Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu độc tính tế bào của cao chiết từ cây đa tử trà hương Polyspora huongiana

Do đó, ĐTTH là đối tượng tiềm năng cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học nói chung cũng như cần phải được nghiên cứu về độc tính tế bào in vitro nhằm đánh giá mức độ an toàn đối với t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

TRẦN THỊ CẨM THI

NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CAO CHIẾT

TỪ CÂY ĐA TỬ TRÀ HƯƠNG Polyspora huongiana

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI NGÂN HÀNG MÔ VNCORD VÀ KHOA Y DƯỢC – TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Bùi Thị Kim Lý PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch: PGS TS Lê Phi Nga

2 Phản biện 1: TS Hoàng Mỹ Dung

3 Phản biện 2: TS Đặng Thị Tùng Loan

4 Ủy viên: TS Bùi Thị Kim Lý

5 Thư ký: TS Phan Thị Thanh Nga

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRẦN THỊ CẨM THI MSHV: 2170490

Ngày, tháng, năm sinh: 08/08/1997 Nơi sinh: An Giang Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Tiếng Việt: Nghiên cứu độc tính tế bào của cao chiết từ cây Đa tử trà hương

Polyspora huongiana

Tiếng Anh: Cytotoxic activity of crude extracts from Polyspora huongiana orel,

curry & luu

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

• Xử lý và thu nhận cao chiết methanol từ lá Đa tử trà hương P huongiana

• Phân tích thành phần hoá thực vật sơ bộ và xác định hàm lượng catechin trong

cao chiết từ lá cây Đa tử trà hương P huongiana

• Khảo sát khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của cao chiết từ lá P huongiana

• Khảo sát tác động của cao chiết lên sự biểu hiện của các gen liên quan đến chu kỳ

tế bào và gen liên quan đến apoptosis của các dòng tế bào ung thư

• Khảo sát tác động thay đổi chu kỳ tế bào và cảm ứng apoptosis các dòng tế bào

ung thư của cao chiết từ lá P huongiana

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 04/09/2023

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22/12/2023

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: TS Bùi Thị Kim Lý

Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Kim Lý – Cán bộ hướng dẫn khoa học cho Em từ những năm đại học cho đến hiện tại Cô đã dìu dắt và hướng dẫn Em từ những ngày đầu tiếp xúc với con đường nghiên cứu khoa học Cô

là người đề xuất hướng nghiên cứu và định hướng cho nghiên cứu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho Em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này Cô vừa là người Thầy, vừa là người Chị luôn hỗ trợ về mặt kiến thức và động viên Em xuyên suốt thời gian thực hiện và viết luận văn Thông qua Cô, Em được rèn luyện, hoàn thiện kiến thức và kỹ năng trong nghiên cứu thực nghiệm và cả trong cuộc sống

Em chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên – Cán bộ đồng hướng dẫn,

Em cảm ơn Cô vì nhận lời hướng dẫn em và luôn theo sát hướng dẫn, góp ý và chỉnh sửa trong suốt quá trình từ thực hiện đề cương cho đến hoàn thành luận văn này Cô luôn nhiệt tình và tận tâm chỉ dạy, đưa ra lời khuyên và giúp em hoàn thiện công trình nghiên cứu này

Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể Giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật hóa học, Trường đại học Bách khoa TPHCM đã luôn nhiệt huyết, tận tình trong giảng dạy và hỗ trợ Em xuyên suốt thời gian học tập tại trường Em được Thầy/ Cô hướng dẫn và chia sẻ không những về kiến thức chuyên môn, kỹ năng và kinh nghiệm thực tế Đây là nền tảng kiến thức vững chắc cho con đường học tập và làm việc trong tương lai

Bên cạnh đó, Em cũng mong muốn gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Thành Chí Anh Chí cũng là người đã khuyến khích và tạo điều kiện giúp Em sắp xếp công việc

và cân bằng giữa công việc và học tập Cảm ơn Anh Nguyễn Trung Quân và Chị Phạm Hoài Linh đã luôn hỗ trợ Em trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Con cảm ơn Ba Mẹ và gia đình đã luôn ủng hộ mọi quyết định của Con và luôn vững tin vào Con Ba Mẹ và gia đình luôn bên cạnh và là chỗ dựa vững chắc cho Con khi khó khăn, mệt mỏi hay khi con vấp ngã Con sẽ tiếp tục cố gắng phấn đấu trong công việc và học tập để không phụ sự kỳ vọng của Ba Mẹ

TÓM TẮT

Đa tử trà hương Polyspora huongiana (ĐTTH) là một trong những loài trà đặc

hữu của Việt Nam có ý nghĩa quan trọng về sinh thái và khoa học Hiện nay, các nghiên cứu trên ĐTTH còn hạn chế, chủ yếu là các nghiên cứu về mô tả và phân loại

Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm cung cấp các bằng chứng khoa học về thành phần hóa học thực vật và hoạt tính gây độc tế bào của cao methanol chiết xuất

từ lá ĐTTH (Me-ĐTTH) Thành phần hóa học thực vật trong lá ĐTTH được xác định dựa theo phương pháp của Cuilel và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Cao Me-ĐTTH được thu nhận bằng phương pháp chiết ngâm dầm và khảo sát khả năng

ức chế tăng sinh tế bào, cảm ứng biểu hiện gen, tác động đến chu kỳ tế bào và cảm ứng quá trình tế bào chết theo chương trình của cao chiết Me-ĐTTH thông qua thử nghiệm MTT, nhuộm trypan blue, realtime RT-PCR và thử nghiệm annexin V/PI Kết quả thành phần hóa học trong lá ĐTTH có sự hiện diện của nhóm hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin, polyphenol, glycoside tim và đường khử; thành phần catechin từ lá trà được xác định gồm có catechin, epicatechin và epigallocatechin gallate với hàm lượng lần lượt là 0,74 mg/g, 48,97 mg/g và 1,06 mg/g Cao Me-ĐTTH

có hoạt tính gây độc trên tất cả các dòng tế bào nguyên bào sợi BJ, tế bào bạch cầu mạn dòng tủy K562, tế bào ung thư biểu mô gan HCC-J5 và tế bào ung thư biểu mô

vú MCF-7 với giá trị IC50 lần lượt là 66,8 ± 10,7 µg/mL, 126,2 ± 15,9 µg/mL, 151,0

± 18,6 µg/mL và 184,4 ± 13,1 µg/mL Cao Me-ĐTTH có khả năng cảm ứng tăng sự

biểu hiện của các gen CASP9 trên tế bào K562, gen TP53 trên tế bào MCF-7 và các gen CASP3, CASP8, CASP9, Fas, TP53, CDK1, CDK2 và CDK4 trên tế bào HCC-

J5 Cao chiết tác động đến sự phân bố pha chu kỳ tế bào làm tăng tỷ lệ tế bào tập trung tại pha S trên cả ba dòng tế bào ung thư ; cao chiết có tác động cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào K562, trên dòng tế bào HCC-J5 và MCF-7 không cho thấy tác động đến apoptosis

