Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Khảo sát hàm lượng Polyphenol tổng và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thô từ rong nho

Việc lựa chọn phương pháp trích ly và nâng cao hiệu suất trích ly các hợp chất cóhoạt tính chống oxy hóa từ các loại nguyên liệu thực vật ngày càng được quan tâm.Trong nhiều năm gân đây,

NGÔ THỊ THANH TÂM

KHAO SÁT HAM LUONG POLYPHENOL TONG VÀ HOATTINH CHONG OXY HOA CUA DICH CHIET THO TU RONG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHỌO Tp HCMngày 12 tháng 01 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 PGS TS Nguyễn Thúy Hương

2.PGS TS Trần Công Luận3 TS Tran Bích Lam

4 TS Nguyễn Hữu Phúc5.TS Trần Thị Ngọc YênXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lýchuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

(Họ tên và chữ kỹ) (Họ tên và chữ ký)

ii

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Ngô Thị Thanh Tâm MSHV: 12110213Ngày, tháng, năm sinh: 07/11/1988 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống Mã số: 605402I TÊN DE TÀI: KHẢO SÁT HAM LƯỢNG POLYPHENOL TONG VÀ HOATTÍNH CHÓNG OXY HÓA CỦA DỊCH TRÍCH THÔ TỪ RONG NHO

Il NHIỆM VỤ LUẬN VĂN- — Xác định một số chỉ tiêu thành phần dinh dưỡng của nguyên liệu: độ âm,carbohydrate, protein, lipid, chất xơ, tro

- Khao sát sự ảnh hưởng của các yếu tố: phương pháp bảo quản nguyên liệu,nhiệt độ trích ly, pH trích ly, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian nghiền nguyênliệu, thời gian trích ly và hàm lượng enzyme đến hàm lượng polyphenol và hoạt tínhchống oxy hóa của dịch trích thô từ rong nho

- _ Tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ rong nho.- So sánh hiệu quả trích ly polyphenol bang dung môi nước có sự xúc tác thủyphân của enzyme với phương pháp trích ly bằng nước và cồn

Ill NGÀY GIAO NHIEM VU: 20/01/2014IV NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 21/11/2014v CÁN BO HƯỚNG DAN: PGS.TS DONG THỊ ANH DAO

Tp.HCM, ngay thang nam 2014

CÁN BO HUONG DAN) CHUNHIEMBOMON TRUONG KHOA

(Ho tén va chtt ky) DAO TAO (Ho tên và chữ ky)

(Họ tên và chữ ký)

lil

Em xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ và hồ trợ của các thay cô trong Bộ môncông nghệ thực phẩm, Khoa kỹ thuật hóa học — Trường Đại học Bách khoa Tp.HCMtrong quả trình em thực hiện dé tài luận văn của mình Em cũng xin gửi lời cảm ơnđến các anh chị, các thay cô cua Viện Công nghệ sinh hoc va thực phẩm — Trường Đạihọc Công nghiệp Tp.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ các thiết bị, vật tư giúp emhoàn thành luận văn đúng tiễn độ.

Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến Cô, PGS.TS Đống Thị Anh Đào, giáo viênhướng dân đề tài Em chân thành cảm ơn Cô, cam ơn cô đã tán tình chi bao, hỗ tro,giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình em thực hiện luận văn của mình

Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên yêu quý (DHTP6B,C; DHTPSLT)của trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM đã rất nhiệt trình giúp đỗ tôi thực hiện dé tàiluận văn này.

Tôi cũng gửi lời cảm ơn của mình đến các anh/chi/cdc bạn của Nhóm tải báo vàNhóm tải tài liệu khoa học đã nhiệt tình giúp đồ tôi về mặt tài liệu dé tôi có thé hoàn

thành tốt luận văn của mình.Cuối cùng, con cam ơn gia đình đã luôn cô vũ, động viên, giúp đỡ con trong suốtthời gian con học táp.

Tp.HCM, thang 12 năm 2014

iV

Việc lựa chọn phương pháp trích ly và nâng cao hiệu suất trích ly các hợp chất cóhoạt tính chống oxy hóa từ các loại nguyên liệu thực vật ngày càng được quan tâm.Trong nhiều năm gân đây, một trong những xu hướng được dé cap nhat nham cai thiénhiệu quả chiết xuất các hợp chat polyphenol là sử dụng các enzyme xúc tác thủy phânhỗ trợ quá trình trích ly, có thể sử dụng độc lập một loại enzyme, hoặc là kết hợp cácloại enzyme khác nhau Mục tiêu của luận văn là trích ly polyphenol từ rong nho bằngdung môi nước có sự hỗ trợ của pectinase với để nâng cao hàm lượng polyphenol(TPC) và hoạt tinh chống oxy hóa (AO) của dịch trích thô từ rong nho.

Tiến hành so sánh hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dichtrích được trích ly từ rong nho được bảo quản đông lạnh và rong nho được bảo quản ởnhiệt độ phòng, với cùng điều kiện trích ly Hàm lượng polyphenol trích ly được từrong nho bảo quản đông lạnh cao hơn khoảng 10% và hoạt tính chỗng oxy hóa giảm40% so với rong nho bảo quan ở điều kiện thường Tuy nhiên dé 6n định nguyên liệuvà hoạt tính chống oxy hóa của nguyên liệu trong suốt quá trình bảo quản, chúng tôilựa chọn phương pháp bảo quản đông lạnh cho các khảo sát tiếp theo

Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ trích ly, pH môi trường trích ly, tỉlệ nguyên liệu/dung môi (w/w), thời gian nghiền, thời gian xử lý pectinase và hàmlượng pectinase (v/w) đến TPC và AO được thực hiện Kết quả cho thấy tất cả các yếutố khảo sát đều có ảnh hưởng nhất định đến TPC và AO của dịch trích thô từ rong nho

Với nhiệt độ trích ly là 50°C, pH5, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/4 (w/w), thời gian

nghiền là 30 giây, thời gian xử lý enzyme là 100 phút và hàm lượng pectinase là 6%(v/w), TPC và AO của dịch trích thô đều cho kết quả tốt nhất

Tiến hành tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ rong nho sử dụng mô hìnhtối ưu RSM để đánh giá sự ảnh hưởng của: thời gian nghiên, thời gian trích lý và hàmlượng enzyme đến quá trình trích ly Hàm lượng polyphenol thu được cao nhất là 2,92mgGAE/g chất khô ứng với điều kiện trích ly: 27,7 giây nghiên, 102.8 phút trích ly và53,6% pectinase.

enzyme (EAE), trích ly bang nước (WE) và trích ly bang cồn (EE) Kết quả còn chothay EAE có hiệu suất cao hon 28,1% so với WE va cao hon 20% so với EE.

VỊ

extraction of natural antioxidant from plants Recently, a trend of phenolics extractionwith assisting enzyme hydrolysis is improved deeply, using one or some enzymecombining Therefore, the extraction of phenolics from seagrape using water with anassistant of pectinase to increase total phenolic content (TPC) and antioxidant activity(AQ) is the aim of this thesis.

We compared the total phenolics and antioxidant values of crude extract fromfrozen seagrape to fresh seagrape in the same extraction condition The frozen showedhigher phenolics than fresh sample, about 10%, whereas in antioxidant activity, valuedescreased about 40% when seagrape was kept in frozen condition Though, tostabilize quality of material the freezing method was chosen to preserve seagrape forexperiments.

The impact of factors: temperature, pH, sovent — to — solid ratio (w/w dry weight),grinding time, extraction time and enzyme concentration (v/w dry weight) on TPC andAO was investigated The result indicated that there was a statistically significant

influence of all factors on TPC and AO In the condition of temperature 50°C, pH5,

1/4 solvent — to — solid ratio, 30 seconds grinding time, 100 minutes time extractionand 6% pectinase concentration TPC, AO were both raised up.

