Bài viết Nghiên cứu tổng hợp và đặc trưng nano rutin trình bày ảnh hưởng của nồng độ chất tham gia phản ứng; Hình dạng và kích thước hạt; Đặc trưng nhóm phân tử bằng phổ FTIR; Xác định hàm lượng rutin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
SCIENCE - TECHNOLOGY P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ ĐẶC TRƯNG NANO RUTIN STUDY ON PEPARATION AND CHARACTERIZAITION OF RUTIN NANOPARTICLES Vũ Duy Hiển1,*, Quản Thị Thu Trang , Nguyễn Bình Dương1 DOI: https://doi.org/10.57001/huih5804.50 TĨM TẮT Nano rutin tổng hợp phương pháp tạo phức vùi với cyclodexxtrin, phần rutin tự tạo micelle với casein Hệ nano không bị suy giảm qua dày, giải phóng cách hiệu ruột, làm tăng khả hấp thụ sinh khả dụng Các thông cần khảo sát hàm lượng rutin, cyclodextrin casein để tạo hệ nano có hàm lượng rutin cao nhất, kích thước nhỏ 100nm phân tán tốt nước Hàm lượng rutin khảo sát theo tỷ lệ phần trăm trọng lượng 10%, 13%, 15%, 17% 20% Lượng casein không thay đổi với giá trị 5% trọng lượng Lượng CD tham gia tương ứng 85%, 82%, 80%, 78% 75% Các đặc tính hệ nano xác định phương pháp SEM, FTIR, HPLC DSC Kết tổng hợp thành công hệ nano rutin, hạt nano có kích thước đồng nằm khoảng 30 - 100nm Hàm lượng nano rutin thích hợp 15%, cyclodextrin 80%, casein 5% Điều kiện thích hợp phản ứng nhiệt độ 80oC, thời gian phản ứng giờ, tốc độ khuấy 200 - 300 vòng/phút Từ khóa: Rutin, Cyclodextrin, Casein, hệ phức vùi, hạt nano ABSTRACT Nanorutin has been synthesized by the method for inclusion complex formation of cyclodextrin the inclusion complexation method with cyclodextrin, a part of free rutin that will form micelles together with casein This nanorutin is not degraded by gastric passage and is effectively released in the intestine, increasing absorption and bioavailability The parameters were investigated including rutin, cyclodextrin, and casein content to create a nanosystem with the highest content of rutin, particle size smaller than 100 nm, and good dispersion in water Surveyed rutin content was 10%, 13%, 15%, 17% and 20% by weight The casein was 5% constant The number of participating CDs is 85%, 82%, 80%, 78% and 75%, respectively The nanosystem was evaluated for its physicochemical and thermal characteristics using SEM, FTIR, HPLC, and DSC methods As a result, the rutin nanosystem has been successfully synthesized, the nanoparticles have uniform size (30 - 100nm) The appropriate nanorutin content is 15% rutin, 80% cyclodextrin, 5% casein Optimum reaction conditions for nanorutin synthesis is at 80oC for hours, stirring speed of 200 - 300 rpm Keywords: Rutin, Cyclodextrin, Casein, inclusion complex, nanoparticles Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Email: hienvdot@gmail.com Ngày nhận bài: 06/9/2022 Ngày nhận sửa sau phản biện: 16/10/2022 Ngày chấp nhận đăng: 27/10/2022 * CHỮ VIẾT TẮT RU: Rutin Website: https://jst-haui.vn CD: Cyclodextrin CS: Casein SEM: Hiển vi điện tử quét FTIR: Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao DSC: Phân tích nhiệt vi sai GIỚI THIỆU Rutin (quercetin-3-rhamnosyl glycoside, RU) flavonoid thu từ phận hoa, rễ số lồi Theo tài liệu cơng bố, có 50 lồi thực vật chứa rutin, hoa hòe chứa nhiều rutin cả, hàm lượng rutin hoa hòe cao gấp đến lần lồi khác có chứa rutin [1] Rutin trích ly từ hoa hòe (Sophora japonica L.), tồn dạng tinh