Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxi hóa In Vitro của lạc tiên tây (Passiflora Incarnata Linneaus)

Ngày nay, cùng với sự phát triển nền y học hiện đại, con người đã có thé tonghợp được rất nhiều các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh nhưng các phương thuốc từcây có vẫn được xem là có hiệ

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS.Nguyễn Thị Phương Phong

Cán bộ cham nhận xét 2: TS Hà Cam Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCMngày 14 tháng 01 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:Chủ tịch:PGS TS Phan Thanh Sơn Nam

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong

Phản biện 2: TS Hà Cam AnhỦy viên: TS Bạch Long GiangThu ký: TS Lê Xuân Tiến

mA BR WD t2 =Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn va Trưởng Khoa quan lý chuyênngành sau khi luận văn được sữa chữa.

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tự do — Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: LE THỊ THU HIEN MSSH: 12924374Ngày, tháng, năm sinh: 03/ 04/ 1990 Nơi sinh: Bình DươngChuyên ngành: Cong nghệ Hóa học Mã số ngành: 60 52 75

I TÊN DE TÀI:“Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính khángoxi hóa in vitro của Lạc tiên Tây (Passiflora incarnata Linneaus)”

Il NHIEM VU VÀ NỘI DUNG:1 Trinh bày tong quan về dé tài nghiên cứu.2 Cô lập và xác định cấu trúc hóa học một số hợp chat từ Lạc tiên Tây

— Điều chếcác cao n-hexan, ethyl acetate, methanol từ cao ethanol.— Cô lập và định danh bằng các phương pháp phân tích hiện đại 5 hợp chat.3 Khao sát hoạt tính kháng oxi hóa in vitromot số cao chiết và hợp chất đã

phân lập được bằng phương pháp DPPH.Ill _ NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:ngày 8 tháng 6 năm 2014

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: ngày 8 tháng 12 năm 2014V _ CÁN BỘ HƯỚNG DAN: PGS TS Nguyễn Ngọc Hạnh

Tp HCM, ngày tháng năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh

TRUONG KHOA

Luận văn này được truc tiếp thực hiện tại phòng Hóa Học Các Hợp Chat ThiênNhiên-Viện Công Nghệ Hóa Học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam;số 1 Mac Dinh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, TP Hô Chí Minh, năm 2014.

Với tam lòng kính trọng và biết ơn chân thành, tôi kinh gửi lời cảm ơn đến:

PGS TS NGUYÊN NGỌC HẠNHNgười Cô đã truyền dat cho tôi những kiến thức chuyên môn và nhiễu kinhnghiệm nghiên cứu quý báu trong suốt thời gian tôi học tập, tận tình hướng dẫn vàquan tâm thường xuyên đến suốt quá trình thực hiện công trình nghiên cứu của tôi.Người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi tốt nhất cho tôi hoàn thiện luận văn nay

Tôi chân thành biết onTS Phùng Van Trung, ThS Nguyễn Tan Phát, THhS.Phan Nhật Minh, đã giúp đỡ chân thành và hỗ trợ hết lòng dé tôi hoàn thành luận

van.

Ban Giám Hiệu va Quy Thay, Cô công tác tại Khoa Hóa học - Trường DaiHoc Bách Khoa đã trang bị cho tôi những kiến thức nên tảng vững chắc trong suốtthoi gian hoc cao học.

Các bạn học viên cùng lop cao hoc tại Trường Dai Học Bách Khoa, niên khóa2012 — 2014 đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, con rất cảm ơn người thân trong gia đình đã động viên, tạo mọiđiều kiện từ vật chất đến tỉnh thần cho con học tap, nghiên cứu và hoàn thành luậnvăn này.

Xin chân thành cam on!

TP Hô Chi Minh, tháng năm 20

LE THỊ THU HIEN

Ching tôi đã cô lập được 5 hợp chat gdm 3 hợp chất flavonoid C-glycoside:apigenin6—C——D—glucopyranostde (PIO1), luteolin 6-C-B-D-quinovopyranostde(P102), apigenin 8-C-—D-glucopyranoside (P103) và 2 hợp chất steroid O-glycoside: passiflorine (PIO4), sitosterol-3-O-$-D-glucopyranoside (PIO5) từcao methanol của Lac tiên Tây (Passiflora incarnata Linneaus) Trong số đó,6-C-8-D-quinovopyranoside (P102) và passjflorine (PI04)lan đầu tiên được cô lậptừ cây này Cấu trúc của những chất này được xác định bằng các phương pháppho HR-ESI-MS, ‘H-NMR, '°C-NMR, COSY, DEPT, HSỌC, HMBC và so sánh

với các tài hiệu tham khảo.Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vitro bằng phương pháp DPPHcũng cho thấyapigeninõ-C-f-'D-glucopyranoside (PIO1), luteolin 6-C-ð-D-quinovopyranoside (Pl02), apigenin S—C——D-glucopyranostde (PI03)có hoạttính khá tốt với ICso lan lượt là 30,36; 11,35; 30,41 ug/ml Đặc biệt là luteolin 6-C-8-D-quinovopyranoside có hoạt tính cao hơn ca vitamin C (lCs¿= 20,227pg/ml) Các cao ethanol, methanol cho kết quả không cao với ICsạ là 324,59

va97,46 Riêng passiflorine có hoạt tính rất yếu

We isolated 5 compounds including 3 flavonoid C-glycosides: apigenin6—C—Ø8 D-giucopyranosde (PIOI), luteolin 6-C-f$-D-quinovopyranoside (P102),apigenin S—C—{-D-glucopyranoside (PIO3) and 2 steroid O-glycosides:passiflorine (P104), sitosterol-3-O-B-D-glucopyranoside (PIO5) from the methanolextract of the whole Passiflora incarnata Linneaus Their structures were

elucidated by spectral methods as HR-ESI-MS, “H-NMR, 'SC_NMR, COSY, DEPT,

HSQC, HMBC and comparision with reported data.In addition, we also tested anti-oxidationabilityin vitro of ethanol, methanol extractand some isolated compounds by DPPH method using vitamin C (IC59=20,227ug/ml) as a standard anti-oxidant The results showthat theapigenin6—C—/-D—glucopyranoside, luteolin 6-C-B-D-quinovopyranoside andapigenin 6—C—-D—glucopyranoside exhibited significant ability (ICso= 30,36; 11,35; 30,41 ug/mlrespectively), especially luteolin 6-C-$-D-quinovopyranoside compared withvitamin C (ICsp= 20,227 ug/ml) as the standard oxidant The results on the Ethanoland methanol extract (IC5g= 324,59 and 97,46) were not high while passiflorinedidn’t exhibit any ability.

cứu của riêng tôi, chưa từng được dùng trong bat kì luận văn cùng cấp nào.Các kết quả thu được trong luận văn đảm bảo tính chính xác và khách quan.