Response surface methodology (RSM) was used to evaluate effecting of grindingtime, extraction time and enzyme concentration on TPC The optimised extractpresented the highest content of phenolic is 2,93 mg gallic acid equivalent (GAE)/gdry weight with 27,75 seconds grinding time, 102,8 minutes extraction time and 5,62%pectinase concentration, respectively.

We also compare extraction yield of phenolic content and antioxidant of crudeextract by different method, enzyme — assisted extraction (EAE), water extraction(WE) and ethanol extraction (EE) EAE showed more efficient than WE 28,1% andEE about 20%.

Vil

Tôi, tác giả luận văn xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tácgiả Toàn bộ kết quả cũng như kết luận trong luận văn này là trung thực và không saochép bất kỳ tài liệu nào dưới bất kỳ hình thức nào Những nội dung có tham khảotrong luận văn này đều đã được trích dẫn nguồn tài liệu tham khảo theo đúng như quyđịnh.

Tác giả luận vănNgô Thị Thanh Tâm

Vill

TOM TAT LUẬN VAN THAC SI -G-G- G9111 E191 9151 1 1g neo VABSTRACT HH ng nọ re VilLOI CAM DOAN CUA TAC GIA LUẬN VAN c6 sec EsEseskseeeree viiiMỤC LỤC: QQQ QQQHng ọ IXDANH MUC BANG 22 xiiDANH MUC HINH 2 xiiiDANH MỤC CÁC TU VIET TẮTT G-G- s6 SE E E931 SE S312 E9 ng: XVCHƯƠNG I: MO ĐẦU 6c St th HH H221 |1.1 Ly do chọn để tài 6E S121 1 15115 12111111111 11115 1101111111101 11 01x |1.2 Mục đích nghiÊn CỨU - << 5G E001 199990001 l1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên Ứu - ¿2© + 2 +E+E+E+E£EEE£E£E+EeErErkrkrereee 214 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của để tài, HH H12 ng ngu 2CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIỆỆU ¿2 << + E+E+E+E+E+E+E+EeEeEeEekekekeeeersrsree 32.1 Tổng quan vỀ rong nho -¿- - ¿+ 5£ +s+E+S£+E+E£EEEE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkrrrrrrrrree 32.1.1 Giới thiệu về rong DIN ¿- ¿6+ + S223 1+3 EEEEEEE219E5 1121111113111 EU 32.1.2 Nguồn gốc rong nho ¿+ 5+9 SE‡E#EEE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEErErkrrkrkrreee 32.1.3 Thanh phan dinh dưỡng trong rong nho - 2 25525 s+s+x+£ezszsze: 52.2 Chất chống oxy hóa polyphenol - ¿+2 + S2 £E+E£E+E£EEE£E£E+EeErErkrsrersee 122.3 Tổng quan enzyme Pectinase ¿5-5252 S2 SE £E‡ESEEEEEEEEEEErErkrrererreee 152.4 Trích ly polyphenol có hỗ trợ enzyme cecceccscccsssesesesesesesesesssessseseseseseseseeeens 16

1X

3.1.1 Nguyên lIỆU G0 re 183.1.2 co nh ẽ 183.1.3 Dụng cụ - thiết Bi icc ccccccecescsscscscscsssscsescscsssscscscssssssesessssssssesceseseees 193.2 Quy trình thí nghieM G1 099900101 ngờ 203.2.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm - ¿©2252 2 +E+E+E+EE£E£E£E+EeE£erersrereee 203.2.2 Thuyết minh quy trình thí nghiệm - + 2 2 522£+E+££E£E+E+Ezrzrsred 203.3 Nội dung nghiÊn CỨU -Ă G00 ngờ 213.3.1 Khao sát phương pháp bao quản nguyên lIỆU - << << <2 223.3.2 Khảo sát nhiệt độ trích Ïy - - - << c1 11111991111 1 0 1111 1 ng ree 233.3.3 Khao sát pH trích Ly ch 233.3.4 Khảo sát ty lệ nguyên liệu/dung M01 - (<< 5S 5S eeeess 233.3.5 Khảo sát thời gian nghiền nguyên liệu . - 25 2 25s+s+ss+szsee 243.3.6 Khao sát thời gian Xử ly CNZyMe - << ng re, 243.3.7 Khảo sát hàm lượng enZVIm© - «s0 re 243.3.8 Tối ưu hóa băng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 253.4 Phương pháp phân tich (<1 1113931110111 119 99930101 ngờ 253.4.1 Xác định âm c1 SH 11111111 110111111 1111111 1n ng ri 253.4.2 Xác định hàm lượng TO - - << 5 1130001011 ng re 253.4.3 Xác định hàm lượng xơ th -cS SG S111 1333331 1119 9 1 111111 1 ve, 253.4.4 Xác định hàm lượng protein bang phương pháp Kjeldahl 263.4.5 Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Soxhlet 263.4.6 Xác địmh hàm lượng polyphenol tổng - ¿55+ 22s+c+cscszsee 26

CHƯƠNG 4: KET QUA VA BAN LUẬN ¿-c-c s E312 EEsESESESEeEEesereeerke 284.1 Thành phần dinh dưỡng của nguyên liệu ¿5-5- 2 2 252+s+£+£z£z£szxzceẻ 284.2 Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ rong nho biến - 294.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản nguyên liệu - 294.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly -. - + 255252 s+£+E£e+xsxererrerered 314.2.3 Anh hưởng của pH môi trường trích Ly - ¿55 +2 2 s+s+s+szcze 344.2.4 Ảnh hưởng của ty lệ nguyên liệu/dung môi - 2-2 25s: 354.2.5 Ảnh hưởng của thời gian nghiền nguyên liệu 25-55525552 374.2.6 Anh hưởng của thời gian trích Ìy + + 2 s+s+s+££E+E£E+EeEzrerererrsreee 384.2.7 Anh hưởng của hàm lượng enzyme c.cececcccsessssesessssesessescsssssseseseseeseseseees 404.2.8 Tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm quá trình trích lypolyphenol băng nước có hỗ trợ enZyme - + + 2 s+++s++s+x+xzxzxersrsrseei 42CHƯƠNG 5: KET LUẬN — KIÊN NGHỊ, 6 s sEESE2ESEEEsEsEEESESEEeseseseree 485.1 KKẾt luận - G11 11219110 11110191111 11111 TT ng nen: 485.2 Kiến nghị c tt S13 1 1511111111 11111111 111111111111 01 201101111171 01011111 ru 49DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BO CUA TÁC GIA 5- 5555555: 50TÀI LIEU THAM KHẢO 6s E112 E9E 919198 1E 1112121 11181113 ng ree 51PHU LUC eceeecccecsccscsssscscsscscscsscscscsscscsvsscscsvsscsvsvsscavsvsscsvsecavavsesscsssscsesvsecscstavsecssavees 60

XI

Bảng 2.1: Hàm lượng chất xơ trong rong nho (% chất khơ), rong đỏ E cottonii, vàrong nâu S DỌVCVSÍHIfN 0 0 ch 6Bảng 2.2: Hàm lượng các acid amin của cĩ trong rong nho -« «+ ++<<< «<2 7Bang 2.3: Hàm lượng của các acid béo (% trong tong hàm lượng acid béo) trong rongTNO — - 8Bang 2.4: Ham lượng chất khống của rong nho cccsceesessssesesssseseesesessesesescseseeseseeeees 10Bảng 2.5: Hàm lượng vitamin của rong nho, một số lồi rau củ (tính theo mg/100gphan ăn được) và nhu cau vitamin hăng ngày (mg/người/ngày) 5- 5-5555: 1]Bang 3.1: Tổng hợp các loại hĩa chat dùng trong quá trình thực hiện dé tải 18Bang 4.1: Thanh phan định dưỡng của rong nho nguyên liệu (% chất khơ tuyệt đối).28Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng acid amin của rong nho -5-<- 28Bảng 4.3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm tâm bậc hai, ba yếu tố và kết quả thựcnghiệm phương pháp trích ly polyphenol từ rong nho băng nước cĩ hỗ trợ enzyme 42Bảng 44: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hàm lượng của polyphenol trích ly

