Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của lá huyền tinh (Tacca ieontopetaloides (L.) Kuntze)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập- Tự do – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trần Minh Thục Vi MSHV: 167072

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH

( Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG –HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Lê Xuân Tiến

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS Quách Ngô Diễm Phương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 17 tháng 07 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

2 Thư ký: TS Phan Thị Huyền

3 Phản biện 1: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

4 Phản biện 2: PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương

5 Ủy viên: PGS.TS Lê Phi Nga Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

PGS.TS Nguyễn Đức Lượng GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập- Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Minh Thục Vi MSHV: 1670722 Ngày, tháng, năm sinh: 15/08/1992 Nơi sinh: Phú Yên Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ HUYỀN TINH (TACCA LEONTOPETALOIDES (L.) KUNTZE)

Nhiệm vụ và nội dung: Nghiên cứu thành phần hóa thực vật có trong lá huyền tinh và

đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết Phân lập hợp chất từ cao chiết cho hoạt tính cao nhất

Ngày giao nhiệm vụ : 6/2018 Ngày hoàn thành nhiệm vụ : 7/2019

Cán bộ hướng dẫn : TS Lê Xuân Tiến

TS Lê Xuân Tiến PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN:

Người duyệt (chấm sơ bộ):

LỜI CẢM ƠN

Trong hành trình chinh phục kiến thức, em luôn có sự đồng hành và giúp đỡ của những người bạn, người cô, người thầy mà nếu thiếu họ em sẽ không thể hoàn thành luận văn của mình

Lời cảm ơn đầu tiên, em xin gửi đến các thầy, các cô của bộ môn Công nghệ sinh học đã luôn tận tâm truyền đạt cho em kiến thức mới về các lĩnh vực trong công nghệ sinh học để em thêm hiểu rõ và yêu quý bộ môn mà em đã lựa chọn

Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Xuân Tiến Thầy đã luôn giúp đỡ và hướng dẫn cho em, chỉ dạy những kiến thức mà em còn thiếu sót Thầy luôn tràn đầy năng lượng và mang năng lượng tích cực ấy truyền sang mọi người Thầy giúp em thấy được khó khăn nào cũng có thể vượt qua, có cố gắng thì mọi việc sẽ thành công

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Kim Minh Tâm, người đã luôn luôn đồng hành và theo sát em trong quá trình làm thí nghiệm Cô tận tình hướng dẫn những kỹ năng, thao tác thí nghiệm và hơn nữa, cô luôn cùng chia sẻ với em những lúc bị khó khăn, áp lực, luôn thúc đẩy, động viên em trong quá trình làm việc

Cũng xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn, người em đã luôn sát cánh cùng em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn Họ là những người mang lại tiếng cười, giúp đỡ và cùng với em chia sẻ những buồn vui trong suốt khoảng thời gian học tập dưới mái trường Bách Khoa

Lời cảm ơn đặc biệt nhất, con xin gửi đến cha mẹ Cha mẹ đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để con được học tập, luôn bên cạnh để cổ vũ và động viên con Cha mẹ luôn là một điểm tựa để con có thể chia sẻ mọi niềm vui và khó khăn trong cuộc sống

Cuối cùng, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người Cầu chúc mọi đều tốt đẹp sẽ đến và hy vọng trên con đường tương lai sắp tới, em sẽ luôn có mọi người đồng hành bên cạnh

Trần Minh Thục Vi

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn lựa chọn lá huyền tinh được thu hái ở vùng Bảy Núi, tỉnh An Giang là đối tượng nghiên cứu và tách chiết hợp chất Các cao phân đoạn hexane, ethyl acetate, butanol và nước thu được bằng phương pháp chiết -lỏng lỏng từ cao tổng ethanol được xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật và khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa Kết quả cho thấy, lá huyền tinh chứa nhiều nhóm hợp chất quan trọng như alkaloid, saponin, flavonoid và tannin Trong các cao phân đoạn, cao ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS˙+ cao nhất, với giá trị IC50 lần lượt là 70.13 ± 2.2, 42.77 ± 0.1 µg/mL Ngoài ra, cao ethyl

acetate thể hiện hoạt tính kháng viêm in vitro cao gấp 2 lần chất chuẩn diclofenac

sodium với giá trị IC50 đạt 11.11 ± 0.5 mg/mL Bên cạnh đó, cao ethyl acetate ức chế đối với hầu hết các chủng vi sinh vật thử nghiệm đặc biệt trên vi khuẩn Gram (+)

Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRSA

ATCC 43300 với giá trị MIC lần lượt là 6000, 6000 và 3000 µg/mL

Từ cao chiết ethyl acetate, luận văn đã phân lập được hợp chất luteolin Cấu trúc của hợp chất được phân tích dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và MS so sánh với tài liệu tham khảo Luteolin thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và thể hiện giá trị IC50 = 52.75 ± 2.53 µg/mL tương đương với vitamin C Luteolin đồng thời cũng có khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram (+)

là E faecalis ATCC 29212, S aureus ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 với kính

vòng ức chế tương ứng là 11, 11 và 13 cm và cho giá trị MIC đối với MRSA đạt 200 µg/mL