thể hình kim Tinh thể có màu vàng nhạt, vàng xanh, có vị đắng, thường chứa ba tinh thể nước, điểm nóng chảy 161 - 178°C Rutin hòa tan metanol, pyridin, dung dịch kiềm nước sơi khơng hịa tan nước lạnh, cloroform, cacbon disunfua, ete, benzen ete dầu mỏ Phân tử rutin có chứa nhóm -OH, chất phân cực mạnh, tách chiết cồn, nước nóng hỗn hợp cồn nước [2] Là sản phẩm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học dược lý cao, nhiều nghiên cứu chứng minh rutin có khả làm tăng bền vững thành mao mạch, chống oxi hóa, chống viêm nhiễm, chống ung thư khối u, kháng khuẩn, giảm hen suyễn, giảm choles-terol có khả phịng ngừa bệnh thần kinh…[3] Ngồi ra, phương pháp phân tích kết nối phân tử rutin, cho thấy hoạt chất có khả ức chế protein quan trọng SARS-CoV-2 [4] Tuy nhiên, việc sử dụng rutin lĩnh vực dược phẩm thực phẩm chức hiệu quả, khả hòa tan kém, dễ bị phân hủy dịch thể người dẫn đến sinh khả dụng thấp Ðể tăng khả hấp thụ vào thể hay tăng tính sinh khả dụng hoạt chất này, nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp khác Có thể hịa tan rutin vào protein với chất tạo nhũ hóa nhằm tạo hệ vi nhũ tương Phân tán hoạt chất vào polyme, monopolyme, chitosan, polysaccharide, casein, tạo Vol 58 - No (Oct 2022) ● Journal of SCIENCE & TECHNOLOGY 115 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ liposome, micelle inclusions (phức vùi),… Sản phẩm nhận nanomedicine (thuốc nano) có kích thước nano mét, với khả hịa tan phân tán tốt môi trường nước dịch thể Việc lựa chọn giải pháp công nghệ sử dụng chất mang trình tổng hợp nanomedicine cần phải đảm bảo cho hoạt chất không bị biến tính, giữ nguyên trạng thái hạt nano, chất mang tương thích sinh học, khơng gây độc khơng gây phản ứng phụ q trình sử dụng Cyclodextrin (CD) hợp chất tan nước, phân tử dạng hình nón cụt, có lỗ rỗng bên Đường kính lỗ CD 7,8Å (hình 1b) Điểm đặc biệt CD liên kết với số hợp chất tan không tan nước nhóm –OH bên ngồi nhóm kỵ nước bên lỗ rỗng, tùy thuộc điều kiện pH, nhiệt độ, dung mơi [5]… Hình Cấu trúc phân tử RU (a) CD (b) Casein (CS) thành phần sữa, bao gồm axit amin proline (axit amin không thiết yếu) Ở môi trường nước, CS hòa tan dạng hạt huyền phù, gọi micelle casein Micelle casein có dạng hình cầu, bề mặt có tính ưa nước Phần bên khối cầu liên kết với ion canxi tương tác kỵ nước Do có tính chất này, CS hợp chất sử dụng hiệu trình tạo hạt nano [6] Việc đưa vòng A rutin vào môi trường CD cho nguyên nhân gây tương tác siêu phân tử với cyclodextrin Một phần cấu trúc hợp chất rutin tương tác theo cách khơng cộng hóa trị với nguyên tử mặt CD theo hướng 1, tạo hệ phức vùi Phần lại tương tác cộng hóa trị với nhóm -OH bên ngồi CD theo hướng (hình 1b) [7] Thực tế cho thấy, tương tác CD RU liên kết thuận nghịch Nếu khơng có giải pháp hạn chế phá vỡ liên kết này, RU tự giải phóng thành hạt tự tồn lâu môi trường nước Mặt khác, tồn lỗ rỗng CD bị lỗi, hạt RU khơng vùi hồn tồn vào lỗ rỗng Sự có mặt RU tự làm cho dung dịch không suốt Việc bổ sung lượng định CS, có tác dụng tạo micelle CS lượng nhỏ RU tự do, giúp cải 116 Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ● Tập 58 - Số (10/2022) P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 thiện chất lượng nanomedicine, cụ thể sản phẩm nano RU-CS Với phân tích ưu điểm khả đáp ứng cao nano rutin cho mục đích y sinh