TP HCM, ngày Tháng năm 20

Tác giảLê Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

Trang

MUC 01100 P8P8nn |Danh mục các ký hiệu, chữ VICE ẨẶT Gv TH T ng 1g ng net iilDanh mục các hình - - - - << + S210 3300 210100 11110 1 1111 HH ng n1 56 VDanh mục các bảng - - + 099000 0 nọ re viDanh mục các SO d6 G1112 21 3 5111915111 5 010113 111101111110 H11 ni VIIDanh mục các d6 thị -ó- - tt 51111 1 3 51919191 1 5 011129 5111011111 0 H11 nen: VIIDanh mục các phụ LUC - << << <5 99999990010 ve VillMO DAU

CHUONG 1: TONG QUAN1.1 Dai cương

1.1.1 Đặc điểm thực Vat oe ceeececseesseesseesseesseesseeseeesseeseeesueeseseseseaseeseesseensesses |1.1.2 Phan bố và sinh thái cc-c+ecxeEkteEkrerkrtrkrrrkrrrkrrrirrrirrrkerked 3I.I.3 Y học dân gian cọ net 31.2 Cacnghién cứu khoa học

1.2.1 Thanh phan hóa học - ¿2 - 5252 SE2E£E+E£EEEE£E£ESEEEEEEEEEErErErrersred 41.2.2 Tae dụng dược Ìý - SH HH vn 13

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU,

HOA CHAT VA THIẾT BỊ2.1 Phuong pháp nghiên cứu

2.1.1 Phuong pháp phân lập các chất - - + 2 2 s+s+s+x+££ezszezeerrsred 172.1.2 Phuong pháp xác định cau trúc hóa học - - 2 2 s5s+s+s+£s£zszs2 202.1.3 Phuong pháp nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa 212.2 Hóa chất- thiết bi

2.2.1 Hóa chất ccc re 212.2.2 Thiết bị cà ng hư 22

CHUONG 3: THUC NGHIEM

3.1 Nguyên liỆU - Ă Gà 243.2 Quá trình trích ly các loại cao chiẾT - ¿+ 5+ +2 £E£E£E+EeEEkrkrkrrerersred 24

3.3 Các quá trình sắc ký - 5< 5c St 1 E1 121115111 111111111111 1111111 rk 243.4 Quá trình tinh chế và thu thập thông tin về cau trúc hóa học các chất 263.5 Quá trình khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa - «Ăn seesss 35

CHƯƠNG 4: KET QUA VA BAN LUẬN4.1.Nhận danh cấu trúc các chất đã phân lập -. - 5-5 2 2 2+s+£+£z££szxceee 38

4.1.1 Nhận danh cấu trúc PÏ(]L - xk+k sEsE9ESE SE EsEsESESEvkEeeseseseree 384.1.2 Nhận danh cấu trúc P1O2 «xxx EsESESESkEEsESESESEvEEeEseseseree Al4.1.3 Nhận danh cấu trúc PIO3 ceeeccecescssesscecesessssecscecceesevavscecesesececeees 454.1.4 Nhận danh cấu trúc P( -c ¿+ xxx EsE SE EeEsESESEve vest seseree 494.1.5 Nhận danh cấu trúc PÏ(5 - x+k+kSsESE 93k EeESESkee re seseree 544.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxI Oa - G100 ke 59

CHUONG 5: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

5.1 KẾT luận Q.11 TT H111 TT ng TH HT TH nung: 655.2 Kiến nghị 5< cScSn 1 HT T3 111511111 111121111 01111121 1101 011121 11 1n rg 65TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CCC: MC:M:WCNSCOSY'*C-NMRd

dd

DEPT

DMSODMSO-dg

DPPHE:ME:M: W

EtOHESI-MSGF60F 54‘H-NMRHMBCHPLCHR-ESI-MSHSQCH,SO,

JL.

m

MPLC

DANH MUC CAC KY HIEU, CHU VIET TAT

BenzoflavoneColume ChromatographyChloroform: MethanolChloroform: Methanol: WaterCentral neutrous systemCorrelation SpectroscopyCarbon (13) Nuclear Magnetic ResonanceDoublet

Doublet of doubletsDetortionless Enhancement by Polarization TransferDimethyl Sulfoxide

DeuterioDimethyl Sulfoxide1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylEthyl acetate: Methanol

Ethyl acetate: Methanol: WaterEthanol

Electrospray Ionization Mass SpectrometrySilicagel, [CaSO,(0,5H2O) and fluorescent substanceProton (1) Nuclear Magnetic Resonance

Heteronuclear Multiple Bond CoherenceHigh Performance Liquid ChromatographyHigh Resolution Mass Spectrometry

Heteronuclear Single Quantum CorrelationAcid Sunfuaric

Coupling constantLinneaus

MultipletMedium Performance Liquid Chromatography

no.

PP:ppm

Sp.

TLCUPLCUVVol.

A”-THC

Mass SpectrometryNumber

PagePages

Parts per millionRetention factorSinglet

SpeciesTripletThin Layer ChromatographyUltra Performance Liquid Chromatography

UltravioletVolumeChemical shiftDelta-9-tetrahydrocannabinol

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Một số bộ phận thực vật của Lạc tiên T ây S99 111k, 2Hình 1.2: Một số sản phẩm titLac tiên Tây - ¿2-5-5 S22 2E£E+EzEEE£ErErEerrsred 2Hình 2.1 Phương trinh phan ứng giữa DPPH và gốc tự do - 21Hình 2.2: Một số thiết bi dùng trong thí nghiệm - 2-2 255 +2 2£<+<z5+2 230i 000 27Hinh 3.2: TLC PIOL eee 27Hình 3.3: IPI2 (<< 9900 nọ re 27Hinh 3.4: TLC P02 eee 27Hình 3.5: PO Ô - nọ nọ re 27Hình 3.6: TLC PIỐ -G G0999 00101 nọ re 27Hình 3.7: PÏ4 - G9 re 28Hình 3.6: TLC PI⁄4 - -G G00 99990010 nọ re 28Hình 3.9: PIOE - nọ re 280010 3009565 28Hình 4.1: 1SOVI{€XIT 0 gọt 40Hình 4.2: luteolin 6-C- /Ø-qUInOVOSI€ - - G5 00v re 4Hình 4.3: vi{€XIn Q0 gọt 46Hình 4.4: pasSIÍÏOTITI€ - G00 nọ re 52Hình 4.5: Ø-sitosterol-3-@-Ø-D-glucopyranosIde - «<< ess 57