XI

Hình 2.1: Rong nho — Caulerpa lentiÏÏIÍ€Ta - - - <5 S5 + 111325111 99511 ke 4Hình 2.2: Cấu tạo hóa học của Flavonoid và Isoflavones s5 + se sscsesxsxe: 13Hình 2.3: Cấu tạo hóa hoc của một số hợp chất phenoÌIC << «s << ssx«s 13Hình 2.4: Cấu tạo của catechin trong chè xanh + ¿55 +2 2S2+E+EzEzErereresrees 14Hình 2.5: §°8§ — bieckol dẫn xuất của phlotorotannin trong tảo nâu - 15Hình 3.1: Rong nho — Caulerpa lentIÏÏIÍ€Tá - <5 5 + 311 33935111 953111 se 18Hinh 3.2: Quy trinh chuan bi dich chiét tir rong nho có sự xác tác cua pectinase 20Hình 3.3: Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu - ¿25 +2 2+£+E+EzEz£zxzeresree 22Hình 4.1: Ảnh hưởng của phương pháp bao quản nguyên liệu đến hiệu quả trích lypolyphenol băng nước có hỗ trợ enZ4yme :- ¿+2 2 ++*+E££+E+Ez£e+xvxererxererered 30Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu quả trích ly polyphenol bằngnước có hỗ trO ©IIZVIN© << s00 0 32Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH thủy phân đến hiệu quả trích ly polyphenol bằng nướcCONG tr ENZYME 0077 34Hình 4.4: Anh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu dung môi đến hiệu qua trích lypolyphenol băng nước có hỗ trợ enZ4yme :- ¿+2 2 ++*+E££+E+Ez£e+xvxererxererered 35Hình 4.5: Ảnh hưởng của thời gian nghiền nguyên liệu đến hiệu quả trích lypolyphenol băng nước có hỗ trợ enZ4yme :- ¿+2 2 ++*+E££+E+Ez£e+xvxererxererered 37Hình 4.6: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly polyphenol bằngnước có hỗ trO ©IIZVIN© << s00 0 39Hình 4.7: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hiệu quả trích ly polyphenol bằngnước có hỗ trợ eZ⁄VIe - - 552525222 Sx2E2E2EEEEEEEEEEEEEEEEEE 1111111111 xe 40Hình 4.8: Mô hình bề mặt đáp ứng (Xa = 102,8 phút) - 2 252 25s+s+£s£ecscs2 45Hình 4.9: Mô hình không gian 2 chiều (Xa = 102,8 phút) - 52 +52 s5s552 45

Xiil

i00 ẢẢ 47

XIV

DPPH

IC50WE

EE

EAE

Total phenolic contentAntioxidant activitygallic acid equivalent2 ,2-Diphenyl-1-picrylhydrazylHalf maximal inhibitory concentrationWater extraction

Ethanol extractionEnzyme — assist extraction

XV

CHUONG 1: MO ĐẦU1.1 Ly do chọn đề tài

Rong biển là nguồn nguyên liệu giàu protein, polysaccharide, chất khoáng như Ca,P, Na, K và I; vitamin A, Bi, Biz, C, D và E đã được con người sử dung dé bổ sungvào thực phẩm nhằm tăng hàm lượng protein, chất xơ, iod Ngoài ra rong biển cònđược coi là nguôn tự nhiên giàu các hợp chat polyphenol có hoạt tính chống oxy hóanhư flavoinoid, gallic acid, phlorotannin Chế độ ăn uống giàu polyphenol mang đếnnhiều lợi ích cho sức khỏe, ngăn ngừa các bệnh thoái hóa, đặc biệt là ung thư, timmạch và thoái hóa thân kinh Bên cạnh những đặc tính chống oxy hóa mạnh, cácpolyphenol tự nhiên được biết có nhiều lợi ích về mặt sinh học như kháng viêm, chồngdị ứng, kháng khuân, ức chế antiplasmin

Với lợi thế là một đất nước năm trong vùng khí hậu nhiệt đới và có bờ biển kéodài từ Bắc đến Nam, Việt Nam có điều kiện thuận lợi trong việc nuôi trồng các loạirong biến va thu hoạch mỗi năm lên đến hang nghìn tan rong biến các loại, tuy nhiênviệc sử dụng rong biển như một loại thực phẩm ở Việt Nam chưa thực sự pho bién

Rong nho—Caulerpa lentillifera, là một loại rong xanh phố biến ở những quốc giatrong vùng khí hậu nhiệt đới giàu các thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tínhsinh học polyphenol Tại Việt Nam rong nho vẫn chưa được nghiên cứu nhiều đặc biệtlà về hàm lượng polyphenol tông và hoạt tính chống oxy hóa của rong nho Do đó việcnghiên cứu trích ly, khảo sát hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa từ rongnho bằng một số phương pháp hóa lý, hóa học và đặc biệt băng phương pháp enzymelà van dé bức thiết, đáng quan tâm hiện nay

1.2 Mục dich nghiên cứuKhảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol từ rong nho vớisự hỗ trợ xúc tác thủy phân của enzyme với mong muốn thu được dịch trích có hàmlượng polyphenol va hoạt tính chống oxy hóa là cao nhất

1.3 Đối tượng và phạm vỉ nghiên cứuNghiên cứu được thực hiện với quy mô phòng thí nghiệm với đối tượng nghiêncứu là rong nho — Caulerpa lenfillifera có nguồn gốc từ Ninh Hòa — Khánh Hòa, ViệtNam Quá trình trích ly polyphenol sử dụng pectinase xúc tác thủy phân.

1.4 Y nghĩa khoa học và thực tiễn của dé tàiNghiên cứu bước đầu tìm được điều kiện tối ưu nhất để trích ly polyphenol từrong nho với hiệu quả trích ly cao nhất Nghiên cứu này sẽ tạo tiền để cho nhữngnghiên cứu khác phía sau để tạo ra những sản phẩm được sản xuất từ dịch chiết rongnho với những ưu điểm: sản phẩm giàu các hợp chất dinh dưỡng (giàu chất khô, cácacid amin với tỉ lệ cân đối, chất khoáng ) và đặc biệt giàu các hợp chất chống oxyhóa Trên cơ sơ đó mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng rong nho va các chế phẩmcủa nó ở Việt Nam ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm

CHUONG 2: TONG QUAN TÀI LIEU2.1 Tổng quan về rong nho

2.1.1 Giới thiệu về rong biếnRong biển hoặc "tảo biển" là thực vật da bào phát triển trong nước mặn hoặc nướcngọt, là thực vật bậc thấp, có nghĩa là chúng không có rễ, thân và lá Rong biển đượcphân loại thành ba nhóm lớn dựa trên sắc tố của chúng: Rong nâu (Phaeophyceae),rong đỏ (Rhodophyceae) và rong xanh (Chlorophyceae) [1].

