đó, cà phê được xác định chứa hàm lượng furan cao nhất với 4148 nanogam/gam.

Độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo của phương pháp được tính với k =2 và độ tin cậy 95%