Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng nhân nhanh Protocorm like Bodies và tái sinh chồi like Bodies và tái sinh chồi lan Mokara vàng chanh trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Rita

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời không những tận dụng được các ưuđiểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch mà còn hạn chế được nhược điểmcủa hai hệ thống nuôi cấy trên giúp tạo r

ĐẠI HOC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

VUONG THI HONG LOANKHAO SAT KHA NANG NHAN NHANH PROTOCORMLIKE BODIES VA TAI SINH CHOI LAN MOKARA VANG

CHANH TRONG HE THONG NUÔI CAY NGAP CHÌM TAM

THOI RITA®

CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOC

MA SO NGANH : 60.42.80LUAN VAN THAC SiHUONG DAN KHOA HOC: TS LE THI THUY TIEN

TP HO CHI MINH, THANG 8 NAM 2012

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa- ĐHỌG-TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : ¿- ¿+ 6 E52 2 E5EEEEEEEEEEEEEEEEE 3 E1 1E 5E re,

Thanh phan Hội đồng đánh giá Luận văn thạc sĩ gồm:

(ghi rõ họ, tên, học ham, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng khoa quản lý

chuyền ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúcNHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Vương Thị Hồng Loan -. 5-5- MSHV: 10310943

Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1982 _ - Nơi sinh: Hà Nội

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học - 7-5 ++<<<<<<<2 Mã số : 60.42.80 I TÊN DE TÀI: Khảo sát khả năng nhân nhanh Protocorm like bodies và tai

sinh chối lan Mokara Vàng chanh trong hệ thong nuôi cay ngập chìm tạm

thời RITA®

H NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:e Tạo PLBs từ mẫu phát hoa cây ex vitro: sử dung hai loại cytokinin làBA và Kinetin ở các nồng độ khác nhau

e Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và NAA đến sự tăng sinh củaPLBs và sự tái sinh chồi từ PLBs trên môi trường thạch

e Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập chìm và thời gian ngập chìm tới sự tăngsinh PLBs và tái sinh chổi từ PLBs trong hệ thống nuôi cay ngập chim tạm

thời RITA®

e Khảo sát ảnh hưởng của mật độ PLBs tới sự tăng sinh PLBs và tai sinh chéi từ

PLBs trong hệ thống nuôi cây ngập chìm tạm thời RITA®

Ill NGÀY GIAO NHIEM VU : thang 2 năm 2012IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: thang 8 năm 2012V CAN BO HUONG DAN: TS Lê Thị Thuy Tiên

Tp HCM, ngay thang năm 20

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Ho tén va chit ky) (Ho tên và chữ ky)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

(Họ tên và chữ ký)

- Các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức chuyênngành và phương pháp nghiên cứu khoa học tiếp thêm hành trang để tôi tự

tin hơn trong học tập và công tác.

- Ban Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp công nghệcao Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện vé thời gian và kinh phí

giúp tôi hoàn thành luận văn này.

- Các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ tế bào thực vật đã giúp đỡ, chia sẻbuồn vui trong suốt thời gian làm việc, giúp tôi hoàn thành nhiệm vụ được

giao.

- Gia đình, ban bè đặc biệt là me chồng và ông xã đã tạo mọi điều kiện, độngviên, phụ giúp tôi chăm sóc con gái nhỏ làm chỗ dựa tinh thần vững chắc cho

tôi yên tâm học tập và công tác.

Tôi đã được thực hiện luận văn trong sự yêu thương quý mến và hỗ trợ nhiệt

tình của tât cả mọi người Tôi xin cảm ơn và gửi lời chúc sức khỏe đên tât cả!

Vương Thị Hồng Loan

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời mang lại hiệu quả vượt trội về khả năngnhân nhanh nhiều loài thực vật như chuối, lan hồ điệp, ca phê, khoai tây, Nghiêncứu này được thực hiện nhằm xác định một vài thông số quan trọng ảnh hưởng tớihiệu quả tăng sinh PLBs có nguồn gốc từ cọng phát hoa lan Mokara vàng chanh vàtái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống nuôi cay ngập chìm tam thời RITA” Kết quảcho thay sự tăng sinh PLBs cao nhất ở mật độ 5g PLBs trong môi trường MS bổsung BA 1 mg/l kết hợp với NAA 0,5 mg/1 với thời gian ngập chìm 3 phút sau mỗi2 giờ trong điều kiện này tỷ lệ tăng sinh PLBs cao gấp 2.43 lần so với khi nuôi trênmôi trường thạch và gấp 1,779 lần so với môi trường lỏng được lắc liên tục với tốcđộ lắc 140 vòng/phút Chế độ ngập chìm thích hợp cho sự tái sinh chéi từ PLBstrong hệ thống RITA® là 3 phút ngập chim sau mỗi 4 giờ với mật độ khởi đầu là 70PLBs/binh trong môi trường MS bố sung BA 1 mg/1 kết hợp với NAA 0,2 mg/I Sốlượng chi tái sinh trong hệ thống RITA® cao gấp 2,72 lần so với trên môi trườngthạch và gấp 2.42 lần so với môi trường lỏng lắc

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG c2 0000022211211 TH nh nh nhà nh chviiDANH MỤC HỈNH -c- CC 2020122111211 2111 11 1k nh nh nh viiiDANH NY LOL OO UN 5 en ixDANH MỤC CHU VIET TẮTT - cc-c 2 2121122111211 111 1111 111 E12 XCHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết €Ủa dé tài << << << sư ưng 0 esesesesesesee 1

1.2 Mục tiều nghiÊn CỨU c0 G6555 999 9.99 99.96609899 9088999999994969966666666688666966 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU2.1 Sơ lược về đặc điểm của Mokara vàng chanh (Full moon) - 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân b6 - - 2 256 E+EE2EEEE2EEE9 1 EE1EE215E11E5 1111 ecxrk 32.1.2 Đặc điểm hình thái c6 scct2tte tri 32.1.3 Đặc điểm sinh trưởng -¿-¿- + 2 2E E32 E1 1 12151 211111 re 42.1.4 Tạo nguồn PLBs vô tính - + ¿6E 2 SE SE+E£E#EEEEEEEEEEEEEEEEEErErkrrrrrrkred 52.2 Hệ thống nuôi cay ngập chìm tạm thời . - - + 2525252522 cesezszsze2 7

2.3.1.1 Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đến hiệu suất

sinh học của các kiêu vi nhân giông khác nhau - 555 << <++2 15

2.3.1.2 Các thông số ảnh hưởng tới hiệu quả của hệ thống nuôi cay ngập chìm

tạm tHỜI . - << + << 101333303010 111111335 11111180 11H HH n1 r 182.3.2 Các nghiên cứu trong NUGC - SH re 20

IV

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2À e 243.2 Phương pháp nghiền CỨU - - (<< re 26

3.2.1 Phương pháp tạo mẫu sạch i7: wif7O ¿- ¿5252 E22 E££2EsEekrkrrereesed 27

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của BA va KIN lên sự tạo PLBs từ phát hoa 28

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp nông độ giữa BA và NAA đến sự tăngsinh của PLBs và sự tái sinh chéi từ PLBs trên môi trường thạch 293.2.4 Khao sát ảnh hưởng của tần suất ngập chìm va thời gian ngập chìm tới sựtăng sinh PLBs và sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thông nuôi cay ngập chim

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng cua mật độ PLBs tới sự tăng sinh PLBs và sự tái sinh

chéi từ PLBs trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® 32

3.2.5.1 Khao sát ảnh hưởng cua mật độ PLBs tới sự tăng sinh PLBs 32

3.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ PLBs tới sự tái sinh chổi từ PLBstrong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 15 IO c5 ccckccckererereered 333.2.6 Phương pháp xử lý $6 liệu ¿ - - + 2562 E+E2EEEEEEEEEEEEEEEEEEEErErErrerrred 34CHƯƠNG 4 KET QUÁ - BAN LUẬN

