Luận Văn Nghiên Cứu Một Số Đặc Điểm Thực Vật Học, Gen Phân Loại Và Thành Phần Hóa Học Tinh Dầu Lá Cây Khổ Sâm (Croton Kongensis) Tại Thanh Hóa.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC NGUYỄN THẾ LỢI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC, GEN PHÂN LOẠI VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU LÁ CÂY KHỔ S

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

NGUYỄN THẾ LỢI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC, GEN PHÂN LOẠI VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU LÁ CÂY KHỔ SÂM

(CROTON KONGENSIS) TẠI THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THANH HÓA, 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

NGUYỄN THẾ LỢI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC, GEN PHÂN LOẠI VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU LÁ CÂY KHỔ SÂM

(CROTON KONGENSIS) TẠI THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học

Mã số: 8.42.01.11

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Chắc

THANH HÓA, 2023

Danh sách Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ khoa học theo Quyết định số 951/ QĐ- ĐHHĐ ngày 26 tháng 04 năm 2023 của Hiệu trưởng Trường Đại học

GS TS Chu Hoàng Mậu Trường ĐHSP Thái Nguyên Chủ tịch

PGS TS Lê Thị Hương Trường ĐH Vinh Phản biện 1 PGS TS Nguyễn Bá

Thông

Trung tâm TV chuyển giao KHCNNN và PTNT Thanh Hoá Phản biện 2

Xác nhận của Người hướng dẫn

Học viên đã chỉnh sửa theo ý kiến của Hội đồng

Ngày tháng năm 2023 (Ký và ghi rõ họ tên)

TS Lê Đình Chắc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, đặc biệt là

trình tự vùng gen ITS và gen Matk và thành phần hóa học tinh dầu lá loài Khổ

sâm (Croton kongensis) tại Thanh Hóa là những kết quả đầu tiên được công

bố tại Việt Nam, một phần cũng đã được công bố trên các tạp chí Khoa học

Tự nhiên và Công nghệ trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa với sự đồng ý

và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác

Thanh Hóa, ngày tháng năm 2023

Tác giả

HV Nguyễn Thế Lợi

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS Lê Đình Chắc - Trưởng Bộ môn Sinh học, người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tôi xin cảm ơn

sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của tất cả các anh, chị em và các bạn lớp K14 cao học Thực vật học

Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này!

Thanh Hóa, ngày tháng năm 2023

HV Nguyễn Thế Lợi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Đặc điểm hình thái, thành phần hóa học và giá trị dược học của Khổ sâm 3

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của loài Khổ Sâm (Croton kongensis) 3

1.1.2 Thành phần hóa học cơ bản của Khổ sâm 4

1.1.3 Giá trị y học của cây Khổ sâm 5

1.2 Đặc điểm gen phân loại ITS, MatK 8

1.2.1 Khái niệm mã vạch DNA 8

1.2.2 Các tiêu chuẩn cơ bản của trình tự barcode 9

1.2.3 Gen phân loại ITS, MatK 11

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 14

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu 14

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và máy móc 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 17

2.3 Phương pháp chiết xuất và nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu 20

2.3.1 Xử lý mẫu nguyên liệu 20

2.3.2 Phương pháp cất tinh dầu 20

2.3.3 Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu và dầu béo bằng hệ

thống máy sắc ký khí GC-MS 21

2.3.4 Xử lý các số liệu thu được 22

2.3.5 Yêu cầu đối với kết quả phân tích 22

2.3.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của tinh dầu lá cây Khổ sâm 23

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Đặc điểm hình thái của mẫu Khổ sâm thu tại Thanh Hóa 26

3.2 Kết quả phân tích trình tự gen ITS và gen Matk 28

3.2.1 Kết quả đọc trình tự 2 đoạn gen ITS; Matk của cây Khổ sâm 29

3.2.2 Kết quả phân tích trình tự ITS 31

3.2.3 Kết quả phân tích trình tự Matk 37

3.3 Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu lá cây Khổ sâm thu tại Thanh Hóa 42

3.3.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học lá Khổ sâm thu tại Như Xuân, Thanh Hóa 42

3.3.2 Kết quả phân tích thành phần hóa học lá Khổ sâm thu tại Thường Xuân, Thanh Hóa 45

3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá cây Khổ sâm thu tại Như Xuân và Thường Xuân Thanh Hóa 49

3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của tinh dầu lá Khổ sâm thu tại Như Xuân và Thường Xuân Thanh Hóa 50

3.6 Kết quả thủ hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá Khổ sâm thu tại Như Xuân và Thường Xuân Thanh Hóa 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC P1

Bảng 3.1 Kết quả đọc trình tự gen ITS và Matk của các mẫu Khổ

sâm thu tại Như Xuân và Thường Xuân, Thanh Hóa

29

Bảng 3.2 Kết quả so sánh trình tự ITS thu được với các trình tự ITS đã

công bố trên gen bank bằng phần mềm MEGA XI

34

Bảng 3.3 Kết quả so sánh trình tự MatK thu được với các trình tự MatK

đã công bố trên gen bank bằng phần mềm MEGA XI

40

Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu lá cây Khổ sâm thu tại Như

Xuân Thanh Hóa

Bảng 3.7 Kết quả hoạt tính kháng viêm (Hoạt tính ức chế sản sinh

nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7)

51

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của hai mẫu tinh dầu lá Khổ sâm thu tại Thường Xuân và Như Xuân Thanh Hóa

52

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh chụp cành và mặt trên Khổ sâm 26 Hình 3.2 Ảnh chụp mặt trên và mặt dưới lá Khổ sâm 27

