TÓM TẮT Trong nghiên cứu này huyền phù nano rutin nồng độ cao >5% được chuyển thành dạng bột bằng hai phương pháp sấy phun và đông khô từ 5 mẫu huyền phù nano rutin khác nhau với việc sử
TỔNG QUAN
CÔNG NGHỆ NANO
Thông thường, hạt dưới 1000 nm là hạt nano, tuy nhiên hạt dưới 100 nm được khuyến khích bởi những đặc tính vượt trội duy nhất mà hạt nano mới có Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng hạt với kích thước 20 – 50 nm có khả năng hòa tan cao nhất, khả năng hấp thu lớn nhất Tuy nhiên, trong dược phẩm, thuốc tạo bởi những hoạt chất và vật liệu polymer có nhiệt độ nóng chảy nhỏ hơn 300°C thì việc tạo ra hạt có kích thước trong khoảng 1 – 100 nm rất khó, do đó, cỡ hạt nhỏ hơn 300 nm được khuyến khích [27] Hạt nano có những tính chất đặc biệt và mang lại hiệu quả đáng kể khi ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm các hạt nano có thể phân phối thuốc vào tận sâu trong cơ thể, điều này có ý nghĩa rất quan trọng vì hạt nano tăng khả năng hấp thụ của thuốc [17]
1.2.2 Những ưu điểm của vật liệu nano
Vật liệu nano có những ưu điểm nổi bật so với vật liệu thông thường như [2, 28]:
• Diện tích bề mặt lớn
• Tăng khả năng lơ lửng và ổn định
• Dễ hấp thụ vào trong tế bào
1.2.3 Những phương pháp chính tạo ra vật liệu nano
Có nhiều phương pháp để tạo ra vật liệu nano, trong đó hai nguyên lý cơ bản là:
“từ trên xuống” và “từ dưới lên” Từ hai nguyên lý này, có thể tiến hành bằng nhiều phương pháp công nghệ và kỹ thuật để chế tạo vật liệu cấu trúc nano [27]
9 Hình 1.6: Phương pháp “từ dưới lên” và phương pháp “từ trên xuống”
1.2.3.1 Phương pháp từ dưới lên
Phương pháp này còn có tên gọi khác là phương pháp “build-up” Quy trình được bắt đầu bằng việc hòa tan vật liệu trong một dung môi xác định, sau đó bằng việc thay đổi độ phân cực của dung môi (đổi dung môi) hoặc cho dung môi bay hơi đột ngột, vật liệu sẽ kết tinh và vật liệu nano sẽ được tạo thành [27] Phương pháp này rất khó thực hiện vì dễ tạo ra kích thước micro và dung môi sử dụng đắt tiền Đồng thời, quá trình này lại phụ thuộc vào độ tan của thuốc trong dung môi Do đó không được ứng dụng nhiều [29]
1.2.3.2 Phương pháp “từ trên xuống”
Do việc áp dung phương pháp “bottom-up” gặp nhiều khó khăn trong nhiều trường hợp đặc biệt việc sản xuất thuốc, phương pháp “top-down” thường được sử dụng như một giải pháp thay thế Trong phương pháp này, thuốc sẽ được đưa về kích thước nano bằng cách dùng các lực vật lý [27] Do đó, phương pháp này còn có một tên gọi khác là “break-down”
• Đồng hóa trên tác dụng cơ học “xé”
Xé là phương pháp đồng hóa ở tốc độ cao, tạo lực xé mạnh nhờ các phương pháp, kỹ thuật truyền thống như nghiền, roto – stato, tua-bin,… Thích hợp khi phối trộn 2 pha, tạo pha phân tán rắn – lỏng, lỏng – lỏng Có 2 dạng quy trình liên tục và gián đoạn Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, có thể chuyển từ quy mô phòng thí nghiệm ra sản xuất công nghiệp Tuy nhiên việc giảm kích thước hạt của phương pháp này không cao do khó đạt đựợc độ đồng nhất trong toàn thể tích [27]