nêu, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tổng hợp đặc trưng nano rutin THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất Các hóa chất sử dụng gồm: Rutin 95% Việt Nam; beta casein, cyclodextrin nhập từ Pháp; cồn 98o cồn thực phẩm Việt Nam 2.2 Quy trình tổng hợp vật liệu Quá trình phản ứng nano hóa thực mơi trường siêu âm có khuấy gia nhiệt, nhằm kết hợp hạt rutin với cyclodextrin casein, thành hệ nano có hàm lượng rutin cao có thể, với đặc tính cần hướng đến Các thơng số thích hợp khảo sát thực nghiệm nhiệt độ phản ứng 80oC, thời gian phản ứng giờ, hàm lượng CS 5% sử dụng cho nghiên cứu Các thông số cần khảo sát ảnh hưởng hàm lượng CD RU đến hàm lượng kích thước hạt nano rutin tạo thành Hàm lượng RU khảo sát 10%, 13%, 15%, 17% 20%, so với tổng chất tham gia phản ứng nano hóa (RU, CD CS) Lượng CD tham gia tương ứng 85%, 82%, 80%, 78% 75% Lượng CD cần chọn dư so với lý thuyết, ngun liệu CD ln tồn nhiều phân tử bị lỗi, đường kính lỗ nhỏ đường kính phân tử RU, làm cho RU vùi vào sâu lỗ Đầu tiên, chuẩn bị lượng RU 95% theo kế hoạch thực nghiệm, hòa tan vào cồn 98o theo tỷ lệ RU/cồn 1/20, thiết bị phản ứng hồi lưu dung môi, tốc độ khuấy 200 - 300 vòng/phút, nhiệt độ 80oC Hệ thiết bị đặt bể siêu âm LSP-500-USA Bổ sung CD theo tỷ lệ tương ứng trì thời gian Sau tiếp tục bổ sung 5% CS, trì phản ứng nano hóa Tắt siêu âm, tiếp tục khuấy gia nhiệt để đuổi dung mơi Khi lượng dung mơi cịn lại khoảng 30% so với lượng dung môi ban đầu, tháo lấy dung dịch cô đưa vào tủ sấy chân không Sản phẩm sau sấy khối rắn xốp, nghiền mịn xác định đặc trưng hàm lượng RU, kích thước hạt, đặc trưng nhóm phân tử hành vi nhiệt… 2.3 Phương pháp nghiên cứu Độ hòa tan sản phẩm đánh giá định tính cách hào tan vào nước cất có pH 6,8 - 7,4 Hệ nano đạt yêu cầu độ tan dung dịch nhận suốt, không vẩn đục tồn hạt rắn lắng phía Hình dạng kích thước hạt sản phẩm xác định phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) thiết bị S-4800 Nhật Bản Đặc trưng nhóm phân tử sản phẩm phổ FTIR, máy Impact 410-Nicolet FTIR (Mỹ), theo phương pháp ép viên KBr Website: https://jst-haui.vn SCIENCE - TECHNOLOGY P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 Xác định hàm lượng RU phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), thiết bị 1100 Agilent (Mỹ) tạo micelle với CS Các phân tử rutin tự tái kết tinh, tạo thành tinh thể lớn Hành vi nghiệt sản phẩm xác định thiết bị phân tích nhiệt vi sai (DSC) Labsys Evo1600 Setaram (Pháp) Khi hàm lượng RU giảm 15% Trên hình 2b nhận thấy, hạt nano có dạng gần giống hình cầu, biên hạt rõ ràng, chứng tỏ chúng phân bố rời rạc, không bị dính vào Chất mang CD đủ để tạo liên kết siêu phân tử, lượng CS đủ để tạo micelle với RU phát sinh tự do, làm cho chúng kết tập thành hạt lớn Thể hình 2b, kích thước hạt nano nhỏ 100nm đồng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng nồng độ chất tham gia phản ứng Ảnh hưởng nồng độ chất tham gia phản ứng đến độ hịa tan kích thước hệ nano RU-CD trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất tham gia phản ứng đến độ hịa tan kích thước hệ nano RU-CD STT RU (%) CD (%) CS (%) Độ tan nước Kích thước (nm) 10 85 Trong suốt 20 - 60 13 82 Trong suốt 20 - 80 15 80 Trong suốt 30 - 100 17 78 Đục 30 - 400 20 75 Đục 30 - 500 Kết cho thấy với hàm lượng RU 20%, hàm lượng CD tương ứng 75%, CS 5%, pha sản phẩm nano vào nước, dung dịch không