ẴŸ"{cr hố ‹ii 35

4.1.1 Khao sát ảnh hưởng của BA, KIN lên sự tạo PLBs từ phát hoa 35

4.1.2 Ảnh hưởng của BA va NAA lên sự tăng sinh PLBs và sự tái sinh chỗi từ

PLBs trên môi trường thạch . <1 199999011 ng, 4

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập chìm và thời gian ngập chìm tới sựtăng sinh PLBs trong hệ thống RILT A) ¿- <5 SE+E+EE+E£EE£EEEEEEEEEEEEEkrkerkrkee 464.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ PLBs đến sự tăng sinh PLBs 534.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập chìm và thời gian ngập chìm tới sựtái sinh ChOi từ PLBS .- ¿©5252 SE SEEE*E5 2 E21 15151511 111111511 111115111 cxe, 544.1.6 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ PLBs khởi đầu tới sự tái sinh chơi 6l

4.2 Bàn luận - - - - << G S190 nh 63

4.2.1 Ảnh hưởng của cytokinin lên sự hình thành PLBs của mẫu cấy 634.2.2 Các thơng số ảnh hưởng đến hiệu quả tăng sinh PLBs và tái sinh chéi củahệ thống ngập chìm tam thời RIT A”” ¿2 <5 +SE+E£EE+EEEEEEEEEEEEEEEEErkrkrrerkee 644.2.3 Anh hưởng của mật độ PLBs khởi dau trong hệ thơng nuơi cay 674.2.4 Anh hưởng của hình thức nuơi cay tới sự tăng sinh PLBs và sự tái sinh chéi

5.1.2 Sự tăng sinh PLBs va tái sinh chéi trên mơi trường thạch 7]

5.1.3 Sự tăng sinh PLBs trong hệ thống RITẠ” 2 2c+ccs+Ecszrrse 715.1.4 Sự tái sinh chdi từ PLBs trong hệ thống RIT.A - 2-2 s+cs+sz 71

5.2 (86) 08 -““ -:£+‹1 73TÀI LIEU THAM KHAO < << << S9 S2 4 4xx 9seseseSeEeE 246 74

Vi

DANH MỤC BANGBảng 4.1 Ảnh hưởng của BA, KIN lên sự tạo PLBs từ phát hoa sau 45 ngày nuôiBang 4.2 Ảnh hưởng của BA va NAA lên sự tăng sinh PLBs và tái sinh chỗi từPLBs trên môi trường thạch sau 45 ngày nuôi cấy - - 2 252 cscc+cszcsced 42Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm và thời gian ngập chìm tới sự tăngsinh PLBs sau 45 ngày nuôi cấy: ¿ ¿6-5-5252 3 E2 E1 1 1115211111111 E11 ecxrk 47Bang 4.4 Ảnh hưởng của mật độ PLBs tới sự tăng sinh PLBs sau 45 ngày nuôi cay:Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm và thời gian ngập chìm tới sự tái sinhchéi từ PLBs sau 45 ngảy nuôi cẫyy ¿-¿- - - S221 3 112 111111151111 1111 1111 re 55Bang 4.6 Ảnh hưởng của mật độ PLBs khởi dau tới sự tái sinh chổi sau 45 ngày

TUOI gà :.à 61

DANH MỤC HÌNHHình 2.1 Hệ thống APCS G-G-EE SE 3 121515151315 511 1111111111 111111111e 1e 9Hình 2.2 Sơ đồ hệ thống nuôi cấy bán tự động - 2 2555c+cscscscs2 10Hình 2.3 So đồ hệ thống nuôi cây bán tự động - - c2 2c seen 11

Hình 2.4 Hệ thống RITA® (Teisson va Alvard, 1995) cccccescecccccecesseeceeeeeeeeees 13Hình 2.5 Hệ thống bình đôi BIT® (Escalona và cộng sự, 1998) 14

Hình 2.6 Hệ thống Plantirmal”” - - + SE SESE E9 SE EEEEEE E111 111111111 14Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu Chung ¿+25 S252 SE 2E£E+E£EEEEEEEeEeErrkrkrerree 26Hình 3.2 Sơ đồ khử trùng Mau - + 2E EE+E2E2EE2E£E£E£EEEEEEEEErEeErkrkrerree 27Hình 4.1 Anh hưởng của BA, KIN lên tỷ lệ mẫu tạo PLBs sau 45 ngày nuôi cấy 37Hình 4.2 Ảnh hưởng của BA, KIN lên số lượng PLBs/mau sau 45 ngảy nuôi cayHình 4.3 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự tăng sinh PLBs trên môi trường thạchsau 45 ngảy nuôi CẤY - - E1 S S1 191515151511 1 1111111 111111151511 1111101011111 43Hình 4.4 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự tái sinh chi từ PLBs trên môi trườngthạch sau 45 ngày nuôi cấy . 5-5-5211 1 E1 1 11151111111 11211 1101111111111 re 43Hình 4.5 Ảnh hưởng của thời gian và tần suất ngập chìm tới sự tăng sinh PLBs

trong hệ thống RITA sau 45 ngày nuôi cấy ¿- 52 ScSecteEckeErkerkrkrred 46

Hình 4.6 Ảnh hưởng của thời gian và tần suất ngập chìm tới số lượng PLBs/g

trọng lượng tươi khi nuôi cấy trong hệ thống RITA sau 45 ngày nuôi cấy 48

Hình 4.7 Anh hưởng của thời gian va tần suất ngập chim tới sự tái sinh chỗi từPLBs trong hệ thống RITA® sau 45 ngày nuôi cấy 255ccscccrcesred 56Hình 5.1 Quy trình tăng sinh và tái sinh chéi lan Mokara vàng chanh trong hệ

thống RITA® 5-Sc <2 k2 1 12151121521511112111111151111111 111111111 1111 11c 72

Vill

DANH MỤC ANHẢnh 2.1 Cây Mokara vàng chanh + 5-52 56+E+S£SE+E+EEEE‡EEEEEEEEEEErErkrrrrererrees 3Ảnh 3.1 Phát hoa Mokara vàng chanh 10 ngày tuổi (a), lát cắt phát hoa (b) 24

Ảnh 3.2 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm RITA(Cirad, Pháp) 2-52 25

Ảnh 4.1 PLBs trên môi trường MS không bổ sung BA, KIN sau 45 ngày nuôi cay

Ảnh 4.6 Cụm PLBs trong các chế độ nuôi cây khác nhau sau 45 ngảy nuôi cấy 52

Ảnh 4.7 Sự tái sinh chéi từ PLBs trong hệ thong RITA® sau 45 ngay nudi cay voi

tan suất ngập chìm sau mỗi 2 giÒ - ¿5 5252212339 E3 EEE5EE5 2121711712221 x xe, 58Ảnh 4.8 Sự tái sinh chi từ PLBs trong hệ thống RITA® sau 45 ngày nuôi cấy vớitan suất ngập chìm sau mỗi 4 giÒ - ¿G2 5252212332 SE 3 1115111212111 11x cxe, 59

Anh 4.9 Sự tái sinh chéi từ PLBs trong hệ thong RITA® sau 45 ngay nudi cay voi

tan suất ngập chìm sau mỗi 6 giÒ esesssesescssssesessscssssesessscssssessssseseseeseseens 60

Ảnh 4.10 Chdi tái sinh trong hệ thống RITA® sau 45 ngày nuôi cấy 62

KIN

BA

PLBsTISTDZDHSTTV

CAC TU VIET TAT

môi trường Murashige va SkoogI-naphthalene acetic acid

Kinetin (6- furfurylaminopurine)

6- benzylaminopurineprotocorm like bodiestemporary immersion systemThidiazuron

Điều hoa sinh trưởng thực vat

CHUONG 1

MO DAU

1.1 Tính cấp thiết của đề tàiMokara là nhóm giống chủ lực trong việc phát triển diện tích và cung cấp sanphẩm hoa lan cắt cành tại Thành phố Hồ Chí Minh Hiệu quả của việc trồng Mokaracắt cành rất cao, nhu cầu tiêu thu của thị trường nội địa và xuất khâu cũng rất lớn.Với tốc độ phát triển kinh tế xã hội nhanh như hiện nay thì việc trồng lan Mokaravừa mang lại lợi nhuận cao vừa phù hợp với định hướng nên nông nghiệp đô thị củathành phố.