Sóng siêu âm tạo ra sự nổ bong bóng dưới áp suất chân không một cách mạnh mẽ và vô hướng Tại cường độ cao, sóng siêu âm lan tỏa khắp dung dịch gây ra sự xen kẽ các chu kì áp suất cao và áp suất thấp Trong suốt chu kì áp suất thấp, sóng siêu âm cường độ cao tạo ra một lượng lớn những bong bóng nhỏ và lan tỏa khắp trong dung dịch Khi bong bóng đạt đến thể tích mà tại đó nó không thể hấp thu thêm năng lượng nữa, chúng sẽ nổ tung trong suốt chu kì áp suất cao Sự giảm kích thước hạt là do lực cắt tạo ra bởi những bong bóng Tuy nhiên hiệu quả phương pháp này không cao nên không được ứng dụng rộng rãi [27]
• Đồng hóa áp suất cao
Có 2 loại chính : vi tầng sôi và đồng hóa kiểu piston-gap ắ Vi tầng sụi
Kỹ thuật vi tầng sôi vận hành theo nguyên lý dòng tia (jet-stream), hạt nano được tạo ra do sự va chạm trực diện của 2 dòng huyền phù ở áp suất cao trong đường ống hình chữ Y hoặc chữ Z Động lực của quá trình đồng hóa ở đây là lực va chạm của các hạt, lực xé và tạo bọt khí Phương pháp này thường cho hiệu quả không cao do thời gian đồng hóa lâu (có thể lên tới 75 chu kì) [2] ắ Phương phỏp đồng húa kiểu piston – gap
Hỗn hợp được nén bởi piston thông qua một khe hở nhỏ với áp suất lên đến 4000 bar, thụng thường dựng 1500 – 2000 bar Độ rộng của khe hở khoảng 5 – 20 àm Dũng chảy tốc độ cao của hỗn hợp gây ra sự tăng áp suất động cân bằng với sự giảm áp suất tĩnh xuống dưới áp suất của pha hơi Khi nước sôi tại nhiệt độ phòng, bong bóng được hình thành Chúng nổ tung ngay khi dung dịch rời khỏi khe hở tại áp suất thường Sự hình thành và nổ của bong bóng khí gây nên sóng xung kích Chính nhờ sóng xung kích, lực cắt mạnh cùng với dòng chảy hỗn loạn làm cho hạt giảm kích thước về nano [28, 30] Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đồng hóa áp suất cao:
- Dễ tạo hạt kích thước nhỏ
- Không gây ăn mòn vật liệu
- Được ứng dụng trong điều chế thuốc có độ hoà tan kém trong nước hay trong các dung môi hữu cơ
- Thiết bị đắt tiền làm tăng giá thành sản xuất
Hiện nay phương pháp “từ trên xuống” được sử dụng khá phổ biến nhờ thuận tiện và rẻ tiền [31] Trong nhiều nghiên cứu, phương pháp “từ trên xuống” mà đặc biệt là đồng hóa áp suất cao được sử dụng để tạo hệ huyền phù nano rutin do những ưu điểm của phương pháp đem lại [1, 32].
PHƯƠNG PHÁP TẠO BỘT
Hiện nay có nhiều phương pháp để chuyển các hệ huyền phù nano về dạng bột như: đông khô, sấy phun, sấy bằng vi sóng, sấy lò, sấy siêu tới hạn [33, 34] Trong các nghiên cứu gần đây, việc chuyển từ hệ huyền phù nano rutin về dạng bột chủ yếu dùng phương pháp : đông khô [1, 28].Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng hai phương pháp để chuyển hệ huyền phù nano rutin về dạng bột, cũng như để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và phương pháp đến tính chất của bột rutin
Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật đông khô là dựa vào sự thăng hoa của tinh thể nước Một quá trình đông khô thông thường diễn ra trong ba bước Đầu tiên sản phẩm được làm đông, để toàn bộ nước trong vật liệu đóng băng ở dạng tinh thể nước đá
Tiếp theo đó, quá trình đông khô được thực hiện để tách nước ra khỏi vật liệu Các tinh thể nước sẽ thực hiện quá trình bay hơi ở điều kiện nhiệt độ rất thấp (thường dưới 0°C) và kết hợp với áp suất chân không Trong quá trình này, nước bay hơi khỏi nguyên liệu từ trạng thái rắn sang hơi mà không thông qua trạng thái lỏng (thăng hoa)
