Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

TÓM TAT LUẬN VĂN Trong nghiên cứu này, oleanolic acid là sản phẩm được phân lập từ quátrình thuỷ phân saponins toàn phan của rễ cây định lăng Polyscias fruticosa L.Harms.. Cau trúc hoá h

ĐẠI HOC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHOA KY THUAT HOA HOCBO MON KY THUẬT HOA LÝ - XÚC TAC

LUAN VAN THAC SI

GOP PHAN NGHIEN CUU THANH PHAN

HOA HOC RE CAY DINH LANG

(Polyscias fruticosa (L.) Harms)

CBHD : PGS.TS NGUYEN NGOC HANH

TS VO HUU THAOHVTH : VÕ THỊ THUY TRANG

MSHV : 11050157

TP HO CHi MINH 2014

Công trình được hoàn thành tại: TrườngĐạihocBáchKhoa- DHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học :PGS TS NguyễnNgọcHạnh

(Ghirõhọ, tên, hocham, hocvivachitky)

(Ghiroho, tên, họchàm, hocvivachitky)Luận văn thạc si được bảo vệ tại Trường Đại học Bach Khoa, ĐHQG Tp HCM

Thành phân Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đông cham bao vệ luận văn tha csi)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau

khi luận văn đã được sửa chữa (nêucó).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRUONG KHOA

ĐẠI HOC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THAC SĨ

Họ tên học viên: VÕ THỊ THUY TRANG MSHV: 11050157

Ngày, tháng, nămsinh: 15/12/1988 Nơi sinh: BR-VT

Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học Mãsố: 60.52.75I TEN DE TÀI: GÓP PHAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHAN HOÁ HỌC RE CAYĐINH LANG (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

NHIEM VU VA NOI DUNG:

Tong quan.Phương pháp chiết tach Saponins toàn phan.Thuỷ phân Saponins toàn phan và phan lập Acid Oleanolic

Kêt quả và bàn luận.

Il NGÀY GIAO NHIEM VU: 20/01/2014IH NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 20/06/2014IV CÁN BỘ HƯỚNG DAN: PGS.TS NGUYÊN NGỌC HẠNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BO MON KHOA QL CHUYEN NGANH

(Ho tén va chir ky) (Họ tên va chữ ky) (Họ tên và chữ ký)

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Voi tam lòng kính trọng và biết on sâu sắc nhất, tôi xin kính gửi lời cảm ơnđến

PGS.TS NGUYÊN NGỌC HẠNH

Viện Công Nghệ Hóa Học — Viện Han Lam Khoa học & Công Nghệ Việt Nam.

Cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệmnghiên cứu quý báu, tận tình hướng dan và quan tâm thường xuyên đến suốt quảtrình thực hiện công trình nghiên cứu của tôi Người đã tạo mọi diéu kiện cũng cho

tôi hoàn thiện luận văn này.

Tôi chân thành biét ơnTS Phùng Văn Trung — Trưởng phòng Hóa Học Các Hop Chat Thiên Nhiênđã truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm thực nghiệm quý bdo và tao diéu kiện cho

tôi hoàn thành luận van.

ThS Phan Nhật Minh, ThS Nguyễn Tan Phátdã giúp đõ chân thành và hỗtrợ kịp thoi dé tôi hoàn thành luận văn

Quý Thay, Cô công tác tại Trường Dai Hoc Bách Khoa Tp HCM đã trang bịcho tôi những kiến thức nên tảng vững chắc trong suốt thời gian học cao học

Cudi cùng con xin cam ơn gia đình đã động viên, tạo mọi điêu kiện từ vat chat

đến tinh than cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Xin chán thành cam on.

TP Hô Chi Minh, tháng 08 năm 2014

VÕ THI THUY TRANG

CONG H_ A XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIET NAM

Độc lập — Tự do — Hanh Phúc

ws

LOI CAM DOAN

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: “Góp phan nghiên cứu thành phan hoá học rễ câyDinh Lăng ( Polyscias fruticosa (L.) Harms) do tôi thực hiện, các số liệu, kết quảđều là trung thực

Tp Hỗ Chí Minh, ngày 01 tháng 08 năm 2014

Học viên

Võ Thị Thuỷ Trang

ABSTRACTIn this project, oleanolic acid is a product isolated from the hydrolysis of thesaponins from the roots of Polyscias fruticosa (L.) Harms Conditions of thehydrolysis of the saponins were in HCI 10% at 70°C for 6 hours The structure ofoleanolic acid were determined and identified based on the results of spectral data

‘H-NMR, 'C-NMR combined with DEPT, HMBC

TÓM TAT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, oleanolic acid là sản phẩm được phân lập từ quátrình thuỷ phân saponins toàn phan của rễ cây định lăng Polyscias fruticosa (L.)Harms Điều kiện thuỷ phân saponin toàn phân là trong acid HCI 10% ở nhiệt độ70°C với thời gian 6h Cau trúc hoá học của oleanolic acid được xác định và nhậndanh dựa trên kết qua đo phố NMR một va hai chiều, kết hợp so sánh với tài liệu

tham khảo.