Mokara là loài lan đơn thân, các kiểu nhân giống truyền thống cho hệ số nhânrất thấp vì vậy nguồn cây giống hiện nay chủ yếu nhập khẩu từ Thái Lan Trongnhững năm gần đây, sự phát triển của công nghệ sinh học đặc biệt là kỹ thuật nuôicay mô tế bào thực vật đã mở ra một hướng đi day triển vọng cho ngành sản xuấtcây giống trong nước Cho đến nay, các báo cáo trong và ngoài nước trên loài hoanày sử dụng nguyên liệu cho nghiên cứu tái sinh gồm: đỉnh sinh trưởng, đỉnh chéibên, lá non tuy nhiên khi sử dụng các bộ phận này sẽ làm ảnh hưởng tới sức sống

của cây mẹ hoặc hủy cả cây mẹ Do vậy nghiên cứu tái sinh từ phát hoa sẽ giúp

chúng ta chủ động được nguồn nguyên liệu ban đầu, mặt khác khi cắt phát hoa sẽkhông ảnh hưởng nhiều tới sức sống của cây mẹ, phát hoa có thể thu hoạch quanhnăm, trên phát hoa có các đốt mang mat ngủ nên rất thuận lợi cho việc kích thíchtạo chéi

Do những hạn chế của phương pháp nhân giống in vitro trên môi trường thạchnhư phải sử dụng số lượng lớn bình nuôi cấy, giá thể agar đắt tiền, tốn công laođộng cho việc cây chuyền mẫu định kì sang môi trường dinh dưỡng mới, làm sạch,rót môi trường, bao gói các bình nuôi cay dẫn đến việc tăng giá thành của sảnphẩm (Etienne và Berthouly, 2005 [16]; Chakrabarty và cộng sự, 2007 [18]) Mộthạn chế khác phải kế đến là hiện tượng mau cấy tiết ra các hợp chất phenol làm môitrường va mẫu cay hóa nâu dẫn đến sự giảm sức sống và sự chết của mẫu cấy.Trong khi đó nuôi cấy trên môi trường lỏng, toàn bộ mẫu cấy sẽ tiếp xúc với môitrường lam tăng sự phân chia tế bào và tái sinh co quan, gia tăng hệ số nhân chi,rễ, củ và phôi soma (Ziv, 1989 [56]; Sandal và cộng sự, 2001 [42]) Tuy nhiên nếu

nuôi cay hoàn toàn trong môi trường lỏng có thé dẫn tới sự không thoáng khí làmmẫu cây bị chết đặc biệt là xảy ra hiện tượng thủy tinh thể (Kevers và cộng sự,

200) [36].

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời không những tận dụng được các ưuđiểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch mà còn hạn chế được nhược điểmcủa hai hệ thống nuôi cấy trên giúp tạo ra môi trường nuôi cay thoáng khí, cây conkhỏe mạnh, tỉ lệ sống cao, giảm chi phí nhân công, tiết kiệm và giảm chi phí môitrường nuôi cấy do sử dụng ít môi trường trên một mẫu cấy và không sử dụngthạch, hệ số nhân gia tăng nhiều lần so với khi nhân giống hệ thống nuôi cấy thôngthường [16] Luận văn được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng tạo

protocorm like bodies (PLBs) từ cơ quan sinh dưỡng là cong phát hoa ở giai đoạn

non (7-10 ngày tuổi), khả năng nhân nhanh PLBs và tái sinh chỗi từ PLBs trong hệ

thống nuôi cấy ngập chim tam thời RITA®

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo PLBs từ cọng phát hoa giai đoạn còn non (7-10 ngày tuổi) và xác địnhmột vài thông số quan trọng ảnh hưởng tới hiệu quả nhân PLBs và tái sinh chổi củalan Mokara trong hệ thống nuôi cây ngập chìm tạm thời RITA®, từ đó xác địnhđược điều kiện nuôi cấy thích hợp cho từng giai đoạn phát triển nhăm tạo ra sốlượng lớn cây giống có chất lượng tốt trong thời gian ngắn, đáp ứng được nhu cầu

của thị trường.Nội dung nghiên cứu

Tạo PLBs từ mẫu phat hoa cây ex vitro: sử dụng hai loại cytokinin là BA và Kinetinở các nồng độ khác nhau

Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và NAA đến sự tăng sinh của PLBs vàsự tái sinh chéi từ PLBs trên môi trường thạch

Khảo sát ảnh hưởng của tan suất ngập chìm va thời gian ngập chìm tới sự tăng sinh

PLBs và tái sinh chdi từ PLBs trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA®

Khảo sát ảnh hưởng của mật độ PLBs tới sự tăng sinh PLBs và tái sinh chổi từ

PLBs trong hệ thống nuôi cây ngập chìm tạm thời RITA®

CHUONG 2

TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Sơ lược về đặc điểm của Mokara vàng chanh (Full moon)

Phân loại khoa học:Gidi: PlantaeNgành: AngiospermatophytaLớp: Monocotyledon

Bộ: OrchiddalesHo: OrchidaceaeTén lai: MokaraTén thuong mai: Mokara vang chanh

2.1.1 Nguồn gốc va phân boGiống hoa lan Mokara lai đầu tiên có tên là Mokara Wai Liang (ArachnisIsable x Ascocenda Red Gem) Tác giả của giỗng lan này là C.Y Mok từ Singapore,người đã đăng ký bản quyền giống lan này vào năm 1969 Nền tang cơ ban của việclai tạo này là tô hợp lai của ba giống bố mẹ: Arachnis x Vanda x Ascocentrum, nỗmang đặc tính nội trội từ bố mẹ là dạng hoa và màu sắc đẹp từ Vanda, tăng trưởngnhanh từ Ascocenda (Ascocentrum x Vanda) Giỗng lan Mokara vàng chanh (Fullmoon) có nguồn gốc từ Thái Lan [2]

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Lan Mokara vàng chanh là loài lan đơn thân, thân hình trụ dài, không có giả

hành, luôn mọc cao về phía đỉnh, sinh trưởng vô hạn Thân mang cả lá và rễ Lá dài

hình lòng máng hay hình trụ, mọc cách ở hai bên thân, lá dày và cứng, hai mép lá

hơi xòe ra Rễ trần mọc từ thân xen kẽ với lá, rễ xẻ bẹ lá chui ra ngoài dọc theochiều dài của cây, rễ ra nhiều, thân rễ lớn [2]

Phat hoa mọc từ nách lá giữa than, phat hoa dai, phân nhánh, đường kính phát

hoa lớn, số lượng hoa nhiều, có thé từ 10 -15 hoa/phát hoa Hoa màu vàng tươi, rực

rỡ, cánh hoa lớn va dày, đặc biệt trên cánh hoa thường có châm, có đôm rat đẹp.

2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng [8].

Nhiệt độ: Mokara vàng chanh thuộc nhóm lan ưa nóng Nhiệt độ thích hợp

ban ngày không dưới 21°C, nhiệt độ ban đêm không dưới 18°C.Ánh sáng: Mokara vàng chanh là loài cây ưa sáng Ánh sáng yếu làm chocường độ quang hợp giảm, cây thiếu dinh dưỡng và không ra hoa Cây sẽ phát triểntốt với độ che năng 50-60% ánh sáng tự nhiên

Am độ: Mokara vàng chanh cần độ 4m cao, mùa khô phải tưới đủ nước để

tránh hiện tượng rụng lá và giảm cường độ quang hợp.