Hầu hết nước tự do và một phần nước liên kết bị tách ra khỏi vật liệu trong giai đoạn này Kết thúc giai đoạn này, khoảng 95% đến 98% nước được tách ra khỏi vật liệu
Sau đó, quá trình tách nước tiếp tục chuyển sang giai đoạn thứ ba Trong giai đoạn này, chủ yếu tách phần nước liên kết còn lại trong vật liệu Tổng thời gian của quá trình đông khô có thể từ vài giờ đến vài ngày tùy thuộc vào loại cũng như kích cỡ nguyên liệu
12 Ưu và nhược điểm của phương pháp [33]:
- Là quá trình sấy tốt nhất để bảo đảm chất lượng sản phẩm Được sử dụng chủ yếu trong sấy dược phẩm, thực phẩm cao cấp
- Chi phí vận hành, năng lượng cao
Sấy là quá trình làm bốc hơi nước ra khỏi vật liệu dưới tác dụng của nhiệt Trong quá trình sấy, nước được tách ra khỏi vật liệu nhờ sự khuếch tán do:
• Chênh lệch độ ẩm giữa bề mặt và bên trong vật liệu
• Chênh lệch áp suất hơi riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh
Mục đích của quá trình sấy là làm giảm khối lượng vật liệu, tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn Sấy phun là một trong những công nghệ sấy công nghiệp chính do khả năng sấy nguyên liệu từ dạng lỏng sáng dạng bột khá đơn giản, dễ dàng kiểm soát nhiệt độ và định dạng hạt sản phẩm một cách chính xác Thiết bị sấy phun dùng để sấy các dạng dung dịch và huyền phù trong trạng thái phân tán nhằm tách ẩm ra khỏi vật liệu giúp tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn [34] Ưu và nhược điểm của sấy phun [35]:
- Năng suất cao - Thời gian sấy nhanh
- Chi phí vận hành, năng lượng thấp
- Quá trình sấy dùng hơi đốt ở nhiệt độ cao Có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
Nhóm Mueller và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm nâng cao nồng độ rutin trong huyền phù lên đến 10% Phương pháp sử dụng là nghiền kết hợp đồng hóa cao áp với sự hỗ trợ của một số chất hoạt động bề mặt khác nhau Hệ huyền phù nano rutin được tiến hành bằng máy đồng hóa cao áp ở áp suất 1500 bar trong 20 chu kỳ Kích thước hạt đạt được từ 500 nm đến 900 nm [1]
Bảng 1.1: Công thức của hệ huyền phù rutin
1.4.2 Khả năng tái hòa tan của bột nano rutin
Từ hệ nano rutin tạo được, nhóm nghiên cứu của Rainer H.Müller tiếp tục tạo ra thuốc dạng viên nén nano rutin [1] Khả năng tái phân tán của những viên nén này sau đó đã được tái khảo sát Theo như kết quả so sánh về kích thước hạt giữa hệ huyền phù ban đầu và hệ huyền phù tạo từ các viên nén nano rutin rất ít sai lệch giữa 2 kết quả được ghi nhận Qua đó đã chứng minh được khả năng tái phân tán của các hạt nano rutin trong các viên nén Tính chất này cho phép bột nano rutin có thể được sự dụng dưới các hình thức khác nhau như viên nén, viên nang trong các quá trình điều trị bệnh
14 Hình 1.7: Kết quả kích thước hạt (LD) của hệ huyền phù sau khi tạo thành (trái) và hệ huyền phù tạo thành từ viên nén nano rutin (phải) Thanh sai số (error bar) thể hiện sự sai lệch của kết quả sau 3 lần đo
Hình 1.8: Hình ảnh của rutin thô (a) và các tinh thểnano rutin sau khi đồng hóa áp suất cao (b) được chụp bằng kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần)