DANH MỤC BANG

Bảng 1.1: Công thức các chất đã được cô lập từ Lạc tiên Tây -. - 7

Bang 3.1: Dữ liệu phố 'H, 'C-NMR va HSQC của PIO! trong DMSO-đ; 29

Bang 3.2: Dữ liệu phố 'H, 'C-NMR va HSQC của PI02 trong DMSO-đ; 30

Bang 3.3: Dữ liệu phố 'H, 'ÌC-NMR va HSQC của PI03 trong DMSO-đ; 31

Bang 3.4: Dữ liệu phố 'H, 'C-NMR va HSQC của PI04 trong DMSO-đ; 32

Bang 3.5: Dữ liệu pho 'H, 'ÌC-NMR va HSQC của PI05 trong Pyridine-đs 33

Bảng 3.6: Thành phan dung dịch DPPH/ ethanol ở các nồng độ 32

Bang 3.7: Độ hấp thu của DPPH /ethanol ở các nồng độ - 5+: 36Bảng 3.8: Độ hap thu của DPPH/ethanol sau phản ứng với vitamin C 36

Bảng 3.9: Độ hap thu của DPPH/ethanol sau phan ứng với cao etanol 36

Bang 3.10: Độ hap thu của DPPH/ethanolsau phan ứng với cao methanol 36

Bảng 3.11: Độ hap thu của dung dịch DPPH/ethanol sau phản ứng với PI01 37

Bang 3.12: Độ hap thu của DPPH/ethanol sau phản ứng với PI02 37

Bang 3.13: Độ hap thu của DPPH/ethanol sau phản ứng với PI03 - 37

Bang 3.14: Độ hap thu của DPPH sau phản ứng với PI044 -255- 2: 37Bảng 4.1:Dữ liệu '°C-NMR ctaPI01 so sánh với tài liệu tham khảo - 40

Bảng 4.2:Dữ liệu '°C-NMR của PI02 so sánh với tài liệu tham khảo 44

Bảng 4.3: Dữ liệu '°C-NMR của PI03 so sánh với tài liệu tham khảo 48

Bảng 4.4: Dữ liệu '“C-NMR của PI04 so sánh với tài liệu tham khảo 52

Bảng 4.5: Dữ liệu '°C-NMR của PI05 so sánh với tài liệu tham khảo 58

Bảng 4.6: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C 60

Bang 4.7: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethanol 60

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tinh kháng oxi hóa cao methanol 61Bang 4.9: Kết quả khảo sát hoạt tinh kháng oxi hóa PIOL -2-55- 2: 62Bang 4.10: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa PI02 5- 5-5-5 s5s5¿ 62Bảng 4.11: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa PI03 - 5-5-5552 63Bảng 4.12: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa PI04 5- 5-5-5 s5s5s¿ 64

Sơ đồ 2.1 :Đồ thị 4.1 :Đồ thị 4.2:Đồ thị 4.3:Đồ thị 4.4:Đồ thị 4.5:Đồ thị 4.6:Đồ thị 4.7:Đồ thị 4.8:

DANH MUC CÁC SƠ ĐÓ

Sơ đồ quy trình trích ly các loại cao chiẾt -. 5- + s55 cs+csscsee 18

DANH MUC CAC DO THI

Độ hấp thu của dung dịch DPPH /ethanol ở các nông độ 59

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C 60

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa cao ethanol - 61

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa cao methanol - 61

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa PIOL -. 55+: 62Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa PIO2 -55+: 63Kết quả khảo sát hoạt tinh kháng oxi hóa PI03 -. - +: 63Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa PI04 - 55+: 64

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

PHU LUC 1: PHO CUA PI01Phụ lục 1.1: Phổ HR-ESI-MS PIO1

Phụ lục 1.2a: Phố 'H-NMR PI0IPhụ lục 1.2b: Phố 'H-NMR PI0IPhụ lục 1.2c: Phố 'H-NMR PIO1Phụ lục 1.3: Phố '“C-NMR PIO1Phụ lục 1.4: Phố DEPT PIO1Phụ lục 1.5: Phố HSQC PIO1Phụ lục 1.6: Phổ HMBC PIO1

PHU LUC 2: PHO CUA PI02Phụ lục 2.1: Phố HR-ESI-MS PI02

Phụ lục 2.2b: Phố 'H-NMR PI02Phụ lục 2.2a: Phố 'H-NMR PI02Phụ lục 2.2c: Phố 'H-NMR PI02Phụ lục 2.3: Phố 'C-NMR PI02Phụ lục 2.4: Phé DEPT PI02Phụ lục 2.5: Phổ HSQC PI02Phụ lục 2.6: Phô HMBC PI02

PHU LUC 3: PHO CUA PI03Phụ lục 3.1: Phé ESI-MS PI03

Phu lục 3.2a: Phé 'H NMR PI03Phụ lục 3.2b: Phố 'H NMR PI03Phụ lục 3.3: Phổ ‘°C NMR PI03Phụ lục 3.4: Phé DEPT PI03Phụ lục 3.5: Pho HSQC PI03Phụ lục 3.6: Phố HMBC PI03

PHU LUC 4: PHO CUA PI04Phụ lục 4.1: Phé6 HR-ESI-MS PI04

Phụ lục 4.2a: Phố 'H NMR PI04Phụ lục 4.2b: Phố 'H NMR PI04Phụ lục 4.2c: Phô 'H NMR PI04Phụ lục 4.3: Phố °C NMR PI04Phụ lục 4.4: Phổ DEPT PI04Phụ lục 4.5: Phé HSQC PI04Phụ lục 4.6a: Phố HMBC PI04Phụ lục 4.6b: Phd HMBC PI04Phụ lục 4.7: Phổ COSY PI04

PHU LUC 5: PHO CUA PI05Phụ lục 5.1: Phố HR-ESI-MS PI05

Phụ lục 5.2a: Phố 'H NMR PI05Phụ lục 5.2b: Phố 'H NMR PI05Phụ lục 5.2c: Phô 'H NMR PI05Phụ luc 5.2d: Phố 'H NMR PI05Phụ lục 5.3: Phổ °C NMR PI05Phụ lục 5.4: Phé DEPT PI05Phụ lục 5.5: Pho HSQC PI05Phụ lục 5.6a: Phố HMBC PI05Phụ lục 5.6b: Phố HMBC PI05Phụ lục 5.7:a Phố COSY PI05Phụ lục 5.7b: Phố COSY PI05

Ngày nay, cùng với sự phát triển nền y học hiện đại, con người đã có thé tonghợp được rất nhiều các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh nhưng các phương thuốc từcây có vẫn được xem là có hiệu quả tốt, an toàn và được sử dụng rộng rãi.

Trên thế giới, đặc biệt là ở các nước phương Tây, PassifloraincarnataLinneaus làmột trong những loại thảo dược được sử dụngtừ xa xưanhờ tác dụng giảm đau, anthan Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về thành phan hóa học cũng như cáchoạt tính sinh học của loài cây này.