Độ thông thoáng: môi trường thiếu thông thoáng dễ làm tăng bệnh cho lan.Trái lại ở nơi quá thoáng, sự thoát hơi nước cao, cây kém phát triển

Kiểu trồng: lan Mokara có thé được trồng trên lưới hay trên luống có chứa vỏ

đậu.

Tiêu chí chọn giống lan Mokara [8]:- Hoa đẹp, cánh to, nhiều hoa trên một phát hoa, màu sắc hoa rực rỡ.- Cây siêng ra hoa, liên tục quanh năm, cho tối thiểu 6-8 phát hoa/ năm

chính.

Phương pháp nhân giống [2], [8].Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi có thé ra hoa mat khoảng 4 năm hoặc

nhiều hơn tùy giống Tuy nhiên, một đặc điểm nỗi bật ở các cây họ lan là biến dị

xảy ra thường xuyên và dễ dàng, điều này đã giúp đem lại sự đa dạng cho các loàilan nhưng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân giống vì các cây con tạo thành từhạt không đồng nhất về mặt di truyền

Bên cạnh đó, việc nhân giống vô tính băng phương pháp tách chiết truyềnthống tạo được cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhângiống rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao.

Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô (in vitro): đây là phương pháp nhângiống chung được áp dụng cho lan rất hiệu quả Từ một cây mẹ ban dau có thé nhânra hàng ngàn cây con có kích thước va chất lượng đồng đều như nhau Kho khănlớn nhất trong nhân giống vô tính lan Mokara là nguồn mẫu rất hạn chế do chúng làlan đơn thân, sử dụng chổi đỉnh dé nuôi cây như nhiều loài lan khác sẽ làm tốnthương cây mẹ Hơn nữa, Mokara thường tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt cắt ramôi trường nuôi cay, gây độc cho mẫu

2.1.4 Tạo nguồn PLBs vô tinh.Protocorm là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi nhà quản lý Melchoior Treub

của vườn bách thao Bogor, Indonesia (hiện nay là vườn Kebun Raya), ông dung từ

này để chỉ ra một giai đoạn phát triển của rêu Sau đó, Noel Bernard dùng

protocorm cho các cây họ lan vào những năm 1899 - 1910 Hiện nay, protocorm

dùng dé mô tả những cấu trúc hình cầu nhỏ của lan hình thành từ hạt.Protocorm like bodies (PLBs) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu trúctương tự protocorm được hình thành từ mô sẹo nuôi cây in vitro Quá trình hìnhthành mới các PLBs có thé thu được bang cách cắt nhỏ các PLBs và cay lên môitrường tạo PLBs Sự hình thành PLBs từ những PLBs cũ cho thấy tầm quan trọngcủa PLBs trong công nghiệp nuôi cây mô lan

Hai nguồn vật liệu chính để tạo PLBs lan Mokara là chóp rễ và phát hoa Docầu trúc don thân đặc biệt, đỉnh sinh trưởng và chổi bên ít được dùng làm vật liệunuôi cây ban đầu vì sẽ gây tốn thương nặng đến cây mẹ

Sử dụng đầu rễ tạo nguồn PLBs vô tính

Các công trình của Park và cộng sự (2000), Michio Tanaka (1976), Tian Su

Zhou (1995, 1999), T W Yam (1991), M Kobayashi (1997) đều cho thấy chóp rễtuy là nguồn vật liệu khá dé tìm so với phát hoa nhưng hiệu suất tái sinh PLBs lạirất thấp (theo Park và cộng sự, 2002) [41]

Sử dụng phát hoa tạo nguồn PLBs vô tínhỞ lan Hồ điệp, phát hoa được dùng làm vật liệu tạo PLBs khá phổ biến thôngqua mô seo từ phát hoa, từ cụm chéi trực tiếp trên phát hoa hay từ lá trên chỗi củaphát hoa Trong thực té, người ta thường kết hợp sự tạo cụm chổi trực tiếp, sau đótạo PLBs từ các gốc chéi con và lá.

Tai sinh PLBs thong qua mồ seo từ phát hoa

Chin Chi-Lin (1986) đã cảm ứng tạo được mô seo tu bề mặt vết thương trênlát cắt phát hoa non trên môi trường MS bố sung | mg/l BAP Tuy nhiên, phươngpháp này cho hiệu quả không 6n định đồng thời hiệu suất biến dị cao do mô pháthoa là vùng có mức độ tập trung cao các tế bào biến dị kiêu đa bội hóa Tuy việccảm ứng tạo mô sẹo khá dễ dàng nhưng dang mô sẹo nay chỉ tôn tại trong thời gianngăn va khả năng tái sinh PLBs rất thấp (theo Park và cộng sự, 2002) [41]

Nghiên cứu của Tokuhara và Mii (2001) cho thay có thé cảm ứng mô sẹo trựctiếp từ chổi của phát hoa trên môi trường New Dogashima bố sung 0,1 mg/l NAA,10 g/l sucrose, 2 g/l Gellan Gum Mô sẹo sẹo được tạo ra cũng có hệ số tái sinh rấtthấp, môi trường cần được bồ sung day đủ các chất dinh dưỡng như khoai tây, nước

dira, [52].

Tái sinh PLBs từ cum chdéi trực tiếp trên phát hoaKhi tách các lá của chỗi in vitro từ phát hoa Hồ điệp 2 tháng tuôi nuôi cấy trênmôi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật sẽ hình thành nhiều chổi con.Những chéi này thường chỉ hoạt động sau khi đỉnh sinh trưởng chính bị hủy, đây làcơ sở cho việc sử dụng nông độ BAP cao để tạo cụm chồi trực tiếp từ chồi ngủ trênphát hoa, từ cụm chổi sau đó tao PLBs

Tái sinh PLBs từ lá trên chéi của phát hoaMichio Tanaka và cộng sự là những người đầu tiên thực hiện nghiên cứu tậptrung trên việc tối ưu hóa quy trình tạo chéi dinh dưỡng và nuôi cấy tạo chỗi từ lá.Tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao và không ứng dụng được trên nhiều gidng [47]

Năm 2002, Park và cộng sự khảo sát tối ưu hóa quá trình tạo PLBs từ lá, đưara quy trình hoàn chỉnh và kiểm chứng trên nhiều giống lan Hồ điệp khác nhau Các

yếu tố được tối ưu hóa gôm: nền khoáng, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thựcvật, nồng độ dudng, [41].

2.2 Hệ thong nuôi cay ngập chìm tạm thời

2.2.1 Giới thiệu

2.2.1.1 Nguyên tắc vận hành và cau trúc co bản của hệ thongTất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều tuân theo những điều

kiện sau (Teisson và cộng su, 1999) [49]:

-Tránh sự ngập liên tục vì đây là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinhtrưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy

- Cung cấp oxy đầy đủ cho mẫu cấy.- Toản bộ mẫu cấy có thé tiếp xúc với môi trường nuôi cấy

Tom lại, hệ thống nuôi cay ngập chim tạm thời thông thường có những bộphận chủ yếu sau:

- Bơm hay máy nén khí tạo áp lực dé hút môi trường từ ngăn chứa lên ngănchứa mẫu cay và ngược lại

- Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiến chu kỳ ngập.- Hệ thống ống dẫn và van điều khiến

- Các màng lọc.

- Bình nuôi cay thường băng nhựa polycarbonate hay thủy tinh.Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời,nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mụcđích nuôi cấy khác nhau.