1.4.3 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, các đề tài nghiên cứu rutin chủ yếu là xây dựng quy trình trích ly, tinh chế và khảo sát hoạt tính sinh học của hoạt chất nguyên chất hay các dẫn xuất của rutin và rất ít đề tài nghiên cứu hệ phân tán kích thước nano của rutin Nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh dựa trên thiết bị của Mueller và Mauludin, sử dụng Tween80 làm chất hỗ trợ phân tán, khác biệt là nhóm có sử dụng hỗ trợ thêm ethanol, và đạt được kích thước 10 nm (TEM) sau khi đồng hóa áp ở 500 bar, 15 chu kỳ [36] Khi tăng nồng độ rutin lên 5%, nhóm đã sử dụng các chất hoạt
15 động bề mặt như: SSL, PEG [9] Tuy nhiên kết quả của nghiên cứu này chỉ mới là bước đầu tạo hệ huyền phù nồng độ cao, chưa quan tâm khảo sát đến độ bền và ổn định của hệ phân tán theo thời gian nên khả năng định hướng ứng dụng chưa cao Vì vậy, mục tiêu của đề tài là đưa về sản phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun và đánh giá các tính chất của chúng nhằm định hướng cho các ứng dụng về sau
THỰC NGHIỆM
MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Từ các kết quả nghiên cứu tạo hệ phân tán nano rutin ở nồng độ rutin cao (khoảng 5%), mục tiêu luận văn là nghiên cứu đưa về sản phẩm dạng bột bằng hai phương pháp sấy phun và đông khô, các sản phẩm dạng bột này được đánh giá các tính chất nhằm định hướng cho các ứng dụng về sau
Với các mục tiêu trên, nội dung cơ bản của luận án bao gồm các nội dung sau:
• Chuẩn bị các hệ huyền phù nano rutin
• Đánh giá tính chất hệ huyền phù rutin: kích thước hạt, hàm lượng rutin
• Đưa hệ huyền phù nano rutin về dạng bột bằng phương pháp sấy phun và đông khô
• Đánh giá ngoại quan, hình thái hạt và khả năng tái phân tán của bột nano rutin trong các môi trường giả lập điều kiện sử dụng
• So sánh và đánh giá sự ảnh hưởng của phương pháp tạo bột, thành phần phụ gia đến độ phân tán của bột nano rutin.
DỤNG CỤ HÓA CHẤT THIẾT BỊ
Tạo huyền phù và bột rutin các thiết bị đã được sử dụng :
• Máy đồng hóa cầm tay Phillips (HR 1361)
• Máy đồng hóa cao áp (APV 2000)
• Thiết bị sấy phun GEA Niro-2002 (Đan Mạch)
• Thiết bị sấy đông khô FD5508 ILshin (Hàn Quốc) Để phân tích đánh giá nguyên liệu, hệ huyền phù, bột sản phẩm, đã sử dụng một số máy:
• Máy đo độ ẩm (Satorius M45)
• Máy HPLC Agilent 1260 (sắc ký lỏng hiệu năng cao)
• Máy phân tích nhiễu xạ XRD (D8 Advance Bruker)
• Máy đo màu (Minolta CR 300)
• Máy đo kích thước hạt (Horiba LA – 950V2)
• Kính hiển vi điện tử quét SEM (SU6600 Hitachi)
Các nguyên liệu sử dụng và các tính chất, nguồn gốc như sau:
Bảng 2.1: Đặc tính của nguyên liệu, hóa chất sử dụng Nguyên liệu Nguồn gốc, tính chất
Rutin nguyên liệu Công ty Dược Khải Hà (Việt Nam) Độẩm 5,7%, độ tinh khiết 95%, mức độ tinh thể cao kiểm tra bằng XRD (các kết quả chi tiết trình bày trong Phụ lục 1)
Chitosan Cần Thơ (Việt Nam)
Phân tử lượng thấp Mn = 24,42 kDa, Mw = 48,01 kDa, Mv 48,01 kDa; độ deacetyl hóa 82,3%; mức độ tinh thể cao kiểm tra bằng XRD (các kết quả chi tiết trình bày trong Phụ lục 2)
Ethanol 99% Nguyên liệu thực phẩm- Việt Nam SSL (sodium stearoyl lactylate)
Nguyên liệu thực phẩm -Trung Quốc
Glutaraldehyde Merck - Đức Axit acetic Trung Quốc STPP - Sodium tripoly phosphate
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Đánh giá độ ẩm Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng máy đo độ ẩm SATORIUS MB45 tại phòng thí nghiệm bộ môn Hữu Cơ, trường đại học Bách Khoa TP.HCM Khoảng 1g rutin được sử dụng cho mỗi lần đo, và độ ẩm của nguyên liệu sẽ là kết quả trung bình