Hình 3.3 Kết quả PCR 2 mẫu với cặp mồi ITS, MatK 28

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự ITS của hai mẫu Khổ sâm thu được

với một số trình tự ITS đã được công bố trên gan Banks

33

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự ITS thu được với trình tự ITS đã công

bố trên gen bank

36

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự Matk của hai mẫu Khổ sâm thu được với một số trình tự Matk đã được công bố trên gan Banks

39

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự MatK thu được với trình tự MatK đã

công bố trên gen bank

41

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BioEdit và DNAstar: Phần mềm Tin sinh học phân tích dữ liệu DNA NXTH : Như Xuân Thanh Hóa

TXTH : Thường Xuân Thanh Hóa

Blast : Basic Local Alignment Search Tool

CTAB : Cetyl trimethyllammonium Bromide

matK : Maturase K

ITS : internal transcribed spacers

PCR : Polymerase chain reaction

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Khổ sâm, tên gọi khác là Khổ sâm bắc bộ, cây cù đèn, tên khoa học là

(Croton kongensis), thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae) Theo y học dân gian,

Khổ sâm được xem là cây dược liệu quý có tác dụng hiệu quả cao trong điều trị một số bệnh về dạy dày, đại tràng, vẩy nến, các viêm nhiễm khác [1], [2]

… Điều này cũng đã được minh chứng bởi một số các công trình nghiên cứu khoa học về thành phần các hoạt chất mang tính dược học cao trong lá cây Khổ sâm Những nghiên cứu gần đây, cho thấy, trong lá cây Khổ sâm có một

số các nhóm hoạt chất sau: nhóm flavonoid, alcaloid, β – sitosterol, stigmasterol, acid benzoic, tecpenoid… đây là những hoạt chất có giá trị trong

y học và dược học [3], [27] Theo y học hiện đại, Khổ sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, giúp giảm đau, chống dị ứng…[28]

Tại Việt Nam, về phân bố, Khổ sâm có phạm vi phân bố rộng, gần như

có phân bố khắp các tỉnh trong cả nước, đây là một lợi thế để các nhà y học, dược học có thể tận dụng tối đa nguồn dược liệu quý này trong việc nghiên cứu tạo ra được nhiều sản phẩm hỗ trợ sức khỏe của con người từ nguồn cây này Tuy nhiên, việc tạo ra các sản phẩm dược học có tác dụng chữa bệnh từ nguồn dược liệu này còn hạn chế Thực tế cho thấy, các hướng nghiên cứu về loài cây này chủ yếu là nghiên cứu mô tả đặc điểm hình thái, phân loại để sắp xếp loài

này trong hệ thống phân loại thực vật Tuy nhiên, trong chi Croton có rất nhiều

loài, mỗi loài có những đặc điểm về giá trị dược học và y học là khác nhau, nhưng về hình thái và một số đặc điểm thực vật học của các loài trong chi này

có những điểm tương đồng tương đối lớn, điều này cũng đã gây ra không ít những khó khăn trong việc lựa chọn và sử dụng đúng giá trị của nguồn dược liệu này

Tại Thanh Hóa, Khổ sâm cũng là một trong những loại thực vật dược quý được người dân sử dụng hàng ngày trong việc điều trị các bệnh về tiêu hóa, chống viêm… Tuy nhiên, việc sử dụng này vẫn mang tính dân gian, chưa

thực sự phát triển mạnh mẽ và khoa học Do vậy, việc cung cấp thêm những

cơ sở dữ liệu khoa học về loại dược liệu này là rất cần thiết và cấp bách, giúp các nhà khoa học dược học có thêm những cơ sở khoa học để đánh giá, bảo rồn, phát triển và khai thác tốt nguồn dược liệu quý này

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi chọn "Nghiên cứu một

số đặc điểm thực vật học, gen phân loại và thành phần hóa học tinh dầu

lá cây Khổ sâm (Croton kongensis) tại Thanh Hóa" làm đề tài nghiên cứu

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được đặc điểm hình thái, trình tự gen ITS, Matk, xác định được hoạt tính sinh học của tinh dầu, thành phần hóa học tinh dầu lá cây Khổ sâm (Croton kongensis) nhằm cung cấp cơ sở khoa học phục vụ cho việc phát

triển, lưu giữ và khai thác nguồn dược liệu quý này tại Thanh Hóa

3 Phạm vi nghiên cứu

Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài tập trung phân tích đặc điểm hình

thái, gen ITS, Matk và thành phần hóa học tinh dầu lá loài Khổ sâm ở hai địa

phương là Như Xuân và Thường Xuân (Thanh Hóa) Bước đầu tạo dữ liệu

phân loại học phân tử dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm của đoạn gen ITS và Matk phân lập được phục vụ nhận diện cây Khổ sâm tại Thanh Hóa

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả phân tích các đặc điểm về hình thái và thành phần hóa học tinh dầu lá, sự phân bố và những đặc điểm sinh học khác của cây Khổ sâm là dữ liệu được tư liệu khoa học cho cây Khổ sâm tại Thanh Hóa Đặc biệt là đặc

điểm về trình tự nucleotide của đoạn gen ITS và Matk phân lập từ cây Khổ

sâm là những dữ liệu khoa học quý giúp nhận diện cây Khổ sâm bằng công nghệ gen Kết quả nghiên cứu vừa có ý nghĩa về khoa học và vừa có nhiều ứng dụng trong thực tiễn

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Đặc điểm hình thái, thành phần hóa học và giá trị dược học của Khổ sâm

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của loài Khổ Sâm

(Croton kongensis)

Khổ sâm (Croton kongensis) còn được gọi là Khổ sâm bắc bộ, cây cù

đèn được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc và được định danh như sau:

Giới : Thực vật (Plants)

Bộ : Sơ ri (Malpighiales)

Họ : Thầu dầu (Euphorbiacea)

Chi : Ba đậu (Croton)

Loài : Khổ sâm (Croton kongensis)

Khổ sâm trong tự nhiên phân bố tập trung ở các kiểu bìa rừng nhiệt đới

và á nhiệt đới núi thấp và hầu hết thích nghi tốt với nhiều điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu khác nhau, ở nước ta, Khổ sâm gần như có phân bố ở hầu hết các tỉnh: Lào Cai, Hà Giang, Yên Bái, Vĩnh phúc, Ninh Bình, Thanh Hóa, Quảng Trị, Kontum, Gia Lai,… Phân bố trên thế giới: Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Inđônêxia…

Về hình thái, Khổ sâm (Croton kongensis) có chiều cao trung bình từ

1,3- 1,5m thuộc loại cây bụi Lá đơn, mọc cách hay gần như mọc đối, có hình mũi mác, dài trung bình 7 – 9 cm, rộng trung bình 3 – 4,5 cm, mép nguyên Mặt dưới của lá có màu trắng bạc, mặt trên thường xanh nhạt Cụm hoa mọc tại đỉnh cành, thân, hoặc nách lá, có màu trắng, có cả hoa đơn tính và lưỡng tính

Hoa cái có 5 lá đài cùng 3 vòi nhụy còn hoa đực cũng có 5 lá đài nhưng chỉ có 1 – 2 nhị Quả có màu hung đỏ có lông trắng gồm 3 mảnh vỏ Hạt có

màu nâu hung, hình trứng và có mỏ Mùa hoa quả rơi vào khoảng tháng 3 tới tháng 5 [28]

1.1.2 Thành phần hóa học cơ bản của Khổ sâm

Trong thực tế, theo các tài liệu đông y, Khổ sâm là loài cây thuốc rất đặc hiệu trong điều trị chữa mụn nhọt, lở ngứa, viêm mũi, lỵ, đau bụng, viêm loét dạ dày, tá tràng, tiêu hoá kém, viêm đại tràng, vẩy nến… bộ phận dùng chủ yếu là lá của cây Khổ sâm Các nghiên cứu gần đây cho thấy, thành phần hóa học trong lá Khổ sâm chứa chủ yếu các hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, alcaloid, β – sitosterol, stigmasterol, acid benzoic, tecpenoid…[27] đây là những hoạt chất có giá trị trong y học và dược học Theo y học hiện đại, Khổ sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, giúp giảm đau, chống dị ứng…

Gần đây các nhà khoa học trong và ngoài nước đã phân lập được một

số thành phần hóa học từ các hợp chất tecpenoid của lá Khổ sâm như sau: Ent – 7 β – hydroxyl – 15 – oxokauran – 16 – en -18 – yl acetate,

Ent – 1 α – acetoxy – 7 β, 14 α– dihydroxykauran – 16 – en – 15 – one

Ent – 18 – acetoxy- 7 β, 14 α – dihydroxykauran – 16 – en – 15 – one

Ent – 7 β, 14 α – dihydroxykauran – 16 – en – 15 – one [27] Đây là những

hoạt chất có giá trị y học và dược học cao, điều này được chứng minh bởi: chất chất ent – 7 β – hydroxyl – 15 – oxokauran – 16 – en -18 – yl acetate và alkaloid toàn phần có hoạt tính kháng sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum rõ rệt, kể cả chủng nhậy và chủng kháng cloroquin Mặt khác, những hợp chất này còn có tác dụng gây độc tính mạnh đối với các dòng tế bào ung thư người Hep – G2 (ung thư gan), RD (ung thư màng tim), FI (ung thư màng tử cung) và VR (tiền ung thư thận) Ngoài ra, các thành phần của flavonoid trong lá Khổ sâm còn có tác dụng kháng khuẩn; đặc biệt là chất ent – 7 β – hydroxyl – 15 – oxokauran – 16 – en -18 – yl acetate có tác dụng ức chế mạnh với Bacillus sublities, Aspergillusniger, Fusarium oxysporum và nấm Candida albicans…[27], [28] Theo Viện Dược liệu Việt Nam, Khổ sâm

có tác dụng chữa ung nhọt, lở loét, viêm mũi, đi ngoài ra máu, viêm loét dạ

dày, tá tràng, lỵ, đau bụng, tiêu hoá kém Có thể dùng nước sắc đặc để rửa, chữa mụn nhọt, lở ngứa

Tại Thanh Hóa, Khổ sâm được là một trong những loại thực vật dược quý được người dân (chủ yếu là đồng bào miền núi) sử dụng hàng ngày trong việc điều trị các bệnh về tiêu hóa, chống viêm… Tuy nhiên, việc sử dụng này chủ yếu mang tính dân gian, chưa thực sự phát triển mạnh mẽ và khoa học

1.1.3 Giá trị y học của cây Khổ sâm

Trong thực tế, theo đông y và dân gian, đã từ lâu, Khổ sâm đã được xem là loài cây dược liệu có giá trị cao trong việc chữa các bệnh về tiêu hóa, chống viêm … đây cũng là cơ sở để các nghiên cứu về sau của các nhà khoa học nghiên cứu về thực vật dược tiến hành nghiên cứu một cách khoa học về loài Khổ sâm Trước hết, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về đa dạng chủng loài, nhằm nhận biết và sử dụng đúng, hiệu quả giá trị y học của nguồn thực vật dược này Những nghiên cứu trên đã cho thấy, trong chi