Ngoài khả năng giảm đau, an thần loài cây này còn được dùng như một phươngthức phòng ngừa các bệnh tim mạch Các gốc tự do có khả năng tân công các cơquan, bộ phận trong cơ thé, đặc biệt là những nơi tiêu thụ nhiều oxi như các mạchmáu não là một trong những nguyên nhân gây xơ vữa động mạch, đau tim.Phươngpháp khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vitro DPPH dựa trên nguyên tắc bắt giữsốc tự do là phương pháp phù hợp dùng để tìm hiểu cơ chế tác dụng của loài câynày.

Ở nước ta, loài cây này không được biết đến nhiều Theo đó, số lượng các nghiêncứu va ứng dụng gan như không có

Với mục đích tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng loài cây như một loại thảodược mới được trông ở Việt Nam bên cạnh góp phan b6 sung vào kho tàng kiếnthức về các loại thảo dược trên thế giới Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Gópphân nghiên cứu thành phan hóa học và hoạt tính kháng oxi hóa in vitro của

Lạc tiên Tây (PassifloraincarnataLinneaus)”.

TONG QUAN

Trước khi đi vào thực nghiệm, chúng tôi tiến hành tham khảo một số tài liệu vàcó những nhận xét về đại cương thực vật cũng như các công trình nghiên cứu cóliên quan đến đề tài.

1.1 Đại cương1.1.1 Đặc điểm thực vậtTên khoa học: PassifloraincarnataLinneaus

Tại Việt Nam, loài cây này cũng đã xuất hiện trong một số tài liệu Theo tác giảPhạm Hoàng Hộ, loài cây này được gọi tên là Mắc mát hay Lạc tiên Tac giả ĐỗHuy Bích cũng gọi là cây Mắc mát, nhưng dành tên Lạc tiên để gọiPassiflorafoetidaL và dùng tên Lạc tiên Tây cho loài cây này dé phân biệt

Lạc tiên Tâylà cây 2 lá mâm, có dạng thân leo, mãnh, vỏ màu xám nhạt sauchuyển mau đỏ tia, khi non có lông mịn, dài 3-9m

Lá có phiến, có ba thùy, mọc so le, không lông, rộng 7-12 em, đáy hình tim, mépcó răng cưa rất nhỏ

Hoa màu trắng có tràng tía, thơm, mọc đơn độc, rộng 4-5 cm, nở quanh năm,thường vào buổi trưa, tức là khoảng thời gian âm áp nhất trong ngày

Quả hình trứng, bên trong có nhiều hạt, khi chín chuyển từ màu xanh sang vàng,to 3,5-7 cm, có thé ăn được

Hạt bên trong quả mau nau đậm, dài 4-6 mm!!!

Thân Lạc tiên Tây Lá Lạc tiên lây

Hoa Lạc tiên Tây Quả Lạc tiên Tây

Quả Lạc tiên Tây cắt ngang Hạt Lạc tiên Tây

Hình 1.1: Một số bộ phận thực vật của Lạc tiên Tây

CÔNG TY TNHH SX - TM HỒNG ĐÀI VIỆT |

A94 Bị VĂN DỒN Pt Q4.TP Hồ Chi Minh

„e284«

4 CC KHÁNH HỘI 380C BEN VĂN ©

Tot (848) 0627105 : 9409144GARY CHONG NHỆN Đ: ĐIẾ0 BEEN VE 4X AN TOÁN HIVE rin

j a) Dh: Dw FTP OC AYVXTP - HỘ Y TẾ

+ teen oe : : 5

Sản xuất tại: Trung tâm nghiên cứu và sản xuất được liệu miễn TrungKCN Hoà Hiệp Nam - Đông Hoà - Phó Yee - De : 097 35346009

Hình 1.2: Một số sản phẩm từ Lạc tiên Tây

1.12 — Phân bốsinh tháiChi Passiflora lần đầu tiên được biết đến vào năm 1529 ở Peru trong những ghichép của nhà nghiên cứu Monardus người Tây Ban Nha Chi Passiflora là chi lớnnhất trong hoPassifloraceae, gồm hơn 500 loài, thường phân bỗ ở khu vực nhiệt đớivà có khí hậu ấm áp của châu Mỹ, cũng có ở châu Á, châu Úc và châu Phi nhưngkhông nhiều Trong khi một số loài khác như Passifloraedulis, PassifloraLaurifloliaL., được trồng do cho quả ăn được hay cho hoa lạ, rất đẹp, một số khác lại được

trồng để chữa làm cây thuốc Passifloraincarnata L.la một loại thảo dược được sử

dung pho biến trong dân gian ở các nước phương Tây nhờ tính năng làm dịu thankinh, giảm đau nhẹ va cũng được trồngđề làm cảnh trong vườn do có hoa rat đẹp

PassifloraincarnataL có nguồn gốc từ Đông Bắc nước Mỹ, tuy nhiên, theo tácgiả Pham Hoàng Hộ, PassifloraincarnataL có nguồn gốc từ châu Phi và xuất hiệnở Việt Nam từ trước kháng chiến ở Hà Nội và Đà Lạt dưới tên gọi là Mắc mát để

làm cảnh và ăn quả, chưa thay có ghi nhận về khả năng chữa bệnh!?!!P!®L

1.1.3 Y học dân gian

Ở Việt Nam, Lạc tiên Tây không được biết đến nhiều nhuPassiflorafoetida một cây cùng chi Passiflora- còn được gọi là Lac tiên được dùng phố biến trongdân giandé làm thuốc hay nau nước uống, có tác dụng an thân, dễ ngủ! 1,

L.-Ở các nước phương Tây, Lạc tiên Tâylại là loại thảo được được dùng phổ biếnnhất so với các loài khác trong chi Passifora dé chữa bệnh

Thổ dân châu Mỹ dùng lá Lạc tiên Tây như thuốc nhuận trường, thuốc giảm daunhức, trị tiêu chảy, kiết ly, kinh nguyệt bất thường, mất ngủ, động kinh, co giật,dùng trái trị ho và là thuốc bồ tim Lạc tiên Tây được dùng làm trà an thần ở BắcMỹ Ở Brazil, Lạc tiên Tây được dùng để giảm đau, chống co thắt, trị hen và anthan Olrac, Lạc tiên Tây được dùng làm thuốc an than và thuốc ngủ Ở Thổ NhĩKỳ, Lạc tiên Tây dùng trong những trường hợp đau bụng kinh, động kinh, mất ngủ,rồi loạn thần kinh chức năng và đau dây than kinh O Ba Lan, Lạc tiên Tây dùng déchữa chứng suy nhược thần kinh và dễ kích động Ở Mỹ, Lạc tiên Tây được dùngđể chữa tiêu chảy, đau bụng kinh, đau dây thần kinh, bỏng, bệnh trĩ và mất ngủ