Rong biến là một nguồn tài nguyên biển quan trọng Từ lâu, rong biển đã đượcbiết đến như một nguồn thực phẩm có nhiều giá trị dinh dưỡng cao và có tác dụngchữa bệnh Bên cạnh đó, rong biển còn làm nguyên liệu cho rất nhiều ngành côngnghiệp như thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm [2]

Rong biển được sử dụng ở nhiễu quốc gia như một nguồn thực phẩm, ứng dụngcông nghiệp dược phẩm, làm phân bón Rong biến được sử dụng chủ yếu ở chau A,đặc biệt là Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc, nơi trồng rong biển đã trở thành một

ngành công nghiệp lớn.Sản xuất rong biến thé giới năm 2000 đạt khoảng 10 triệu tan bao gồm cả tự nhiênvà nuôi trồng, 12 nước sản xuất chính hang đầu là: Trung Quốc, Pháp, Anh, Nhật Ban,Chile, Philippines, Hàn Quốc, Indonesia, Na Uy, Hoa Ky, Canada và Ireland [3]

Ở nước ta hiện nay, rong biển đang là một trong những đối tượng có nhiều triểnvọng trong công cuộc xây dựng va phát triển kinh tế xã hội Trồng rong biến sẽ là mộttrong những ngành nghề mới góp phân đáng ké làm thay đổi bộ mặt các vùng nôngthôn nhât là các vùng nông thôn ven biên.

2.1.2 Nguồn gốc rong nhoRong Nho (Caulerpa lentilifera) còn được gọi là trứng cá hồi xanh (green caviar)hay nho bién (sea grapes), được ưa chuộng va su dung như một loại rau xanh trong cácmón salad tại một số nước châu Á như Nhật Bản, Philippine [4]

Tén khoa hoc: Caulerpa lentilliferaTên tiếng Anh: Sea grape

Tên tiếng Việt: Rong nhoGidi (regnum): Plantae

Ngành (divisio): ChlorophytaLop (class): BryopsidophyceaeBo (ordo): Bryopsidale

Ho (familia): CaulerpaceaeChi (genus): CaulerpaLoai (species): C lentilliferaRong nho có nguồn sốc từ Philippines, sau đó du nhập vào Nhật Bản và đượcngười Nhật trồng, chế biến thức ăn như một loại rau xanh từ năm 1986 Tuy nhiên tạixứ sở mặt trời mọc, rong nho phát triển không thuận lợi Năm 2004, loài rong nàyđược một kỹ su dia chất Việt Nam mang về nghiên cứu, cải tiến phương pháp trông vànhân giống thành công, cho ra đời một sản phẩm rong nho có chất lượng cao hơn.Người kỹ sư ay la ông Lê Bên - Hội viên Hội Khoa học - Kỹ thuật Khánh Hòa, PhóGiám đốc Công ty TNHH Trí Tín (Nha Trang) Năm 2006, Viện Hải dương học NhaTrang triển khai dé tài khoa học trồng thử nghiệm đối tượng nay bằng phương phápsinh sản sinh dưỡng trong bể composite cho kết quả khả quan

Rong nho có mau xanh đậm, gồm có phan thân bò chia nhánh, có hình trụ tròn,đường kính 1-2mm Trên thân bò mọc ra nhiều thân đứng Trên thân đứng mọc ra

nhiều nhánh nhỏ, tận cùng là các khối hình cầu, đường kính 1,5-3mm, mọc dày kínchung quanh các thân đứng Bên trong các khối hình cầu nay chứa day chất dịch, dạnggel Chính vì hình dạng này, nên nó được gọi là rong nho, đây là phần có giá trị sửdụng Trên thân bò có nhiều “rễ giả” phân nhánh thành chùm như lông tơ, bám sâu vảođáy bùn.

Rong nho mọc trên nền đáy là bùn cát những vũng, vịnh kín sóng, nước trong.Tại Việt Nam, rong nho được tìm thay ở mũi Chim Chim thuộc Côn Dao, tinh Ba RiaVũng Tàu (2005), dao Phu Quy, tinh Bình Thuận (2006) Tuy nhiên kích thước cuarong nho lại rất nhỏ, bang 1/3 - 1/4 so với rong nho đang trông hiện nay Rong nho làloài chịu được mặn, với nồng độ khoảng 25 %o, rong nho ngừng phát triển và có biểuhiện chống chịu, nếu nồng độ muối dưới 20%o chúng sẽ chết Rong nho không chịulạnh, khi nhiệt độ hạ thấp 20°C, chúng tăng trưởng chậm hoặc ngừng tăng trưởng,nhiệt độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của rong nho trong khoảng 28 — 30°C Tốcđộ tăng trưởng khi trồng trong tự nhiên có thể đạt từ 2,5 — 3,19%/ngày Sau 60 ngàytrong, rong nho tăng trưởng gấp 10 — 15 lần so với khối lượng ban dau [5]

2.1.3 Thành phần dinh dưỡng trong rong nho

s* Carbohydrate

Hàm lượng carbohydrate trong rong nho chiếm khoảng 60% khối lượng chất khô.Hàm lượng carbohydrate của rong nho ở một số quốc gia trên thế giới đã được công bốtrong một số nghiên cứu như: rong nho ở Thái Lan có chứa 59,27% carbohydrate (tínhtrên khối lượng chất khô) [6] và ở Đài Loan hàm lượng carbohydrate trong rong nho là64% khối lượng chất khô [7] Sự khác nhau về hàm lượng carbohydrate ở các quốc giakhác nhau là do ảnh hưởng của khí hậu và nước biến làm thay đối thành phần dinhdưỡng trong rong biển [8] [9]

Bảng 2.1: Hàm lượng chất xơ trong rong nho (% chất khô), rong đỏ E cottonii, vàrong nâu S polycystum [10]

` Rong đỏ Rong nauThanh phan Rong nho

E.cofonH | S polycysHunTổng hàm lượng chat xơ 32,99 25,05 39.67

Chat xơ hòa tan 1721 18,25 5,57Chất xơ không hòa tan 15,78 6,80 34,10Tổng chat xơ (tính trên chất khô tuyệt đối) trong rong nho 32,99% là cao hơn rongnâu E cottonii 25,05% nhưng thấp hon so với rong đỏ S polycystum 39,67% Hamlượng chất xơ của rong biển cao hơn so với các loài thực vật trên can [11] [12] Việcsử dụng những thực phẩm giau chất xơ có tác dụng bảo vệ và thúc đây sự phát triểncủa hệ vi sinh vật đường ruột [13], giảm nguy cơ mac ung thư ruột kết [14]

Theo bảng nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị cho người Việt nam (2007), nhu cầuchat xơ tối thiểu cần là 18 — 20g/người/ngày Ở một số nước có khuyến nghị nhu cầuchất xơ cao hơn như của Nhật bản là 20 — 25g/người/ngày, của Mỹ khoảng 28 —30g/người/ngày Những người dễ thiếu chất xơ như trẻ em, người gia khả năng nhaikém, người phải ăn qua ống thông và những người mac bệnh man tinh, đái tháođường, xơ vữa động mạch, rỗi loạn lipid máu, béo phi, ung thu, Với khẩu phần ănhiện nay của chúng ta thì lượng chất xơ chỉ đạt được khoảng 10g xo/ngay, như vậyhầu hết mọi người đều bị thiếu chat xơ (Theo Viện Dinh Dưỡng Việt Nam)

Tuy chất xơ không sinh năng lượng nhưng nó có vai trò rất quan trọng đối với cơthé Việc tiêu thu rong biến có thé tăng lượng chất xơ và giảm sự xuất hiện của một sốbệnh mãn tính Vậy rong nho chứa hàm lượng xơ cao nên có thể là thực phẩm có tiềmnăng cung cấp xơ hàng ngày cho con người

s* Protein

Trong rong nho, hàm lượng protein chiếm khoảng 9,26 — 12,49% chất khô (hàmlượng protein của rong nho ở Thái Lan được phân tích là 12,49% [6], ở Đài Loan là9.26% [7] và ở Malaysia là 10,41%, tính trên khối lượng chất khô [10])

Theo nghiên cứu của Matanjun và cộng sự (2009), hàm lượng protein trong rongnho là cao hơn so với rong đỏ S polycystum (976%) và rong nau E cottonii (5.4%).