Croton có nhiều loài khác nhau, các loài này về hình thái có những điểm

tương đồng khá lớn, tuy nhiên chúng cũng mang các đặc điểm đặc trưng cho từng loài, đây là các nghiên cứu rất có giá trị, làm cơ sở để nâng cao hiệu quả việc sử dụng trong thực tiễn Ngày nay, với sự phát triển của khoa học hiện đại, ngoài việc căn cứ vào vai trò của Khổ sâm theo dân gian, đông y… các nhà khoa học đã tiến hành phân tích, đánh giá thành phần hóa học của Khổ sâm để khẳng định vai trò của Khổ sâm đối với y học Các nghiên cứu này cho thấy, trong lá cây Khổ sâm có chứa một số nhóm chất quan trọng như: flavonoid, alcaloid, acid benzoic, β – sitosterol, tecpenoid, stigmasterol…[30], đây là các hoạt chất có giá trị cao trong điều trị các bệnh

về viêm nhiễm, chống oxy hóa tế nào, chống ung thư và một số các bệnh về tiêu hóa khác… Từ đó cho thấy, giá trị dược học và y học của cây Khổ sâm là rất lớn trong đời sống của con người, tuy nhiên, điều này ở nước ta chưa thực

sự phát triển và quan tâm một cách khoa học về loài thực vật dược quý này

- Một số bài thuốc dân gian từ cây Khổ sâm:

Sử dụng trong điều trị viêm đại tràng: Lá Khổ sâm 20 gram đun nước,

lấy khoảng 300ml nước uống vào buổi sáng sớm Kết hợp với ăn món trứng

gà lá mơ lông tía ăn hàng ngày Bệnh nhân viêm đại tràng kiên trì dùng cách trên khoảng 1 tháng tiêu hóa sẽ tốt hơn rất nhiều [29]

Sử dụng trong chữa kiết lỵ, đau bụng đi ngoài [29]

Bài thuốc 1: Bài thuốc này được sử dụng bởi lá Khổ sâm kết hợp vớ lá phèn đen; mỗi thứ một nắm, sắc uống

Bài thuốc 2: Đây là bài thuốc có sự kết hợp giữa lá Khổ sâm với 4 loại lá khác là: rau sam, cỏ sữa, nhọ nồi, lá mơ lông Cách dùng, mỗi vị 10g sắc uống mỗi ngày 1 thang

Bài thuốc 3: Có sự kết hợp giữa lá Khổ sâm với cỏ sữa lá nhỏ và lá mơ lông, mỗi vị 10g sắc uống ngày 1 thang

Sử dụng trong việc chữa đau bụng không rõ nguyên nhân: Cách

dùng: lấy một nắm nhỏ lá Khổ sâm nhai cùng với vài hạt muối, có thể sử dụng thêm gừng để hạn chế tình trạng nôn do không quen sử dụng [29]

Sử dụng trong việc chữa đau bụng sau khi ăn, đầy bụng, khó tiêu:

Lấy 30g lá Khổ sâm và 30g dây ngấy hương đã phơi khô, sau đó thêm 3 lát gừng tươi, sắc thành nước uống hàng ngày, có thể dùng thay trà [29]

Sử dụng để chữa nổi mẩn ngứa trên toàn da: Bài thuốc này cần có sự

phối hợp của lá cây Khổ sâm với lá kinh giới, lá đắng, lá trầu không Mỗi thứ một nắm nấu nước xông và tắm rửa [29]

Sử dụng chữa vẩy nến: Cách dùng, lá Khổ sâm 15g, huyền sâm 15g,

kim ngân 15g, sinh địa 15g, quả ké 10g, tán bột làm thành viên, ngày uống 20-25g [29]

Sử dụng chữa viêm loét dạ dày tá tràng: Bài thuốc này có sự kết hợp

giữa lá Khổ sâm với bồ công anh và nhân trần Cách dùng, mỗi vị 12g; cùng với lá khôi, chút chít, mỗi vị 10g Tán bột, mỗi ngày pha 30g với nước đun sôi, khuấy đều và uống [29]

Sử dụng trong chữa vẩy nến: Cách dùng, Khổ sâm 15g, huyền sâm 15g,

kim ngân 15g, sinh địa 15g, quả ké 10g, tán bột làm thành viên, ngày uống 20-25g [29]

Sử dụng chữa đau dạ dày: Cách sử dụng: Lá Khổ sâm 12g, lá khôi

50g, lá bồ công anh 20g, nước 600ml Sắc đặc còn chừng 200ml, chia làm 2-3 lần uống trong ngày Uống liên tục 10 ngày, nghỉ 3 ngày Rồi lại uống tiếp cho đến khi khỏi [29]

Sử dụng chữa sa tử cung: lá Khổ sâm 10g, phèn phi 25g, bồ công anh

10g, thổ phục linh 10g Sắc lấy nước rửa âm đạo, cách ngày làm 1 lần

Sử dụng chữa lở ngứa âm đạo: lá Khổ sâm kết hợp với lá phòng

phong, lộ phong phòng, chích thảo Lượng bằng nhau, sắc lấy nước rửa…[30]

Trị ngứa, lở loét ngoài da: Nguyên liệu: Khổ sâm 32g, kinh giới bỏ

cành 16g Đem tán nhuyễn các vị thuốc này thành bột mịn rồi trộn đều Cho nước vào để vo thành viên với kích thước bằng hạt bắp Mỗi lần sử dụng khoảng 30 viên uống cùng với trà sau bữa ăn [31]