Trong dược điển của nhiều nước, Lạc tiên Tây được m6 tả là một loại dược liệuđược dùng từ xa xuadé giảm đau, giảm căng thăng, làm dịu than kinh, an than, lợitiêu Ngoài ra, Lạc tiên Tâycòn dùng chữa mat ngủ, hồi hộp, suy nhược than kinh,động kinh, dưới dạng côn thuốc tươi, với liều 30- 50giot/ngày hay dạng cao lỏngvới liều 1-5g/ngay hay côn thuốc với liều 2-5 g/ngày Lạc tiên Tây đã được dượcđiển Pháp chính thức công nhận là thuốc an than và chống co thắt H Leclerec(Pháp) còn cho rằng Lạc tiên Tây có tác dụng hạ huyết áp, giảm co bóp cơ trơn ruội.Trong “The Materia Medical Americana’, xuất ban năm 1787 tại Đức, dé cập đếnsử dụng Lạc tiên Tây chữa chứng than kinh phân liệt ở người lớn tuổi Một số tàiliệu khác nhắc đến việc sử dụng loại cay nay để chữa rối loạn co that, mat ngủ oO trẻ

nhỏ và người lớn tuôi!P!!5!,

1.2 Cac nghiên cứu khoa hoc

Lạc tiên Tây không được trồng pho bién va biét dén rộng rãi ở Việt Nam, do đó,số lượng các nghiên cứu vẻ thành phan hóa hoc cũng như hoạt tính sinh học haunhư không được tìm thấy Ngược lại, tại các nước phương Tây như Úc, Mỹ, Ấn Độ,Lạc tiên Tây lại là loài cây được nghiên cứu từ rat sớm, đặc biệt là về hoạt tính sinhhọc tác dụng lên hệ than kinhl”!!°l,

1.2.1 Thành phân hóa họcFlavonoid, glycoside, alkaloid, hợp chất benzopyrol, hợp chat cyanogen, aminoacid và tinh dau là những thành phan đã được tìm thay trong Lạc tiên Tây! !!9

Những nghiên cứu dau tiên dé cập đến thành phan hóa học củaLạc tiên Tây là vềcác hợp chat alkaloid Harman(1)- một indole alkaloid có câu trúc dựa trên hệ vòngf-carboline- được tim thay dau tién trong loai nay (Neu, 1954) Mot số cácharmalankaloid khác như harmol(2), harmalin(3) cũng được tìm thay sau đó cùngvoiharman trong lá và thân Lạc tiên Tây Năm 1965, tác giả EskilHultinda xây dựngmột phương pháp tách riêng các harmal alkaloid trong dịch chiết ether của Lạc tiênTây dựa trên sự phụ thuộc của hệ SỐ phân bố của các alkaloidvào pH và khả năngphát quang dưới tia cực tim của chúng Hai ankaloidtiép theo được tìm thấy trongcây là harmalol(4) và harmin(S).Năm 1970, Poethke và cộng sự chỉ tìm thay harmannông độ 1,2-3 ppm va không tim thay các harmal alkaloid khác trong cây Năm

1971, Bennati lại tim thay harman và harmine trong cây với hàm lượng 10-20 pg/100ml dịch chiết bằng phương pháp phố huỳnh quang trên TLC",

Nam 1995, bang phương pháp HPLC pha đảo- một phương pháp rất nhạy và độchọn lọc cao, đã đạt hiệu quả rất cao trong khảo sát thành phân alkaloid có trong hạtPeganumharmala, tác gia Anne Rehwald và các cộng sự, đã tiến hành khảo sát sựcó mặt của tat cả các harmala alkaloid có trong 17 mẫu Lạc tiên Tây khác nhau Kếtquả thu được cho thay chỉ có 1 mẫu có mặt harman nhưng với nông độ rất thấp

0.1ppm!”°! Cũng băng phương pháp HPLC, từ năm 2001 đến năm 2007, nhiều

nghiên cứu để định lượng các harmal alkaloid trong Lạc tiên Tay đã được tiễn hành.Grice và cộng sự, năm 2001, đã xác định có harman và harmine với hàm lượng0.012 và 0,007% trong mẫu cây Lạc tiên Tây được trồng trong nhà kính và đối vớimẫu cây Lạc tiên Tây được trồng bên ngoài là 0,005% Harman va hầu như khôngtìm thấy harmine Các tác giả Abigail Frye và Catherine Haustein, năm 2007, tìmthay harmol và harmin với hàm lượng 0,031 và 0,00935 mg/g mẫu khô trong mẫuLạc tiên Tay!’ Nam 2010, với sự phát triển của kĩ thuật UPLC, nhóm tác giả Avulavà cộng sự đã xây dựng phương pháp phân tích tất cả 5 harmal alkaloid nay bangUPLC-MS, là một phương pháp mới, với độ nhạy cao hơn HPLC, kết quả không

cho thay sự có mặt nao cua ca 5 harmal alkaloid nay! HP),

Kết quả sự có mặt cũng như hàm lượng các alkaloid này là khác nhau trong cácthí nghiệm Sự khác nhau này hoàn toàn có thể giải thích dựa trên quá trình pháttriển của cây tại những nơi thu hoạch khác nhau, và thời gian thu hoạch trong nămcũng khác nhau Nhưng nhìn chung hàm lượng của các alkaloid đều rất thấp Đồngthời, các thí nghiệm trên cũng chứng minh được hàm lượng harmine trongPassifloracaerulea- một loài cây cùng hoPassiflora, nhưng lại không được dùng déchữa bệnh- cao hơn trong Lạc tiên Tây và hàm lượng các flavonoid trong Lạc tiênTây cao hơn rất nhiều hàm lượng các alkaloid có mặt Kết quả mở ra một hướngnghiên cứu mới- các flavonoid trong cây.

Năm 1974, bốn flavone apigenin(6), luteolin(7), quercetin(8) và kaempferol(9)lan đầu tiên được cô lập từ lá và hoa Lạc tiên Tay!" Trong hơn 20 năm tiếp theo,rất nhiều các C-glycosyl flavonenhu vitexin(10), isovitexin(11), orientin(12),

isoorientin(13), swertisin(14) cùng với các di-glycosyl flavone như saponarin(15),Isovyifexin-2ˆˆ-O-/-ID-glucopyranoside(16), Isoorienftin-2ˆ°-O-Ø-D-glucopyranoside(17),schaftoside(18), isoschaftoside(19), vicenin-2 (20), lucenin-2(21),apigenin6-Ø-D-glucopyranoside-8-Ø-D-ribopyranoside(22)đã được tìm thấytrong Lạc tiên Tâyh>'5! Năm 1997, lần đầu tiên ¡isoscoparin-2-O-glucopyranoside(23), một di-glycosyl flavone nhưng có 1 nhóm hydroxyl bi methylhóa, được Rahman và các cộng sự phân lập từdịch chiết methanol của Lạc tiênTây! ”!.

