Đặc điểm thực vật học, gen phân loại và thành phần hóa học tinh dầu lá cây Khổ sâm (Croton kongensis) tại Thanh Hóa

Vật liệu, hóa chất và thiết bị

- Gentamycin cho vi khuẩn Gr (-), doxycyclin cho vi khuẩn Gr (+) và nystatin cho nấm sợi và nấm men. Chủng nấm (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) được cung cấp bởi viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên). Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), Griess reagent, LPS (lipopolysacharide) được mua từ nguồn Sigma-Aldrich (nay là Merck KGaA, Darmstadt, CHLB Đức) Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

Các hóa chất chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu: Tris HCl, EDTA, phenol, ethanol (100%), agarose. Ngoài ra còn một số hóa chất khác được sử dụng trong việc làm tiêu bản giải phẫu rễ, thân, lá…. Các trang thiết bị như bộ nguồn điện di NanoPAC - 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800, Nhật Bản, một số thiết bị khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic của Nhật Bản), tủ lạnh -85oC (Nuaire của Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng và một số thiết bị khác.

Phương pháp tách chiết tinh dầu và xác định thành phần hóa học tinh dầu lá cây Khổ sâm: Hệ thống chiết shoxlet, chiết hồi lưu; hệ thống máy siêu âm loại 10L và 20 L; hệ thống chiết tinh dầu và dầu béo; hệ thống sấy; hệ thống quay cất chân không; các trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác.

Phương pháp nghiên cứu 1. Phương pháp thu mẫu

Hút cẩn thận 500pl dịch trong ở pha trên sang ống eppendorf 1,5pl mới (bỏ tủa). Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50pl nước cất 2 lần đã khử trùng. Trong đó, đoạn gen ITS, Matk được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS-1f/ITS-4r và MatK_390f/MatK_1326r với kích thước dự kiến là khoảng 700 nucleotide.

Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.2. Sau khi chạy điện di, lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide. Sau khi nhân được gen ITS, Matk; bước tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch và không lẫn gel agarose.

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ITS, Matk Trình tự nucleotide của các đoạn gen được xác định tại bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu.

Phương pháp chiết xuất và nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu

Nguyên lý của quá trình này là hỗn hợp 2 chât lỏng không hòa tan khi được chưng cất sẽ có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ sôi riêng phần của từng chất lỏng, do đó, các hợp chất hóa học trong tinh dầu được chưng cất lôi cuốn cùng hơi nước sẽ có nhiệt độ sôi dưới 100 oC, thấp hơn nhiều so với nhiệt độ sôi của tinh dầu, như vậy sẽ tránh được sự phân hủy bởi nhiệt. Cụ thể: Các mẫu nguyên liệu thực vật được cắt nhỏ, tiến hành ngâm ủ với 2 L nước trong 5-6 giờ, sau đó được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong vòng 48 giờ bằng thiết bị chưng cất Clavenger với tốc độ cất 2-3 mL/phút. Tinh dầu được tách và thu ở phần ngưng, loại nước bằng Na2SO4 khan, đựng trong chai thủy tinh kín, lưu trữ trong tủ lạnh đến khi phân tích.

+ Sau khi kết thúc quá trình chưng cất tinh dầu, tiến hành loại bỏ nước trong tinh dầu và cân lượng tinh dầu để xác định được hàm lượng tinh dầu thu được, sau đó tinh dầu được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các bước tiếp theo. + Đối với những tinh dầu chứa nhiều acid béo cần thêm bước xử lý loại chất béo như sau: Mẫu tinh dầu (0,5 mL) được cho vào bình cầu, thêm 10 mL hexane, thêm 5 mL NaHCO3 5%, lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy qua đêm, sau đó chuyển toàn bộ lượng dung dịch sang phễu chiết để tách pha. - Tinh dầu được pha với dung môi dichloromethane ở nồng độ 3%, lọc qua màng lọc PTFE 0.45 μm sau đó được đưa vào máy với các thống số đã được tối ưu.

Chỉ số khóa thời gian lưu RI (retention time indices) của từng cấu tử được xác định bằng phần mềm dựa theo chỉ số khóa thời gian lưu của dãy đồng đẳng n-ankanes chạy cùng chương trình. So sánh phổ khối của các peak thu nhận được với thư viện phổ W09N08, HPCH1607, thư viện online NIST Chemistry WebBook [32] và sử dụng phần mềm khóa thời gian lưu, phần mềm xử lý kết quả MassFinder4.0. Pha dịch vi sinh vật: Dùng que khuấy vô trùng lấy 01 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh vật hòa tan vào 10 ml nước muối sinh lý vô trùng trộn đều bằng mày trộn vortex thu được huyền dịch vi sinh vật.

Mẫu đối chứng: sử dụng NaCl 0,9% tương ứng với thể tích mẫu là mẫu chứng âm tính (-) và chứng dương tính (+) là các kháng sinh chuẩn. Mẫu được xác định có hoạt tính thì không có sự phát triển của vi sinh vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng âm (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU<5). Mẫu biểu hiện hoạt tính được test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC (àg/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế.

Phân tích khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1 diphenyl-2- picrylhydrazyl; Brand-williams et al. 2013) là phương pháp đã được công nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxy hóa. Hiệu quả bẫy gốc tự do tạo bới DPPH của mối mẫu được tính dựa trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank) và chứng âm tính. Giỏ trị IC50 nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.