Trị mệt mỏi, ngủ không ngon giấc: Thành phần, khổ sâm, đương quy,

hoàng cầm mỗi vị 12g; 15g mỗi vị hoàng kỳ và sinh địa; xuyên khung, trạch lan, tô mộc mỗi vị 10g; tế tân và quế chi mỗi vị 6g Cách làm, Tất cả nguyên liệu nói trên tán nhuyễn thành bột rồi hòa tan với nước nóng Cách sử dụng, Sau khi hòa tan bột với nước nóng, sau đó đợi đến khi nước còn ấm vừa thì cho chân vào ngâm trong 10-20 phút, thực hiện 1-3 lần/ ngày [26]

Ngoài ra, theo Nguyễn Duy Hưng (2021) nghiên cứu đa dạng nguồn tài nguyên cây thuốc đã công bố rễ cây này được dùng trị bỏng nước, dùng trị viêm dạ dày ruột cấp tính, mẩn ngứa da đầu và lở mép

Năm 2014, Trịnh Hồng Anh và cộng nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của cất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người, kết quả cho thấy sau 3 tháng điều trị, khối u nhỏ và tỉ lệ chết chỉ chiếm 40% so với nhóm đối chứng… Từ đó cho thấy,

Khổ sâm có thể xem là một trong những loài dược liệu có hiệu quả điều trị cao đối với các bệnh về tiêu hóa, viêm nhiễm…

1.2 Đặc điểm gen phân loại ITS, MatK

1.2.1 Khái niệm mã vạch DNA

Thuật ngữ “DNA barcode” được xem như là một chỉ thị phân tử hữu hiệu trong nghiên cứu phân loại học phân tử Năm 2003, Paul Hebert [13], nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đã đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) xem như là một cách để xác định loài, khi ông sử dụng DNA Barcode trong việc nhận diện các mẫu sinh vật Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn nằm trong hệ genome của sinh vật, có cùng nguồn gốc tổ tiên (orthologous), trong đó có vùng ít bị thay đổi (rất ổn định - bảo thủ) và có vùng dễ thay đổi trong quá trình tiến hóa Vì vậy, dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền trong sinh vật Như vậy, mã vạch ADN là một phương pháp định danh mới bằng việc sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngắn nằm trong hệ genome của sinh vật để đánh giá sự phát sinh chủng loài và xác định quan hệ di truyền của sinh vật đó thuộc về loài nào Theo thống kê tại http://www.boldsystems.org/ [25], đến nay đã có khoảng 11.769.884 mẫu có mã vạch AND và khoảng 339.261 loài sinh vật đã có mã vạch, chủ yếu là động vật, tiếp theo là thực vật

và sau đó là các loài nấm và các dạng sinh vật khác) Từ cơ sở dữ liệu trên cho thấy, hướng nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN đang được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm và phát triển mạnh mẽ và sẽ là một xu thế nghiên cứu trong thời gian tới (Valentini et al,

2009 [18]) Từ đó, mã vạch ADN có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ hiệu quả khi nghiên cứu về phân loại, phát hiện loài mới, giám định loài và các mẫu có nguồn gốc từ sinh vật sống hoặc đã chết thậm chí đã qua chế biến, vì vậy mã vạch ADN có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu cũng như thực tiễn

Đến nay, nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra, có nhiều đoạn ADN đặc trưng được sử dụng làm ADN mã vạch, các đoạn ADN mã vạch có thể là những đoạn ADN nằm ở trong nhân (nuclear DNA - nDNA), như: 18S, 5,6S,

26S, 5S spacer và vùng ITS; nằm ở ty thể (Mitochondrial DNA - mtDNA), như: Cytb và vùng kiểm soát (control region); nằm ở lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA), như: matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S (Kress et al, 2008 [11]; Aron et al, 2008 [4]) Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thể

được chia thành 3 nhóm như sau: Nhóm 1 là các gen mã hóa những yếu tố

thuộc hệ thống quang hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ), ATP synthase (atpA, atpB ), Rubisco (rbcL)

và NAD(P)H dehydrogenease (ndhA, ndhB ) (Storchova et al, 2007 [15]) ; Nhóm 2 là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5 ), trnA (trnH, trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), các gen tiểu phần ribosome (rps2, rps3 );

và nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng) và các gen mã hóa protein như matK, cemA… Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như: 16S, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK,…trải rộng từ bộ cho đến mức dưới loài Mỗi đoạn

mã vạch ADN có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn ADN (gen) đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch ADN là rất cần

thiết và đem lại hiệu quả cao (Kress et al, 2008 [11]; CBOL Plant Working Group, 2009 [6]; Vijayan et al, 2010 [20]; Yao et al, 2010 [22])

1.2.2 Các tiêu chuẩn cơ bản của trình tự barcode

Phương pháp phân loại hình thái, giải phẫu so sánh có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ và toàn diện Tuy nhiên, phương pháp phân loại này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển chưa hoàn thiện, những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm

tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài Đặc biệt là các loài đồng hình, hoặc có quan hệ gần gũi thì phân loại bằng phương pháp hình thái thực sự gặp khó khăn [10] Từ những năm cuối tế kỷ XX, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học sinh học nói chung, sinh học phân tử nói riêng đã tạo tiền đề cho một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học ra đời, đó là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (Protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [9] Phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật So với chỉ thị hình thái, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường Đối với sinh vật Eucaryote, hai nhóm gen chính thường được sử dụng là vùng gen nhân và hệ gen lục lạp (cpDNA), gen ty thể là những gen rất bảo thủ trong tiến hóa