Bằng phương pháp HPLC-MS và các phương pháp khác, ngoài việc định tính sựcó mặt của các flavonoid, hàm lượng của các chất cũng được khảo sát Năm 1986,Geiger va Markham đã xác định hàm lượng cua_isovitexin-2’’-O-f-D-glucopyranoside 531 mg/100g, cao hơn han so với các flavone khác trong cây,vitexin chỉ tổn tại với hàm lượng rất thấp, không thé phân lập được!'“°*“! Năm2010, Hans Wohlmuth và cộng sự đã so sánh hàm lượng các flavone có mặt trongmẫu Lạc tiên Tây thu thập từ Mỹ, Ấn Độ, Ý và các khu vực khác nhau ở Úc Kếtquả cho thấy có thé phân chia các mẫu khảo sát thành 2 nhóm có thành phan chínhhoàn toàn khác nhau Nhóm có thành phanchinh là swertisin và không có mặtschaftoside hay isoschaftoside it được sử dụng hơn nhóm có hàm lượng isovitexin,schaftoside hay isoschaftoside cao nhưng lại không có swertisin'”Ì Nhìn chung,thành phan chính trong Lạc tiên Tây là các C-glycosylva di-C-glycosyl flavone dựatrên khung apigenin là chủ yếu, và một số dựa trên khung luteolin

Năm 2002, nhóm tác giả Dhawan và cộng sự lần đầu tiên tìm thay sự có mặt cuamột benzoflavone (BZF)- một flavone găn thêm một vòng benzene tại vi trí 6,7-trong dịch chiết methanol từ phan trên mặt đất của Lac tiên Tây Mặc dù, cầu trúchoàn chỉnh của BZF vẫn còn chưa được công bố nhưng đây được cho răng là thànhphân chính làm nên tác dụng giảm đau ở Lạc tiên Tây PHOLST

Gynocardin(24), maltol(25) va tinh dầu(hexanal (1.4 %), benzyl alcolhol (4,1 %),linalool (3,2 %), 2-phenylethyl alcohol (1,2 %), 2-hydroxy benzoic acid metyl ester(1,3 %), carvone (8.1 %), trans —anethole (2.6 %), eugenol (1,8 %), isoeugenol (1,6

%), 6-Iionone (2,6 %), a-bergamatol (1,7 %), phytol (1,9 %) và hai acid béo (7,2 %),

acid oleic (6,3 %))cũng được tim thay trong Lac tiên Tây!*””,

Bang 1.1 : Công thức các chat đã được cô lập từ Lạc tiên Tây

Harmalin(3)

N

HO \ a

| CH,Harmalol(4)

| CH,

Harmin(5)

Kaempferol(9)

Isovitexin-2’’-O-glucopyranoside (16)

OHvẽ „ OH O

HO* '

OH OH

Schaftoside(18)

OH

Apigenin6-£-D-glucopyranoside-8-6-D-ribopyranoside(22)

Isoscoparin-2’’-O-glucopyranoside (23)

HO te.

OHO CHạ

Maltol(25)

1.2.2 Tác dụng dược lý

Lạc tiên Tây có nhiều tác dụng dược lý như giảm đau, an thần, giảm căng thăng,hỗ trợ các quá trình cai nghiện và các hoạt tính khác như giảm ho, chống co thắt,chữa hen, kích thích tình dục ?”

% Tác dụng giảm dau, an thanVào những năm đầu của thế kỉ 20, việc sử dụng các loại thuốc an thần tonghợp trong điều tri gây ra nhiều tác dụng phụ Lac tiên Tây, loại thao được đượcbiết đên từ rat sớm nhờ tác dụng an thân, được tiên hành nghiên cứu Ban dau,

tác dụng giảm đau, an thần của Lạc tiên Tây được cho là do sự có mặt của cácalkaloid và flavone °"! Nam 1974, Noubuo Aoyagi khảo sát chuột được tiêm vàomàng bụng phân đoạn chứa hau hết các alkaloid có trong cây, ở nông độ 250mg/kg chuột có biéu hiện giảm linh hoạt trong phản xạ, giảm hô hap và nhịp

tim! Tuy nhiên, các alkaloid trong Lac tiên Tay lại thuộc loại harmal alkaloid

được biết đến là các tác nhân ức chế men monoamine oxidase, có tác dụng kíchthích hệ thần kinh ”' Do đó, một thí nghiệm khác cho tiêm dưới da maltol (75mg/kg)- I chất khác cũng được cô lập từ phân đoạn này Kết quả làm giảm 50%độ linh hoạt trong phan xạ sau khi tiêm 60 phút; 300 mg/kg maltol tiêm dưới dakéo dài thời gian ngủ đối với chuột dùng thuốc an thần Nghiên cứu cho thay caonước (400 mg/kg) thé hiện hoạt tính giảm đau!"°”!, Nhiều nghiên cứu sau nàyđã khang định lại giá tri của các nghiên cứu trên ?5!,

% Tác dụng giảm lo lang, căng thangNghiên cứu cho thay cao methanol (400 mg/kg) không có hoạt tính giảm đaunhưng có tác dụng giảm căng thắng, dịu thần kinh Khảo sát trên chuột,với chấtchuẩn là diazepam (2mg/kg) cho thấy cao chiết từ toàn bộ cây(300 mg/kg) cóhoạt tính làm giảm căng thăng trong khi ngoài cao methanol từ lá (100mg/kg),

thân (125mg/kg), hoa (200 mg/kg) thì các cao methanol từ rễ va các cao eter,

chloroform và cao nước hoàn toàn không thể hiện hoạt tính.Từ kết quả trên,nhóm tác giả đưa ra kiến nghị chỉ nên dùng lá, loại bỏ rễ và hoa, khi thực hiệnkhảo sát hoạt tính này!””””!

s* Tác dụng hỗ trợ các quá trình cai nghiện

Trong năm 2002, sau khi cô lập được BZF từ Lạc tiên Tây, nhóm tác giảKamaldeepDhawan cùng cộng sự đã tiến hành nhiều nghiên cứu tác dụng củahoạt chất này đến hệ thần kinh trung ương (CNS) trong hỗ trợ cai nghiệncannabinoid, nicotine, morphinevà alcohol.

Cannabinoid làthành phan chính gây nghiện trong cây cần sa Cannabissatival.Nhóm chuột đối chứng đượccho uốngdelta-9-tetrahydrocannabinol (A”-THC) (10mg/kg)2 lần/ ngày trong 6 ngày Đồng thời, hainhóm chuột nghiên cứu được chouống BZF (10 và 20 mg/kg) cùng với A”-THC 2 lần/ngày trong suốt 6 ngày

Theo dõi hoạt động vận động nhận thay rang nhóm chuột nghiên cứu có khanăng chịu thuốc tăng và ítphụ thuộc vào thuốchơn so với nhóm chuột đối chứng.Thậm chí, BZF được tiêm trực tiếp vào chuột đang lên cơn nghiện còn có khảnăng làm giảm hiệu quả các biểu hiện do thiếu thuốc ở chuột!”°!.