suốt Các hạt tạo thành, thơng qua ảnh SEM có hình thái khơng đồng nhiều hạt có kích thước lớn 100nm (hình 2a) Hàm lượng RU giảm cịn 17%, tương ứng với hàm lượng CD 78%, pha sản phẩm nano vào nước, dung dịch bớt đục so với sản phẩm có hàm lượng RU 20% Các hạt tạo thành có hình thái khơng đồng đều, kích thước hạt giảm tồn nhiều hạt có kích thước lớn Khi giảm hàm lượng RU giảm xuống 15%, kết cho thấy dung dịch suốt, hệ nano tan hoàn toàn Tiếp tục giảm hàm lượng rutin xuống 13% 10%, tương ứng với hàm lượng CD 82% 85%, sản phẩm nhận tan tốt nước, thấy bảng Mục tiêu ưu tiên hàm lượng nano RU có sản phẩm mức cao có thể, đồng thời với kích thước hạt RU nhỏ 100nm, khả phân tán tốt nước, tồn hạt RU tự làm cho dung dịch không suốt Việc bổ sung lượng nhỏ (5%) casein với mục đích tạo micelle với hạt RU tự do, khơng có tương tác siêu phân tử với CD Bởi tỷ lệ nhỏ so với tổng lượng RU CD, nên hiệu ứng tạo có mặt CS khó phát số phương pháp đo Hình Ảnh SEM nano rutin Như vậy, hàm CS 5%, hàm lượng CD 80% hàm lượng RU 15% thích hợp Nếu tăng hàm lượng RU vượt q đến 17% làm tăng lượng phức vùi, đồng nghĩa với tăng hàm lượng RU lên cao Nhưng hệ phức vùi không bền môi trường nước môi trường axit dày, dẫn đến làm giảm chất lượng hệ nano 3.3 Đặc trưng nhóm phân tử phổ FTIR Hình phổ FTIR rutin (a), cyclodexxtin (b), casein (c) nano rutin có hàm lượng RU 15% (d) Có thể nhận thấy thay đổi rõ rệt vị trí, cường độ chiều rộng dải vùng 560 - 1200cm-1 dải có cực đại 3426cm-1 hệ RU-CD (hình 3d) so với giải tương ứng nguyên liệu ban đầu RU, CD CS (hình 3a,b,c) Những thay đổi vùng 560 - 1200cm-1, liên quan đến dao dộng co giãn liên kết C-C, C-O dao động lắc liên kết C-H rutin Đối với CD (hình 3b), dịch chuyển dải có cực đại 1030cm-1 11588cm-1 liên quan đến kéo giãn liên kết C-C, C-O dao động lắc liên kết C-H Dịch chuyển tương ứng với điểm cực đại 1032cm-1 1203cm-1 hệ nano RU-CD (hình 3d) 3.2 Hình dạng kích thước hạt (ảnh SEM) Hình ảnh SEM sản phẩm nano rutin tổng hợp với hàm lượng RU 17% (hình 2a) 15% (hình 2b) Do giới hạn báo, nên nội dung nêu ảnh đại diện đặc trưng trình làm thực nghiệm Kết SEM cho thấy, hàm lượng RU 17% 20%, tồn hạt có kích thước lớn, khoảng 200 - 400nm, biên hạt không rõ ràng (hình 2a) Sảy tượng lượng RU cịn dư, khơng tạo phức vùi khơng Website: https://jst-haui.vn Hình Phổ FTIR rutin (a), cyclodexxtin (b), casein (c) nano rutin (d) Vol 58 - No (Oct 2022) ● Journal of SCIENCE & TECHNOLOGY 117 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Trong phạm vi bước sóng 2500 - 3000cm-1, thay đổi phổ FTIR hệ nano RU-CD không rõ rệt Ở vùng này, dao động kéo giãn đối xứng phản đối xứng tạo liên kết C-H RU CD bị ảnh hưởng tia hồng ngoại, liên kết nằm lỗ rỗng phân tử CD Các liên kết cộng hóa trị O-H…O bề mặt phân tử CD, CS với RU có kéo dãn Điều thể qua dịch chuyển từ vùng 3274cm-1 CS, 3337cm-1 CD 3418cm-1 RU đến 3426cm-1 hệ nano RU-CD P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 Có thể nhận thấy, nhiệt độ nóng chảy hệ RU-CD giảm rõ rệt so với nhiệt độ nóng chảy RU cao nhiệt độ nóng chảy CD Nếu RU CD hỗn hợp học, giản đồ DSC hỗn hợp xuất đỉnh thu nhiệt 95,86oC 161,75oC Trên giản đồ DSC hệ nano RU-CD tồn đỉnh thu nhiệt 99,23oC, chứng tỏ phức chất (hệ nano) tạo thành liên kết cộng hóa trị liên kết tương tác Van Der Waals KẾT LUẬN Từ đặc trưng FTIR hình cho thấy, khơng có phản