Polyspora huongiana (ĐTTH) is one of Vietnam's endemic tea species and

has significant ecological and crucial scientific value Current research on ĐTTH is restricted, mainly studies on description and classification Thus, this study aims to provide scientific evidence about methanol extract's phytochemical compositions and cytotoxic activity from ĐTTH leaves (Me-ĐTTH) Preliminary phytochemical composition in ĐTTH leaves was qualitatively determined based on Cuilel's method, and high-performance liquid chromatography method; Me-ĐTTH extract was obtained by solvent extraction method and used to investigate its ability to inhibit cell proliferation, induce gene expression, affect the cell cycle and apoptosis through MTT assay and trypan blue staining assay, real-time qRT-PCR, and Annexin V/PI assay The results show alkaloids, flavonoids, saponins, polyphenols, cardiac glycosides, and reducing sugars are present in the phytochemical compounds in tea leaves Catechin components from tea leaves were determined to include catechin, epicatechin, and epigallocatechin gallate with respective concentrations of 0,74 mg/g, 48,97 mg/g, and 1,06 mg/g The investigation of the ability to inhibit cell proliferation shows that Me-ĐTTH extract has cytotoxic activity on fibroblast cells BJ, chronic myeloid leukemia cells K562, hepatocellular carcinoma cells HCC-J5, and breast adenocarcinoma cells MCF-7 cell lines with IC50 values, respectively 66,8 ± 10,7 µg/mL, 126,2 ± 15,9 µg/mL, 151,0 ± 18,6 µg/mL, and 184,4 ± 13,1 µg/mL Me-

ĐTTH showed the ability to enhance the expression of the CASP9 gene on K562, the

TP53 gene on MCF-7, and CASP3, CASP8, CASP9, Fas, TP53, CDK1, CDK2, and CDK4 on HCC-J5 The extract affects the cell cycle phase distribution, increasing

rate of cells concentrated in S phase on three cancer cell lines; The extract has an apoptosis-inducing effect on the K562 cell line, and on the HCC-J5 and MCF-7 cell lines there is no clear effect on apoptosis

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình do bản thân tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Bùi Thị Kim Lý Toàn bộ kết quả và số liệu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu và luận văn nào trước đó Tôi xin cam đoan và chịu trách nhiệm về tính trung thực của luận văn này

Tác giả

TRẦN THỊ CẨM THI

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 Tổng quan về cây trà Đa tử trà hương 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 5

1.2 Polyphenol và catechin 10

1.2.1 Polyphenol 10

1.2.2 Catechin 11

1.3 Độc tính tế bào 13

1.3.1 Độc tính tế bào và lĩnh vực ứng dụng 13

1.3.2 Phương pháp đánh giá độc tính tế bào 14

1.4 Apoptosis 15

1.4.1 Con đường nội tại 16

1.4.2 Con đường phối tử 17

1.5 Chu kỳ tế bào 17

2 Vật liệu và phương pháp 20

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 20

2.2 Vật liệu 20

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.2 Các dòng tế bào thử nghiệm 20

2.2.3 Trình tự mồi sử dụng 21

2.2.4 Thiết bị 22

2.3 Phương pháp 22

2.3.1 Xử lý mẫu và thu nhận cao chiết 23

2.3.2 Định tính hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học bằng phương pháp Cuilel 24

2.3.3 Định tính và định lượng catechin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)26 2.3.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào 27

2.3.5 Khảo sát ức chế tăng sinh tế bào bằng phương pháp đếm trypan blue 29

2.3.6 Thử nghiệm MTT 31

2.3.7 Khảo sát biểu hiện gen bằng kỹ thuật real time qrt-PCR 34

2.3.8 Phân tích annexin V/PI 37

2.3.9 Phương pháp phân tích kết quả 39

3 Kết quả và thảo luận 40

3.1 Kết quả xử lý và thu nhận cao chiết Me-ĐTTH 40

3.2 Kết quả phân tích thành phần hoá thực vật sơ bộ và xác định hàm lượng catechin trong cao chiết từ lá ĐTTH 40

3.2.1 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá thực vật bằng phương pháp Cuilel từ bột lá ĐTTH 40

3.3 Kết quả Khảo sát khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của cao chiết

Me-ĐTTH 44

3.3.1 Kết quả khảo sát ức chế tăng sinh trên dòng tế bào fibrolast 44

3.3.2 Kết quả khảo sát ức chế tăng sinh trên các dòng tế bào ung thư 46

3.4 Kết quả khảo sát tác động của cao chiết Me-ĐTTH lên sự biểu hiện của các gen liên quan đến chu kỳ tế bào và gen liên quan đến apoptosis của các dòng tế bào ung thư 50

3.5 Kết quả khảo sát tác động thay đổi chu kỳ tế bào và cảm ứng apoptosis các dòng tế bào ung thư của cao chiết Me-ĐTTH 53

4 Kết luận và kiến nghị 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 74

DANH MỤC VIẾT TẮT

Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

BJ: Fibroblast cell line Dòng tế bào nguyên bào sợi

CDK: Cyclin-dependent kinases Protein kinase phụ thuộc cyclin

Cyt C: Cytochrome C Phức hợp cytochrom C

DMEM: Dulbecco's modified Eagle's

medium

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DNA: Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

ĐTTH: Polyspora huongiana Đa tử trà hương

EGCG: Epigallocatechin gallate

FBS: Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC 50 : Half maximal inhibitory

Me-ĐTTH: Cao chiết methanol từ lá đa tử

trà hương

MTT: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5

diphenyl tetrazolium bromide

pRB: Retinoblastoma protein Protein u nguyên bào võng mạc

ROS: Reactive oxygen species Gốc oxy hóa hoạt động

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

p53: p53 tumor suppressor protein Protein ức chế khối u

PI: Propidium iodide

PBS: Phosphate-buffered saline

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng quan nghiên cứu trên một số cây họ Chè 06

Bảng 2.1 Thông tin các dòng tế bào 20

Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng trong đề tài 21

Bảng 2.3 Thông tin thiết bị sử dụng trong đề tài 22

Bảng 2.4 Các nhóm hợp chất và phản ứng định tính tương ứng 25

Bảng 2.5 Chương trình gradient HPLC 27

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 35

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 36

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng realtime PCR 36

Bảng 2.9 Chu trình luân nhiệt phản ứng realtime PCR 36

Bảng 2.10 Chỉ tiêu phân tích kết quả phương pháp annexin V /PI 39

Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết cao Me-ĐTTH 40

Bảng 3.2 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học thực vật trong lá ĐTTH 41

Bảng 3.3 Kết quả định tính và định lượng catechin từ lá ĐTTH 43

Bảng 3.4 Giá trị IC50 của cao Me-ĐTTH trên các dòng tế bào ung thư 46

Bảng 3.5 Tác động của cao chiết Me-ĐTTH đến sự thay đổi chu kỳ tế bào 55

Bảng 3.6 Tác động của cao chiết Me-ĐTTH đến quá trình apoptosis tế bào 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cành ĐTTH 04

Hình 1.2 Mô tả cấu trúc hoa ĐTTH 04

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất được nghiên cứu nhiều về hoạt tính sinh học trong nhóm catechin 12

Hình 1.4 Cơ chế apoptosis tế bào theo con đường phối tử và con đường ty thể 16

Hình 1.5 Cơ chế điều hòa chu kỳ tế bào ở cấp độ phân tử 18

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm 22

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết thu nhận cao Me-ĐTTH 23

Hình 2.3 Quy trình chuẩn bị dịch chiết các phân đoạn ĐTTH 24

Hình 2.4 Quy trình nuôi cấy và cấy chuyền tế bào K562 28

Hình 2.5 Quy trình nuôi cấy và cấy chuyền tế bào tế bào bám dính 29

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí nghiệm thức khảo sát ức chế tăng sinh tế bào K562 bằng phương pháp đếm trypan blue 30