Trong đó w : độ ẩm trung bình của nguyên liệu (%) n : số lần đo wi: độ ẩm của lần thí nghiệm thứ i th (%) Điều kiện cài đặt khi khi đo mẫu:
- Thời gian: 0,0 phút (ở chế độ mặc định, kết quả được lấy sau khi trọng lượng của mẫu không thay đổi trong 60 giây)
2.3.2 Phân tích nhiễu xạ XRD
Cấu trúc tinh thể của mẫu bột rutin được kiểm tra bằng phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X Nhiễu xạ được đo bằng máy XRD D8 Advance Brucker, máy sử dụng bức xạ Cu Kα Mẫu được đo tại các góc 2θ từ 5 o đến 40 o Kết quả nhiễu xạ của Rutin nguyên liệu sẽ được so sánh với với xạ của rutin chuẩn trong cơ sở dữ liệu của máy
Mẫu được đo tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ Thuật Hữu Cơ, trường Đại Học Bách Khoa Tp HCM
2.3.3 Màu sắc ngoại quan LCh
Trong không gian màu LCh thì L biểu thị độ sáng, C là cường độ màu và h là góc tông màu
Góc màu được biểu diễn trên vòng tròn màu, theo chiều ngược kim đồng hồ, có những giá trị đặc biệt sau:
0° hay 360°: màu đỏ 90°: màu vàng
180°: màu xanh lục 270°: màu lam
2.3.4 Phân tích hình thái, kích thước bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Các hệ nano rutin dang bột sẽ được đánh giá cảm quan để so sánh sơ lược về các hệ huyền phù cũng như phương pháp tạo bột Bên cạnh đó, bột được chụp SEM để đánh giá hình dạng, sự kết chùm và kích thước của nano rutin
Mẫu được đo trên kính hiển vi điện tử quét FE-SEM S4800 Hitachi tại phòng thí nghiệm thuộc Khu Công nghệ cao (SHTP) tại thành phố Hồ Chí Minh
2.3.5 Phân tích phân bố kích thước hạt
Kích thước hạt được đo bởi máy Horiba LA950V2 tại PTN Trọng điểm Nghiên cứu Cấu trúc Vật liệu, trường ĐH Bách Khoa- ĐHQG TPHCM Thực hiện việc kiểm tra kích thước hạt cho cả nano rutin ở dạng huyền phù
Trường hợp mẫu ở dạng bột của nano rutin, mẫu sẽ được phân tán lại trong dung dịch ở các dung dịch đệm có pH khác nhau trong phân đánh giá khả năng phân tán (trình bày chi tiết trong phần 2.3.7)
2.3.6 Phân tích hàm lượng rutin trong mẫu
Sử dụng sắc ký hiệu năng cao (HPLC) để đánh giá hàm lượng rutin trong mẫu
Các phân tích được thực hiện trên máy sắc ký hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 thực hiện tại PTN Trọng điểm Nghiên cứu Cấu trúc Vật liệu, trường ĐH Bách Khoa- ĐHQG TPHCM
Phương trình đường chuẩn của rutin và quercetin được xây dựng để xác định hàm lượng rutin trong nguyên liệu Do đó, bước đầu tiên là xây dựng đường chuẩn giữa nồng độ và diện tích peak của rutin, quercetin chuẩn Rutin và quercetin chuẩn được pha trong methanol với các nồng độ chính xác Bằng phân tích phổ HPLC, phương trình đường chuẩn miêu tả mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ rutin quercetin sẽ được xây dựng bằng phương pháp bình phương cực tiểu Từ đó, độ tinh khiết của rutin nguyên liệu ban đầu sẽ được xác định
Thông số của thiết bị và chương trình phân tích được trình bày trong bảng 2.2:
Bảng 2.2: Bảng thông số vận hành trên hệ thống HPLC
Thông tin về máy HPLC
- Bộ lọc bọt khí chân không, bơm 4 cấp
- Có bộ phận ổn định nhiệt độ cột
- Cột pha đảo C18 (150ì4,6 mm, 5àm)