ABSTRACT

This research was carried out to study the preliminary phytochemical, the optimisation

of extraction process and the bioactivities of Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze

leaves The results indicated that the leaves contained many valuable compounds including alkaloids, flavonoids, saponins and tannins All extracts from different solvent (n-hexane, ethyl acetate, n-butanol and water) showed significant antioxidant, and antibacterial activities, among those ethyl acetate extract showed the highest that activities Free radical scavenging activities according to DPPH and ABTS˙+ assays of the extract showed the IC50 values as 70.13± 2.2, 42.77 ± 0.1 µg/mL, respectively In

vitro anti-inflammatory activity of ethyl acetate extract was with the IC50 value of 11.11 ± 0.5 mg/mL In addition, ethyl acetate extract was able to against all of the tested microorganisms, especially against Gram-positive bacteria such as

Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRSA

ATCC 43300 with the MIC values of 6000, 6000 and 3000 µg/mL, respectively

Luteolin was isolated The chemical structure of luteolin was determined by 1H-NMR, 13C-NMR spectroscopies Antioxidant and antibacterial activities of luteolin were evaluated Luteolin was against all tested Gram-positive bacteria, especially MRSA ATCC 43300 with the MIC value of 200 µg/mL The IC50 value of DPPH assays showed the result of 52.75 ± 2.5 µg/mL

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Trần Minh Thục Vi, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, khóa 2016 đợt 2, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, số liệu là kết quả nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Xuân Tiến

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày 07 tháng 07 năm 2019

Học viên thực hiện

1.1Tổng quan chi Tacca 2

1.1.1 Phân bố của chi Tacca 2

1.1.2 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Tacca 4

1.1.3 Công dụng các loài thuộc chi Tacca 12

1.2Cây huyền tinh (Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze) 13

1.2.1 Mô tả thực vật 13

1.2.2 Thành phần hóa học của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze 14

1.2.3 Công dụng của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze 14

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về Tacca Leontopetaloides (L.) Kuntze 15

1.3Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 18

1.4Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 18

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1Nguyên liệu- hóa chất- thiết bị 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.3Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Chuẩn bị dược liệu 26

2.3.2 Xác định độ ẩm 27

2.3.3 Xác định tro toàn phần 27

2.3.4 Xác định thành phần hóa thực vật 28

2.3.5 Phương pháp chiết 29

2.3.6 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa 29

2.3.6.1 Phương pháp xác định khả năng trung hòa gốc tự do DPPH 30

2.3.6.2 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS 32

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng kháng vi sinh vật 34

2.3.7.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch 35

2.3.7.2 Phương pháp pha loãng trong thạch 36

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng kháng viêm 36

2.3.9 Phương pháp định lượng 38

2.3.9.1 Phương pháp định lượng flavonoid 38

2.3.9.2 Phương pháp định lượng saponin theo oleanolic acid 40

2.3.9.3 Định lượng đường khử theo glucose 42

3.1.2 Độ ẩm và tro toàn phần của dược liệu: 46

3.1.3 Chiết cao phân đoạn 48

3.1.4 Kết quả định tính thành phần hóa thực vật 49

3.2Hoạt tính sinh học của cao chiết lá huyền 50

3.2.1 Khả năng kháng oxy hóa 50

3.2.1.1 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH 50

3.2.1.2 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS˙+ 50

3.2.2 Khả năng kháng khuẩn của các loại cao: 52

3.2.3 Khả năng kháng viêm của cao ethyl acetate: 54

3.3.1.3 Tinh sạch phân đoạn 1.6: 58

3.3.2 Xác định cấu trúc bằng phương pháp đo phổ: 62

3.3.2.1 Phổ MS: 62

3.3.2.2 Phổ NMR: 62

3.3.3 Hiệu suất quá trình tách chiết 65

3.4Hoạt tính sinh học của luteolin: 66

3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của luteolin: 66

3.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của luteolin: 68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

4.1Kết luận 71

4.2Kiến nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 77

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Tacca 4

Hình 1.2 Cấu trúc taccalonolides A và B 5

Hình 1.3 Cấu trúc của một số taccalonolide phân lập từ Tacca plantaginea 6

Hình 1.4 Cấu trúc của spirotanol saponins phân lập từ Tacca leontopetaloides 7

Hình 1.5 Cấu trúc của các diarylheptanoids và glycosides ở Tacca ssps 8

Hình 1.6 Một số hợp chất khác của chi Tacca 9

Hình 1.7 Taccalonolide phân lập từ Tacca paxiana 10

Hình 1.8 Các hợp chất phân lập từ T chantrieri 11

Hình 1.9 Các taccavietnamoside A-E phân lập từ Tacca vietnamensis 12

Hình 1.10 Cây huyền tinh và củ huyền tinh 14

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát 21

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 22

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết cao phân đoạn lá huyền 24

Hình 2.4 Sơ đồ quá trình phân lập hợp chất 25

Hình 2.5 Sơ đồ xác định hoạt tính sinh học của hợp chất 26

Hình 2.6 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 30

Hình 2.7 Quy trình thực hiện phương pháp bắt gốc tự do DPPH 31

Hình 2.8 Phản ứng trung hòa gốc tự do ABTS˙+ 33

Hình 2.9 Quy trình thực hiện phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS˙+ 33