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí nghiệm thức khảo sát ức chế tăng sinh tế bào bằng thử nghiệm MTT 33

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình khảo sát ảnh hưởng của cao chiết lên sự biểu hiện gen 34 Hình 2.9 Sơ đồ quy trình thực hiện nghiệm thức phân tích apoptosis bằng annexin V /PI 38

Hình 3.1 Tác động của cao chiết Me-ĐTTH lên sự tăng sinh tế bào BJ 45

Hình 3.2 Tác động của Me-ĐTTH trên các dòng tế bào ung thư 46

Hình 3.3 Mức độ tác động đến cảm ứng biểu hiện gen của Me-ĐTTH lên các dòng tế bào 51

Hình 3.4 Chu kỳ tế bào dưới sự tác động cao chiết Me-ĐTTH 54

Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng cao chiết Me-ĐTTH lên quá trình apoptosis tế bào 58

MỞ ĐẦU

Trà được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới với vai trò là thức uống, tại các quốc gia châu Á, trà được sử dụng như một loại thức uống hàng ngày [1] Theo thống

kê và báo cáo từ tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) năm 2021,

tỷ lệ tiêu thụ trà tăng so với thập kỷ trước 3,5%, sản lượng trà thế giới đạt khoảng 6,5 triệu tấn, sản lượng trà toàn cầu hàng năm ước tính đạt khoảng 17 tỷ USD, doanh thu

từ các hoạt động thương mại trà đạt khoảng 9,5 tỷ USD [2] Hiện nay, cây trà là một trong những loài cây trồng kinh tế quan trọng, Việt Nam có nhiều vùng chuyên canh cây trà điển hình như: Thái Nguyên, Mộc Châu, Tuyên Quang, Hà Giang và Bảo Lộc Cây trà ngoài được sử dụng như một loại nước uống nó còn là một loại thảo mộc thiên nhiên với nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe, từ xưa ông cha ta đã khai thác và sử dụng trà kết hợp trong chế độ dinh dưỡng hàng ngày Các loại trà được sử

dụng phổ biến hiện nay chủ yếu từ cây trà xanh Camellia sinensis, thông qua quá

trình chế biến và mức độ oxy hóa polyphenol tạo nên những loại như trà xanh, trà vàng, trà đen, trà trắng, hồng trà, trà phổ nhĩ và trà Oolong Cây trà được chứng minh chứa một số nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học như có khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ung thư điển hình như flavonoid, tannin, saponin, alkaloid và terpenoid [3, 4] Trong đó hoạt tính ngăn ngừa và ức chế ung thư của trà được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho đến thời điểm hiện tại, nhằm hướng đến việc sử dụng trà như một nguồn thực phẩm chức năng giúp nâng cao sức khỏe và hỗ trợ ngăn chặn ung thư [5]

Họ Chè (Theaceae) có khoảng hơn 400 loài đã được công bố [6], trong đó có nhiều loài trà mới được phát hiện gần đây và có nhiều loài đặc hữu của Việt Nam,

điển hình như Đa tử trà hương Polyspora huongiana (ĐTTH) Việc phát hiện các loài

mới là cơ hội cho nghiên cứu, ứng dụng và phát triển các sản phẩm thực phẩm và dược phẩm từ trà đặc hữu của Việt Nam, tuy nhiên song song đó vẫn tồn tại những thách thức như cần tiến hành nghiên cứu các dữ liệu khoa học về thành phần hợp chất

tự nhiên và đánh giá về tính an toàn của các loại trà mới này trước khi đưa vào sử

dụng Hiện nay, các cây thuộc chi Polyspora như ĐTTH chưa được nghiên cứu về

thành phần hợp chất và hoạt tính sinh học Do đó, ĐTTH là đối tượng tiềm năng cho

các nghiên cứu về hoạt tính sinh học nói chung cũng như cần phải được nghiên cứu

về độc tính tế bào in vitro nhằm đánh giá mức độ an toàn đối với tế bào bình thường

và các tác dụng ức chế đối với các dòng tế bào ung thư Những kết quả nghiên cứu trên ĐTTH về độc tính tế bào sẽ là tiền đề khoa học vững chắc cho các nghiên cứu sâu hơn về tính an toàn, tác dụng tích cực với sức khỏe con người và tiềm năng trong cho mục đích khai thác sử dụng như một sản phẩm thức uống và mở rộng ứng dụng trong y tế, dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng, song song đó cũng là cơ

sở hướng đến các biện pháp nhằm nhân giống, phát triển số lượng quần thể loài, bảo tồn loài ĐTTH và bảo vệ giá trị về đa dạng sinh học nói chung và đa dạng sinh học tại Việt Nam nói riêng

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu

Xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao chiết từ lá cây Đa tử trà hương

Nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu

• Xử lý và thu nhận cao chiết methanol từ lá Đa tử trà hương

• Phân tích thành phần hoá thực vật sơ bộ và xác định hàm lượng catechin trong cao chiết từ lá cây Đa tử trà hương

• Khảo sát khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của cao chiết từ lá ĐTTH

• Khảo sát tác động của cao chiết lên sự biểu hiện của các gen liên quan đến chu

kỳ tế bào và gen liên quan đến apoptosis của các dòng tế bào ung thư

• Khảo sát tác động thay đổi chu kỳ tế bào và cảm ứng apoptosis các dòng tế bào ung thư của cao chiết từ lá ĐTTH

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây trà Đa tử trà hương

ĐTTH là một loài thuộc họ Chè (Theaceae), có tên khoa học đầy đủ là

Polyspora huongiana Orel, Curry & Luu ĐTTH là một trong 13 loài trà thuộc chi Polyspora được phát hiện ở Việt Nam, đây là loài trà đặc hữu được phát hiện tại khhu

vực Hòn Giao, Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng, và được công bố lần đầu tiên vào năm 2012 [7, 8]

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Chi Polyspora có khoảng 40 loài phân bố chủ yếu ở khu vực Châu Á như Việt

Nam, Malaysia, Trung Quốc, Sri Lanka, Indonesia, Thái Lan, Lào, Myanmar, Ấn Độ

và Philippines[8] Trong đó, khu vực phân bố của ĐTTH được báo cáo chủ yếu tập trung tại miền trung Việt Nam

Về khóa phân loại:

Giới (regnum): Plantae

Bộ (ordo): Ericales

Họ (familia): Theaceae

Tông (tribe): Theeae

Chi (genus): Polyspora

Loài (species): Polyspora huongiana

1.1.2 Đặc điểm hình thái

ĐTTH là cây thân gỗ thường xanh, chiều cao của cây trưởng thành không vượt quá 10 m, cây thường mọc đơn và thẳng đứng, đôi khi có thể phân nhánh tốt Cành cây bóng có màu xanh lá ở giữa, cành non có màu xanh bóng, cành chuyển thành xám

- nâu nhạt khi trưởng thành, cành già có màu xám - nâu, trên cành có nhiều mấu, thường được bao phủ bởi địa y, nhất là tại các vị trí lộ ra bên ngoài (Hình 1.1) Vỏ trưởng thành nhẵn, có các vân hẹp phát triển từ một số vùng rãnh [7]