Rong nho đã được nghiên cứu là chứa day đủ các acid amin, trong đó có 8 loạiacid amin thiết yếu: isoleusine, leusine, lysine, phenylalanine, threonine, valine,

arginine va histidine.Bang 2.2: Ham lượng các acid amin cua có trong rong nho [6]

Hàm lượng Khuyến nghị của FAOTên aicd amin „

(tinh theo mg/100g chat khô) (WHO) (mg/ngay/nguoi)

Acid amin thiét yéuThreonine 790 500/310

Valine 870 800/650

Lysine 820 800/700Isoleucine 620 700/450Leucine 990 1.100/710

Phenylalanine 610 (+tyrosine) |.100/700Histidine 80 -

Methionine - (+cysteine) 1 100/550

Tryptophan - 250/160T ông acid amin 478

thiét yéu

Acid amin không thiết yếuAspartic acid 143

Serine 0,76Glutamic acid 1,78Glycine 0,85Arginine 0,87Alanine 0.85Tyrosine 0,48Proline 0,57

Cysteine

-Tổng acid amin

7,59khong thiét yéu

Tổng acid amin 12,37*: Khuyến nghị ưóc tinh của FAO/WHO (1981) cho người trưởng thành (nam/nit)

Từ bang 2.2 có thé thay rong nho chứa gan như day đủ các aicd amin thiết yếu vớitỉ lệ cân đối (methionine và tryptophan bị phá hủy trong quá trình thủy phân) và gầnmức khuyến nghị của FAO/WHO [10] Như vậy có thể xem rong nho là một nguồnthực phẩm tiềm năng cung cấp protein và acid amin cho con người

s* Lipide

Trong rong nho, tong hàm lượng lipide khoảng 0,86 -1,57% trọng lượng chất khô.Hàm lượng lipid của rong nho (tính trên hàm lượng chất khô) theo nghiên cứu của tácgiả Ratana-arporn & Chirapart (2006) ở Thái Lan là 0,86%, nghiên cứu của Matanjunvà cộng sự (2009) ở Malaysia là 1,11% và nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2011)ở Đài Loan là 1,57%.

Hàm lượng lipid của rong nho thấp nhưng chứa nhiều các acid béo không no cólợi cho cơ thể thuộc nhóm omega-3 như docosahexaenoic acid (DHA), acid a-linolenic(tiền tố DHA) và nhóm omega-6 như acid arachidonic (AA), acid linoleic (tiền chấtAA).

Bang 2.3: Ham lượng của các acid béo (% trong tong hàm lượng acid béo) trong rongnho [10]

Tên acid béo Số Carbon | % tổng acid béoAcid palmitic C16:0 33,78Acid stearic C18:0 783Acid elaidic C18:109 0.22Acid oleic C18:109 32 49Acid linoelaidic C18:206 0,09Acid linoleic C18:206 7641Acid y-linolenic C18:306 0,31

Acid a-linolenic C18:303 5,54Acid cis-11-eicosenoic C20:1@9 0.17Acid cis-11,14,17-eicosatrienoic C20:303 1,15Acid erucic C22:109 0.27Acid nervonIc C24:109 0,66Tong

Acid béo bao hoa (FAs) 46 4lAcid béo không no một nỗi đôi (MUFAs) 36.83Acid béo không no nhiêu nối đôi (PUFAs) 16/76omega-6 (PUFAs œ6) 8,04omega-3 (PUFAs œ3) 7,55Tỷ lệ omega-6/omega-3 (œ6 œ3) 1,07

Dua vao bang 2.3 ta thay, ham luong omega — 9, omega — 6, omega — 3 chiém tylệ cao trong số các acid béo Ham lượng oleic (œ — 9) chiếm 32,49% tong acid béo,acid linoleic (@ — 6) 7,64%, acid a — linolenic (@ — 3) 5,54% Omega — 9, omega — 6,omega — 3 là những acid béo quan trọng trong đối với cơ thé Mặc dù tổng ham lượnglipide rong nho thấp 0.86 — 1,11% trọng lượng chất khô nhưng hàm lượng PUFA caohơn các loại thực vật trên cạn [9].

Omega — 3, omega — 6 là những chất béo không bão hòa, có rất nhiều trong nguồnthực phẩm tự nhiên như trong cá biển và trong rong nho cũng chiếm tỷ lệ khá cao

Chính phủ Canada đã công nhận tầm quan trọng của DHA omega-3 "DHA, mộtloại acid béo omega — 3, hỗ trợ sự phát triển bình thường của não, mắt và dây thầnkinh”.

Omega — 3 có vai trò trong việc ngăn chặn sự tăng trưởng của mảng bám xơ vữađộng mạch và ảnh hưởng đến đông máu, huyết áp và cải thiện chức năng miễn dịch[15] Chế độ ăn uống giàu omega — 6 giúp làm giảm lượng LDL (low — densitylipoprotein) cholesterol — một loại cholesterol xấu, nhưng đồng thời nếu lượng omega— 6 quá cao cũng có thé làm giảm HDL (high density lipoprotein) cholesterol — một lại

lipoprotein tốt gây nguy co mắc các bệnh như rối loạn mỡ trong máu, làm ảnh hưởngxấu đến tim mạch [16] [17].

Ca hai omega — 3 và omega — 6 đều rất cần thiết và con người cần cung cấp chocơ thể qua con đường thức ăn Tỉ lệ giữa omega — 3 và omega — 3 rất là quan trọng đốivới cơ thé Theo khuyến cao của tô chức Y tế thế giới WHO, chế độ ăn uống sao chotỷ lệ omega — 6/omega — 3 không nên vượt qua 10.

Hiện nay, con người thường sử dụng dau cá là nguồn bố sung omega — 3 Dau cácó chứa các omega - 3 acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexaenoic (DHA),tiền thân của một số eicosanoid được biết đến có vai trò giảm viêm có lợi sức khỏe Cóthể nói răng omega — 3 có trong rong nho cũng có thành phần tương tự như thành phầnomega — 3 có trong dâu cá Do vậy, có thé sử dung rong nho như nguồn bố sungomega-3 thay thế cho dầu cá

Ngoài omega — 3 và omega — 6 ra thì trong rong nho còn có omega — 9 cũng rấtquan trong Dé bù đắp sự thiếu hụt hoặc mất cân bang của hai loại omega — 3,6 đó phảinhắc đến vai trò của omega — 9 Các nhà khoa học cho biết rằng acid béo omega — 9cũng rất tốt trong việc phòng ngừa các bệnh về tim mạch Omega — 9 (acid oleic) mặcdù không phải là một loại acid béo thiết yêu nhưng nó lại có vai trò hết sức quan trọngtrong sự phát triển của trẻ em, tăng cường chức năng của hệ miễn dịch, giảm lượngcholesterol máu và tham gia chống lại nhiều bệnh ly ác tính Omega — 9 được cơ thésản xuất ra một lượng nhỏ khi trong cơ thé có sự mat cân đối giữa omega — 3 vaomega — 6.