Đã có nhiều nghiên cứu trước đây đây đề cập đến việc Lạc tiên Tây có tácdụng hỗ trợ cai nghiện thuốc lá Nhóm tác giả này tiến hành nghiên cứu, chonhóm chuột đối chứng tiêm dưới da nicotine hydrogen tartrate (2 mg/kg) -thànhphân gây nghiện trong thuốc lá- trong 7 ngày liên tục 4 nhóm chuột nghiên cứuđược tiêm dưới da hỗn hop nicotine trộn với BZF (1, 5, 10 và 20 mg/kg) trong 7ngày Kết quả cho thấy mức độ phụ thuộc thuốc của nhóm chuột nghiên cứu (10và 20 mg/kg) thấp hơn đáng kể so với nhóm chuột đối chứng Quan sát kết quả,14 ngày sau khi ngừng dùng thuốc, nhóm chuột nghiên cứu (5, 10, 20 mg/kg) cócác biểu hiện vật vã do thiếu thuốc ở cường độ thấp hơn và có hiệu quả cainghiện cao hơn so với nhóm chuột đối chứng, với hàm lượng BZF thấp hơn (1mg/kg) thì không tác dụng”

Dựa trên các kết quả trên, nhóm tác giả đi vào khảo sát tác dụng của BZFtrong Lạc tiên Tây đến quá trình cai nghiện rượu Nhóm chuột đối chứng đượccho uống ethanol (2g/kg) 2 lần/ ngày trong 6 ngày 3 nhóm chuột nghiên cứuđược cho uống hỗn hợp ethanol- BZF (10, 20, 50 mg/kg) 2 lần/ ngày trong 6ngày 3 nhóm chuột nghiên cứu khác lại được cho uống BZF (10, 20, 50 mg/kg)sau 6 ngày uống ethanol (2 g/kg) 2 lần/ ngày Cả hai hình thức uống lặp lại vauống một lần đều cho kết quả rất tốt trong việc ngăn chặn các biểu hiện vật vã dothiếu thuốc Tuy nhiên, hình thức uống lặp lại cho hiệu quả tốt hơn uống mộtlan!"

“* Tác dụng chống co giậtBệnh động kinh- biểu hiện là các triệu chứng co giật, co cứng- là một bệnh cấptính, có thể dẫn đến tử vong Các loại thuốc hiện nay chữa bệnh động kinh cóhiệu quả khoảng 70% và để lại rất nhiều phan ứng phụ, độc tính tích tụ do dùng ởliều cao hoặc trong thời gian dài, có thể dẫn đến quái thai nếu dùng thuốc khimang thai Khả năng hạn chế các triệu chứng co giật khi dùng chất kich thích

thần kinh pentylenetetrazole(150 mg/kg)của Lạc tiên Tây và maltol (300 g/kg)hứa hẹn việc sử dụng Lạc tiên Tây như một loại thuốc chữa bệnh động kinh hiệuquả và an toàn., kéo dài thời gian chịu thuốc đối với thuốc kích thíchPentylenetetrazole; 500 mg/kg maltol giảm hữu hiệu các triệu chứng co cứng vàtử vong khi dùng chất kích thích thần kinh Strychine nitrate (1,5 mg/kg)!”'.

s* Ngoài ra, Lạc tiên Tây còn được khảo sát các hoạt tính dược lý khác

như tác dụng kháng khuẩn kích thích tình dục, trị bệnh hen, ho, ung thư, caohuyết áp, dé ngủ”

PHUONG PHAP NGHIEN CUU,

HOA CHAT VA THIET BI

Trong luận văn, chúng tôi sử dụng một số hóa chất, thiết bị và phương phápthường được dùng trong nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên như sắc ký, cộnghưởng từ hạt nhân dé phân lập và xác đinh cấu trúc các hợp chất và phươngpháp DPPH dé khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vitro của các mau.

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phwong pháp phan lập các chất 9E!

— Phương pháp chiết siêu âmMẫu được ngâm trong một bình chứa bang thủy tỉnh hoặc bằng thép không rỉ,bình có nap đậy Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu.Đặt bình chứa vào máy siêu âm, để tăng hiệu quả có thể tăng nhiệt độ khi siêu âm,nhiệt độ này thường nhỏ hơn 60°C dé không phá hủy các chất có trong mẫu Sau đó,dung dịch chiết được lọc ngang qua giấy lọc và cô quay áp suất thấp dé thu hồidung môi Tiếp tục rót dung môi mới vào phan căn còn lại trong bình chứa và tiếptục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu

— Phương pháp cô quay áp suất thấpNham loại dung môi ra khỏi dung dịch, dung dịch được chứa trong bình thủy tinhở điều kiện áp suất thấp Dun nóng dung dich dé thúc đây quá trình bay hơi Hơidung môi trong điều kiện áp suất thấp sẽ đi qua hệ thống làm lạnh, ngưng tụ Kếtquả loại được dung môi Nhờ tiến hành quá trình bay hơi ở áp suất thấp nên nhiệt độbay hơi của dung môi giảm, là một ưu điểm đối với các mẫu kém bên nhiệt

— Phương pháp xác định độ âmTrong quá trình cô quay, một lượng nhỏ dung môi có thể còn xót lại làm ảnhhưởng đến các kết quả thí nghiệm Tuy nhiên để loại toàn bộ lượng dung môi, đặcbiệt là các dung môi khó bay hơi như nước, cần nâng nhiệt độ lên cao, có théphahủy mau Do đó can tiễn hành xác định độ âm tuyệt đối của các mẫu băng cách sosánh khối lượng một lượng nhỏ mẫu trước và sau khi sây ở nhiệt độ cao Khốilượng mẫu sau khi say được chon là khối lượng có sai SỐ giữa 2 lần cân liên tiếpkhông quá 1% Lập lại thí nghiệm 3 lần % Độ âm được tính theo công thức:

m, —TMM,A(%) = x 100

m,

A : độ âm (%):m,: lượng mẫu trước khi sây (g);m,: lượng mẫu sau khi sây (g)

Sơ đồ 2.1 : Sơ đồ quy trình trích ly các loại cao chiết

Mẫu khô )

Chiết siêu âm với ethanol 96%

| Ỷ

Dịch chiết ethanol Phân bã

Cô quay áp suât thâp Chiết siêu âm với nước cất

ethyl acetate

C6 quay

Cô quay Chiết siêu âm áp suất thap

áp suất thập với methanol

Dịch chiết ` ởvem Phan can

methanol

Cô quayáp suất thập

\ C

Cao Cao Cao a0

n-hexane ethyl acetate methanol nước

— Phuong phaptrich lySử dụng phương pháp trích ly ran-long với các loại dung môi có tính phân cựckhác nhau để phân nhóm tương đối các hợp chất theo sơ đồ 2.1 Theo đó, các hợpchất không phân cực hòa tan tốt trong dung môi không phân cực, các hợp chất cótính phân cực trung bình hòa tan tốt trong dung môi có tính phân cực trung bình vàdung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực Phương pháp nàygiúp cho quá trình cô lập các hợp chất dễ dàng hơn.