Hình 1.1 Hình thái cành ĐTTH

Lá trưởng thành cứng, dài khoảng 11,0 - 12,5 cm và rộng 4,0 - 4,8 cm, phiến lá mỏng, có hình trứng hẹp, lá có màu xanh lá cây và sáng bóng, bề mặt dưới có màu xanh nhạt và đậm màu hơn mặt trên, phiến gân giữa rộng từ 2,5 - 3,2 mm, lá non có hình dạng hẹp, kích thước thay đổi Cuống lá hơi xoắn quanh trục có màu tía ở phần trên, phần dưới tía - nâu và bóng[7]

Hình 1.2 Mô tả cấu trúc hoa ĐTTH [7]

Nụ hoa tròn, đỉnh nhọn, dài 2,3 - 2,5 cm, rộng 1,5 - 1,7 cm, có màu xanh lục nhạt, sau đó chuyển sang màu đỏ tía đến nâu rồi nhạt dần sang màu hồng nhạt, vảy

nụ màu tối nâu đến tím Hoa mọc ở nách lá, có cuống, hoa mọc nghiêng 45o về phía cuống, hoa mọc đơn lẻ, đôi khi mọc thành cặp, không có mùi thơm, hoa có màu hồng đậm đến đỏ, đường kính của hoa từ 5,0 – 6,0 cm, số cánh hoa từ năm đến bảy cánh,

lõm, dạng hình trứng, không đều, cánh hoa xếp thành 2 vòng, vòng đầu tiên bên trong được cấu tạo bởi hai đến bốn cánh hoa, dài 4,0 - 4,5 cm, rộng 3,5 - 4,0 cm, vòng bên ngoài có từ ba đến bốn cánh hoa dài 4,0 - 5,0 cm rộng 3,8 - 4,5 cm Nhị hoa xếp thành hình tròn với đường kính 2,0 - 4,0 cm, sợi nhỏ dài 2,5 - 3,0 cm, có lông tơ mịn, nhị hoa màu vàng, gần gốc hơi hồng, bao phấn nhẵn có màu vàng sáng, chuyển sang vàng sẫm đến nâu, kích thước thay đổi từ khoảng 2,5 - 3,0 mm (Hình 1.2) [7]

Quả có dạng hình trụ thuôn dài, hóa gỗ và cứng, dài 2,5 - 3,0 cm, đường kính 1,1 - 1,3 cm, màu nâu ngoài, có lông tơ Hạt dẹt theo chiều dọc màu nâu, nhẵn và bóng, khi còn non có lông tơ ngắn, có một cánh mỏng hình elip dài 13,0 - 15,0 m và rộng 4,0 - 5,0 mm [7]

Thời gian ra hoa của ĐTTH vào khoảng tháng 1, quả chín trong khoảng từ tháng

2 đến tháng 4 và rụng vào khoảng tháng 4 [7]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Hiện nay tại Việt Nam và trên thế giới, các công bố khoa học về cây ĐTTH còn hạn chế chủ yếu là mô tả và phân loại loài này, chưa có công bố khoa học nào về thành phần hợp chất tự nhiên và hoạt tính sinh học cũng như độc tính tế bào của ĐTTH Theo một công bố vào năm 2020, nội dung báo cáo thực hiện so sánh đặc điểm hình thái và khu vực phân bố giữa ĐTTH và Đa tử trà cương, kết quả so sánh cho thấy hai loài có mối quan hệ gần về tập tính loài và một số đặc điểm hình thái như về hình dáng hoa, đa nhị, màu sắc hoa [8] ĐTTH được phát hiện theo từng nhóm nhỏ nằm rải rác với diện tích phân bố loài dưới 1300 km2 ĐTTH có ý nghĩa quan trọng về đa dạng sinh học, được xếp vào nhóm dễ bị tổn thương Vu “Vulnerable” theo phân loại của sách đỏ loài trà được công bố bởi Liên minh bảo tồn thiên nhiên quốc tế do diện tích phân bố loài hạn chế [6] Do đó, cần có biện pháp bảo tồn loài thích hợp nhằm ngăn chặn nguy cơ quần thể loài bị đe dọa, tổn thương và tuyệt chủng

Trên các cây cùng chi Polyspora vẫn chưa có các công bố khoa học về thành

phần hợp chất tự nhiên cũng như hoạt tính sinh học

Trên các đối tượng cây thuộc họ Chè có nhiều công bố về hoạt tính trên tế bào (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tổng quan nghiên cứu trên một số cây họ Chè

Đối tượng Thành phần

hóa thực vật

Phương pháp được thực hiện Kết quả

Tài liệu tham khảo

Camellia

kissi

Alkaloid, flavonoid, saponin, polyphenol và đường khử

Nhuộm trypan blue

Cao chiết gây độc trên dòng tế bào K562 với

IC50 = 40,01± 3,12 (𝜇g/mL)

[9, 10]

Camellia

cuongiana

Thử nghiệm MTT, nghiệm thức ức chế tạo colony tế bào và nghiệm thức ức chế sự xâm lấn

Cao chiết ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư biểu mô gan HCC-J5 với giá trị

IC50 >100 (𝜇g/mL) Cao chiết ức chế khả năng tạo colony và di chuyển của tế bào ung thư biểu mô gan HCC-J5

[11]

C.sinensis polyphenol,

flavonoid, xanthone, caffein, tannin, saponin,

polysaccharide, amino acid, vitamin và một

số nguyên tố vô

cơ, epicatechin

Nhuộm trypan blue được sử dụng xác định tỷ

lệ tế bào sống, thử nghiệm làm lành vết thương

và Western Blotting trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô vú

Kết quả cho thấy dịch

chiết từ C sinensis có

khả năng ức chế tăng sinh và di căn của MDA-MB-231 và MCF-7, tăng mức độ biểu hiện protein p53

và p21 trên dòng tế bào MCF-7

[12]

(EC), epicatechin gallate (ECG), epigallocatechin (EGC) và epigallocatechin gallate (EGCG)

da người trưởng thành (HDF-a)

và tế bào nguyên bào sợi chuột (3T3-L1)

Khảo sát cho thấy dịch chiết trà sau ngâm chiết 5 phút trong nước có khả năng ức

chế tăng sinh in vitro

tế bào HT-29 với giá trị IC50 là 86,68 ± 0,73 µg/mL, trên dòng tế bào HDF-a giá trị IC50

là 164,26 ± 2,02 µg/mL, thêm vào đó kết quả khảo sát cũng đưa ra rằng trên dòng

tế bào HT-29, dịch chiết có tác động tăng mức độ biểu hiện gen caspase-3, caspase-8

và caspase-9, điều này

có thể liên quan đến nguyên nhân gây ức chế tăng sinh tế bào HT-29

[13]

C sinensis

(Cs) (L.)