2.2.1.2 Phân loại hệ thong nuôi cay ngập chim tạm thời [16]Hệ thống ngập chìm sử dụng trong vi nhân giống thực vật được mô tả và phânloại theo 4 nhóm chính theo cách thức vận hành như sau: hệ thống nuôi cấy ngậpchìm nghiêng lắc; hệ thống ngập chìm hoàn toàn có sự thay mới môi trường dinhdưỡng: hệ thống ngập chìm một phần có sự thay mới môi trường dinh dưỡng: hệthống ngập chìm hoàn toàn trong đó môi trường dinh dưỡng được bơm vào khu vựcnuôi cây và không có sự thay mới môi trường

Các hệ thống ngập chìm được phân loại dựa trên các yếu tố về kích thước bìnhnuôi cấy, loại giá đỡ, có hay không có sử dụng hệ thống máy vi tính để điều khiếnhay chỉ đơn giản điều khiển băng các máy hẹn giờ, cách thức vận chuyển môitrường (sử dụng bơm nhu động, bơm khí hay di chuyền bình chứa)

Những điểm khác biệt khác giữa các hệ thống ngập chìm là có hay không cóviệc tái sử dụng môi trường dinh dưỡng, sử dụng hai bình riêng biệt để dự trữ môitrường va tăng sinh mẫu cay hay chỉ sử dụng một bình Đặc điểm chung của các hệthống này là sử dụng những bình chứa có dung tích lớn hơn những bình chứa truyềnthống, trong suốt và có thé hấp khử trùng được Việc vận hành hệ thống nay đơngiản hơn các bioreactor truyền thống va cho phép kéo dải thời gian cấy chuyên.Những hệ thống nuôi cay ngập chìm cho phép lập trình chế độ ngập của mẫu cấy(ngập một phan hay ngập toàn phan) Các hệ thống ngập chim được chia làm 4 kiểuthiết kế như sau:

Hệ thong thùng nghiêng hay lắc.Có 2 hệ thống thuộc dạng này đã được thiết kế bởi Harris và Mason (1983):(1) hệ thong thùng nghiêng sẽ kéo bình tam giác nghiêng một góc 30° theo haihướng ngược nhau, một máy có thể kéo nghiêng khoảng 400 bình erlen dung tích50 ml hoặc 320 bình tam giác dung tích 125 ml; (2) hệ thống Rocker lăn 70 bình trụ

tròn miệng rộng có thé tích 910 ml trên các khay của hệ thống một góc 30° — 40° cứsau mỗi 30 phút Hai hệ thống này đều không có hệ thống bố sung môi trường mới

[30].

Hệ thong ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng (hình

2.1)

Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuôi cấy lớn có thé nâng

lên hạ xuống, môi trường được bơm vào và rút ra khỏi buông nuối cây theo chu kỳ

nhất định trong điều kiện vô trùng Hệ thống nuôi cay thực vật tự động (APCS) baogôm hệ thống ống bang silicone, hai bơm đây, hai bình thủy tinh chứa môi trường,một van inox ba chiều băng thép không gi, một buồng nuôi cấy và một bảng điềukhiến có gan bộ ngắt điện tự động Hệ thống này có thé sử dụng để nuôi cây thực

vật in vitro trong một thời gian dai [51].

PZ, ngan nuôi cấy

đất trên cao

:

\y /

Yy ƒ \ y / Ì môi trường\

bó loc đường

nah a ^ ae `

khí( dan mdi \| trudng

One Yo |

Siom 2 XS

|

bể chứa | I8 bể chứaa +:

môi trường | chất thai

Hình 2.1 Hệ thông APCS (Tisserat và Vandercook, 1985) [51]Hệ thong ngập chìm một phan và co chế thay mới môi trường dinh dưỡng.Trong hệ thống này, mô thực vật luôn được đặt nằm trên phía trên giá đỡ(agar, mang propylene, cellulose) Môi trường lỏng được bồ sung và rút khỏi bìnhnuôi cay Chỉ có phần dưới của mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường Hệ thongnày được phát triển thành 2 mô hình:

Mô hình 1: Mô hình Aitken — Christie va Jones (1987) [10] va Aitken —

Christie va Davies (1988) [9] gồm một hệ thống bình chứa bang polycarbonate có

kích thước 250 x 390 x 120 (mm) điều khiến bán tự động (hình 2.2) Trong hệthống nay, chồi Pinus spp được nuôi trên môi trường có giá thé agar với hệ thốngrút và bồ sung môi trường lỏng bang hệ thống bom theo một chu kỳ nhất định Môitrường lỏng vừa được bồ sung sẽ tiếp xúc với mẫu cấy trong khoảng thời gian 4 đến6 giờ bằng cách sử dụng máy hút chân không, sau đó môi trường sẽ được rút cạn.Mô hình này hoạt động trên cơ sở ảnh hưởng tích cực của việc b6 sung môi trườnglỏng hoặc auxin vào môi trường bán ran ở giai đoạn cuối của kỹ thuật nuôi cay invitro mà Maene và Debergh (1985) đã dé nghị trước đó.

9

sre

5 ——““nự

—.-—

Hình 2.2 Sơ đồ hệ thông nuoi cấy ban tự động (Aitken và cộng sự, 1987) [10]

1 Binh chứa 6 Cua ra môi truong

2 Bơm nhu động 7 Bê chứa môi trường3 Thì kế được cai đặt chương trình 8 Bê chứa chất thải

4 Cua thông thi 9 Cua thong khi5 Cua Vào cua moi rưởng

Mô hình 2: mô hình do Simonton và cộng su (1991) thiết kế gồm hệ thốngbơm điều khiến bang hệ thống vi tính có thé bơm môi trường lỏng vao bình nuôicấy có thể tích 7 lít theo chu kỳ (hình 2.3) Mẫu cay được đặt trên một tam lướipolypropylene gan vào thành bình nuôi cay Quá trình điều khiến thực hiện ở việc

nạp môi trường, độ sâu của mực chât lỏng, chu kỳ tuân hoàn của môi trường lỏng

10

và được điều chỉnh theo lịch trình trong suốt quá trình nuôi cấy Hệ thống có khảnăng điều khiến đồng thời 4 bình nuôi cấy [44].

bó lọc OES

: ngăn nuồi cấy

lươi lọcbom nhủ

không khí và không có sự thay moi moi truong

Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đócó những hệ thống nuôi cay ngập chim tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cảđều khá đơn giản và rất dễ sử dụng Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu cây đượctiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, đồng thời thành phần không khí trong bìnhnuôi được làm mới nhờ sử dụng bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp khôngkhí vào môi trường, vừa đây chất long ra vào bình nuôi cay Mau cấy được đặttrong bình nuôi thành một khối, giúp tiết kiệm thời gian đặt mẫu trên giá đỡ [12]

Môi trường lỏng được đây từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cấy vàngược lại nhờ một áp lực khí được bơm vào bình chứa chất lỏng Đề tránh sử dụngnhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình có cùng thể tích Áp suấtvượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với công tacđã được lập trình Điều nay cho phép xác định được thời gian va thời điểm bơm môi

trường vào ngăn chứa cây.

Do những hệ thống này không có bình chứa môi trường mới nên môi trườngnuôi cấy phải được thay mới sau 4 - 6 tuần Tuy nhiên việc thay đối này rất nhanhvà không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy Các biến thé khác nhau của hệ thong

này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA®, hệ

thống bình đôi (BIT) và hệ thống Plantima®

Hệ thống RITA®Hệ thống RITA® (hình 2.4) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa

dung tích 1 lít, có hai ngăn, ngăn trên chứa mau cấy và ngăn dưới chứa môi trườnglỏng Một áp suất khí dương được cung cấp vào ngăn dưới sẽ đây môi trường lỏngdâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏngnhanh hay chậm tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì Trong thời gianmẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí vẫn được cung cấp vào bình nuôi cấydưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới khônggian bên trong bình nuôi cấy Áp suất dương trong bình cay sẽ day không khí trongbình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình [48]

12

> Van điện (A) Bom ++ Màng loc

Hinh 2.4 Hé thong RITA® (Teisson và Alvard, 1995)[48]

Mô tả hoạt động cua hệ thống

Pha 1: Mô không ngập trong môi trường.

Pha 2: Các van mở ra cho khí đi qua các mang lọc day môi trường lỏnglên ngập mô cấy

Pha 3: Mẫu cấy tiếp xúc trực tiếp với môi trường lỏng.Pha 4: Chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống

ngăn bên dưới.