Như vậy, rong nho có thé coi như một nguén cung cấp các acid béo có lợi cầnthiết cho cơ thể và đảm bảo cho một chế độ ăn uống cân bằng

s%* Chất khoángBảng 2.4: Hàm lượng chất khoáng của rong nho [6]

Chất khoáng Hàm lượng (mg/100g chất khô)P 1030

K 970Ca 780

10

Mg 630Zn 2,6Mn 79Fe 93Cu 22| 1424

Từ bảng 2.4 có thé thấy rong nho đặc biệt giàu phosphorus, potassium, calcium vamagnesium Ngoài ra rong nho còn chứa nhiều chất khoáng vi lượng cần thiết cho cơthể như iode, sắt, kẽm, đồng `

Rong nho còn có selen, là thành phần của enzyme glutathione peroxidase có vaitrò bảo vệ mang tế bao khỏi bị phá hủy do oxy hóa giúp cơ thể ngăn chặn được ungthư, trì hoãn sự lão hóa và các bệnh thoái hóa [10] Selen rất cần thiết cho hệ thốngmiễn dịch và sự hoạt động của cơ tim, giúp cân bang kich thich t6 va tao ra chatprostaglandin, làm da và tóc khỏe mạnh Hàng ngày cơ thé chúng ta cần khoảng 0,05 -0,10 mg.

II

Tổng hàm lượng vitamin A trong rong nho 170 mg/100g phan ăn được, thấp honso với vitamin A trong cà rốt (một loại nguyên liệu cung cấp vitamin A phô biến) 1116mg/100g phan ăn được khoảng 7 lần nhưng cao hơn khoảng hon 20 lần so với bap cải.

Như vậy, rong nho cũng có thể được coi là một loại thực phẩm giàu vitamin E,vitamin C và chứa nhiều viatmin cần thiết cho co thé

2.2 Chất chống oxy hóa polyphenolCac polyphenol được phân bồ rộng rãi trong giới thực vật và là chất chuyển hóathứ cấp nhiều nhất của các loài thực vật Polyphenol thực vật đã thu hút được sự chú ýcủa các nhà nghiên cứu do đặc tính chống oxy hóa mạnh cũng như tác dụng rõ ràngcủa nó trong việc phòng chống các bệnh liên quan đến stress, oxy hóa như ung thư.Trong những năm qua việc xác định và phát triển phương pháp trích ly các hợp chấtpolyphenol hoặc chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ thực vật trở thành một lĩnhvực nghiên cứu chính của thực phẩm, y học liên quan đến sức khỏe [18]

Polyphenol có đặc tính chống oxy hóa giúp chống lại việc tạo lập các gốc tự do.Các hợp chất polyphenol được gọi là chất chống oxy hóa an toản và không độc hại,hoạt tính sinh học của hợp chất này đã có những tác dụng đã được chứng minh nhưngăn ngừa ung thư hoặc phòng chống và hỗ trợ điều trị các bệnh về bệnh tim mạch [19] Bên cạnh những đặc tính chồng oxy hóa mạnh, các polyphenol tự nhiên đượcbiết có nhiều hoạt động sinh học như kháng viêm [20], chồng di ứng [21], khángkhuẩn [22]

Hiện nay, có hơn 8000 cấu trúc hợp chất polyphenol được biết đến và trong số đócó hơn 4000 hợp chất thuộc nhóm flavonoid đã được xác định Có nhiều cách dé phânloại các hợp chat polyphenol như dựa vào nguồn gốc, chức năng sinh học hay cấu trúchóa học Dựa trên phương pháp phân loại của tác giả Tsao (2010), các hợp chấtpolyphenol thành hai nhóm lớn và nhiều nhóm phụ

Nhóm quan trọng nhất của các phenolic trong thực phẩm là flavonoid trong đóbao gồm chủ yếu là catechin, proanthocyanin, anthocyanidin và flavon, flavonolglycoside Cac flavonoid có cấu trúc bộ khung carbon cơ ban là C6-C3-C6 với haivòng 6 carbon (vòng A và vòng B) [23].

12

Gow ©Flavonoid backbone Isoflavones

Hình 2.2: Cấu tao hóa hoc của Flavonoid và IsoflavonesAcid phenolic là các hợp chat polyphenolic thuộc loại non — flavonoid Chúng cóthé được chia thành hai nhóm chính là acid benzoic và các dẫn xuất của acid cinnamicdựa trên câu trúc bộ khung carbon tương ứng là C1-C6 và C3-C6 [23]

Ole) O H

ớ ớ ©H

H OH HO O—R R—ơ

Protocatechuic acid, R = H:Vanillic acid, R = OCH,oum: đ Caffeic acid R = H:

, HO Chlorogenic acid, R = 5-quinoyl;

Cryptochlorogenic acid, R = 4-quinoyl:

Neochlorogenic acid, R = 3-quinoyl: R

Hình 2.3: Cấu tạo hóa học của một số hợp chất phenolic

Các hợp chat polyphenol trong nguyên liệu thực đã thu hút sự quan tâm lớn từnhững năm 1990 vì những lời ích về mặt sức khỏe mà nó mang lại Sự quan tâm đãđược chú ý chủ yếu bởi các nghiên cứu cho thấy mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa lượngthức ăn giàu các hợp chất polyphenol và tỷ lệ mắc bệnh, chăng hạn như bệnh timmach, đái tháo đường và ung thư [24] [25] [26] [27] [28].

Trong nhiều nghiên cứu về dich té hoc, polyphenol của thực vật được xem làthành phan quan trọng trong khẩu phan ăn con người Các thành phan này mang lại ratnhiều hiệu quả hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng chống oxy hóa, khả năng chốngtế bào ung thư Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được thành phần catechin trà cóthé ức chế quá trình hình thành và phát triển khối u ở động vật [29] Kết quả của tácgiả Jeanelle Boyer va Rui Hai Liu (2004) đã nghiên cứu táo chứa nhiều hợp chất

13

phenolic, trong đó có quercetin, catechin, phloridzin và acid chlorogenic, tất cả đều làchất chồng oxy hóa mạnh, có thé hỗ trợ trong việc phòng chống các bệnh mãn tính vàduy trì sức khỏe tốt [30] Trong nghiên cứu của tác giả Keejung Kang và cộng sự(2003) cho những kết quả chứng minh vai trò của các hợp chất polyphenol chiết xuấttừ rong nâu ngăn ngừa các tác nhân gây ung thư sơ cấp và chống lại các yếu tố nguycơ tim mach [31].

Các hợp chat polyphenol được nghiên cứu trên tảo nâu cho thay kha năng bat cácgốc tự do là rất cao, tốt hơn so với chất chống oxy hóa được biết đến như catechin,tocopherol, t — butylhydroxyanisole (BHA) và t — butylhydroxytoluene (BHT) [31][32] Theo Toshiyuki Shibata dẫn xuất của plorototannin là 8,8 e — bieckol có ở trongtảo E bicyclis và E kurome có tac dụng chống dị ứng và chống ung thư [32].Phlorotannin là những chất chồng viêm mạnh có thể đóng vai trò như một loại thựcphẩm chức năng mới, giúp hỗ trợ các bệnh liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơthé [32]

Cau tạo của các polyphenol của những loại nguyên liệu thực vật trên cạn có chứanhiều nhất là ba vòng benzen liên kết với nhau Các phlorotannin rong biến lại có đếntám vòng benzen liên kết với nhau, làm cho hoạt tính của chúng mạnh và ôn định hơn10-100 lần so với các phenolic trích ly từ các nguyên liệu thực vật Tổng hàm lượngphenolic và khả năng chống oxy hóa thay đổi theo loài, nhưng nói chung rong xanh (vidụ như Caulerpa spp.) có hoạt tính cao hơn cao nhất so với các loài rong biến khác,tiếp theo là rong nâu (Sargassum polycystum), cuối cùng là rong đỏ (Eucheumacoftomii, Eucheuma spinosum và Halymenia durvillaei) [ l|.

OH

OH

CO

OH

FIGURE 3 Major tea catechins.