Kuntze

Phương pháp thử nghiệm MTT sử dụng đánh ggiaskhar năng kháng ung thư của cao chiết trên dòng tế bào ung thư xương U2OS và tế bào nguyên bào sợi NIH3T3

Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nồng độ 10 µg/mL dịch chiết từ trà không gây độc cho

tế bào NIH3T3 và ở nồng độ thấp dịch chiết tác động tích cực trong nghiệm thức chữa lành vết thương, tuy nhiên trên dòng tế bào U2OS, dịch chiết thể hiện hoạt tính gây độc ở nồng độ 60 µg/mL

[14]

Camellia

japonica L

phenolic acid, gallic acid, flavonoid,

quercetin, epicatechin, tannin, saponin, anthocyanin, đường khử, và triterpenoid

Dịch chiết từ lá

C.japonica được báo

cáo có khả năng ức chế tăng sinh một số dòng tế bào ung thư bao gồm MCF-7, Calu – 6, và SNU -601

[15]

Camellia

nitidissima

Catechin và mười hợp chất flavonoid,

saponin, monoterpen và triterpene

Bộ đếm tế bào-8 (CCK-8) được

sử dụng đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào

Kết quả nghiên cứu

cho thấy cao chiết C

Nitidissima có hoạt

tính gây độc trên dòng

tế bào SGC7901 với

[16]

ung thư dạ dày ở người SGC7901

giá trị IC50 = 91.7 μg/mL

C

Nitidissima

Trong nghiên cứu này thử nghiệm MTT, thử nghiệm FCM và nhuộm hóa mô miễn dịch được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế

sự tăng sinh tế bào và tác động đến apoptosis trên dòng tế bào ung thư biểu mô phổi A549

dịch chiết C

Nitidissima có tác dụng ức chế tăng sinh

tế bào, ức chế sự phát triển của tế bào phụ thuộc thời gian và nồng độ dịch chiết, dịch chiết còn có tác động làm giảm sự tập trung tế bào trong pha

S và G2/M đồng thời trong khảo sát đánh giá lên sự cảm ứng biểu hiện gen, dịch chiết có ảnh hưởng làm gia tăng tỷ lệ biểu

hiện CASP3, CASP8,

CASP9 và giảm biểu

hiện Bcl-2, Ki-67 và

p21 trên dòng tế bào A549

[17]

Gordonia

obtusa

Thử nghiệm MTT được sử dụng để đánh giá hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư biểu mô

Kết quả công bố cho thấy cao chiết từ G

Obtusa có hoạt tính gây độc trên cả hai dòng tế bào A549 và HT-29 với giá trị IC50

[18]

phổi A549 và ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng HT-29

lần lượt là 35,12µg/mL và 6,65 µg/mL

Schima

wallichii

flavonoid, tannin, saponin, quinone và anthraquinone

Trong nghiên cứu sử dụng thử nghiệm MTT để khảo sát tác động gây độc trên hai dòng tế bào là Hela và V79

Công bố đưa ra kết

quả cao chiết S

Wallichii có khả năng

ức chế sự tăng sinh tế bào Hela và làm tăng biểu hiện gen caspase

8 và caspase 3

[19, 20]

Từ những công bố và kết quả khảo sát về hoạt tính sinh học, tính an toàn và tác động tích cực của các cây cùng họ và cùng điều kiện thổ nhưỡng cho thấy trong cây

họ Chè có chứa nhóm hợp chất polyphenol, nổi bật là nhóm hợp chất catechin với hoạt tính kháng oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, và tiềm năng trong cải thiện các vấn đề về sức khỏe Trên cơ sở đó, những nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học cũng như về độc tính trên tế bào của ĐTTH là cần thiết thực hiện, nhằm cung cấp bằng chứng khoa học, bổ sung thông tin và sự hiểu biết về loài trà mới, cũng như là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng của ĐTTH đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm,

y học, và sức khỏe từ đó là cơ sở nhân giống và phát triển quần thể loài ĐTTH góp phần bảo vệ sự đa dạng sinh học của Việt Nam

1.2 Polyphenol và catechin

1.2.1 Polyphenol

Polyphenol là nhóm các hợp chất thứ cấp được tìm thấy ở thực vật, chúng đóng vai trò quan trọng nhất định trong toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như kháng khuẩn, kháng nấm, chống lại tác động tiêu cực từ tia UV, tạo màu cho

lá, hoa, và nhiều vai trò khác giúp thực vật có thể thích nghi với điều kiện môi trường sống và đáp ứng lại sự tác động từ các tác nhân bên ngoài [21]

Về cấu trúc, polyphenol là nhóm hợp chất có chứa cấu trúc gồm những đơn vị phenol tạo thành Bên cạnh đó, các hợp chất thuộc nhóm phenol còn chứa các cấu trúc khác như ester hoặc ether, với nhiều kiểu cấu trúc khác nhau [22] Nhóm polyphenol được chia thành các nhóm hợp chất nhỏ dựa vào cấu trúc kết hợp với đơn

vị phenol như: phenolic acid, phenolic ketone, phenylpropanoid, naphthoquinone, xanthone, flavonoid, và tannin [23]

Các hợp chất polyphenol không những đóng vai trò quan trọng đối với thực vật

mà có còn được bổ sung vào chế độ dinh dưỡng của con người mang đến những lợi ích đối với sức khỏe con người Một số tác động tích cực đối với sức khỏe như: polyphenol có khả năng kháng oxy hóa, chống lại các gốc tự do được hình thành trong cơ thể, từ đó ngăn ngừa và làm giảm ảnh hưởng của gốc tự do cho cơ thể; nhiều hợp chất trong nhóm có khả năng ức chế sự tăng sinh của một số loại tế bào ung thư, nguyên nhân có thể do sự tương tác và tác động của các chất lên các con đường truyền tín hiệu tế bào như MAPK kinase và PI3 kinase, thúc đẩy quá trình apoptosis thông qua cảm ứng biểu hiện các gen liên quan và tác động đến tiến trình của chu kỳ tế bào; đối với bệnh tim mạch, polyphenol hỗ trợ cải thiện các vấn đề về huyết áp, bảo vệ hệ thống mạch [24]

1.2.2 Catechin

Một nhóm hợp chất polyphenol được nghiên cứu và ứng dụng nhiều hiện nay là catechin (flavan-3-ol), hợp chất này chiếm hàm lượng cao trong trà xanh, khoảng 70% trong tổng hàm lượng polyphenol và khoảng 1/3 trọng lượng khô trong trà xanh, đây cũng là nhóm hợp chất điển hình về hoạt tính sinh học trong của nhóm cây họ Chè [25, 26] Hợp chất catechin bao gồm catechin (C), EC, gallocatechin (GC), catechin gallate (CG), EGC, ECG, gallocatechin gallate (GCG), và EGCG, trong đó hợp chất được biết đến phổ biến là EGCG (Hình 1.3) [27, 28] Hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính kháng viêm là hai hoạt tính nổi bật của catechin, bên cạnh đó catechin còn được nghiên cứu và báo cáo về hoạt tính kháng ung thư, hoạt tính kháng khuẩn [27]

Khả năng kháng oxy hóa của catechin phụ thuộc vào các nhóm OH trong cấu trúc hóa học của catechin trên các vòng benzen, do đó với sự khác nhau trong cấu

trúc hóa học và số lượng nhóm OH của từng hợp chất sẽ ảnh hưởng đến khả năng kháng oxy hóa của chúng, trong đó hai hợp chất có khả năng kháng oxy hóa mạnh nhất trong nhóm là EGC và EGCG [29] Một số dẫn chứng khoa học đề xuất cơ chế tác động của EGCG dựa trên cơ sở thúc đẩy sự biểu hiện của hệ thống kháng oxy hóa nội sinh như điều chỉnh nồng độ các enzyme tham gia vào phản ứng kháng oxy hóa trong cơ thể như superoxide dismutase, catalase, và các enzyme liên quan đến chuyển hóa glutathione [30] Gốc oxy hóa hoạt động (ROS) được hình thành trong cơ thể trong trường hợp xảy ra stress oxy hóa, ROS gây tổn thương và phá vỡ DNA, là nguyên nhân dẫn đến mất ổn định về gen EGCG được báo cáo có khả năng làm giảm ROS và kích hoạt con đường truyền tín hiệu Nrf2, từ đó tăng sự biểu hiện và mức hoạt động glutathione S -transferase P, kết quả điều chỉnh và giảm sự stress oxy hóa [31]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất được nghiên cứu nhiều về hoạt

tính sinh học trong nhóm catechin [32]