Hình 2.10 Quy trình thực hiện phương pháp kháng viêm in vitro 37

Hình 2.11 Quy trình định lượng flavonoid 39

Hình 2.12 Quy trình định lượng saponin 41

Hình 2.13 Quy trình định lượng đường khử 43

Hình 3.1 Lá huyền tinh sau khi phơi khô 46

Hình 3.2 Sắc ký đồ của cao EtOAc với các hệ dung môi khác nhau, quan sát dưới đèn UV 254 nm (trái), 365 nm (phải) 56

Hình 3.7 Cấu trúc của luteolin 63

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của luteolin 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Tacca phân lập ở Việt Nam 2

Bảng 1.2 Các hợp chất diaryl heptanoid glycoside 7

Bảng 1.3 Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu thô 16

Bảng 1.4 Thành phần hóa thực vật của các mẫu Tacca leontopetaloids 16

Bảng 2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm DPPH 32

Bảng 2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm ABTS˙+ 34

Bảng 2.3 Nồng độ các mẫu thử trong DMSO 36

Bảng 2.4 Các mẫu chuẩn bị cho phương pháp kháng viêm 38

Bảng 2.5 Chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm định lượng flavonoid 40

Bảng 2.6 Chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm định lượng saponin 42

Bảng 2.7 Chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm định lượng đường khử 44

Bảng 3.1 Kết quả định danh mẫu thực vật 46

Bảng 3.2 Độ ẩm của vật liệu sau khi sấy (%) 47

Bảng 3.3 Hàm lượng tro toàn phần (%) 47

Bảng 3.4 Kết quả chiết cao tổng EtOH lá huyền tinh 48

Bảng 3.5 Kết quả chiết cao phân đoạn lá huyền tinh 48

Bảng 3.6 Kết quả định tính thành phần hóa thực vật cao lá huyền 49

Bảng 3.7 Giá trị IC50 của cao chiết lá huyền theo phương pháp DPPH 50

Bảng 3.8 Giá trị IC50 của cao chiết lá huyền theo phương pháp ABTS˙+ 51

Bảng 3.9 Đường kính vòng ức chế của cao ethyl acetate và cao hexane trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 52

Bảng 3.10 Kết quả MIC của cao EtOAc trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 53

Bảng 3.11 IC50 của diclofenac sodium và cao EtOAc trong khảo sát kháng viêm 54

Bảng 3.12 Kết quả định lượng các thành phần trong cao EtOAc lá huyền 55

Bảng 3.13 Kết quả các phân đoạn sắc ký cột thô 57

Bảng 3.14 Kết quả các phân đoạn sắc ký phân đoạn 1.6 59

Bảng 3.15 Kết quả sắc ký cột hexane: EtOAc phân đoạn 1.6.7 60

Bảng 3.16 So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR giữa V1 và luteolin 63

Bảng 3.17 So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR giữa luteolin và V1 64

Bảng 3.18 Kết quả IC50 của luteolin và vitamin C theo phương pháp DPPH 66

Bảng 3.19 Đường kính vòng ức chế của luteolin trên vi sinh vật thử nghiệm 68

Bảng 3.20 MIC của luteolin trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 69

MHA Mueller Hinton Agar

MHB Mueller Hinton Broth

MIC Minimum Inhibitory Concentrations

MỞ ĐẦU

Việt Nam có một hệ thực vật rất đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài thực vật mang nhiều giá trị mà ta chưa biết đến Việc tìm ra, nghiên cứu và ứng dụng các loài cây này đang là một vấn đề mà các nhà khoa học rất quan tâm

Huyền tinh là một loài thực vật bản địa ở vùng Thất Sơn, An Giang có rất nhiều tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm,… Huyền tinh được coi như một nguồn tinh bột mới thay thế cho các loại tinh bột truyền thống như ngô, khoai, sắn,… góp phần không nhỏ trong việc cải thiện nạn đói và sự tăng trưởng kinh tế ở châu Phi Bên cạnh đó, bột huyền tinh đã được sử dụng trong dân gian như một loài thuốc chữa trị tốt cho các bệnh như đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, nôn mửa, xuất huyết Ngoài ra, huyền tinh còn là một nguyên liệu sạch đầy hứa hẹn để sản xuất bao bì không gây ô nhiễm môi trường

Tuy nhiên, các nghiên cứu trên thế giới cho đến nay đều chỉ tập trung khai thác sử dụng tinh bột từ củ huyền tinh, rất ít nghiên cứu về thành phần hợp chất cũng như hoạt tính của các bộ phận khác của cây như lá, hoa, quả Tại An Giang, đa số người dân tập trung vào việc khai thác củ huyền làm thực phẩm, lá huyền tinh tươi đôi khi được sử dụng như một loại rau dùng trong các bữa ăn hằng ngày Sau khi thu hoạch củ, hầu hết lá huyền tinh sẽ bị bỏ đi hoặc tận dụng làm compost cho mùa huyền tinh năm sau Do đó, luận văn ―Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của lá huyền

tinh (Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze)‖ nhằm góp phần hiểu rõ hơn và đánh giá

tiềm năng của loài cây ở vùng Bảy Núi, An Giang, đồng thời tạo tiền đề cho các nghiên cứu về ứng dụng lá huyền tinh trong tương lai