Hình 2.4: Cấu tạo của catechin trong chè xanh [33]

14

HO OH

8,8'-Bieckol(C3)

Hình 2.5: 8’8 — bieckol dẫn xuất của phlotorotannin trong tao nâu [31]Một số nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy rong nho có chứa hop chất có hoạttính sinh học polyphenol Hàm lượng polyphenol của rong nho Caulerpa lentilliferađược chiết bang dung môi methanol tính bằng đương lượng phloroglucinol (PGE) là42,85 + 1,22 mg PGE/g chất khô [34], theo Ahmad (2012) hàm lượng polyphenol rongnho biến là 51,87 + 0,53 mg PGE/g chất khô [35] Ngoài ra, kết quả trong nghiên cứucủa Nguyen va cộng sự (2011) tổng hàm lượng phenolic tính băng đương lượng acidgalic của rong nho biển khoảng 2,04 mg GAE/g chất khô [7]

2.3 Tổng quan enzyme pectinase

Enzyme pectinase sử dung trong nghiên cứu nay có tên thương mai là Pectinex®

Ultra SP — L, là chế phẩm enzyme được thu nhận từ chủng nam mốc Aspergillusaculeatus.

Pectinex® Ultra SP — L là hỗn hợp gồm endo, exo — polyalacturonase thủy phânliên kết a — 1,4 — glycoside của phân tử acid pectic (acid polygalacturonic) và acidpectinic (acid polygalacturonic trong đó một số gốc — COOH bị metyl hóa) Endo —polygalacturonase thủy phân liên kết glucoside ở giữa mạch của các phân tử acidpectic hoặc acid pectinic Exo — polygalacturonase thủy phân các liên kết glucoside từđầu không khử của phân tử acid pectic hoặc acid pectinic

Điều kiện hoạt động của pectinex® Ultra SP — L được nhà sản xuất cung cấp Ở

khoảng pH 3,5 — 5,5, nhiệt độ 50 — 55°C.

15

2.4 Trích ly polyphenol có hỗ trợ enzymeTrích ly chất răn là quá trình hòa tan có chọn lọc một hay nhiều cầu tử trong chấtran băng cách cho chat ran tiếp xúc với dung môi lỏng [36].

Trích ly bằng dung môi lỏng vốn là phương pháp truyền thông và được sử dụngphố biến nhất hiện nay để trích ly polyphenol từ nguyên liệu thực vật vì những ưuđiểm như dễ sử dụng, hiệu quả khá cao, đối tượng áp dụng rộng rãi, không quá tốnkém vì sử dụng các loại dung môi hữu cơ rẻ tiên hoặc nước; tuy nhiên, nhược điểmcủa phương pháp này là thời gian trích ly dài dẫn đến khả năng làm giảm hoạt tính củadịch trích ly Hàm lượng chất trích ly được phụ thuộc vào loại dung môi, thời gian,nhiệt độ trích ly, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thành phần hóa học và đặc tính vật lý củanguyên liệu Do dd, việc lựa chọn phương pháp trích ly dé trích ly polyphenol với hiệusuất trích ly cao nhất được rất nhiều các nhà nghiên cứu quan tâm Có rất nhiềuphương pháp trích ly đã được tiến hành trên những đối tượng nguyên liệu khác nhaunhư phương pháp sử dụng các loại dung môi (nước, dung môi hữu cơ như ethanol,acetone, methanol) hoặc sử dụng độc lập từng phương pháp hoặc có sự hỗ trợ của visóng, siêu âm, enzyme [37] [38] [39].

Trong nhiều năm gan đây, xu hướng mới nhất dé cải thiện hiệu quả chiết xuất cáchợp chất phenolic chủ yếu tập trung vào sử dụng các enzyme, hoặc là sử dụng độc lập,hoặc là kết hợp các loại enzyme khác nhau [40] Lee và Wrolstad (2004) đã chứngminh rang sử dụng enzyme có ảnh hưởng trên tong hàm lượng anthocyaninmonomeric và trên tong phenolics trích ly được từ phế liệu của quá trình chế biếnnước ép từ quả việt quất Kim và cộng sự (2005) cũng đánh giá hiệu quả của việc sửdụng cellulase dé hỗ trợ trích ly polyphenol từ vỏ táo [41] Trong một nghiên cứu củamình về trích ly hợp chất phenolic từ bã nho đen của quá trình sản xuất nước ép,Landbo và Meyer (2001) đưa ra kết luận quá trình trích ly có sự hỗ trợ của enzymegiúp tăng hiệu suất thu hồi một cách đáng kê và rất nhiều các nghiên cứu đã đượccông bố cũng chứng minh được vai trò của việc sự dụng enzyme trong việc làm tănghiệu suất thu hồi các hợp chất phenolic và hoạt tính chống oxy hóa [42] [39] [43] [44]

[45].

16

Đã có nhiều nghiên cứu cũng cho thay hiệu quả của việc sử dụng enzyme dé thủyphân rong biển với mục đích thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh hoc [46] [47] [48][49] Các liên kết của các polysaccharide cầu tạo nên thành tế bao trong rong biển hạnchế khả năng dung môi tiếp cận với các hợp chất tồn tại trong nguyên liệu Thườngthành tế bào cấu tạo băng polymer sinh học lớn và rất phức tạp như cellulose,hemicellulose, lignin và pectin va cau trúc thành tế bào rong biển và lớp biểu bì phứctạp hơn và không đồng nhất so với các thực vật trên cạn [50] Rõ ràng đây là nhữngrào cản làm hạn chế hiệu quả của các quá trình chiết xuất chung của các hợp chất từrong biển Tác dụng của enzyme là có kha năng làm thoái hóa polymer thành tế bao vàtrở thành một lựa chọn hấp dẫn dé nâng cao hiệu suất thu nhận các hợp chất bên trongtế bảo |49].

Pectinase đã được sử dụng và chứng minh có khả năng nâng cao hiệu suất thu hồihợp chất có hoạt tính sinh học và làm tăng hàm lượng chất khô trong dịch chiết so vớimẫu không xử lý bang enzyme [43] Jan Oszmianski đã công bố một kết quả nghiêncứu của mình rằng hàm lượng polyphenol tổng trong các loại nước ép mà trong quátrình sản xuất có sự hỗ trợ của các chế phẩm enzyme thương mại như: pectinex AFPL-4, pectinex yield mash và pectinex XXL cao hơn so với quá trình sản xuất không sửdung enzyme [51] Theo tác giả Weinberg (1999) cũng đã chứng minh rang VIỆC sudung kết hop hemixenlulase va pectinase giúp làm tăng hiệu suất trích ly polyphenoltừ cay hương thảo va cây xô thom [52].

Với những lý do như trên, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháptrích ly polyphenol từ trong nho với sự hỗ trợ xúc tác thủy phân của pectinase vớimong muốn nâng cao hiệu suất thu hồi polyphenol và hoạt tính chồng oxy hóa

17

CHUONG 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Vậtliệu

3.1.1 Nguyên liệuNơi cung cấp: công ty TNHH Trí Tín (35, Võ Trứ, TP Nha Trang, Tỉnh KhánhHòa).

Nơi nuôi trồng và sản xuất: thôn Đông Hà, P Ninh Hải, TX Ninh Hòa, TỉnhKhánh Hòa.

Rong nho biến sau khi mua về sẽ được rửa bằng nước máy ba lần để loại bỏ muối,thực vật biểu sinh và cát trên bề mặt Sau đó, được lưu trữ trong tủ lạnh gia đình ở -20°C [53].