Bên cạnh hoạt tính kháng oxy hóa thì hoạt tính kháng ung thư của catechin cũng đang được tập trung nghiên cứu nhằm giải thích và làm rõ về cơ chế hoạt động của

nó Người ta nhận thấy catechin có sự tác động và ảnh hưởng đến các con đường

truyền tín hiệu tế bào, chu kỳ tế bào và cả quá trình apoptosis [33] Hợp chất catechin

có tác động trong phòng ngừa và sự phát triển của tế bào ung thư với cơ chế phức tạp

vì tham gia vào nhiều con đường dẫn truyền tín hiệu khác nhau

Hợp chất catechin tác động ức chế lên con đường truyền tín hiệu tế bào PI3K/AKT/mTOR, EGCG tác động làm giảm sự biểu hiện yếu tố tăng trưởng IGF1

và thụ thể IGF1, ngăn ngừa sự kích hoạt con đường PI3K/AKT/mTOR [31, 34] EGCG còn được báo cáo trong việc làm giảm mức độ protein PI3K, phospho-AKT

và phospho-ERK 1/2 dẫn đến điều hòa cyclin E1, đây là protein quan trọng trong tiến trình phát triển của khối u, đồng thời khi con đường PI3K/AKT/mTOR bị ngăn chặn kích hoạt sẽ dẫn đến sự ức chế hoạt động protein survivin (gây ức chế apoptosis), kết quả là thúc đẩy quá trình apoptosis thông qua việc tăng biểu hiện của các protein thuộc họ caspase [35, 36] EGCG có khả năng liên kết với protein Bcl-2 và tác động đến sự kích hoạt quá trình apoptosis, EGCG và EGC cũng được báo cáo về cơ chế chống ung thư thông qua sự ức chế quá trình phosphoryl hóa STAT1 qua trung gian JAK2 khi liên kết với nhân tố kích hoạt phiên mã STAT1, một protein đóng vai trò như một yếu tố kích hoạt apoptosis trong tế bào, đồng thời EGCG còn ức chế tín hiệu JAK/STAT3 qua đó kích hoạt quá trình apoptosis [31, 35, 37]

Bên cạnh đó, catechin gây cảm ứng làm tăng biểu hiện của các gen mã hóa protein ức chế khối u p53 và p21, đây là những gen quan trọng với vai trò điều hòa chu kỳ tế bào và sự phân chia tế bào, do đó khi có sự tăng biểu hiện của hai gen này

sẽ giúp ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư [31, 36] Catechin ức chế tăng sinh

và hình thành mạch thông qua ngăn chặn sự biểu hiện của nhân tố tăng trưởng nội

mô mạch VEGF, metallicoproteinase NMP2 và NMP9 [34] Mặc dù nhiều cơ chế tác động của catechin đã được nghiên cứu và đề xuất, tuy nhiên sự tác động sẽ có sự khác nhau phụ thuộc vào liều sử dụng cũng như đối tượng tế bào

1.3 Độc tính tế bào

1.3.1 Độc tính tế bào và lĩnh vực ứng dụng

Độc tính tế bào là một lĩnh vực trong sinh học và y học nhằm khảo sát, xác định

và đo lường khả năng tác động gây độc của các tác nhân trên tế bào sống [38] Các thử nghiệm độc tính trên tế bào được đưa ra nhằm thay thế và hạn chế thử nghiệm

trên động vật và trên cơ sở cân nhắc về vấn đề đạo đức trong thử nghiệm in vitro trên

mô hình động vật [39] Độc tính tế bào là một trong những thử nghiệm bắt buộc thực hiện để đánh giá mức độ gây độc của các hợp chất, sản phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và y tế trước khi sản phẩm được công bố và sử dụng [40] Bên cạnh đó, thử nghiệm về độc tính tế bào còn được sử dụng trong trường hợp đánh giá hiệu quả tác động của một hợp chất hay cao chiết mục tiêu lên đối tượng xác định điển hình như các dòng tế bào ung thư, đây là một trong những đóng góp quan trọng của khảo sát khả năng gây độc tế bào trong nghiên cứu và phát triển thuốc nhắm mục tiêu nói riêng và trong lĩnh vực phát triển dược phẩm nói chung [41, 42] Hiện nay, nhiều loại thảo mộc được khai thác và sử dụng rộng rãi như một nguồn thực phẩm hàng ngày, bên cạnh những hợp chất có lợi cho sức khỏe, một số thành phần hợp chất khác có thể gây độc khi sử dụng với liều lượng vượt ngưỡng Trong trường hợp đó, thử nghiệm độc tính được sử dụng để đánh giá liều gây độc của các chiết xuất từ thực vật nhằm xác định liều dùng an toàn cho cơ thể [42] Cơ sở của thử nghiệm độc tính tế bào dựa vào sự tổn thương tế bào được gây ra bởi tác nhân khảo sát, những tổn thương đó có thể là sự ức chế tăng sinh, sự thúc đẩy quá trình apoptosis,

sự gián đoạn chu kỳ tế bào, những ảnh hưởng trong biểu hiện gen hay sinh tổng hợp protein, sự tác động đến các con đường dẫn truyền tín hiện bên trong tế bào Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào phụ thuộc vào tác nhân gây thử nghiệm, liều lượng sử dụng và thời gian tiếp xúc của tế bào với tác nhân cần khảo sát [40, 42-44]

1.3.2 Phương pháp đánh giá độc tính tế bào

Phụ thuộc vào mục đích và sự đáp ứng của tế bào đối với tác nhân cần khảo sát Hiện nay, nhiều phương pháp được đề xuất sử dụng cho đánh giá khả năng gây độc trên tế bào Các phương pháp được chia thành một số nhóm dựa vào các tiêu chí đánh giá bao gồm khả năng sống, sự trao đổi chất, sự thay đổi trạng thái, và sự kích ứng [40] Trong nhiều phương pháp được sử dụng khảo sát khả năng gây độc trên tế bào, thử nghiệm MTT (3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay do quy trình đơn giản,

dễ thực hiện và phản ánh được sự ảnh hưởng của tác nhân gây độc đến sự phát triển

và tăng sinh tế bào cũng như gây chết tế bào [43] Bên cạnh thử nghiệm MTT, thì

phương pháp nhuộm trypan blue cũng thường xuyên được sử dụng để đánh giá sự sống chết của tế bào với ưu điểm nhanh và chi phí thấp Phương pháp đếm tế bào dòng chảy với thuốc nhuộm Annexin V/PI nhằm xác định mức độ ảnh hưởng đến apoptosis được xem là phương pháp hiện đại và cho kết quả tin cậy nhất hiện nay [45] Mỗi phương pháp nêu trên đều dựa trên sự đáp ứng khác nhau của tế bào khi thử nghiệm cũng như sử dụng riêng biệt trong phân tích ảnh hưởng của tác nhân gây độc