MỤC LỤC

09099097 iLOT CAM DOAN 0757 -. “ - ii

DANH MỤC PHU LỤC - 2E S22 SE EEEESEE E15 1 1111111151111 1 x0 xii

MO DAU oiieeeccccccccccccccscsscsescscscsscscsescscssescscscsvsssscscscscsssscscscsvsssscscsssvsssesesscsesssssssscseass |CHƯƠNG 1: TONG QUAN - G111 1 111111121 11 11T 11T HH ngu 21.1 ĐẠI CƯƠNG VE CÂY ĐINH LANG . ¿5-5 2525222 E2 2 EEEErErrrrrered 21.1.1 PHAN LOẠI THỰC VẬTT G3911 SE 11121 1E 12926 xnxx: 21.1.2 MÔ TẢ G- - c2 121115121511 1111215111111111511010111 11111111121 11 1111112171111 21.1.3 PHAN BO VÀ SINH THÁI 2-5-5 2522 EE+EEEE£E£E+E£EEE£E£E+EeEeEerererereee 41.2 MỘT SỐ NGHIÊN CUU VE CÂY ĐINH LĂNG - c5 s62 seseseseei 41.2.1 THÀNH PHAN HÓA HỌC - - - ksSE53912E SE E9 E121 1E E18 ve rxei 41.2.2 TÁC DỤNG DƯỢC LLỶ -G-G- E53 9191 1 1E 11121 1E 1282 ng ng: 6CHƯƠNG 2: THỰC NGHIIỆM -. 5-52 S253 3E 1 1 1115111121111 ecxrk 92.1 THIẾT BỊ HOA CHẤTT St SE 9E E SE SE 318v 318v 181218 gxrkei 92.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - + + SE +2 sE+eES2EE2EE+EE+zE£zEczeezsecsse 10

2.3 CHIẾT TÁCH SAPONIN TOAN PHAN e.cscscseccscssscsessesescscsssesesesesssesseseseens 122.4 THUY PHAN SAPONIN TOAN PHAN w.e.ccscsescsessecsesesesescscsesescsessseseseseens 142.5 PHAN LAP CAC HOP CHAT HOA HOC TỪ CAO CHIET A 16CHƯƠNG 3: KET QUA VA NHẬN XT Gv rrerrree, 183.1 XÁC ĐỊNH CAU TR C HOA HOC HỢP CHAT PE-O1 555555: 183.2 XÁC ĐỊNH CÂU TR C HOA HOC HỢP CHAT PE-02 555555: 24CHƯƠNG 4: KET LUẬN - - E212 22121 1512111121 11111111 111tr 27TÀI LIEU THAM KHAO . 5-5 52522523 E2 2E E23 1511511112121 71 11111 cxe, 28PHU LUC PHO

DANH MUC CAC KY HIEU, CHU VIET TATbrs

CHCl,COSYCTPT

'SC_NMR

ddd

DEPT

DMSOdvCEtOAcEtOH

'H-NMR

HMBCHPLCHSQC

LC-MS

MeOHppm

Board (NMR)ChloroformCorrelation SpectroscopyCông thức phan tử

Carbon (13) Nuclear Magnetic ResonanceDoublet (NMR)

Doublet of doublets (NMR)Detortionless Enhancement by Polarization TransferDimethyl Sulfoxide

Don vi CacbonEthyl acetateEthanolProton Nuclear Magnetic ResonanceHeteronuclear Multiple Bond CoherenceHigh Performance Liquid ChromatographyHeteronuclear Single Quantum CorrelationCoupling constant (NMR)

Liquid chromatography — Mass spectrometryMultiplet (NMR)

MethanolPart per million

Retention factor

Vill

Singlet (NMR)Triplet (NMR)

Thin Layer Chromatography (Sac ký lớp mỏng)Số thứ tự

Weight/weight

DANH MUC CAC BANG

Bang 2.1: Kết quả sắc ký cột cao E 5-55: c1 t2 E121 1115111111111 11 re 15Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột GaO A - 22 1 1 3 12 1111111121111 11111111 rk l6Bảng 3.1: Dữ liệu phố'H—NMR, C-NMR tương quan HMBC của PF-01 20Bang 3.2: So sánh phô '°C-NMR của PF-01 với hợp chất acid oleanoie 22Bảng 3.3: So sánh phố '°C-NMR của hợp chất PF-02 với Ø-sitosterol 25Bảng 3.4: So sánh phố °C-NMR của hop chất PF-02 với đường D-glucopyranose 25