Đối với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng

điều khiển và không tái tổ hợp được COI là một công cụ hữu hiệu trong

nghiên cứu tìm ra nguồn gốc các loài Mặt khác, DNA ty thể có số lượng bản sao lớn trong tế bào và bền vững trong thời gian rất dài, hàng nghìn năm trong khi đó DNA nhân chỉ có một bản sao và nhanh chóng bị phân huỷ ra ngoài môi trường Do vậy phần lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắn

của gen ty thể mã hóa cytochrome oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị DNA Mặc dù có vài trường hợp ngoại lệ, COI được COI là một chỉ thị DNA điển

hình và chung cho các loài động vật [19], [20]

Đối với thực vật, hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với

chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS

(Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [5], [14], [17] Trong những năm gần đây, nhiều vùng gen

đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật như Matk, Rpoc…

[7], [11], [13], [16] Theo Taberlet và cs (2007) [16], hệ thống mã vạch DNA

lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài

- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…)

- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA

1.2.3 Gen phân loại ITS, MatK

Trình tự ITS (internal transcribed spacers )

rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S,

5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal

transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba

gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA

được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị

tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Thực tế cho thấy, vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những

công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì

nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ (đối với sinh sinh vật sinh sản hữu tính) và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một số nghiên cứu gần đây

ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số mức độ biến

đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai

gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên cơ sở này rDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và

nguồn gốc tiến hóa khác nhau [20], [22] [23] Do đó, hiện nay, trình tự ITS,

trình tự rDNA được xem là những marker phổ biến nhất trong nghiên cứu quan hệ chủng loài của giới sinh vật, đặc biệt là thực vật và động vật

Trình tự Maturase K

Trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R tanguticum (Maxim ex Regel) Maxim ex Balf, R officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [5], [12]

Ở thực vật, trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến

hoá nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron trong quá trình phiên mã

RNA Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong giới thực vật, đồng

thời đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của DNA barcode, nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở

thực vật CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng

90% mẫu thực vật hạt kín, matK dễ dàng được khuếch đại bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn; do đó, CBOL đã đề nghị sử dụng matK là một trong những

locus barcode chuẩn cho thực vật [20, [23]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu

* Đối tượng, địa điểm, thời gian thu mẫu

Mẫu Khổ sâm (Croton kongensis) được thu thập tại Thanh Hóa

1 Khe Hạ, Xuân Liên, Thường Xuân, Thanh Hóa: 19º48’35.52’’ vĩ độ Bắc; 105º23’42,4’’ kinh độ Đông Thời gian thu mẫu: 8h00-9h00 ngày 20/5/2022

2 Núi Mơ, Bãi Trành, Như Xuân, Thanh Hóa: 19º27’56.41’’ vĩ độ Bắc; 105º027’10.58’’ kinh độ Đông Thời gian thu mẫu: 8h00-9h00 ngày 21/5/2022

Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để nhân bản 2 trình tự gen nói trên được trình bày tại bảng 2.1

* Nội dung nghiên cứu

i) Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Khổ sâm;

ii) Phân tích đặc điểm về trình tự nucleotide của gen ITS và Matk

của các mẫu nghiên cứu và so sánh với một số trình tự nucleotide của gen

ITS và Matk của cây Khổ sâm đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế

iii) Phân tích thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học, hoat tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá cây Khổ sâm

* Vật liệu nghiên cứu

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhân bản 2 trình tự tương ứng

thước

Tác giả

al 1990 [21]

al 1990 [21]

Matk MatK_390f CGATCTATTCATTCAATATTTC 936bp Cuenoud

- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc bằng nước cất vô trùng Từ dung dịch gốc pha lo.ng ½ đến nồng độ cần dùng: gentamycin (16 - 8 - 4 IU/mg), doxycyclin (0,4 - 0,2 - 0,1 IU/mg) và nystatin (12 - 6 - 3 IU/mg)

Nấm sợi (mốc): Asperghillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum

Tế bào RAW264.7 cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)

Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), Griess reagent, LPS (lipopolysacharide) được mua từ nguồn Sigma-Aldrich (nay là Merck KGaA, Darmstadt, CHLB Đức) Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và máy móc

Các hóa chất chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu: Tris HCl, EDTA, phenol, ethanol (100%), agarose thuộc các hãng: Merck, Sigma, Biolabscasc của các nước nước Mỹ, Anh, Đức Ngoài ra còn một số hóa chất khác được sử dụng trong việc làm tiêu bản giải phẫu rễ, thân, lá…

Các trang thiết bị như bộ nguồn điện di NanoPAC - 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800, Nhật Bản, một số thiết bị khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic của Nhật Bản), tủ lạnh -85oC (Nuaire của Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng và một số thiết bị khác

Phương pháp tách chiết tinh dầu và xác định thành phần hóa học tinh dầu lá cây Khổ sâm: Hệ thống chiết shoxlet, chiết hồi lưu; hệ thống máy siêu

âm loại 10L và 20 L; hệ thống chiết tinh dầu và dầu béo; hệ thống sấy; hệ thống quay cất chân không; các trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác

STT Tên vật tư, thiết bị Thông số kỹ thuật Tình

trạng

2 Bộ cất tinh dầu vi lượng Thủy tinh Đức Tốt

3 Máy khuấy từ RH Basic IKA Labortechnik Tốt

4 Hệ thống máy sắc ký khí Agilent GC 7890A nối ghép

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Thu thập mẫu Khổ sâm ở Như Xuân và Thường Xuân Thanh Hóa, cây Khổ sâm được chọn các cây khỏe mạnh Sử dụng lá có độ tuổi thích hợp để tiến hành tách DNA Sau khi thu, mẫu lá được làm sạch, sau đó được cho vào túi nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -

80oC để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá của các mẫu Khổ sâm thực hiện theo phương pháp CTAB Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước như sau:

Bước 1 Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (- 1960C) thành bột mịn Bổ sung vào mẫu 6ml đệm rửa có thành phần (Tris - HCl 100mM,

pH = 8,0; EDTA 5mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước) Chia ra

ống eppendorf 1,5ml Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C, bỏ dịch, thu cặn ( Bước này lặp lại 2 lần)

Bước 2 Thêm vào mỗi ống 500 pl đệm chiết ( bao gồm các thành phần: Tris - HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 20mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; nước), mix nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65°C trong vòng 30 phút (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần) Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút

Bước 3 Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C Thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới

Bước 4 Bổ sung thêm 500pl C : I (24 cloroform: 1 isoamyl) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C Hút cẩn thận 500pl dịch trong ở pha trên sang ống eppendorf 1,5pl mới (bỏ tủa) Bước này lặp lại 2 lần

Bước 5 Thêm 500 pl isopropanol, mix nhẹ, tủa DNA ở -20°C để qua đêm Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C, loại dịch thu tủa

Bước 6 Bổ sung 500 pl cồn 70 độ Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút

ở 4°C, loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần) Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50pl nước cất 2 lần đã khử trùng Bảo quản ở tủ -20oC đến khi sử dụng

2.2.2.3 Phương pháp nhân gen ITS, Matk bằng kĩ thuật PCR

Theo phương pháp của Peter và cs (2011) [24] và bảng các cặp mồi DNA Barcoding

Trong đó, đoạn gen ITS, Matk được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS-1f/ITS-4r và MatK_390f/MatK_1326r với kích

thước dự kiến là khoảng 700 nucleotide

Với chu trình nhiệt và thời gian phản ứng của PCR bao gồm: Biến tính khởi động ở 94ºC trong 4 phút; lặp lại 25 chu kì (Sambrook et al, 1989 [2]) (biến tính ở 94ºC trong 30 giây, gắn mồi ở 55ºC trong 40 giây, tổng hợp và kéo dài ở 72ºC trong 40 giây); ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72ºC trong 10 phút và bảo quản mẫu ở 4ºC

Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen

2.2.2.4 Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Sau khi chạy điện di, lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide Nhuộm trong 10 phút, sau đó lấy bản gel ra, ngâm trong nước 2 - 3 phút Đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh

2.2.2.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi nhân được gen ITS, Matk; bước tiếp theo cần thu nhận gen ở

dạng tinh sạch và không lẫn gel agarose Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific

2.2.2.6 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ITS, Matk

Trình tự nucleotide của các đoạn gen được xác định tại bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu Trình

tự gen đó được phân tích, so sánh và lập cây phát sinh chủng loại bằng các chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar

2.3 Phương pháp chiết xuất và nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu

2.3.1 Xử lý mẫu nguyên liệu

Toàn bộ mẫu nguyên liệu tươi (lá Khổ sâm) sau khi thu hái về được phân loại, xử lý loại bỏ tạp, sau đó rửa sạch và để khô, giữ lạnh trong tủ lạnh trước khi tiến hành các bước tiếp theo

1 Trạng thái, màu sắc,

mùi vị

Nguyên liệu đảm bảo không mốc, đã được bảo quản lạnh, có màu đặc trưng và không có mùi lạ

2 Tạp chất Không lẫn các loại tạp chất nhìn thấy được

3 Thời gian xử lý mẫu Nguyên liệu sau khi được đưa ra khỏi tủ lạnh

cần được xử lý luôn trong ngày

2.3.2 Phương pháp cất tinh dầu

- Trước khi tiến hành chưng cất tinh dầu cần kiểm tra hệ thống chưng cất, bộ làm lạnh để đảm bảo quá trình chưng cất đạt hiệu suất cao nhất và không làm ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu thu được

- Đưa nguyên liệu đã xử lý vào bình cầu và lắp nối với thiết bị chưng cất

- Hệ thống làm lạnh và gia nhiệt được duy trì ổn định trong suốt quá trình chưng cất

- Tiến hành chưng cất trong 48 giờ, thời gian được tính từ lúc hỗn hợp sôi đến khi tắt bếp

2.3.2.1 Phương pháp cất cuốn hơi nước

Phương pháp chưng cất cuốn hơi nước là phương pháp cổ điển thông dụng nhất để dùng chưng cất các chất hữu cơ tự nhiên dễ phân hủy ở nhiệt độ cao, khi thêm nước vào hỗn hợp, nhiệt độ sôi của hỗ hợp giảm xuống, cho

phép các chất hóa học hóa hơi ở nhiệt độ thấp hơn Nguyên lý của quá trình này là hỗn hợp 2 chât lỏng không hòa tan khi được chưng cất sẽ có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ sôi riêng phần của từng chất lỏng, do đó, các hợp chất hóa học trong tinh dầu được chưng cất lôi cuốn cùng hơi nước sẽ có nhiệt độ sôi dưới 100 oC, thấp hơn nhiều so với nhiệt độ sôi của tinh dầu, như vậy sẽ tránh được sự phân hủy bởi nhiệt Sau đó hỗn hợp hơi được làm lạnh, nhưng

tụ, tách thành hai pha là pha nước và pha hữu cơ, dễ dàng cho quá trình tách tinh dầu

Cụ thể: Các mẫu nguyên liệu thực vật được cắt nhỏ, tiến hành ngâm ủ với 2 L nước trong 5-6 giờ, sau đó được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong vòng 48 giờ bằng thiết bị chưng cất Clavenger với tốc độ cất 2-3 mL/phút Tinh dầu được tách và thu ở phần ngưng, loại nước bằng Na2SO4 khan, đựng trong chai thủy tinh kín, lưu trữ trong tủ lạnh đến khi phân tích