- Dung dịch 0,3% phosphoric acid trong nước (A), acetonitrile (B) và methanol (D)
- Tốc độ dòng 1 ml.min -1
Gradient rửa giải của pha động
Bước sóng - Đối với rutin: 254 nm, 360 nm
- Đối với quercetin: 360 nm, 375 nm
*Xác định hàm lượng rutin trong mẫu rắn:
Cân chính xác khoảng 22mg mẫu dạng bột vào bình định mức 100ml, thêm 70ml methanol, lắc mạnh và siêu âm (nếu cần) để hòa tan hoàn toàn Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15 phút rồi định mức bằng cùng dung môi sau đó lọc qua giấy lọc 0,45àm Cho dịch lọc vào lọ phõn tớch và tiến hành phõn tớch bằng HPLC
Công thức tính toán hàm lượng rutin trong hệ:
P’, : hàm lượng rutin trong hệ và hàm lượng rutin chuẩn (%)
: khối lượng rutin phân tích dựa trên đường chuẩn (mg)
C: nồng độ của mẫu phân tích dựa trên đường chuẩn (mg/ml)
D: thể tích pha mẫu (ml) m: khối lượng mẫu cân ban đầu (mg) w: độ ẩm của mẫu phân tích (%)
2.3.7 Đánh giá khả năng phân tán lại
Khả năng phân tán lại của bột nano rutin được đánh giá trong 3 môi trường pH khác nhau là 1,2; 4,5 và 6,8 nhằm mô phỏng lại các điều kiện pH khi đưa vào sử dụng trên cơ thể con người [37, 38]
* Chuẩn bị các dung dịch đệm [39]:
• Dung dịch đệm pH = 1,2 được chuẩn bị bằng cách sử dụng 11,7 g NaCl hòa tan trong 85 ml dung dịch HCl 1N và định mức đến 2000 ml bằng nước cất
• Dung dịch đệm pH = 4,5 được chuẩn bị bằng cách sử dụng 13,6 g KH 2 PO 4 hòa tan trong 1500 ml nước cất sau đó điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl 1N hoặc NaOH 1N (nếu cần) và định mức đến 2000 ml bằng nước cất
• Dung dịch đệm pH = 6,8 được chuẩn bị bằng cách sử dụng 13,6 g KH 2 PO 4 hòa tan trong 45 ml dung dịch NaOH 1N và định mức đến 2000 ml bằng nước cất
Phương pháp chuẩn bị mẫu được tiến hành tương tự như nội dung đánh giá độ hoà tan của thuốc được quy định trong Dược điển Mỹ [40]
Cho 100 mg bột nano rutin vào bình cầu chứa 900 ml dung dịch đệm, tốc độ khuấy 100 vòng/ phút, nhiệt độ dung dịch là 37 o C 0,5 o C Sau 60 phút, dừng quá trình phân tán và tiến hành lấy mẫu để xác định độ phân tán Dùng pipet 10ml lấy mẫu khoảng giữa của lớp dung dịch đệm rồi đem lọc qua giấy lọc thông thường để loại bớt những hạt kích thước lớn Mẫu được đánh giá theo 2 cách:
• Đánh giá phân bố kích thước hạt: hỗn hợp được đánh giá bằng tán xạ ánh sách theo phương pháp trình bày trong phần 2.3.5
• Đỏnh giỏ độ phõn tỏn: lấy một thể tớch mẫu lọc qua màng lọc 0,45àm rồi tiến hành phân tích bằng HPLC theo chương trình phân tích khi phân tích nguyên liệu Khả năng phân tán đánh giá bằng tỷ lệ rutin đã qua lưới lọc 0,45àm so với lượng rutin ban đầu trong mẫu Độ phõn tỏn được tớnh theo công thức sau:
C: nồng độ mẫu phân tích dựa trên đường chuẩn (mg/ml)
D: thể tích pha mẫu (ml) P’, : hàm lượng rutin trong hệ và hàm lượng rutin chuẩn (%) m: khối lượng cân nano rutin (mg) w: độ ẩm của mẫu nano rutin (%)
Mỗi mẫu được thực hiện lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
NỘI DUNG THỰC NGHIỆM
2.4.1 Chuẩn bị hệ huyền phù nano rutin
Các điều kiện thực hiện các hệ huyền phù nano rutin trong nghiên cứu này là các điều kiện tối ưu cho từng hệ huyền phù và đã được khảo sát trong các đề tài nghiên cứu trước đó của PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan
5 dạng mẫu huyền phù nano rutin được chuẩn bị có ký hiệu như sau:
• SE: Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi SSL và ethanol
• P: Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi PEG400
• PC: Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi PEG400 có bổ sung chitosan
• PCP: Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi PEG400 có bổ sung chitosan và tác nhân tạo liên kết ngang STPP
• PCG: Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi PEG400 có bổ sung chitosan và tác nhân tạo liên kết ngang glutaraldehyde
Các hệ được tạo thành theo quy trình được thể hiện trong hình 2.1
Hình 2.1: Qui trình tạo huyền phù nano rutin
Chi tiết cách chuẩn bị các hệ huyền phù bao gồm:
*Hệ huyền phù hỗ trợ bởi SSL và ethanol (mẫu SE) [41] Để tạo hệ huyền phù này, trước hết cho 15g rutin nguyên liệu trong 50ml ethanol và khuấy đều (pha A) Cho từ từ pha A vào 260ml nước cất (pha B) đã được ổn định ở 70 o C trong bể ổn nhiệt, vừa cho vào vừa khuấy nhẹ và đợi 10 phút cho hỗn hợp ổn định nhiệt Tiến hành đồng hóa sơ cấp bằng máy đồng hóa cầm tay Phillips trong tổng thời gian 15 phút với tốc độ 13500 vòng/ phút
Hòa tan 2g SSL vào trong 40ml nước cất (pha C) và cho vào hỗn hợp trên, tiếp tục đồng hóa bằng máy Phillips trong tổng thời gian 10 phút ở cùng tốc độ Sau đó, hỗn hợp này được đồng hóa cao áp bằng máy APV2000 trong 15 chu kỳ ở áp suất 700 bar Kết thúc quá trình sẽ thu được hệ huyền phù có hỗ trợ ethanol và SSL
Huyền phù nano rutin Đồng hóa cao áp
Gia nhiệt Đồng hóa sơ cấp 1
Hòa tan Đồng hóa sơ cấp 2 Đồng hóa sơ cấp 3
*Hệ huyền phù hỗ trợ bởi PEG400 (mẫu P) [42]
Cân 15g rutin nguyên liệu và 0,3g PEG400 cho vào trong cốc chứa 40ml nước (pha A), khuấy đều hệ Sau đó, cho từ từ hỗn hợp vào trong cốc chứa 260ml nước (pha B) đang được ổn định ở 70 o C trong bể ổn nhiệt, vừa cho vào vừa khuấy nhẹ và đợi khoảng 10 phút cho hệ ổn định nhiệt Tiến hành đồng hóa sơ cấp bằng máy đồng hóa cầm tay Phillips trong tổng thời gian là 15 phút với tốc độ 13500 vòng/ phút Sau đó, hỗn hợp này được đồng hóa tiếp tục bằng máy đồng hóa cao áp APV2000 với áp suất khoảng 700 bar trong 15 chu kỳ Hệ huyền phù nano rutin có hỗ trợ bởi PEG-400 được tạo thành khi kết thúc quá trình
*Hệ huyền phù hỗ trợ bởi PEG400 và chitosan (mẫu PC) [43]
Cho 15g rutin nguyên liệu vào 40ml nước và khuấy trộn đều (pha A) Cho từ từ pha A và 260ml nước cất (pha B) đã được ổn định ở 70 o C, vừa cho vừa khuấy nhẹ
Sau 10 phút, tiến hành đồng hóa sơ cấp với máy đồng hóa cầm tay Phillips trong tổng thời gian 15 phút ở tốc độ 13500 vòng/ phút
Cân 0,75g chitosan hòa tan vào 75ml CH 3 COOH 2% (pha C) Cho pha C vào hỗn hợp trên và tiến hành đồng hóa sơ cấp lần 2 với máy đồng hóa cầm tay trong 10 phút và tốc độ 13500 vòng/ phút Đồng hóa cao áp ở áp suất 700 bar trong 15 chu kỳ của hỗn hợp sau khi đồng hóa sơ cấp lần 2 Kết thúc quá trình, hệ huyền phù nano rutin có hỗ trợ bởi PEG-400 và chitosan được hình thành
*Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi PEG400 và chitosan và tác nhân tạo liên kết ngang glutaraldehyde (Mẫu PCG) [44]
Qui trình tạo hệ huyền phù nano rutin này tương tự như hệ huyền phù có hỗ trợ PEG-400 có bổ sung chitosan nhưng sau khi đồng hóa sơ cấp lần 2 thì thêm 0,075g glutaraldehyde và đồng hóa sơ cấp lần 3 trong 10 phút và tốc độ 13500 vòng/ phút