DANH MỤC CÁC SƠ DO

Sơ đỗ 2.1: Quy trình chiết tách saponin toàn phân Sơ đỗ 2.2: Quy trình thuỷ phân Saponin toàn phan Sơ đồ 2.3: Quy trình phân lập các hợp chất hoá học từ cao A

Hình 1.1:Hình 1.2:Hình 1.3:Hình 2.1:Hình 2.2:Hình 2.3:Hình 2.4:

XI

DANH MỤC CÁC HINHCây định lăng Ặ GGG ngờ 3

RE đỉnh lăng - G1 21 1 1212121211111 11 11111 1211210171 0101010111111 3

Hoa định lăng - - - ( << 111990000 re 3

Sắc ký bản mỏng - + 256% E+ 9 SE SEEE9E5 11511112115 1511 11111 ck 10

6Ô Ấ00À010)0//500) 007707077 10TLC của PPE-Ï G0 nọ nà 16TLC của PE~Ú2 << << c0 999000 00000 kh 17

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1.1: Phé MS của hop chat PF 01Phu lục 1.2: Phố 'H— NMR của hợp chất PF 01Phụ lục 1.3: Phố 'H — NMR của hợp chất PF 01 giãn rộngPhụ lục 1.4: Phố °C — NMR của hop chất PF 01

Phụ lục 1.5: Phố °C — NMR của hợp chat PF 01 giãn rộngPhu lục 1.6: Phổ ‘°C — NMR va DEPT của hợp chat PF 01Phụ lục 1.7: Phổ °C — NMR va DEPT của hop chat PF 01 giãn rộngPhụ lục 1.8: Phố HMBC của hợp chat PF 01

Phụ lục 1.9: Phố HMBC của hợp chất PF 01 giãn rộngPhụ lục 1.10: Phố HMBC của hop chất PF 01 giãn rộngPhụ lục 1.11: Phố HMBC của hop chất PF 01 giãn rộngPhụ lục 1.12: Phé HSQC của hợp chat PF 01

Phụ lục 1.13: Phé HSQC của hợp chất PF 01 giãn rộngPhụ lục 2.1: Phố 'H — NMR của hợp chất PF 02

Phụ lục 2.2: Phố 'H — NMR của hợp chất PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.3: Phố 'H — NMR của hợp chất PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.4: Phố 'H — NMR của hợp chất PF 02 giãn rộngPhu lục 2.5: Phổ °C — NMR của hợp chat PF 02

Phụ lục 2.6: Phổ ‘°C — NMR của hợp chat PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.7: Phổ °C — NMR của hợp chat PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.8: Phổ ‘°C — NMR của hợp chat PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.9: Phố ‘°C — NMR và DEPT của hợp chất PF 02

Phụ lục 2.15: Phổ HMBC của hợp chất PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.16Ph6 HMBC của hợp chất PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.17: Phố HMBC của hợp chất PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.18: Phố HSQC của hop chat PF 02

Phụ lục 2.19: Phố HSQC của hợp chất PF 02 giãn rộngPhụ lục 2.20: Phé HSQC của hop chất PF 02 giãn rộng

MO DAU

Xã hội ngày càng phát triển thì van dé giữ gin sức khoẻ của con người ngàycàng được quan tâm hơn vì sức khoẻ là vốn quí nhất của con người, một thứ tài sản

vô giá Qua kinh nghiệm của dân gian và những nghiên cứu của các nhà khoa học

đã đưa đến kết quả là những hợp chất chiết xuất từ thiên nhiên luôn được người

bệnh đánh giá cao và an tâm khi sử dụng vì tính an toàn không gây tác dụng phụ

cho con người và môi trường giống như những loại thuốc tổng hợp Bên cạnh đó cónhững hợp chất có hoạt tính sinh học cao hoàn toàn không thể tổng hợp được bằngcon đường hoá học Do vậy xu hướng ngày nay trên thế giới cũng như Việt Namngười ta đi tìm các hợp chất thiên nhiên đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinhhọc dé ứng dụng vào dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm

Trong số các cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học cỗ truyền Việt Nam có

cây Dinh lăng — Polyscias fruticosa (L.) Harms, họ Ngũ gia bì Araliaceae, đây la

loại cây rất phd biễn được trồng làm cảnh ở Việt Nam và các nước trên thé giới.Dé góp phần vào việc nghiên cứu thành phần hóa học của rễ cây đỉnh lăng,chúng tôi đã tiễn hành thực hiện đề tài: “Góp phần nghiên cứu thành phần hoá họcrễ cây đỉnh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)” Với mục tiêu tiễn hành khảo sátthành phần hóa học của rễ cây đỉnh lăng nhăm tìm hiểu thành phần hóa học cũngnhư góp phan làm sáng tỏ hoạt tính sinh học mà dân gian đang áp dụng