Hệ thống bình đôi BIT”Hệ thống bình đôi BIT® (hình 2.5) do Escalona và cộng sự (1998) [22] được

dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma; thiết kế chủ

yêu phục vụ cho việc nhân sinh khôi cơ quan do có thê tích bình chứa lớn hơn và có

giá thành thấp hơn Cách dé dàng nhất để vận hành hệ thống nuôi cay ngập chim sửdụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh hay plastic có dung tích từ 250 ml - 10 lít

băng một hệ thông ông dân, và điêu khiên tạo ra áp suât vượt mức dé đưa môi

trường vào bình chứa mẫu và ngược lại Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với

những yêu câu trên.

Hình 2.5 Hệ thông bình đôi BIT® (Escalona và cộng sự, 1998) [22]Hệ thống Plantima®

Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiêncó thay đối và cải tiến một số chỉ tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc Hệthống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo DaiLoan Cau tạo và phương pháp vận hành cơ bản (hình 2.6)

Hệ thống Bơm :

if

Hình 2.6 Hệ thống Plantima®

14

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Đề có thể thương mại hóa hệ thống nuôi cây ngập chìm tạm thời tự động, cầncó những số liệu cụ thể về mức độ tăng trưởng, sản lượng và chất lượng của sảnphẩm từ hệ thống này đồng thời có sự so sánh với những hệ thống nuôi cấy truyềnthống

2.3.1.1 Anh hướng của hệ thống nuôi cay ngập chìm tạm thời đến hiệu suấtsinh học của các kiểu vỉ nhân giống khác nhau

e Sự nhân choiHệ thống ngập chìm có tác dụng thúc day việc nhân chéi Aitken — Christie vàJones (1987) chứng minh rang bằng cách thay mới môi trường lỏng, kết quả sinhtrưởng của chổi cây thông (Pinus radiata) tốt hơn việc cây chuyền mỗi tháng trênmôi trường thạch Trong hệ thống này, chổi có thé tăng trưởng liên tục, vì thé chophép thu hoạch chổi sau mỗi tháng trong khoảng thời gian 18 tháng ma không cầncay chuyên Chéi thu được từ hệ thống nuôi cay ngập chìm tam thời có chất lượngtốt hơn va dài hơn so với chéi thu nhận trên môi trường bán răn [9] Một chứngminh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chim tamthời trong việc gia tăng số lượng chổi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây chuối(Musa nhóm phụ AAH) Đồng thời Alvard và cộng sự (1993) cho thấy rang việc sửdụng môi trường lỏng đã ảnh hưởng mạnh mẽ tới sự phát triển và hệ số nhân trongvi nhân giống cây chuối Khi so sánh các phương pháp nuôi cay lỏng với phươngpháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường bán ran, sau 20 ngay nuôi cấy kết quathu được như sau: những chéi nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc môi trường lỏngcó giá thé có hệ số nhân chéi rất thấp, những chéi nuôi cay trên môi trường thạchhay trong môi trường lỏng ngập chìm một phan có hệ số nhân là 2,2- 3,1, hệ sốnhân chổi cao nhất (>5) thu được trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thờiRITA® với 20 phút ngập chim sau mỗi 2 giờ [12]

Một nhóm tác giả người Cuba đã thu được kết quả tương tự trên đối tượng cây

chuối (Musa acuminata) khi sử dụng hệ thống bình đôi (Teisson và cộng sự, 1995)

[47] Chéi cây hoa anh dao (serviceberry) được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìmtam thời và được so sánh với mẫu cay trong môi trường thạch, môi trường lỏng tinhtrong các bình nhỏ, kết quả cho thấy nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thờicho số lượng chéi gấp 2,6 lần, trọng lượng mỗi chéi gấp 2,1 lần, chiều dài chỗi gấp1,2 lần và tong trong luong tuoi cla mau cay gap 2,2 lần [44].

Với cây mia (Saccharum spp.), Lorenzo và cộng su (1998) chứng minh ranghệ thống bình đôi sử dụng cơ chế ngập chim đã kích thích sự hình thành va kéo daichéi một cách rõ rệt, hệ số nhân (23,9 chdi/30 ngày) lớn gấp 6 lần hệ số nhân khinuôi cây trên môi trường ban rắn [37]: tương tự như vậy, Angela M Mordocco vàJean A Brumbley (2009) khi khảo sát sự nhân chỗi cây mía trong hệ thống RITA?đã đạt được trung bình 275 chồi/bình nuôi sau 45 ngày nuôi cay với chu kỳ 1 phút

ngập chìm sau mỗi 12 hoặc 24 giờ [13]

Escalona và cộng sự (1999) đã sử dụng hệ thống bình đôi để nuôi cây đỉnhsinh trưởng cây dứa (Ananas comosus), kết quả cũng cho thay phương pháp nuôicây ngập chim tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọnglượng khô sau 42 ngày nuôi cay Hệ số nhân tăng khoảng 300% so với nuôi caylỏng và 400% so với nuôi cay trên môi trường bán rắn Có gần 5000 cây dứa thuđược từ một hệ thống như vậy [23]

Các đỉnh chéi cây lan Porinera sp và Mitragyna inermis Willd được nuôi caytrong hệ thông ngập chim APCS phát triển nhanh hơn trên môi trường thạch Cả haithông số trọng lượng tươi và thé tích đều tăng gấp 4 lần ở cây lan Potinera sp.và 1,8lần ở cây Mitragyna inermis Willd sau 45 ngày nuôi cấy Thí nghiệm tương tự trêncây cúc sao (Callistephus hortensis) không thê hiện một sự khác biệt đáng kế giữacác hệ thống nuôi cấy, tuy nhiên cây tái sinh trong hệ thống ngập chìm tạm thời cóSứC sống tốt hơn khi ra ngoài vườn ươm (Tisserat B và Vandercook, (1985) [51]

Đối với cây cà phê (Coffea arabica va Coffea canephora), vi nhân giỗng trênmôi trường thạch cho hệ số nhân khoảng 6-7 lần sau 3 thang, chi sinh trưởng chậm

(Sondhal và cộng sự, 1989) [45] Khi sử dụng hệ thống RITA” hệ số nhân tương tự

có thé dat tới chỉ trong vòng 5 - 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995) [14]

l6

Đối với cây cỏ tranh Cymbopogon citratus (D.C) Stapf khi nuôi cấy trong hệthống ngập chìm tạm thời đạt được hệ số nhân chéi cao nhất (12,3) với chu kỳ 6 lầnngập chim/ngay, đồng thời giá trị gia tăng trọng lượng tươi cũng cao nhất (66,2 g).Tuy nhiên, trọng lượng khô (6,4 g) và chiều cao chổi (8,97 cm) cao nhất đạt đượcvới chu kỳ 4 lần ngập chìm/ ngày (Elisa Quiala và cộng sự, 2006) [21].

® Sự hình thành cu biSự sinh trưởng của cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) và sự hình thành củ

bi được kích thích trong hệ thống nuôi cay ngập chim tạm thời dạng bình đôi (Akitavà Takayama, 1994) Sau 10 tuần nuôi cấy, khoảng 500-600 củ khoai tây bi đượchình thành trong mỗi hệ thống, cao hơn những kết quả nuôi cấy trước đây (khoảng220 củ trong một mẻ nuôi cấy) Trọng lượng va độ đồng đều giữa các củ cũng đượccải thiện đáng kể Ngược lại trong điều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không có bất cứsự hình thành củ nao [11] Một thí nghiệm khác cũng trên đối tượng cây khoai tâyđược Teisson và Alvard (1999) thực hiện, sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời

RITA® Sau 10 tuần nuôi cấy, từ một mẫu cấy nốt đơn thân tác giả đã thu được 3 củ

khoai tây bi Khoảng 50% củ bi có trọng lượng trên 0,5 g đã nảy mam ngay trong hệthống, 3-4 chồi đã hình thành từ một củ, chứng tỏ đây là hệ thống nuôi cay nhanh và

hiệu quả [48].e Quá trình nhân phôi soma.