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan chi Tacca

1.1.1 Phân bố của chi Tacca

Họ Râu hùm (Taccaceae) hay còn gọi là họ Củ nưa là một họ nhỏ trong bộ Củ nâu

(Dioscoreales) Họ Taccacceae là các loài cây thân thảo sống lâu năm, ưa ẩm vừa phải, với lá có cuống dài, mọc so le hay mọc vòng và cụm hoa có màu tía sẫm Trên thế giới, họ Taccaceae có duy nhất một chi (chi Râu hùm) và 11 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á- Thái Bình Dương và chỉ có một loài ở miền Nam nước Mỹ là

Tacca parkeri Seem [49, 63]

Theo thống kê đến năm 2019, ở Việt Nam có 7 loài thuộc chi Tacca đã được phát hiện

và định danh Thông tin về các loài thuộc chi Tacca được nêu trong Bảng 1.1 [7, 63]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Tacca phân lập ở Việt Nam

STT Tên khoa học Tên khác Tên thường gọi Nơi phân bố

André

Tacca paxiana Limpr., Schizocapsa breviscapa Limpr

Râu hùm hoa tía

Tuyên Quang, Thái Nguyên, Bắc Giang,

Phú Thọ, Hòa Bình…

2

Tacca integrifolia Ker-

Gawl

Tacca laevis Roxb Ngải rợm, cỏ râu

hùm, hạ túc

Lào Cai, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Khánh Hòa,

Đồng Nai…

3

Tacca leontopetaloides

(L.) Kuntze

Leontice lentopetaloides L., Tacca pinnatifida

Forst

Củ nưa, bạch tinh, huyền tinh

Bình Thuận, Ninh Thuận, Bà Rịa, An Giang, Kiên Giang

(Hance.) Drenth

Schizocapsa plantaginea Hance Hồi đầu, vùi đầu

Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,

Bắc Giang, Thái Nguyên, Thanh

Hóa,…

STT Tên khoa học Tên khác Tên thường gọi Nơi phân bố

6

Tacca subflabellata P P

Ling

Tacca vietnamensis Thin

et Hoat

Râu hùm Việt Nam, phá lủa

Hà Nội, Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ,

Đà Nẵng…

7

Tacca khanhhoaensis V.

S Dang & Vuong

Hòa

Hòn Bà (Khánh Hòa)

Tacca chantrieri André Tacca integrifolia Ker-Gawl

Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze Tacca palmata Blume

Tacca plantaginea Tacca subflabellata

Tacca khanhhoaensis

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Tacca 1.1.2 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Tacca

Đã có trên 134 hợp chất với các hoạt tính khác nhau được chiết tách từ chi Tacca bao

gồm các nhóm chính như diaryheptanoid, taccalonolide, saponin và các phenolic glycoside [8]

Vào đầu những năm 1960, Scheuer và cộng sự đã nghiên cứu tính chất của củ và phân lập được một hợp chất đặt tên là Taccalin có màu vàng nhạt vị đắng với cấu trúc tetracyclic [9] Cấu trúc taccalonolides này sau đó được làm rõ vào năm 1987 và thực tế đây một nhóm chất lớn có khả năng gây độc cho tế bào có khả năng trở thành chất chống ung thư [8]

Taccalonolides là nhóm mới của steroid tự nhiên có hoạt tính ổn định Các

Taccalonolides đầu tiên (1-2) được phần lập từ T plantaginea và được làm sáng tỏ cấu trúc bằng kỹ thuật hiện đại (Hình 1.2) [10]

(4) Taccalonolide AF: R = Oac (5) Taccalonolide AJ: R = OH

(6) Taccalonolide H2

(7) Taccalonolide H

Hình 1.3 Cấu trúc của một số taccalonolide phân lập từ Tacca plantaginea

Năm 1990, trong chiết xuất ethanol 80% của bột lá T leontopetaloides thu thập ở

Sudan, Abdel-Aziz đã phân lập được các steroidal saponins (8-11) bằng sắc ký cột,

cấu trúc của chúng được xác định thông qua phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (Hình 1.4) [12]

(8) Leontogenin

(9) Diosgenin: R1 = H, R2 = Me

(10) Isonutatigenin: R1 = OH, R2 = Me

(11) Isonarthogenin: : R1 = H, R2 = CH2OH

Hình 1.4 Cấu trúc của spirotanol saponins phân lập từ Tacca leontopetaloides

Bên cạnh đó, cấu trúc các diaryl heptonoid và diaryl heptanoid glycoside được phân

lập từ T chantriers và T plantaginea cũng được xác định cấu trúc (Bảng 1.2 và Hình

(12) R1 = OH, R2 = H, R3 = H

(13) R1 = OH, R2 = OH, R3 = H

(14) R1 = OH, R2 = H

(15) R1 = OCH3, R2 = H

(16) R = OH, R1 = Oglu, R2 = OGlu

(17) R = β-OH, R1 = Oglu, R2 = OGlu

(18)