CHƯƠNG 1: TONG QUAN1.1 ĐẠI CUONG VE CAY ĐINH LANG

1.1.1 Phan loai thwe vatTén khoa hoc:Polyscias fruticosa (L.) Harms.Họ: Ngũ Gia Bi (Araliaceae)

Tên đồng nghĩa: Tieghmopanax fruticosus (L.) R Vig (Rene Viguier),Nothopanax fruticosus (L.)Mig (Miquel); Panax fruticosa L.; ,HIBI

Tên nước ngoài: Ginseng tree (Anh), Polyscias (Pháp).Tên Việt Nam: Goi cá, Nam Dương Lâm, Dinh Lăng lá xẻ, Dinh Lăng lá nhỏ.1.1.2 Mô ta thực vat

Cây bụi xanh tốt quanh năm, cao 0,5-2 m, thân tròn sân sùi không gai, mangnhiều vết seo lỗi to mau nâu xám do lá rụng để lại Lá mọc cách, kép lông chim 2-3lan, dài 20-40 cm Lá chét chia thùy nhọn không đều, màu xanh, bóng mặt dướinhiều hơn, gốc lá và phiến lá thuôn nhọn dai 3-5 cm, rộng 0,5-1,5 cm; gân lá hìnhlông chim, gân chính nỗi rõ, 3-4 cặp gân phụ Cuống la dai, tròn, màu xanh sam, cónhững đốm xanh nhạt trên cuống, đáy cuống phình to thành be lá Lá kèm dangphiến mỏng dính hai bên be lá."

Bộ nhị: 5 nhị rời, đều, đính xen kẽ với cánh hoa; chỉ nhị dạng sợi mảnh, màutrắng, đài 0,1-0,15 cm; bao phan 2 6 thuôn dài màu vàng, nứt dọc, hướng trong,đính gốc Hạt phan rời, hình cầu có 3 lỗ, mau vàng nhạt, đường kính 30-35 um

Bộ nhụy: 2-3 lá noãn, bầu dưới 2 ô hay 3 ô, mỗi 6 1 noãn, đính noãn trungtrụ; 2-3 vòi rời úp sát vào nhau, thăng đứng, màu xanh dam, dai 1 cm; đầu nhụyhình điểm.

Quả hạch hình bầu dục mang trên đỉnh quả vòi nhụy tồn tại mọc choãi ra vàđài ton tại, vỏ quả màu xanh đậm có những nốt tròn màu xanh nhạt hơn, dài 4-6

mm, rộng 3-4 mm.Rê cong queo, dài khoảng 30cm, rộng khoảng 2,5cm, đâu trên to, đâu dướithuôn.Mặt ngoài màu trăng xám có nhiêu nêp nhăn dọc, nhiêu lô bì năm ngang,nhiêu vét tích của ré con và các đoạn rê con còn sót lại Thê chat cứng chac, giòn,

dễ bẻ gãy, mặt bẻ lom chởm Mặt cắt ngang màu vàng nhạt, có các tia tủy loe rộng

1.1.3 Phân bố và sinh tháiCây Đinh lăng có xuất xứ từ vùng đảo Polynesie ở Thái Bình Dương, đượctrồng khắp nơi từ đồng băng đến miền núi Cây ưa sáng, ưa âm và đất sâu, có théchịu hạn và bóng râm Thường được trồng chủ yếu băng cách giâm cành Cây trồngcàng lâu càng tốt Tại Việt Nam, cây Dinh Lăng thường được trông làm cảnh ở

trước nhà, sân đình, nhà thờ, khu di tích lịch sử văn hoá Mùa hoa quả: thang 4-7.

1.2 MOT SỐ NGHIÊN CỨU VE CAY ĐINH LANG

1.2.1 Thanh phan hóa hoc

glucopyranosyl] oleanolic acidÏ”

Nam 1996, Proliac và cộng su đã tach được từ lá cây Dinh lăng hợp chat

Acid3-O-[ a@-rhamnopyranosyl—(1-4) D-glucopyranosyl

]-28-O-(D-glucopyranosyl oleanolic!!

1.2.1.2 Trong nước

Năm 1989, Nguyễn Khắc Viện cho biết trong rễ Đinh lăng có khoảng 4%saccaroza, một chất kết tinh gọi là chất A chưa được xác định, có nhiệt độ nóngchảy 158-161 °C, tan nhiều trong chloroform và aceton!”!

Năm 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã phát hiện trong thân và lá

cây Dinh lăng có glucosid, alkaloid, tannin, vitamin B1, và 20 loại axit amin khác:argenin, alanine, asparagine, acid glutamic, leucin, lysine, phenyl alanine, prolin,

threonine, tyrosin, cysteine, tryptophan, methionine!!