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm đã được ứng dụng để tăng sinh phôi soma và sosánh với các phương pháp nuôi cấy truyền thống như nuôi cấy trên thạch hay nuôicây huyền phù tế bào trong erlen Tisserat và Vandercook (1985) khi nghiên cứu sựsinh trưởng phôi cà rốt (Daucus carota) va cây cọ (Phoenix dactylifera) trong hệthống ngập chìm tạm thời APCS, áp dụng chế độ ngập chìm 5-10 phút sau mỗi 2giờ đã nhận thấy so với nuôi cấy trên thạch, sinh khối phôi soma tăng gấp 1,9 lần ởcây cà rốt và 4 lần ở cây cọ [50] Tương tự kết quả này khi thử nghiệm trên phôi củacây cà phê (Coffea arabica) với các kiêu gen khác nhau, phôi được nuôi cay tronghệ thống APCS tăng trưởng tốt hơn so với nuôi cay lắc trong erlen (Berthouly vacộng su, 1995) [14] Nghiên cứu gần đây của tác giả Sankar-Thomas và cộng sự

(2008) cũng cho thấy hiệu quả nhân phôi soma của cây Camptotheca acuminata

cũng được gia tăng đáng kế khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời RITA®

[43].

e Sự phát triển của phôi soma

Sản lượng và chất lượng phôi soma của nhiều loài thực vật đã được cải thiện

nhờ vao hệ thống nuôi cấy ngập chim tạm thời Trên cây Citrus deliciosa, Cabassonvà cộng sự (1997) đã so sánh quá trình phát triển phôi soma trong nhiều hệ thốngnuôi cay khác nhau Kết quả cho thay khoảng 60% phôi trên môi trường thạch pháttriển sang giai đoạn lá mầm nhưng có hiện tượng mọng nước Mẫu trong hệ thốngnuôi cấy lỏng lắc, tốc độ lắc 100 vòng/phút, ngăn cản sự hình thành của lá mầm vàvỏ mô phân sinh ngọn do phôi soma không thé phát triển tiếp sau giai đoạn phôi

hình cầu Trong hệ thống RITA®, su phat triển của phôi soma được kích thích, 66%

phôi soma phát triển lá mầm [17].2.3.1.2 Các thông số ảnh hưởng tới hiệu qua của hệ thong nuôi cấy ngập

chìm tạm thời.e Thoi gian ngập chim.

Trong các hệ thống nuôi cay chìm ngập tam thời, thời gian ngập chim là mộtthông số rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến sự hấp thu chất dinh dưỡng va hiệntượng thủy tinh thể của mẫu cấy Đối với các hệ thống nuôi cay khác nhau, thời

gian ngập chìm khác nhau tuy theo loài thực vật.

e Thể tích môi trường nuôi cấyThể tích môi trường lỏng cũng là một yếu tố quan trọng khi sử dụng các hệthống nuôi cay chìm ngập tạm thời mà không có sự thay mới môi trường như hệthống BIT®, hệ thống RITA® hay hệ thống nghiêng lắc Lorenzo và cộng sự (1998)đã tìm ra một thé tích môi trường dinh dưỡng tối thích cho sự tăng sinh chéi mía khinuôi cay trong hệ thống bình đôi BIT® Khi tiễn hành tăng thể tích môi trường nuôicay từ thể tích chuẩn ban đầu 5 ml lên 50 ml, hệ số nhân tăng từ 8,3 chổi/30 ngàylên 23,9 chồi/30 ngày, nhưng không làm tăng kích thước chôi Tiếp tục tăng thé tích

môi trường thì hiệu quả lại giảm đi Theo các tác giả, điêu này có thê được giải

18

thích là do có sự tiết ra các chất kích thích cho sự tạo chổi, và khi tăng thể tích môitrường lên quá nhiều thì nồng độ các chất này sẽ giảm đi [37] Tương tự, trong mộtthí nghiệm sử dụng cùng hệ thống BIT trên, Escalona và cộng sự (1999) đã chứngminh cần có một thé tích môi trường tối ưu cho quá trình nhân chồi dứa (khoảng200ml/ mẫu cay) và khi tăng thé tích lên nữa thì tỉ lệ tăng sinh giảm di [23].

e Thể tích của ngăn chứa mẫu cấyVới hau hết hệ thong nuôi cấy chìm ngập tạm thời, thé tích ngăn nuôi cay lớnhơn so với các phương pháp thông thường khác Hơn nữa, các thùng chứa có thểtích khác nhau từ 1 đến 20 lít thường đều có thể gắn được vào hệ thống Krueger vàcộng sự (1991) đã chứng minh kích thước bình nuôi cấy lớn (7 lít) cho kết quả tốthơn trong vi nhân giống cây serviceberry khi so sánh với nuôi cấy trong các bìnhnhỏ 140ml, trong đó đáng chú ý là việc tránh được hiện tượng quan thé được nuôicấy quá day, đồng thời thúc day sự kéo dai của chồi mầm [35] Monette (1983)cũng cho răng khi nuôi cấy Vitis vinifera L trong các bình chứa lớn sẽ thu đượcchéi dài hơn [39] Sự tăng trưởng của mẫu cấy cây nho trong môi trường lỏng sửdụng hệ thống nghiêng rất mạnh, vì thế Mason đã cần phải sử dụng bình chứamiệng rộng có thé tích 910 ml thay cho bình 125 ml để tránh tình trạng mật độ mẫunuôi cay trong bình quá dày, đồng thời việc này còn đem lại loi lich như tạo khoảngkhông gian rộng hon để dé di chuyển các mẫu nuôi cấy, thé tích môi trường lớn cònhạn chế sự thiếu hụt dinh dưỡng cho mau cấy (Harris va Mason, 1983) [30] Khi sửdụng những bình chứa càng lớn thì lượng môi trường lỏng có thể được dùng nhiềuhơn, điều nay có thé ảnh hưởng tốt đến sự tăng sinh và phát triển của mẫu thực vậtnuôi cay

e Luong oxy và sự thoáng khí

Thí nghiệm bởi Alvard và cộng sự (1993) [12] trên mô phân sinh chuối chứngminh sự thiếu khí oxy trong môi trường nuôi cấy lỏng là nhân tố chính hạn chế sựphát triển của mẫu cấy thực vật Trong thí nghiệm đó, nếu môi trường lỏng khôngđược khuấy trộn sẽ dẫn đến hiện tượng mô bị ngạt thở Sự sục khí vào sẽ giúp môphát triển tốt còn sự chìm ngập một phần mô thì không cung cấp đủ lượng oxy cần

thiết cho mô Trong khi đó, hệ thống chìm ngập tạm thời đã chứng tỏ là hệ thốngnuôi cấy có hiệu qua tốt nhất Tuy nhiên, đối với các hệ thông nuôi cay khác, hiệuquả của việc cung cấp khí không được chứng minh Aitken-Christie và Jones (1987)cho răng nếu chỉ cung cấp khí thì không đủ dé có thé thúc day sự phát triển chồi câythông, cũng như sẽ không phải là nhân tố góp phần vảo sự gia tăng khả năng pháttriển mà chủ yếu là nhờ sự bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng [10] Năm 1952,Stewart và cộng sự cho rang sự phát triển chéi sẽ tốt hơn nếu sử dụng một hệ thôngcung cấp khí oxy được cải tiễn thông qua việc thay đổi chế độ chìm ngập Tuynhiên, các lớp phim gan trên các bình tiếp nhận không hề có ảnh hưởng xấu đến sựphát triển của mô sau 2 tháng nuôi cây (theo Berthouly M, Etienne H (2005, [16]).