— Phương pháp sac kýSắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợpchất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loạichất đối với một hệ thống (hệ thống gdm hai pha: một pha động và một pha tĩnh).Phương pháp nay được sử dụng dé phân lập các hợp chat từ hỗn hợp nhiều chat

Có nhiều loại sắc ký:+ Sắc ký lớp mỏng (TLC) hay còn gọi là sắc ký phang được thực hiện trên bannhồm tráng san silica gel như GF60F 554, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm Pha động làdung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển cham chậm dọc theo bản mỏng vàlôi kéo mẫu chat đi theo nó Dung môi di chuyên lên cao nhờ vào tính mao quan.Mỗi thành phan của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mứcdung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tinh vàtùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.Mẫu cân phân tích thường là hỗnhợp gồm nhiều hợp chat với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng IụL dungdịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểmgon trên pha tinh, ở vi trí phía trên cao hon một chút so với mặt thoáng của chấtlỏng đang chứa trong bình Phát hiện chất băng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nmhoặc dùng thuốc thử là dung dịch HạSO„/ Ethanol 10%

* Sắc ký cột (CC)Pha động là chất lỏng, pha tinh là là các hạt silicagel cỡ hạt 40-63 um Trên bềmặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rấtphân cực Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực,do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha răn

là chất rất phân cực Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thuhoặc dính lên bé mặt của pha tĩnh Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hapthu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động kếtquả là trong quá trình pha động di chuyền chúng sẽ tách nhau ra.

+ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)HPLC sử dụng các cột chịu áp lực lớn nén sẵn silicagel kích thước 5-10 um.Nhờ pha tĩnh là các hạt có kích thước rất nhỏ nên HPLC cho hiệu quả tách cao hơnnhiều so với phương pháp sắc ký cột Bên cạnh đó, cũng phải kế đến các ưu điểmkhác như tốc độ sắc ký nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao; cột có thé sử dụng lại saukhi rửa bằng dung môi thích hợp Hơn nữa, các loại đầu dò dùng trong HPLCkhông phá mẫu nên có thé thu lại mẫu sau phân tích

+ Sắc ký lỏng trung áp (MPLC)HPLC có rất nhiều ưu điểm nhưng đòi hỏi thiết bị phức tạp, làm việc trong điềukiện áp suất lớn Do đó, một phương pháp êm dịu hơn nhưng vẫn đạt được hiệu quảcao so với phương pháp sắc ký cột được sử dụng thay cho HPLC là MPLC vớinguyên tắc tương tự nhưng với hạt có kích thước hạt lớn hơn

— Phương pháp kết tinhCác hợp chất tự nhiên để có thể xác định được cấu trúc hóa học thì phải có độtinh khiết cao (>95%) Sau khi được cô lập bang phương pháp sắc ký, dù một sốhợp chất khi quan sát ở dạng bột trăng hoặc tinh thể không màu nhưng độ tinh khiếtvan thấp hơn 95% Một trong những phương pháp dé nâng độ tinh khiết là kết tinhlại Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất đốivới một loại dung dịch Lập lại việc kết tinh nhiều lần sẽ mang lại độ tính khiết cao.Tuy nhiên, phương pháp này lại làm hao hụt một lượng lớn sản phẩm

2.1.2 Phương pháp xác định cau trúc hóa hoc’?!

— Phuong pháp do nhiệt độ nóng chảyMỗi hợp chất sẽ được đặt trưng bởi nhiệt độ nóng chảy xác định Mẫu được chứatrong mau quản, đặt vào máy đo nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ tăng từ từ đến khithay thay xuất hiện giọt lỏng đầu tiên, ghi nhận nhiệt độ đó là nhiệt độ nóng chảy

Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy có sai số rất lớn, muốn xác định chính xác cautrúc của một hợp chat cần sử dụng các phương pháp pho hiện đại.

— Phương pháp khối phố (MS)Cho phép xác định khối lượng phân tử của một chất sau khi chuyển chất đó thànhtrạng thái hơi rồi thành ion bằng phương pháp thích hợp Theo đó, mẫu phân tích sẽbị phá hủy trong quá trình phân tích.

— Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)Phương pháp dựa trên tương tác của các hạt nhân nguyên tử với điện từ trườngngoai Khi bị kích thích bởi bức xạ điện từ tần số thích hop, các hạt nhân được đặttrong từ trường sẽ hấp thụ năng lượng làm thay đổi trang thái năng lượng của cácspin hạt nhân Sự nhảy spin như thế là co sở của phương pháp NMR

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hoa"!

DPPH tự do bền, màu tím, hấp thu ở bước sóng 517 nm Phân tử không bị dimehóa như một số gốc tự do khác Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng chonguyên tử hydro, sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl).Dùng máy đo mật độ quang BIO-TEK ở bước sóng 517 nm sẽ đánh giá được độchuyển hóa DPPH hay khả năng bắt gốc tự do của chất khảo sát

% Uc ché = (1 — A; /A, )x100

Trong đó: A;: Độ hấp thu của mẫu có chất ức chế ở nồng độ i

A,: Độ hấp thu của mẫu không ức chế (nồng độ chất ức chế băng 0)Vẽ đường biểu diễn % ức chế theo nồng độ, từ đó suy ra ICso

2.2 Hóa chất- thiết bi2.2.1 — Hóa chất

— Silica gel 60, đường kính hạt 0,06—0,2 mm (MERCK)— H;SOx/EtOH1I0%

— n-hexane (Trung Quốc)— chloroform (Trung Quốc)— ethyl acetate (Trung Quốc)— methanol (Trung Quốc)— DMSO (Trung Quốc).— DPPH(Merck).

— vitamin C (Merck).2.2.2 Thiet bi

— Thiết bi dùng dé phân lập và tinh chế các chất

+ Bản nhôm silica gel Merck—-GF60F>s4 tráng san, kích thước 20x20 m,

độ dày lớp hap phụ 0,2 mm (Merck, Germany).+ Can điện tu (TANITA KD-200 và PRECISA XB 220°).+ Máy cô quay chân không ( BUCHI Rotavapor R-200).+ May sắc ký cột trung áp (NovaPrep 200)

+ Máy siêu âm ( Elma S 100 H, Elmasonic, USA).— Thiết bi dùng để xác định cấu trúc các chất

+ Máy đo nhiệt độ nóng chảy (Electrothermal IA 9000 Series, dùng maoquản, không hiệu chỉnh).

+ Máy đo phố cộng hưởng từ hạt nhân (NMR Bruker Avance 500 MHzva Bruker Varian 500MHz).

+ May đo khối phố (ESI-MSAgilent technologies 6120 và HR-ESI-MSAgilent technologies)