1.4 Apoptosis

Apoptosis hay được gọi là “tế bào chết theo chương trình” là cơ chế tự nhiên của cơ thể nhằm giữ cân bằng nội môi và duy trì về mặt số lượng tế bào trong mô [46] Apoptosis có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình và con đường truyền tín hiệu trong cơ thể, với nhiệm vụ loại bỏ tế bào già hoặc tổn thương, loại bỏ các tế bào phát triển bất thường trong cơ thể như tế bào ung thư, tham gia vào cơ chế miễn dịch trong

cơ thể và cả quá trình phát triển của phôi [47]

Apoptosis là một chuỗi sự kiện phức tạp diễn ra theo hai con đường chính: con đường nội tại khởi phát bởi ty thể và con đường phối tử hay con đường bên ngoài, các yếu tố của con đường này ảnh hưởng đến con đường còn lại [48] Quá trình apoptosis có sự tham gia của nhiều yếu tố từ kích hoạt đến kiểm soát quá trình trong

đó một số nhóm yếu tố quan trọng như: protein p53 chịu trách nhiệm kiểm soát sự hoạt động của họ protein Bcl-2, họ protein Bcl-2 chịu trách nhiệm trong ức chế và hỗ trợ apoptosis và họ protein caspase chịu trách nhiệm chính trong thực thi apoptosis [47]

Hình 1.4 Cơ chế apoptosis tế bào theo con đường phối tử và con đường ty thể

1.4.1 Con đường nội tại

Con đường nội tại hay con đường ty thể, đây là con đường tế bào đáp ứng lại với kích thích của môi trường bên ngoài Các nhân tố tác đông dẫn đến tổn thương

và kích hoạt con đường apoptosis nội tại như: tia UV, chất độc hóa học, tác nhân virus và gốc tự do [49]

Các tác nhân tác động dẫn đến thay đổi tính thấm màng ty thể, từ đó kích hoạt một loạt chuỗi sự kiện dẫn đến apoptosis Tiến trình bắt đầu từ khi protein tBid bất hoạt sự hoạt động của protein Bcl-2 và do đó kích hoạt protein BAX đóng góp vai trò trong sự thay đổi cấu trúc màng ty thể hình thành lỗ màng [50] Tiếp đó cytochrome

C (Cyt C) được giải phóng khỏi ty thể, Cyt C liên kết với yếu tố kích hoạt protease apoptotic 1 (Apaf1) và procaspase 9 dẫn đến kích hoạt sự hoạt động Apaf1 và procaspase 9 liên kết hình thành thể apoptosome, thể apoptosome chịu trách nhiệm kích hoạt procaspase 3 và cuối cùng kích hoạt caspase 3, kết quả dẫn đến sự apoptosis

tế bào [48] Bên cạnh đó, yếu tố cảm ứng apoptosis (AIF), enzyme endonuclease G

và protein CAD được giải phóng khỏi ty thể, tại tế bào chất caspase 3 ở trạng thái

hoạt động tách chất ức chế CAD (ICAD) khỏi phức hợp với CAD và kích hoạt enzyme CAD endnuclease phân hủy DNA và cuối cùng dẫn đến sự phân mảnh DNA [47]

1.4.2 Con đường phối tử

Con đường bên ngoài hay con đường thông qua phối tử, điển hình nhất phải kể đến là thông qua Fas/FasR và TNF alpha / TNFR1 [49] Khởi phát con đường bắt đầu

ở màng sinh chất khi Fas liên kết với thụ thể FasR hoặc TNF alpha liên kết với thụ thể TNFR1 tạo thành miền nội bào của thụ thể như miền FADD trong con đường Fas/FasR, tại miền này huy động liên kết với procaspase 8 tạo thành phức hợp tín hiệu gây chết (DISC) [51, 52] Tiếp theo caspase 8 được kích hoạt dẫn đến khởi phát chuỗi kích hoạt caspase 3 và caspase 7, đồng thời protein tBid được thúc đẩy biểu hiện như ở con đường nội tại Giữa con đường nội tại và con đường thông qua phối

tử đều giao nhau từ sự kiện kích hoạt caspase 3 [48, 51] Diễn tiến tiếp theo của con đường truyền tín hiệu apoptosis tương tự như ở con đường nội tại

và chuẩn bị quá trình phân bào, và M – pha xảy ra quá trình phân bào, ngoài ra còn một pha khác được gọi là G0 – giai đoạn tế bào thoát khỏi chu kỳ tế bào [54] Chu kỳ

tế bào có sự tham gia và phối hợp kiểm soát từ nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có protein ức chế khối u (p53), protein u nguyên bào võng mạc (pRB), protein cylclin, protein kinase phụ thuộc cyclin (CDK) [55]

Hình 1.5 Cơ chế điều hòa chu kỳ tế bào ở cấp độ phân tử [56]

Chuỗi sự kiện diễn ra xuyên suốt chu kỳ phân bào tương đối phức tạp và cho đến hiện tại một số cơ chế còn chưa được làm rõ, tuy nhiên có thể khái quát đơn giản như sau: điểm bắt đầu chu kỳ tế bào được tính từ khi tế bào chuyển từ pha G0 sang pha G1 khi tin hiệu phân bào xuất hiện và kích hoạt tiến trình này [56] Sự tăng hàm lượng cyclin D gồm có cyclin D1, cyclin D2 và cyclin D3 dẫn đến các cyclin D liên kết với nhóm protein kinase phụ thuộc cyclin là CDK4 và CDK6 [54] Phức hợp cyclin D/CDK4 và cyclin D/CDK6 kích hoạt sự phosphoryl hóa protein pRB, protein pRB đóng vai trò kiểm tra và điều chỉnh sự chuyển tiếp từ pha G1 sang pha S [54] Ở điều kiện không bình thường, protein pRB liên kết với protein phiên mã E2F ức chế

sự hoạt động của pRB [56, 57] Khi protein pRB bị phosphoryl hóa, nó tách khỏi E2F và giải phóng E2F, protein E2F tiến hành kích hoạt sự phiên mã một số protein trong đó có cyclin E, cyclin E có chức năng quan trọng trong pha S và đóng góp vai

trò trong thúc đẩy quá trình tổng hợp DNA Vào cuối pha G1 mức cyclin E tăng, cyclin E sau đó liên kết với CDK2 tạo thành phức hợp cyclin E/CDK2 và kích hoạt

sự chuyển đổi tế bào từ pha G1 sang pha S [58] Tại pha S, phức hợp cyclin A/CDK2 kích hoạt quá trình sinh tổng hợp DNA, diễn tiến tiếp theo xảy ra ở cuối pha S, thời điểm này cyclin A liên kết CDK1 hình thành phức hợp cyclin A/CDK1, sau khi phức này hình thành, tế bào được chuyển tiếp từ pha S sang pha G2 và chuẩn bị cho quá trình phân bào [59] Tại điểm kiểm tra G2/M, phức hợp cyclin B/CDK1 hoạt động dưới sự kiểm soát Cdc25, tế bào tiến vào pha M và diễn ra quá trình phân bào [59] Trong trường hợp có sự tổn thương DNA diễn ra, p53 thực hiện nhiệm vụ trong điều hòa, dừng chu trình tế bào và dẫn dắt tế bào hỏng hướng đến apoptosis trước khi tế bào bước vào pha M [60] Trong điều kiện không có bất thường xảy ra, p53 hoạt động dưới sự kiểm soát của protein MDM2, MDM2 có chức năng trong điều hòa phiên

mã tạo protein p53 [55] Trong điều kiện DNA bị tổn thương, hoạt động p53 được tăng cường, dẫn đến tăng sự hoạt động protein p21, kết quả của chuỗi hoạt động này

là ức chế sự phosphoryl hóa protein pRB và dừng chu kỳ tế bào tại pha G1, bên cạnh