2.3.2.2 Phương pháp xử lý tinh dầu

Loại nước, cân tinh dầu và loại bỏ chất béo

+ Sau khi kết thúc quá trình chưng cất tinh dầu, tiến hành loại bỏ nước trong tinh dầu và cân lượng tinh dầu để xác định được hàm lượng tinh dầu thu được, sau đó tinh dầu được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các bước tiếp theo

+ Đối với những tinh dầu chứa nhiều acid béo cần thêm bước xử lý loại chất béo như sau: Mẫu tinh dầu (0,5 mL) được cho vào bình cầu, thêm 10 mL hexane, thêm 5 mL NaHCO3 5%, lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy qua đêm, sau đó chuyển toàn bộ lượng dung dịch sang phễu chiết để tách pha Lấy phần dịch hữu cơ ra, rửa lại bằng dung dịch NaCl 5% với 3 lần, mỗi lần 5 mL Dung dịch thu được đem phân tích trên hệ thống sắc ký khí (GC-MS) theo chương trình đã xây dựng được

2.3.3 Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu và dầu béo bằng hệ thống máy sắc ký khí GC-MS

Hệ thống sắc ký khí được tối ưu hóa các thông số:

- Nhiệt độ buồng ion hóa 230 oC

- Tinh dầu được pha với dung môi dichloromethane ở nồng độ 3%, lọc qua màng lọc PTFE 0.45 μm sau đó được đưa vào máy với các thống số đã được tối ưu

2.3.4 Xử lý các số liệu thu được

Chỉ số khóa thời gian lưu RI (retention time indices) của từng cấu tử được xác định bằng phần mềm dựa theo chỉ số khóa thời gian lưu của dãy đồng đẳng n-ankanes chạy cùng chương trình Hàm lượng của các chất trong mẫu thử được tính toán dựa vào diện tích peak trên sắc ký khối phổ thu được

So sánh phổ khối của các peak thu nhận được với thư viện phổ W09N08, HPCH1607, thư viện online NIST Chemistry WebBook [32] và sử dụng phần mềm khóa thời gian lưu, phần mềm xử lý kết quả MassFinder4.0

2.3.5 Yêu cầu đối với kết quả phân tích

- Các chất trong mẫu phân tích (tinh dầu, dầu béo) được tách rời ra khỏi nhau

- Không bị nhiễm tạp chất từ bên ngoài

- Xác định được chính xác hàm lượng, thành phần các chất có trong mẫu phân tích (tinh dầu, dầu béo)

2.3.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của tinh dầu lá cây Khổ sâm

2.3.6.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá cây Khổ sâm

Pha dịch vi sinh vật: Dùng que khuấy vô trùng lấy 01 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh vật hòa tan vào 10 ml nước muối sinh lý vô trùng trộn đều bằng mày trộn vortex thu được huyền dịch vi sinh vật Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với chuẩn 0,5 McFarland (đo ở λ=550nm) được huyền dịch nồng độ 150x106 CFU/mL

Môi trường: Saboraud 4% Dextrose Agra (SDA; Merck, Damstadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho vi khuẩn

Pha mẫu với DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ) Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để được giải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/mL (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ) với mẫu cao thô (cao chiết) và 50-25-12,5-6,25µg/mL với mẫu chất tinh sạch; để trong

tủ ấm ở 370C trong 24h đối với vi khuẩn và 300C trong 48h đối với nấm

Mẫu đối chứng: sử dụng NaCl 0,9% tương ứng với thể tích mẫu là mẫu chứng âm tính (-) và chứng dương tính (+) là các kháng sinh chuẩn

Mẫu được xác định có hoạt tính thì không có sự phát triển của vi sinh vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng âm (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU<5) Mẫu biểu hiện hoạt tính được test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế Mẫu được xác định có hoạt tính khi giá trị MIC ≤ 200 µg/mL đối với mẫu cao chiết và ≤ 50µg/mL đối với mẫu tinh sạch

2.3.6.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá cây Khổ sâm

Phân tích khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1

diphenyl-2-picrylhydrazyl; Brand-williams et al 1995, Shela et al 2003, Kumar et al

2013) là phương pháp đã được công nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxy hóa Chất thử được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và DPPH được pha trong ethanol 96% Sự hấp thụ của DPPH ở λ= 515 nm được xác định sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình ít nhất 3

phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p≤0.05)

Mẫu được pha trong DMSO 100% với nồng độ 4mg/ml đối với dịch chiết thô và 1 mg/ml đối với mẫu tinh sạch Sử dụng flavonoid 1mM hoặc axit ascorbic 5mM trong DMSO 10% làm đối chứng

Mẫu được nhỏ trên phiến vi lượng 96 giếng với dung dịch DPPH để được nồng độ cuối của mẫu thử trong phản ứng từ 200 µg/mL đến 12,5 µg/mL (đối với mẫu chiết thô) và từ 50 µg/mL đến 3,1 µg/mL (mẫu tinh sạch)

Ủ ở 370C trong 30 phút và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng λ= 515

nm trên thiết bị đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ)

Đánh giá khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity,

SC%)

Giá trị trung bình SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử

lý số liệu Excel theo công thức:

Mẫu (chất thử) được pha loãng thành các nồng độ giảm dần, lặp lại 3 lần

ở mỗi nồng độ Hiệu quả bẫy gốc tự do tạo bới DPPH của mối mẫu được tính

dựa trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank) và chứng âm tính