Hình 1.5 Cấu trúc của các diarylheptanoids và glycosides ở Tacca ssps

Ngoài các chất trên, một phenolic glycoside mới

(4-[6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl) -β –D-glucopyranosyloxy] -3 - methoxybenzoic acid) (19),

quercetin-3-α-arabinoside (20), medicagenic acid (21), betulinic acid (22) từ T aspera và T chantriers cũng được phân lập và xác định cấu trúc (Hình 1.6) [13]

Ở Việt Nam, ba loài thuộc chi Tacca là T chantrieri, T plantaginea và T

vietnamensis đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Mühlbauer và cộng sự (2003) đã phân lập được 5 hợp chất taccalonolide mới R-V (23-

27) (Hình 1.7) trong dịch chiết từ rễ Tacca paxiana thu thập ở vùng Thái Nguyên,

Năm 2012, Tran và cộng sự đã phân lập được ba glycoside diarylheptanoid trên T

plantaginea: Plantagineosides A, Plantagineosides B và Plantagineosides C (16-18)

[16]

Năm 2015, Vo và cộng sự đã phân lập được các hợp chất (28-31) từ dịch chiết

methanol của thân rễ loài râu hùm (Tacca chantrieri) thu hái ở vườn quốc gia Bạch

Mã, Thừa Thiên Huế Bằng phương pháp phân tích và so sánh phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR), cấu trúc của các hợp chất được xác định (Hình 1.8) [1] Đồng thời, nhóm tác giả cũng thử hoạt tính gây độc trên tế bào của các chất

này ở các dòng tế bào ung thư PC3, LNCaP và MDA-MB-231, kết quả tất cả các chất thể hiện hoạt tính gây độc ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trong khoảng 17.9 – 22.0 µM

Năm 2016, Pham và cộng sự đã phân lập được năm saponin dạng steroid khác nhau là

taccavietnamoside A-E (32-36) (Hình 1.9) từ thân rễ Tacca vietnamensis và tiến hành

hoạt tính ức chế sản sinh oxit nitric trong tế bào BV2 với giá trị IC50 nằm trong khoảng 12.4 – 59.0 µM [17]

Hình 1.9 Các taccavietnamoside A-E phân lập từ Tacca vietnamensis

Các nghiên cứu trên cho thấy Tacca là một họ thực vật lớn chứa nhiều hợp chất có

hoạt tính sinh học cần được nghiên cứu thêm

1.1.3 Công dụng các loài thuộc chi Tacca

Trên thế giới, một số loài thuộc chi Tacca được sử dụng như một loại thuốc dân gian

để chữa trị các bệnh khác nhau như viêm loét dạ dày, viêm ruột, các bệnh ngoài da…

Tacca chantrieri được sử dụng ở Trung Quốc trong điều trị viêm loét dạ dày và tá

tràng, viêm gan, bỏng, ngứa ngoài da Rễ của loài Tacca plantaginea được dùng làm thuốc trị đau dạ dày, viêm ruột Loài Tacca integrifolia dùng điều trị mụn nhọt, sưng đau vòm họng Ngoài ra, ở Ấn Độ và Indonexia, rễ củ của Tacca leontopetaloides và

Tacca palmata giã nhuyễn dùng để điều trị các vết thương do rắn cắn Bột từ củ của

(32) (33)

(34) (35)

(36)

Tacca leontopetaloides điều trị kiết lị và nôn mửa [13, 18] Ngoài ra, rễ củ các loài chi Tacca có thể sử dụng để làm thực phẩm, phần lá được sử dụng làm rau ăn

1.2 Cây huyền tinh (Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze)

Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze là loài thực vật có hoa thuộc chi Tacca, còn được

biết đến là cây huyền tinh Phân loại khoa học của cây huyền tinh [19]:

Tên khoa học: Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze

Tên Việt Nam: bạch tinh, huyền tinh, củ nưa

Huyền tinh được phân bố ở nhiều nước từ Tây Phi qua Nam Á đến miền Bắc của nước Úc Và những người di cư đã mang theo loài cây này tới vùng đảo nhiệt đới ở Thái Bình Dương [72]

Ở Việt Nam, huyền tinh được trồng nhiều ở ven chân núi xã Thới Sơn, núi Cấm (An Hảo) hoặc trồng xen canh dưới tán rừng dọc theo chân núi Giai, núi Két, núi Voi, thuộc địa phận tỉnh An Giang, ngoài ra huyền tinh còn được tìm thấy ở các vùng ven biển Ninh Thuận, Bình Thuận

1.2.1 Mô tả thực vật

Huyền tinh là cây thảo nhiều năm, không có thân, có nhiều củ tròn màu nâu [20] Từ củ mọc lên những lá có cuống lá dài tới 2 m; phiến lá chia 3 lần; mỗi lần phiến lại mang 5 - 8 cặp đoạn lá hình ngọn giáo còn men theo cuống lá; các thuỳ không đều nhau Mới trông qua, lá huyền tinh giống lá khoai nưa Cụm hoa trên một trục cao 0.2 - 0.5 m, có lá bắc rộng ở ngoài, và nhiều lá bắc hình dải như sợi chỉ Hoa xanh, 3 lá