Năm 1990, Võ Xuân Minh cho biết trong Dinh lăng có alkaloid, glucosid,saponin, các vitamin tan trong nước như: B1, B2, Bó, C và các phytosterol Rễ Dinhlang có tới 20 acid amin, trong đó những acid amin như lysine, cysteine!”

Nam 1992, Võ Xuân Minh va cộng sự nghiên cứu cho kết quả hàm lượngsaponin toàn phan trong các bộ phận khác nhau của Dinh lăng là: rễ 0,49%, vỏ rễ1,00%, lõi rễ 0,11% và lá 0,38%”

Năm 1996, Trần Công Luận đã phân lập và xác định trong lá Đinh lăng cócầu trúc hop chất polyacetylen là falcarinol (4)?

Năm 1998, Võ Duy Huẫn và cộng sự đã cô lập duoc 8 saponin tritepenmới và 3 saponin đã được biết.Những hợp chất này đều có phần sapogenin là acidoleanolic, phần đường là glucose, galactose, rhamnosel””!

Năm 2001, Trần Công Luận đã phân lập được 5 hợp chất polyacetylen

nhưng chỉ có panaxydol (5), panaxynolva heptadeca-1,8 (E)- dien-4,6 diyn-3,10

diol (6) là có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư!'!,

Năm 2003, Nguyễn Tan Thiện đã nghiên cứu và tách được từ lá Dinh lăngmột số hợp chất như: stigmasterol (7), acid oleanolic (8), phytol”!

Năm 2005, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Tan Thiện, Nguyễn Kim PhiPhụng tìm thấy 2 hợp chất 5-hydroxymethyfural, 3-/- hydroxyolean-28— 13-lactonell,

1 17

1.2.2 Tac dụng dược lý

1.2.2.1 Theo y học dân gian*H4hi

+ Ho suyễn lâu nămRễ đinh lăng, bách bộ, đậu săn, rễ cây dâu, nghệ vàng, tần dày lá, mỗi vị đều 8g, củxương bồ 6g, gừng khô 4g, đỗ 600ml sắc còn 250ml Chia làm 2 lần uống trong

ngày.

+ Nồi mé day, man ngứa do dị ứngLá đỉnh lăng 80g sao vàng sắc uống trong 2-3 tháng.+ Mỏi mệt, biếng hoạt động

Rễ đinh lăng phơi khô thái mỏng 5g, thêm 100ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia

2-3 lần uống trong ngày

+ Tac tia sữa

Rễ đinh lăng 40g, gừng tươi 3 lát, đồ 500ml nước sắc còn 250ml Chia làm 2 lầnuống trong ngày

1.2.2.2 Theo y học hiện đại

+ Tac dung tang lực

Năm 1977, Ngô Ung Long va cộng sự nghiên cứu tac dụng tăng lực của

Dinh lăng trên người theo nghiệm pháp của Leutonov đo sức dẻo dai của bộ đội

hành quân cấp tốc Kết quả nhóm uống Đỉnh lăng hồi phục nhanh hơn so với nhómkhông uống thuốc! '°!

Năm 1985, Ngô Ứng Long và cộng sự nghiên cứu tác dụng tăng lực của dịchchiết Dinh lăng trên chuột nhất bằng phương pháp chuột bơi của I Brekmandé đánhgiá sự phục hồi của cơ thể sau khi chuột bơi kiệt sức Kết quả cho thay Dinh lăng cótác dụng tăng lực làm tăng sức dẻo dai của cơ thé chuột sau khi bơi kiệt sức!”

+ Nghiên cứu về độc tính của Đình lăngNăm 1985, Ngô Ứng Long và cộng sự nghiên cứu độc tính của Đinh lăngcho thấy liều gây chết 50% số chuột nhất thử nghiệm (LDs59) của Dinh lăng theo

đường tiêm phúc mac là 32,9 g/lkg chuột ( theo phương pháp cua Barker 1931).

Kết qua cho thay với liều uống hang ngày 60 g/1kg chuột sau 30 ngày có hiện tượngchuột chết, như vay Dinh lăng là thuốc ít độc Nếu so sánh với Nhân sâm về LDs¿cùng đường tiêm phúc mạc thì Dinh lăng ít độc kém 3 lần!””

+ Tác dụng cua Dinh lăng trên tiết niệuNăm 1989, Nguyễn Khắc Viện đã nghiên cứu ảnh hưởng của cao lỏng Dinhlăng trên bai tiết nước tiểu ở chuột cống, theo dõi sau khi uống thuốc 5 giờ liền Kếtquả cho thay Dinh lăng với liều 0,5 g/kg chuột đã làm tăng tiết nước tiểu 5 lần sovới nhóm đối chứng!'?