đó protein p21 còn ức chế sự hoạt động của phức hợp cyclin B/CDK1 và dừng tế bào

ở pha G2 [61]

Giữa quá trình apoptosis và chu kỳ tế bào có mối liên hệ chặt chẽ với mục đích chung điều hòa và cân bằng số lượng tế bào trong cơ thể, đảm bảo sự tăng trưởng, và phát triển bình thường của cơ thể và đáp ứng lại sự tác động của môi trường

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: đề tài được bắt đầu thực hiện vào tháng 09 năm 2022, kết thúc vào tháng 11/2023

Địa điểm thực hiện đề tài: Trường Đại học Thủ Dầu Một và Ngân hàng mô VNCORD

Địa chỉ: 06 Trần Văn Ơn, Phú Hoà, Thủ Dầu Một, Bình Dương và 51-53 Đường D4, Khu dân cư Himlam, Phường Tân Hưng, Quận 7, TP Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu ĐTTH được thu nhận tại TK89, xã Đạ Chais, Lạc Dương, Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng 8 năm 2022

Mẫu được thu nhận bởi Trương Quang Cường, định danh và cấp mã định danh bởi nhà nghiên cứu đa dạng sinh học Phùng Mỹ Trung, mã định danh số 210622PHU Mẫu ĐTTH được định danh sinh học phân tử với mã trình tự được công bố trên Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (NCBI) lần lượt OR525840,

OR52584, OR52584 và OR52584 cho bốn gen accD, matK, rbcL và ycf1

2.2.2 Các dòng tế bào thử nghiệm

Thông tin chi tiết liên quan đến các dòng tế bào được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin các dòng tế bào Tên dòng tế bào Tên viết tắt Nguồn gốc

Tế bào bạch cầu mạn tính dòng tủy K562 ATCC

Tế bào ung thư biểu mô gan HCC-J5

Được cung cấp bởi TS.BS Huỳnh Thanh Tuấn–Đại học

Y Dược Tp HCM [62]

2.2.3 Trình tự mồi sử dụng

Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng trong đề tài Tên gen

mục tiêu Trình tự mồi (3’ – 5’) Nguồn tham khảo

GAPDH - F GAA GGT GAA GGT CGG AGT C

Survivin R TCT CCG CAG TTT CCT CAA AT

Bcl-2 F AAG ATT GAT GGG ATC GTT GC

[66]

Bcl-2 R GCG GAA CAC TTG ATT CTG GT

Bcl-xL F TTG GAC AAT GGA CTG GTT GA

CASP3 R CCT TTG AAT TTC GCC AAG AA

TP53 F TGT GGA GTA TTT GGA TGA CA

Tủ ấm CO2 nuôi cấy tế bào ESCO Singapore

2.3 Phương pháp

Toàn bộ các nghiệm thức thí nghiệm được tóm tắt theo hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm

2.3.1 Xử lý mẫu và thu nhận cao chiết

Lá ĐTTH sau thu hái, rửa sạch hai lần với nước cất, lá trà sau đó sấy khô ở nhiệt

độ 50oC đến khi khối lượng giữa các lần cân không thay đổi, mẫu lá trà khô được xay mịn, bột trà được bảo quản ở nhiệt độ 4oC

Quy trình ngâm chiết thu nhận cao tổng ĐTTH được trình bày ở hình 2.2 Bột

lá trà được chiết bằng phương pháp chiết ngâm dầm với dung môi methanol theo tỷ

lệ 1:3 (w/v) trong điều kiện nhiệt độ phòng, lắc liên tục trên máy lắc trong 3 ngày [76] Sau thời gian ngâm chiết, dịch chiết được thu nhận, lọc qua giấy lọc Whatman, dịch chiết sau lọc được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4oC, bã trà sau chiết được bổ sung methanol và thực hiện tách chiết lặp lại 3 lần nhằm thu hồi tối đa lượng hợp chất trong bột lá trà Gộp dịch chiết của các lần chiết lại với nhau, cô quay chân không để loại bỏ dung môi methanol ở nhiệt độ 40oC, thu được cao đặc sau đó sấy khô cao ở nhiệt độ 50oC đến khi khối lượng cao sau 3 lần cân không đổi, cuối cùng thu được cao tổng methanol ĐTTH (Me-ĐTTH)

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết thu nhận cao Me-ĐTTH

Hiệu suất tách chiết thu nhận cao tổng được tính theo công thức sau:

H(%) = 100* khối lượng cao tổng (g)/khối lượng bột trước chiết (g)

Cao tổng Me-ĐTTH được hòa tan trong DMSO tạo cao chiết nồng độ 400 mg/mL, dung dịch cao Me-ĐTTH được lọc qua màng lọc vô khuẩn 0,2 µm, sau đó

được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ -20C, dung dịch cao chiết được sử dụng cho tất

cả các thí nghiệm khảo sát, và chỉ được rã đông ngay trước khi thực hiện các nghiệm thức khảo sát

2.3.2 Định tính hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học bằng phương pháp Cuilel

Thành phần hợp chất trong lá ĐTTH được định tính sơ bộ bằng phương pháp

mô tả bởi Cuilel vào năm 1994 [77] Bột ĐTTH lần lượt được chiết trong các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực tăng dần là diethyl ether, ethanol và cuối cùng là nước cất Dịch chiết trong các phân đoạn sau đó được sử dụng cho các nghiệm thức phân tích thành phần hợp chất

Hình 2.3 Quy trình chuẩn bị dịch chiết các phân đoạn ĐTTH

Quy trình chuẩn bị dịch chiết ĐTTH được mô tả theo hình 2.3, chi tiết như sau:

+ Dịch chiết diethyl ether: 20 g bột lá trà được ngâm chiết với 200 mL diethyl ether trong 2 - 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết diethyl ether

+ Dịch chiết ethanol: bã từ dịch chiết diethyl ether tiếp tục được ngâm chiết trong 200 mL ethanol trong 2 - 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết ethanol + Dịch chiết nước: bã từ dịch chiết ethanol trên tiếp tục được ngâm chiết trong

200 mL nước cất ở 80oC trong vòng 2 giờ sau đó lọc để thu được dịch chiết nước Thực hiện các phản ứng định tính sơ bộ ứng với loại hợp chất, và thuốc thử cho kết quả phản ứng dương tính như bảng 2.4

Bảng 2.4 Các nhóm hợp chất và phản ứng định tính tương ứng Phân đoạn

dịch chiết Hợp chất

Thuốc thử/ Cách

thử

Phản ứng dương

Tủa trắng đối với thuốc thử Mayer

5%/CH3COOH)

Vòng đỏ ở mặt phân cách

LAC/PAC HCl 10%, đun cách

thủy 10 phút

Chuyển màu thành đỏ