đài, 3 cánh hoa nhỏ, 6 nhị, bầu dưới, dính noãn bên Quả không mở, chứa nhiều hạt [21, 22] Huyền tinh ra hoa vào tháng 6 - 8, quả chín vào khoảng tháng 10

Nơi sống và thu hái: cây mọc hoang ở một số vùng từ Mũi Né (Bình Thuận) đến Vũng Tàu, Thủ Đức cho đến Núi Cấm (An Giang) Cây thường được trồng để lấy củ Củ nặng tới 600 g chứa chất thịt màu trắng, dùng để làm bột

Hình 1.10 Cây huyền tinh và củ huyền tinh 1.2.2 Thành phần hóa học của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze

Củ huyền tinh thu hoạch ở Nigeria có 28.25 - 29% chất khô, 25 - 27.25% tinh bột, 40 - 43 mg/100 g ascorbic acid [23] Tinh bột củ huyền có hàm lượng amylose và amylopectin tương ứng là 22.5 và 77.5% [24] Thành phần gần đúng của thịt củ gồm 1.1 - 1.5% protein, 2.7 - 2.73% tro, 0.08 - 0.1% chất béo và 95.02 - 95.42 % tổng carbohydrate trên tổng chất khô Ngoài ra củ huyền tinh còn chứa tinh bột, ceryl alcohol, saponin dạng steroid và tannin [25] Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá huyền tinh ở bốn vùng khác nhau ở Nigeria cho thấy trong lá huyền có chứa alkaloid, saponin, tannin, anthraquinone và glycoside tim [23]

1.2.3 Công dụng của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze

Tacca leontopetaloides là một nguồn thực phẩm quan trọng ở các nước Thái Bình

Dương, đặc biệt là Malaysia Ngoài ra, ở miền tây châu Phi, tinh bột Tacca được sử

dụng làm chất hồ vải [24] Một số quốc gia sử dụng Tacca làm thuốc để chữa trị các

bệnh đau dạ dày, tiêu chảy và kiết lỵ [26]

Các bộ phận của cây Tacca leontopetaloides từ lâu đã được người dân các nước sử

dụng làm vị thuốc truyền thống trong việc điều trị bệnh Ở Ấn Độ, củ được dùng trong điều trị các bệnh đau bụng, nôn mửa, hen suyễn, viêm phế quản, vảy nến và giun đường ruột [27] Ở Hawaii, cây huyền được sử dụng để điều trị chứng nôn liên tục Trong khi đó, ở quần đảo Polynesia, củ huyền tinh sống được hòa với nước và đất sét đỏ dùng để chữa tiêu chảy, kiết lỵ và ngăn chặn xuất huyết dạ dày [23] Trong các tiểu bang của Nigeria, rễ huyền được sử dụng để điều trị rắn cắn và một số bệnh khác, hoa huyền được cắt ra và đắp lên vị trí vết cắn [72] Ở Bờ Biển Ngà, thuốc sắc từ lá được dùng cho bệnh nhân bị vảy nến và phù nề Ở Úc, tinh bột của củ được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh tiêu chảy và kiết lỵ Ngoài ra, tinh bột từ củ có thể được sử dụng để giảm đau ngực và chữa phát ban ở trẻ sơ sinh [28]

Ngoài việc điều trị bệnh, cây còn được sử dụng với một số công dụng khác như: nước rửa củ huyền được sử dụng như một chất giặt rửa ở cao nguyên Nigeria [72] Tinh bột cũng được sử dụng để tạo ra các biopolymer khi phối trộn với cao su thiên nhiên [26]

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về Tacca Leontopetaloides (L.) Kuntze

Năm 1990, Abdel-Aziz đã phân lập được các hợp chất steroidal saponin (8-11) từ dịch

chiết của lá huyền tinh thu thập ở vùng Sudan [12]

Spennemann và cộng sự (1994) đã tiến hành các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng

có trong tinh bột Tacca và kết quả cho thấy nó có tiềm năng là một nguồn

carbohydrate trong tương lai [29] Năm 2013, Omojola đã thực hiện nghiên cứu so sánh thành phần trong nguyên liệu

khô của Tacca, bắp, ngô, lúa mì và sắn (Bảng 1.3) Kết quả cho thấy mặc dù hàm

lượng protein thấp hơn lúa mì, ngô và khoai tây, Tacca chứa hàm lượng tinh bột cao tương đương các loại nguyên liệu trên [37]

Bảng 1.3 Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu thô

Năm 2012, Borokini và cộng sự đã nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học ở lá

và củ của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze thu thập từ bốn vùng khác nhau ở

Nigeria để xem sự ảnh hưởng của điều kiện địa lý và môi trường lên khả năng tạo các chất chuyển hóa thứ cấp Kết quả cho thấy chất chuyển hóa thứ cấp có sự thay đổi khá nhiều trong mẫu lá và củ Ngoài ra còn có một số yếu tố khác ảnh hường đến thành phần hoá thực vật bao gồm việc sử dụng các hóa chất (thuốc trừ sâu), các yếu tố di truyền, bệnh và sâu bệnh, bón phân, thu hoạch Đồng thời nghiên cứu này cũng đã xác định alkaloid, saponin và tannin có trong lá, trong khi chỉ có akaloid hiện diện trong

củ huyền tinh (Bảng 1.4) [72]