3.1.2 Hóa chatBảng 3.1: Tổng hợp các loại hóa chất dùng trong quá trình thực hiện đề tài

Tên hóa chất Nhãn hiệu Độ tỉnh khiết

Ethanol Chemsol, Việt Nam 99 5%

Folin —| Phong thí nghiệm hóa sinh — DH KHTN

Ciaucalteu Tp.HCM /

DPPH BHD Chemicals Ltd Poole England 100%NaCO3 Xilong chemical Co., Ltd, Trung Quéc >99,8%

18

Acid lactic Guangdong Xilong Chemical, Trung Quốc 85 5- 90%Acid galic

Sigma — Aldrich, chi nhánh Việt Nam >99 0%monohydrate

Vitamin C Sigma — Aldrich, chi nhánh Việt Nam =99 0%Enzyme Pectinase Novozyme, Dan Mach

3.1.3 Dung cu - thiét bi— Máy xay sinh tố: hiệu Bigsun, model: BB-189— Bê điêu nhiệt

— Máy bơm chân không NKF N035.3N18— Cân kỹ thuật : hiệu Sartorius, model: TE412— Cân phân tích 4 số lẻ Sartorius CPA324S.— Máy ly tâm: hiệu Hettich — Đức, model: EBA20S— Thiết bị cô quay: hiệu BIBBY, model: RE301.— Máy so màu UV - Vis: hiệu Spectronic, model: GENESYS 10UV — Tủ lạnh: hiệu: Sanyo, model: SR-13JN

— Tủ ấm: hiệu: Memmert — Đức, model: INB500— pH kế cầm tay: Trans Instrument — Singapore

19

3.2 Quy trình thí nghiệm

3.2.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Nguyên liệuđông lạnh

Mục đích: gia tăng hiệu suất trích ly của polyphenol và các chất khô khác

20

Mục đích: hòa tan, trích ly polyphenol và các thành phân chất khô khác vảo trongnước nhờ sự hỗ trợ xúc tác thủy phân của enzyme.

Lưu ý: hạn chế sự tiếp xúc của oxy không khí đến mẫu thí nghiệm

s* Loc

Loc sơ bộ: tách phan dịch trích ly ra khỏi bã rắn không tan.Lọc tỉnh: dé lọc bỏ hoàn toàn các cặn bã còn sót lại trong dịch chiết, tăng độ tinh

sạch của polyphenol.Dịch trích ly sau khi lọc sẽ định mức theo thé tích xác định rồi tiễn hành phân tíchcác chỉ tiêu (Hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính chống oxy hóa)

Mục đích: loại cặn bã tránh ảnh hưởng đến các công đoạn sau này.3.3 Nội dung nghiên cứu

21

NÓI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp bảo quản nguyên liệu

ee SS

pea Khao tỉ lệ thời gian i `

sát nhiệt , R 7 thoi ham

or sat pH nguyén nghién

độ trích , on Í gian lượng

trích ly liệu/dung nguyên :ly mo " trích ly enzyme

môi liệu

Vv

Tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ rong

Vv

Ham mục tiêu: Hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tinh chong oxy hóa

Hình 3.3: Sơ đồ tóm tat nội dung nghiên cứu3.3.1 Khảo sát phương pháp bao quan nguyền liệu

Thông số khảo sát: nguyên liệu tươi bảo quản ở nhiệt độ phòng nguyên liệu đônglạnh ở -20°C.

Thông số cô định:— Khối lượng nguyên liệu: 30g— Nhiệt độ: nhiệt độ phòng— Ty lệ nguyên liệu/dung môi là 1/3 (w/w)— Thời gian nghiên nguyên liệu: 45s.— Thời gian trích ly: 60 phút

Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh chống oxy hóa

22

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ trích lyThông số khảo sát: 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C.Thông số cô định:

— Khối lượng nguyên liệu: 30g— pH:4,5

— Ty lệ nguyên liệu/dung môi là 1/3 (w/w)— Thời gian nghiên nguyên liệu: 45s— Thời gian trích ly: 60 phút

— Hàm lượng enzyme: 5% (v/w chất khô tuyệt đối)Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tong và hoạt tính chống oxy hóa.3.3.3 Khảo sát pH trích ly

Thông số khảo sát: pH=2, 3, 4 5,6, 7.Thông số cô định:

— Khối lượng nguyên liệu: 30g— Nhiệt độ: kết quả 3.3.2— Ty lệ nguyên liệu/dung môi là 1/3 (w/w)— Thời gian nghiên nguyên liệu: 45s.— Thời gian trích ly: 60 phút

— Hàm lượng enzyme: 5% (v/w chất khô tuyệt đối)Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh chống oxy hóa.3.3.4 Khao sát tỷ lệ nguyên liệu/dung moi

Thông số khảo sát: 1/0, 1/1.5, 1/3, 1/4.5 (w/w)Thông số cô định:

— Khối lượng nguyên liệu: 30gNhiệt độ: kết quả 3.3.2pH: kết quả 3.3.3— Thời gian nghiên nguyên liệu: 45s

23

— Thời gian trích ly: 60 phút— Nong độ Enzyme: 5% (v/w chat khô tuyét đối)Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh chống oxy hóa.3.3.5 Khảo sát thời gian nghiền nguyên liệu.

Thông số khảo sát: 0 giây (không xay) 15 giây, 30 giây, 45 giây, 60 giây.Thông số cô định:

— Khối lượng nguyên liệu: 30g— Nhiệt độ: kết quả 3.3.2— pH: kết quả 3.3.3— Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: kết quả 3.3.4— Thời gian trích ly: 60 phút

— Nong độ Enzyme: 5% (v/w chat khô tuyét đối)Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh chống oxy hóa.3.3.6 Khao sát thời gian xử lý enzyme

Thông số khảo sát: 0 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút, 80 phút, 100 phút, 120 phút.Thông số cô định:

— Khối lượng nguyên liệu: 30g— Nhiệt độ: kết quả 3.3.2— pH: kết quả 3.3.3— Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: kết quả 3.3.4— Thời gian nghiên: kết quả 3.3.5

— Hàm lượng enzyme: 5% (v/w chất khô tuyệt đối)Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính chống oxy hóa.3.3.7 khảo sát hàm lượng enzyme

Thông số khảo sát: 0%, 2%,4%,6%, 8%, 10% (v/w).Thông số cô định:

Khối lượng nguyên liệu: 30g

24

— Khối lượng nguyên liệu: 30g— Nhiệt độ: kết quả 3.3.2— pH: kết quả 3.3.3— Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: kết quả 3.3.4— Thời gian nghiên: kết quả 3.3.5

— Thời gian trích ly: kết quả 3.3.6Ham mục tiêu: hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh chống oxy hóa.3.3.8 Tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Mục tiêu: xây dựng mô hình tối ưu hoi quy ba yếu tố cho quy trình trích lypolyphenol từ rong nho biến Từ đó, xác định các thông số cho ba yếu tố cho hiệu suấttrích ly polyphenol tối ưu từ loại nguyên liệu này

Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao ba yếutố, cau trúc có tâm với hàm mục tiêu là hàm lượng polyphenol, sử dung phần mémmodde phiên bản 5.0.

3.4 Phương pháp phân tích

3.4.1 Xác định amNguyên tắc: dùng sức nóng (100°C) làm bay hơi hết hơi nước trong thực phẩm.Cân trọng lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước cótrong nguyên liệu [54].

3.4.2 Xác định hàm lượng troNguyên tac: dùng sức nóng (550 — 600°C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ.Phần còn lại đem cân, và tính ra phần trăm tro có trong nguyên liệu [54]

3.4.3 Xác định hàm lượng xơ thôNguyên tắc: sau khi loại chất béo có trong nguyên liệu, cho nguyên liệu tác dụngvới acid rồi với kiềm Rửa sạch và say khô, phần không hòa tan được cân và từ đó tínhra hàm lượng xơ thô trong 100g nguyên liệu [54].

25