+ Tac dụng chồng oxy hodNăm 2003, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã nghiên cứu thấy Đinhlăng có tác dụng ức chế sự hình thành MDA ở não chuột nhat với nỗng độ 25 — 50

ug/ml, tương tự chất chống oxy hoá Trolox, một đồng phân tan trong nước củavitamin E ở cả hệ tự oxy hoá và hệ Fentonl”†.

+ Tac dụng chong tram cảm và chong stressNăm 2001, Nguyễn Thị Thu Huong va cộng sự đã dùng chuột trang dé thửnghiệm Kết quả cho thấy cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồithời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress ở liều 45 — 180 mg/kg chuột, khoảng liều nàycũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết,

4 Lá Ầ „ Kẻ A A on ` ~ ^ 20

tăng sức dé kháng của cơ thé, chống viêm và xo vữa động mach!"

CHUONG 2: THỤC NGHIEM2.1 THIET BỊ, HOÁ CHAT

2.1.1 Hoá chấtDung môi dùng chiết xuất

- Ethanol 96%, Việt Nam.

Hoá chat và dung môi dùng sắc ký- n-Hexane, Trung Quốc

- Chloroform, Trung Quốc.- Ethyl acetate, Trung Quốc.- Methanol, Trung Quốc

- Silica gel 60F.54 , Scharlau.

Thuốc thứ va chi thị

- Dung dịch H,SO, 10% trong Ethanol

2.1.2 Thiét bi- Sac ký cột áp suất khí quyén.- Sac ký bản mỏng TLC thực hiện trên bản silica gel 60F 554, Merck tráng sẵn

- Máy cô quay chân không Biichi Ratavapor R-200.- Máy phát tia tử ngoại Mineralight ® Lamp, U.S.A bước sóng 254 và 356 nm.

- Bếp điện Blacker”

- Cân phân tích Precisa XB 220A; độ nhạy 0,Ïmpg

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên may Bruker Avance 500 MHz tại

Viện Hóa Học.

- Pho khối lượng đo trên máy Agilent Technologies 6120 (Quadrupole LC/MS), tai

Viện Công Nghệ Hóa Hoc.

Phương pháp chiết dầm được sử dụng trong dé tài nghiên cứu nay vì kỹ thuậtchiết đơn giản và dễ thực hiện.

2.2.2 Phương pháp sắc ký2.2.2.1 Sắc ký lớp móng (TLC)?"!Sắc ký là một phương pháp để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất rariêng thành từng loại đơn chất dựa vào ái lực khác nhau của loại hợp chất đó vớimột hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tinh Sắc ký lớp mong là 1

2.2.3 Phương pháp kết tinh?"Quá trình các hợp chất được hoà tan hoàn toàn trong dung môi khi gia nhiệtđể đạt trạng thái dung dịch bão hoà, sau đó dung dịch được làm lạnh hoặc làm bayhơi dung môi đề hình thành tỉnh thể gọi là quá trình kết tỉnh.

Dung môi được lựa chọn không được quá hoà tan hay không hoà tan các hợp

chất cần kết tinh Dung môi tốt nhất là hoà tan một phan cac hop chất ở nhiệt độ

thường và hoà tan hoàn toàn khi được gia nhiệt.

2.2.4 Phương pháp xác định cau trúc hợp chất hữu co+ Khối phố (MS) là một kỹ thuật dé xác định khối lượng phân tử của mộthợp chất hữu cơ

+ Phố cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):Phé'H-NMR: Cho thông tin về các proton 'H có trong phân tử.Phố "C-NMR: Cho thông tin về khung carbon của phân tử, độ dịch chuyểnhóa hoc °C của các hợp chất hữu cơ

Phố '°C-NMR-DEPT giúp xác định các carbon có gắn một, hai hay ba

hidrogen (-CH, -CH2, -CH3).

Phố 'H-'H COSY là một trong những kỹ thuật hai chiều quan trọng nhất.Phố COSY cho biết mối liên quan giữa các proton với nhau: hai proton cùng gantrên một carbon, hai proton gan trên hai carbon kể nhau

Pho HSQC là phố NMR hai chiều cho tín hiệu của carbon gan trực tiếp vàoproton, nghĩa là tương tác cách nhau bởi | nối hóa trị

Phố HMBC là phố NMR hai chiều xác định tương tác carbon-proton ngangqua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua | nối hóa

trỊ.