Bảng 1.4 Thành phần hóa thực vật của các mẫu Tacca leontopetaloids

Mẫu

Dragendoff Meyer Wagner’s Kedde Choloroform/

Trong đó: (+): phản ứng dương tính (-): phản ứng âm tính ±: có xuất hiện vết A: mẫu Akoko B: mẫu Eruwa C: mẫu Adamawa D: mẫu Ile-Ife

Năm 2013, Makhtar cho thấy tinh bột huyền khi được phối trộn với cao su tự nhiên và bổ sung các chất dẻo hóa như: glycerol, dầu olein và dầu cọ thô trong sản xuất polymer sinh học giúp tăng khả năng chịu nhiệt của tinh bột và thúc đẩy quá trình phân hủy dễ dàng hơn so với các polymer thông thường, chỉ để lại khoảng 6.6% dư lượng polymer Điều này cho thấy, tinh bột Tacca có tiềm năng để phát triển thành một polymer xanh thân thiện với môi trường [30]

Năm 2014, Ndouyang và cộng sự đã tiến hành đánh giá in vivo về giá trị dinh dưỡng của củ Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze Kết quả thực nghiệm cho thấy tiêu thụ

Tacca chưa qua chế biến với lượng thấp có tác động tích cực đến sự chuyển hóa lipid trong cơ thể, nhưng cần được nghiên cứu thêm [31]

Năm 2015, Ndouyang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các

phương pháp xử lý các chất không có giá trị dinh dưỡng trong các loại bột Tacca

leontopetaloides Ngâm hoặc đun sôi có thể giảm đáng kể hàm lượng các chất này,

đồng thời có thể loại bỏ saponin, oxalate và alkaloid Sau khi xử lý, các chất không có giá trị dinh dưỡng còn lại ở dưới mức không độc hại và có thể đóng vai trò tích cực trong quá trình chuyển hóa [32]

Năm 2015, Abdel-Aziz và cộng sự phát hiện các thành phần đất trồng ảnh hưởng tới kích thước của củ, diện tích lá, chiều cao cây, tốc độ tăng trưởng và phân tích ra thành phần môi trường tốt nhất cho sự phát triển của cây [33]

Năm 2014, Jiang và cộng sự chỉ ra rằng Tacca leontopetaloides chứa nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học mạnh, ảnh hưởng lên hệ thần kinh, có khả năng gây độc cho tế bào và tiêu diệt côn trùng Tuy nhiên vẫn còn nhiều vấn đề liên quan đến cấu trúc, cơ chế hoạt động nên cần được nghiên cứu kỹ hơn về thành phần dược lý [13]

Saponin dạng steroid trong Tacca leontopetaloides có thể dùng làm tác nhân diệt ốc

gây hại [73]

Các cao chiết từ củ Tacca leontopetaloides có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn in vitro trên Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Shamonella typhi,

Escherichia coli, Shigella dysenteria và Candida albicans với vòng kháng khuẩn từ 18

– 27 mm [34] Nhìn chung, các nghiên cứu trên thế giới hiện nay hầu như đều tập trung vào các thành

phần hóa học và ứng dụng từ củ của loài Tacca leontopetaloides Ở Việt Nam, hiện thời chưa có các nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học của cây Tacca

leontopetaloides cũng như các giá trị dược liệu của nó Đầu năm 2017 Sở Khoa học và

Công nghệ tỉnh An Giang kết hợp với trường Đại học Bách Khoa tiến hành đề tài ―Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất, chế biến và tạo sản phẩm đặc sản từ cây huyền tinh, tỉnh An Giang‖ Luận văn này là một phần của đề tài trên

1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu chung của luận văn là cô lập được hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết lá huyền tinh và đánh giá hoạt tính sinh học của nó Để đạt được mục tiêu trên, cần thực hiện các nội dung cụ thể như sau:

 Chiết cao tổng và cao phân đoạn từ lá huyền tinh Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao chiết

 Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết thành phần, gồm hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng oxy hóa Khảo sát khả năng kháng viêm và định lượng các thành phần có trong cao chiết có hoạt tính sinh học cao nhất

 Phân lập thành phần hóa học trong cao chiết  Xác định cấu trúc của hợp chất thu được  Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của hợp chất trên

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin về hoạt tính sinh học trong các cao chiết thành phần từ lá huyền và cấu trúc của hợp chất có trong cao chiết Từ đó, góp phần giúp các nhà khoa học dễ dàng tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn về lá huyền trong tương lai

Ý nghĩa thực tiễn: đánh giá và tìm ra các hoạt tính sinh học để góp phần phát triển các sản phẩm từ cây huyền tinh

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu- hóa chất- thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá huyền tinh (Tacca leontopetaloides) ở vùng núi Cấm, tỉnh An Giang, được thu hái

- Hóa chất đánh giá khả năng kháng viêm: DMSO, Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O(Xilong, Trung Quốc), albumin trứng (HiMedia, Ấn Độ)

- Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: MHA, MHB, TSA, TSB (HiMedia, Ấn Độ)

- Hóa chất đánh giá khả năng kháng oxy hóa: ABTS (Agfa-Gevaert), DPPH (Sigma- Aldrich)

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Salmonella enterica sevovar Typhimurium ATCC 14028

2.2 Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Theo quy trình Hình 2.1, lá cây huyền tinh sau khi thu hái ở An Giang vào tháng 8

được phơi trong bóng râm để độ ẩm đạt dưới 13% , cắt nhỏ Lá huyền được chiết nóng trong EtOH 96% để thu cao tổng Cao tổng sau đó được chiết lần lượt với các dung môi từ không phân cực tới phân cực để thu các cao chiết phân đoạn và tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật có trong các cao chiết này Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết bằng các phương pháp kháng oxy hóa và kháng khuẩn để chọn ra được cao chiết có hoạt tính sinh học cao nhất Cao chiết được lựa chọn sẽ được sử dụng để phân lập hợp chất Hợp chất phân lập được xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát

Thu hái và xử lý nguyên liệu

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật và xác định

hoạt tính sinh học của từng cao chiết

Tách chiết hợp chất

Xác định cấu trúc hợp chất tách được

Xác định hoạt tính sinh học của

hợp chất Chiết cao phân đoạn

2.2.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật

Để phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá huyền tinh như sơ đồ Hình 2.2, các

bước được thực hiện cụ thể như sau:

- Định danh: mẫu nguyên liệu dùng định danh bao gồm lá, hoa, quả và củ của

cây huyền tinh Thí nghiệm định danh được thực hiện tại phòng Bảo tàng Thực vật, viện Sinh học nhiệt đới Phương pháp định danh dựa trên các tài liệu ―Flowering Plants Families of the World‖ của Heywood (2007) [35], ―Key to the families of Flowering Plants of the World‖ của Hutchinson (1967) [36], và

―Cây cỏ Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ (1999) [3]

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Lá T leontepetaloides

Định danh

Làm khô và xay nhỏ Xác định độ ẩm và tro toàn phần

Chiết cao phân đoạn Phân tích sơ bộ hóa thực vật

Các nhóm hợp chất chính

của T leontepetaloides

Chiết cao tổng

- Phơi khô và xay nhỏ: lá tươi của cây huyền tinh được phơi khô tới khi độ ẩm

đạt dưới 13% sau đó được xay nhỏ để xác định độ ẩm và tro toàn phần

- Xác định thành phần hóa thực vật: các cao chiết được chuẩn bị như sau: cao

tổng chiết bằng ethanol 96%, sau đó các cao phân đoạn được chiết bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần là hexane, ethyl acetate, butanol và nước Tiến hành định đính các nhóm chất chính trong từng loại cao chiết phần đoạn lá huyền bao gồm: alkaloid, flavonoid, saponin, anthranoid, tannin, acid hữu cơ, đường khử, chất béo Phương pháp định tính các nhóm chất trên được trình bày

cụ thể ở mục 2.3.4

2.2.2 Chiết cao phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học

Tiến hành thu cao chiết phân đoạn như sơ đồ thể hiện ở Hình 2.3:

 Cao EtOH: lá huyền tinh sau khi phơi khô được xay nhỏ và chiết nóng trong

EtOH 96% để thu dịch chiết EtOH Cô quay đuổi dung môi, thu cao EtOH  Cao hexane: từ cao EtOH phân tán với 100 mL nước cất sau đó việc chiết được

tiến hành bằng cách lắc với dung môi n-hexan Cho hỗn hợp cao EtOH vào bình lóng, thêm 30 mL n-hexane, lắc nhẹ chờ cho hỗn hợp phân lớp hoàn toàn Chiết cho đến khi pha n-hexane thử trên lam kính không còn vết Dịch chiết thu được cô quay đuổi dung môi thu được cao hexane

 Cao ethyl acetate: từ pha nước thu được sau khi chiết với n-hexane, tiếp tục được lắc với 30 ml dung môi ethyl acetate, chiết cho đến khi pha ethyl acetate thử trên lam kính không còn vết Pha ethyl acetate được đuổi dung môi bằng phương pháp cô quay thu được cao EtOAc

 Cao n-butanol: từ pha nước thu được sau khi chiết với ethyl acetate, tiếp tục được chiết với 20 mL dung môi n-butanol bão hòa nước Chiết cho đến khi pha n-butanol thử trên lam kính không còn vết Dịch chiết n-butanol được tiến hành cô quay để đuổi dung môi thu cao butanol

 Cao nước: pha nước thu được sao khi chiết với n-butanol tiến hành cô quay thu được cao nước

Sau đó, các cao chiết phân đoạn được tiến hành kiểm tra hoạt tính sinh học bằng phương pháp kháng oxi hóa và kháng khuẩn

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết cao phân đoạn lá huyền

Chiết nóng trong ethanol 96%

Lắc với n-hexane Dịch chiết n-hexane

Cô quay

Dịch chiết ethyl acetate Cô quay Cao EtOAc

Dịch chiết butanol Cô quay