Trong các hệ thống sử dung phương pháp đây môi trường dinh dưỡng vào

bình chứa nhờ áp lực khí nén, phương pháp thông khí cưỡng bức này làm cho việc

thay mới không khí trong bình nuôi cay được xảy ra hoàn toan ở mỗi giai đoạnchìm ngập Theo Teisson và Alvard (1995), sự trao đối khí trong hệ thống như thếxảy ra đầu tiên ở suốt giai đoạn chìm ngập, và được gây ra gián tiếp nhờ sự chuyểnđộng của môi trường lỏng hoặc trực tiếp nhờ sử dụng bơm không khí, trong nhữngđiều kiện nuôi cấy thích hợp thường dùng để thay mới hoàn toàn không khí sau mỗi5 phút chìm ngập đối với các bioreactor thé tích 1 lít [47]

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Thế giới đã ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chim tạm thời trong nhân giốngcây trồng từ lâu, tuy nhiên công nghệ này mới được áp dụng tại Việt Nam trong vàinăm gan đây

Hệ thống này đã được tiến hành khảo sát trên các đối tượng như hoa lan, câythu hải đường và các giỗng kiếng lá

Năm 2007, Cung Hoàng Phi Phượng và cộng sự (Trung tâm công nghệ sinh

học Tp HCM) đã hoàn thiện qui trình nhân giống lan Phalaenopsis bang hệ thôngPlantima” Kết qua dat được như sau: tỉ lệ nhân PLBs gấp 2,27 lần so với nhân trênmôi trường thạch và gấp 1,2 lần so với môi trường lỏng lac; tỉ lệ chỗi gấp 3,37 lần

20

khi so sánh với nuôi cây trên môi trường thạch, từ | chổi ban đầu thu nhận được 10

chéi mới, cây con phát triển mạnh [5]

Cùng với những ưu điểm của hệ thống Plantima® và phát huy kết quả datđược,Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM đã tiễn hành ứng dụng hệ thongnuôi cay ngập chìm tam thời trong nhân giỗng cây kiếng lá Spathiphyllum sensationthuộc họ Araceae đã cho kết quả ban dau rất khả quan Sau 2 tháng nuôi cấy, cácmau cay sống 100% và có kha năng tái sinh chổi, chéi thu được có từ 3 - 4 lá, xanhmướt, hệ số nhân chéi gap 4 lần trên môi trường thạch [6]

Năm 2008, KS Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự ở Viện Khoa học Kỹ thuậtNông nghiệp Miền Nam đã ứng dụng thành công hệ thống bioreactor dạng ngậpchìm tam thời trong nhân chổi và PLBs hoa lan Dendrobium và Phalaenopsis Kếtquả thu được lượng chổi, PLBs cao hơn 3 đến 20 lần so với nuôi cây trên môitrường thạch, chổi khỏe, PLBs có màu xanh đậm [7]

Nghiên cứu của Nguyễn Đức Minh Hùng và cộng sự (2010) tại phòng thí

nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đớikhi sử dụng hệ thống nuôi cấy bioreacror bán chìm nổi dạng Plantima® (Dai Loan)trong nhân giống hoa lan Mokara cho kết quả tốt khi nhân cụm chỗi trên môi trườngMS có bồ sung BA (0,5 mg/l) + BI (5 mg/l) + nước dừa (10%) với 1 phút mẫu ngậpsau mỗi 2 giờ Môi trường nuôi cây phát sinh rễ cây Mokara tốt nhất trong thínghiệm là MS+NAA (1 mg/l) + BI (5 mg/L) + nước dừa (10 %) (Nguén- Tạp chíNông nghiệp và phát triển nông thôn ISSN 0866-7020 số 16/2011) [1]

Mai Thi Phuong Hoa và cộng sự (2011) đã thực hiện nghiên cứu nhân nhanh

protocorm like bodies (PLBs) va chéi hoa hoang lan, hồ điệp địa lan và ngọc điểmbang công nghệ bioreactor bán chìm nổi, kết quả thu được như sau: tần suất ngậpchìm 1 phút trong 4 giờ thích hop cho nuôi cấy nhân PLBs, tái sinh chổi và sinhtrưởng chéi Khi nuôi cay trong hệ thống bioreactor bán chìm nồi, hoa hoàng lan tỏ

ra thích hợp cho mục đích nhân chôi (6,6 chồi/mẫu) và sinh trưởng nhanh (chiều dài

lá 45 mm), lan hồ điệp, ngọc điểm thích hợp trong mục đích nhân PLBs và nhân

chôi.

Những thành công bước dau trong việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìmtạm thời trong nuôi cay mô góp phan phát triển nguồn cây giống nước ta lên tamcao mới; và phục vụ tốt cho việc sản xuất theo qui mô công nghiệp trong thời gian

Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thông này luôn có chất lượng tốthơn Từ đó, cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chim tạm thời có tỷ lệ sốngsót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm Có thénói hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm củahệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh đượcnhững hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liêntục hay trong hệ thống kín trên môi trường răn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh

dưỡng.

Chu kỳ và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự pháttriển của mẫu cấy cũng như toản bộ quy trình nhân giống Khi những chỉ số nàyđược tôi ưu hóa, sản lượng sẽ gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốthơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thé Đây là ưu điểm lớnnhất của hệ thống nuôi cay ngập chìm tạm thời so với hệ thống bioreactor thông

thường.

Hệ thống nuôi cây ngập chìm tạm thời tiết kiệm được công lao động và khônggian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất Những quá trình nhân nhanh

22

phôi soma, tái sinh chổi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượngcây trồng, từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng ké.

Nhược điểmMật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phan quan trọng nhưng hiện nayvẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng Thời gian ngập tối ưu phải được khảosát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng nhưthời gian giữa các lần cấy chuyển đối với những hệ thống không thể bố sung môitrường mới, cuối cùng là phải tối ưu hóa thành phan môi trường cho từng giai đoạnnuôi cay

Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngậpchìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấytrong những hệ thống này

Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được tác động của cácchất độc ngoại bảo hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trườngcủa mau cấy trong thời gian nuôi cay

Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cayngập chìm tạm thời tương đối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài nhưPháp Cuba, Dai Loan do đó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì những hệ thong nàynhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành Ngoàira, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưuhóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện nhưvậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng hệ thống nuôi cay ngập chim tam thời

rộng rãi trong sản xuât cây giông.

CHƯƠNG 3

VAT LIEU - PHƯƠNG PHAP

NGHIEN CUU

3.1 Vật liệu

Nguyên liệu tạo protocom like bodies (PLBs): cọng phát hoa còn non (7 đến10 ngày tuổi) của giống Mokara Vàng chanh (Full moon) nhập nội từ Thái Lan,trồng tại vườn sản xuất thực nghiệm Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nôngnghiệp công nghệ cao Tp HCM (ảnh ) Cây lẫy mẫu cọng phát hoa là các câyđược tuyển chon có các đặc điểm như cây phát triển tốt, rễ nhiều, ra rễ mới, lá xanhmướt, đang cho hoa 6n định với số lượng phát hoa từ 8-9 phát hoa/năm, hoa dep,

cánh to, trung bình từ 10-15 hoa/phát hoa, phát hoa có phân nhánh.

Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thốngbình nuôi cấy RITA® của hãng Cirad, Pháp Hệ thống này gồm có những bộ phậnchủ yếu sau: mỗi bình chứa có dung tích 1 lít, được chia làm hai ngăn: ngăn dướichứa môi trường và ngăn trên chứa mẫu, mẫu cay nằm trên tam lưới polypropylene.Trên nắp bình chứa có gan hai màng lọc khí chịu nhiệt (Midisart 2000, Sartorius),

đường kính lỗ mang lọc là 0,2um Bom hay máy nén khí (lưu lượng 20 lít/phút) tao

áp lực đây môi trường từ ngăn dưới chứa môi trường lên ngăn trên chứa mẫu vàngược lại Máy hẹn giờ tự động (timer) dùng để điều khiển chu kỳ ngập Hệ thốngống dẫn khí được làm từ silicone chịu nhiệt, các van điều khiến ba chiều bang thép