2.3 CHIET TÁCH SAPONIN TOAN PHAN

Ré Dinh lăng được cung cấp bởi trung tâm Nghiên cứu Phat triển va Sanxuất Dược liệu miễn Trung, huyện Đông Hoà, tỉnh Phú Yên Ré Dinh lăng đượckhai thác từ cây trồng trên 4 năm được rửa sạch, cắt nhỏ sây khô đến khối lượngkhông đồi

31 Ethanol 50°

> -Bê siêu âm, t= 60°C _

Ỷ -Thời gian 20 phut/1 lân

Ỷ UDich con lai Tua

Vv kí

Cô quay Say

CaoA93 5g Saponin toan

phan (4,6g)

So đỗ 2.1: Quy trình chiết tach Saponin toàn phanRé Dinh lăng khô được xay thô, cho vào bình cầu 2 lít, thêm ethanol 50° vớilượng gấp 3 lần được liệu, tiễn hành chiết trong bề siêu âm với nhiệt độ 60°C và

2.4 THUY PHAN SAPONIN TOAN PHAN RẺ ĐINH LANG.

`

PF-014 mg

So dé 2.2: Quy trình thuỷ phan Saponin toan phanTừ 4,6 g cao saponin toàn phan rễ Dinh lăng, tiến hành thủy phân bang acidHCI 10%, nhiệt độ 70°C, trong 6h Dé nguội chiết bang CHCIạ Tach phan tan trong

Kích thước hat silica gel: 0,04-0,06 mm.

Khối lượng cao B: 1,283 g.Khối lượng silica gel: 128 g

Đường kính cột: 1,5 cm.

Chiều dài cột: 60 cm.Dung môi ồn định cột: CHC];Giải ly với hệ dung môi CHCI:-MeOH tăng dan độ phân cực

Bang 2.1: Kết qua sắc ký cột cao B

Phân đoạn Hệ dung môi TC

| CHCI:-MeOH (99: 01) Nhiều vếtII CHCls- MeOH (95 : 05) Có 1 vết tímII CHCI:- MeOH (90: 10) Nhiều vếtIV CHCI;- MeOH (85 :15) Nhiều vếtTại phân đoạn II, thu được dịch không màu, tinh chế, kết tinh lại nhiễulanthu được chất bột vô định hình mau trang xám (4mg) được ký hiệu là PF-01

PF-01 hiện vết mau tím với Ry = 0,45 trong hệ giải ly CHCl:-MeOH (95:05)trên TLC khi dùng thuốc thử là H,SO, 10% trong EtOH và gia nhiệt trên bếp điện

Hình 2.3: TLC của PF-01

2.5 PHAN LẬP CAC HOP CHAT HOA HOC TỪ CAO CHIET A.

Các thông số khi tién hành sắc ký cột áp suất thường của cao A:

Kích thước hạt silica gel: 0,04-0,06 mm.

Khối lượng cao A: 93,38 g.Khối lượng silica gel: 250 g

Duong kinh cot: 5 cm.

Chiều dài cột: 40 cm.Dung môi ôn định cột: n-hexane - EtOAc(8:2).Giải ly với hệ dung môităng dan độ phân cựcn-hexane-EtOAc; EtOAc-MeOH

Bang 2.2: Kết qua sắc ký cột cao A

Phân đoạn Hệ dung môi TLC

I n-hexane-EtOAc (8 : 2) Nhiéu vét moII n-hexane-EtOAc (5 : 5) Nhiéu vétII EtOAc (100%) 1 vết tím

Phân đoạn III (cao A) thu được cặn màu trắng Tinh chế bang cách kết tinhlại nhiều lần trong MeOH thu được tinh thé dạng bột trăng, kiểm tra trên TLC cho 1vết chính màu tím với Ry = 0,24 (CHCI:-MeOH = 9:1), hiện mau bang H.SO, 10%

trong EtOH ho nóng,kí hiệu là PF-02 (582 mg).

Hinh 2.4: TLC cua PF-02

IV EtOAc-MeOH (9: 1) Nhiéu vétV EtOAc-MeOH (8: 2) Nhiều vết

Cao A93 38¢

Sắc ký cột thường

Vv Vv Vv Vy Vv

PDI PD II PD Ill PD IV PD V19/79 15,14¢ 16 A8¢ 25.35g 13.05g

Vv

PF-02582 mg

So đồ 2.3: Quy trình phân lập các hop chất từ cao

Phố MS cho mii ion phân tử giả m/z [M-H] =455, tương ứng với khối lượng

phân tử 456 dvC, với công thức phân tử là CzoH¿sỢ

Phé 'H-NMR (500MHz, CDCI;) (phụ lục 1.2) của hợp chất PF-01 cho thay

tín hiệu cua proton olefin [ồn 5,28 (1H, t, H-12)], tín hiệu proton cua carboncarbinol [dy 3,23 (1H, đ, H-3)], tín hiệu proton metin [dy 2.84 (1H, d, H-18)] Mat

khac, pho ‘H-NMR còn cho tín hiệu bảy nhóm metyl [dy 1,13 (3H, s, H-27) ; ồn

0,99 (3H, s, 23) ; 640,93 (3H, s, 30) ; 540,91 (3H, s, 25) ; ôn 0,90 (3H, s, 29) ; dy 0,78 (3H, s, H-24) ; dy 0,76 (3H, s, H-26)| Ngoài ra, còn có tín hiệu cácproton metin và metylen ở vùng dy 0,6-2,0.