ứng hóa học sảy chất tham gia q trình nano hóa Từ kết nghiên cứu, khảo sát phân tích đặc trưng mẫu RU, đưa kết luận, tổng hợp thành công nano rutin phù hợp với mục tiêu đề 3.4 Xác định hàm lượng rutin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Các hạt nano RU có kích thước đồng nằm khoảng 30 - 100nm Hệ nano có thành phần rutin 15%, cyclodextrin 80% casein 5% Hình phổ HPLC hệ nano RU-CD tổng hợp hợp theo tỷ lệ RU 15%, CD 80% CS 5% Kết định lượng RU HPLC 15,1% Kết phù hợp với lượng RU tính tốn đưa vào phản ứng nano hóa Điều kiện thích hợp phản ứng nano hóa nhiệt độ 80oC, thời gian giờ, tốc độ khuấy 200-300 vòng/phút LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu kết đề tài Khoa học & Công nghệ cấp sở, mã số VHH.2022.09, Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam) tài trợ kinh phí Hình Phổ HPLC nano rutin 3.5 Đặc trưng nhiệt DSC Hình giản đồ phân tích nhiệt vi sai CD (hình 5a), RU (hình 5b) hệ nano RU-CD (hình 5c) Quá trình thu nhiệt sảy nóng chảy CD 95,86oC, RU 161,75oC hệ nano RU-CD 99,23oC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Sofic E., Copra Janicijevic A, Salihovic M, Tahirovic I, Kroyer G., 2010 Screening of medicinal plant extracts for quercetin-3rutinoside (rutin) in Bosnia and Herzegovina Medicinal Plants-International Journal of Phytomedicines and Related Industries, Vol.2, Issue 2, P.97-102 [2] L Paniwnyk, et al., 2001 The extraction of rutin from ower buds of Sophora japonica Ultrasonics Sonochemistry 8, 299-301 [3] Evangeline Papageorge, George Lee Mitchell, 1949 The Effect of Oral Administration of Rutin on Blood, Liver and Adrenal Ascorbic Acid and on Liver and Adrenal Cholesterol in Guinea Pigs: One Figur The Journal of Nutrition, Vol.37, Issue 4, 531-540 [4] Fazlur Rahmana, Shams Tabreza, Rahat Alia, Ali S.Alqahtanib, 2021 Molecular docking analysis of rutin reveals possible inhibition of SARS-CoV-2 vital protein Journal of Traditional and Complementary Medicine, Vol.1, Issue 2, 173-179 [5] Debby M., Yvan V.H., 2020 Cyclodextrin in Handbook of Analytical Separations, Chapter 9.5.2.2 [6] Cornelis G de K., Thom H., Volker S U, Andrei V P., 2012 Casein micelles and their internal structure Advances in Colloid and Interface Science 171-172 (2012) P.36-52 [7] Magdalena P., Mikołaj M., Hanna P., Daria S.P., Kornelia L., 2015 Complex of Rutin with β-Cyclodextrin as Potential Delivery System Plos One, DOI:10.1371/ journal.pone.0120858 AUTHORS INFORMATION Hình Giản đồ DSC CD (a), RU (b) hệ nano RU-CD (c) 118 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ● Tập 58 - Số (10/2022) Vu Duy Hien, Quan Thi Thu Trang, Nguyen Binh Duong Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology Website: https://jst-haui.vn ... chất lượng nanomedicine, cụ thể sản phẩm nano RU-CS Với phân tích ưu điểm khả đáp ứng cao nano rutin cho mục đích y sinh nêu, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tổng hợp đặc trưng nano rutin THỰC... Từ đặc trưng FTIR hình cho thấy, khơng có phản ứng hóa học sảy chất tham gia q trình nano hóa Từ kết nghiên cứu, khảo sát phân tích đặc trưng mẫu RU, đưa kết luận, tổng hợp thành công nano rutin. .. HPLC hệ nano RU-CD tổng hợp hợp theo tỷ lệ RU 15%, CD 80% CS 5% Kết định lượng RU HPLC 15,1% Kết phù hợp với lượng RU tính tốn đưa vào phản ứng nano hóa Điều kiện thích hợp phản ứng nano hóa