Sau đó, hệ được đồng hóa cao áp ở áp suất 700 bar trong 15 chu kỳ
Glutaraldehyde tạo phản ứng với chitosan tạo thành những khung như trong hình 2.2 bao quanh hạt nano rutin
25 Hình 2.2: Phản ứng tạo liên kết ngang của glutaraldehyde với chitosan
*Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi PEG400 và chitosan và tác nhân tạo liên kết ngang STPP (Mẫu PCP) [44]
Thay 0,075g glutaraldehyde trong hệ huyền phù nano rutin bằng 0,125g STPP thì tạo được hệ huyền phù nano rutin có hỗ trợ PEG400 có bổ sung chitosan và tác nhân tạo liên kết ngang STPP
Tương tự như glutaraldehyde, STPP cũng phản ứng với chitosan để tạo ra những khung bao quanh hạt nano rutin (Hình 2.3)
Hình 2.3: Phản ứng tạo liên kết ngang giữa STPP với chitosan
Thành phần chi tiết các chất tạo thành hệ huyền phù được trình bày trong bảng 2.3
Bảng 2.3: Thành phần các chất của hệ huyền phù rutin
Pha Thành phần Khối lượng (hay thể tích) Mẫu P
Rutin 15g PEG400 0,3g Nước cất 40ml B Nước cất 260ml
Rutin 15g PEG400 0,3g Nước cất 40ml B Nước cất 260ml
Nước cất 40ml B Nước cất 260ml
Rutin 15g PEG400 0,3g Nước cất 40ml B Nước cất 260ml
Các mẫu huyển phù được đánh giá ngoại quan và phân bố kích thước hạt theo phương pháp trình bày trong phần 2.3.5 Nồng độ pha rắn trong huyền phù cũng được kiểm tra bằng cách đo độ ẩm đã trình bày trong phần 2.3.1
2.4.2 Chuyển huyền phù nano rutin thành dạng bột
Các hệ huyền phù nano rutin sẽ được đưa hệ huyền phù về dạng bột bằng hai phương pháp đông khô và sấy phun
Hút 4-5ml huyền phù nano Rutin cho vào các chai bi nhỏ (10 ml) Sau đó sẽ được đưa vào máy sấy đông khô để chuyển huyền phù nano rutin về dạng bột Quá trình sấy đông khô được thực hiện ở thông số trong bảng Tất cả bột sau khi tạo thành được chuyển vào bình thủy tinh lớn hơn và đậy kín
Nội dung này được thực hiện trên máy đông khô FD5508 ILshin (Hàn Quốc) tại Viện kiểm nghiệm thuốc Tp HCM
Bảng 2.4: Thông số đông khô sử dụng cho máy FD5508 ILshin
Thời gian duy trì (giờ) Đông lạnh - 45 4
Tương tự như đối với sấy đông khô các hệ huyền phù sẽ được đưa vào máy sấy phun GEA Niro-2002 (Đan Mạch) Nhiệt độ đầu vào của khí sấy khoảng 160 o C, nhiệt độ đầu ra của khí sấy khoảng 60 o C, và áp suất đầu phun là 3 bar, lưu lượng đầu vào 30ml/phút
Nội dung này thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm Đại học Bách khóa Tp HCM
2.4.3 Đánh giá tính chất bột nano rutin
Các tính chất được đánh giá bao gồm:
• Ngoại quan: hình dáng, màu sắc
• Tính chất vật lý: Độ ẩm, nhiệt độ nóng chảy
• Khả năng phân tán lại trong các môi trường pH khác nhau
Các mẫu bột được quan sát, đánh giá ngoại quan và đo màu sắc trên máy Minolta CR300 với hệ đo CIE-LCh Độ ẩm mẫu được đánh giá theo phương pháp trên phần 2.3.1 Hình thái kích thước mẫu bột được đánh giá bằng SEM phần 2.3.4 Khả năng phân tán lại được đánh giá theo phương pháp trình bày trong phần 2.3.7
2.4.4 So sánh và đánh giá
Các kết quả đánh giá tính chất của bột nano rutin được tổng hợp, so sánh và đánh giá giữa hai phương pháp tạo bột là sấy phun và đông khô:
• Ngoại quan: hình dáng, màu sắc
• Tính chất vật lý: Độ ẩm, nhiệt độ nóng chảy
• Khả năng phân tán lại trong các môi trường pH khác nhau