H-Bên cạnh đó, phố '°C-NMR (125MHz, CDC1) (phụ lục 1.4) kết hợp với phổHSQC (phụ lục 1.12) của hợp chất PF-01 cho thấy hợp chất này có 30 carbon vớitám carbon tứ cấp, năm carbon metin, mười carbon metylen và bảy nhóm metyl

Trong đó, có một carbon carbonyl, hai carbon olefin [dc 143,6 (C-13)] và [dc 122:7(C-12)], bay carbon metyl [dc 33,1 (C-29) ; d¢ 28,1 (C-23) ; öc 25,9 (C-27) ; bc 23,6(C-30) ; dc 17,1 (C-26) ; d¢ 15,6 (C-24) ; öc 15,3 (C-25)].

Cac dữ kiện trên giúp dự đoán hợp chat PF-01 là một triterpen có công thứcphân tử CaoHzsO» với một nhóm carboxyl, một nối đôi C=C và năm vòng Đề hiểurõ hơn cau trúc của hợp chất PF-01 chúng tôi ghi thêm phổ HSQC và HMBC (phụlục 1.8) thu được kết quả:

Proton của hai nhóm metyl ở 5y 0,99 và 0,78 cho tương quan lẫn nhau, vàcùng tương quan với carbon carbinol (8c 79,1), một carbon tứ cấp (öc 38.8) và một

carbon metin (dc 55,3) nên hai nhóm metyl này phải ở vi trí C-23 (dc 28,1) và C-24

(dc 15,6), carbon carbinol ở C-3, carbon tứ cấp ở C-4 va carbon metin là C-5

Proton H-3 cho tương quan với carbon metylen (dc 38,5), proton cua carbon này laicho tương quan với C-5 nên nó phải là C-1 Proton cua carbon metylen có (ốc 27,2)cho tương quan với C-3 nên carbon này là C-2.

Hai carbon olefin: tứ cấp là C-13 (dc 143,6) và C-12 (6c 122/7) Protonolefin H-12 (54 5,28) cho tương quan với carbon tứ cap 5c 41,7 ; carbon metin öc47.7 ; carbon metylen 5c 23.4 Vay carbon tứ cấp là C-14, carbon metylen là C-11

Carbon metin là C-9 hoặc C-18, proton metin nay có dy 1,55 cho tương quan vớicarbon metyl 6c 17,1 nên carbon metin phải là C-9.

Proton metyl dy 0,76 cho tương quan với C-9, C-14 nên nhóm metyl nayphải là C-26 (6c 17,1) Ngoài ra, H-26 con cho tương quan với carbon metylen có(dc 32,7) nên carbon metylen nay là C-7 Proton H-7 cho tương quan với carbonmetylen (dc 18,4) nên carbon nay là C-6.

Proton metyl (oq 1,13) cho tương quan với C-13, C-14 nên nhóm metylchính là C-27 có (dc 25,9) Ngoài ra, proton H-27 còn cho tương quan với một

carbon tứ cấp (8c 39,3) và một carbon metylen (8c 27.7) Carbon tứ cấp này là C-8,

carbon metylen là C-15.

Proton metyl (dy 0,91) cho tương quan 5, 9 nên nhóm metyl chính là

C-25 (5c 15,3) Proton H-C-25 còn cho tương quan với một carbon tứ cấp nên carbon tứcấp này chính là C-10 (8c 37,1)

Proton của hai nhóm metyl ở dy 0,93 va 0,90 cho tương quan với cùng

carbon tứ cấp (5c 30,7) nên hai nhóm metyl này phải ở vị trí C-29 (8c 33,1) và C-30(5c 23,6) Carbon tứ cấp chính là C-20

Carbon metin còn lại là C-18 (öc 41,2) Proton metin H-18 cho tương quan

với C-12, C-13, C-14, carbon carboxyl C-28 va carbon tứ cấp còn lại là C-17 (ốc

46,5) Ngoài ra, H-18 con cho tương quan với carbon metylen là (dc 23,0), nêncarbon metylen này là C-19, C-16 hoặc C-22 Mặt khác, proton cua carbon này lạicho tương quan với C-15 nên nó phải là C-16.

Carbon metylen (dc 32,5) có proton cho tương quan với C-28 va C-16 nênxác định là C-22 Proton H-22 lại cho tương quan với carbon metylen (ðc 33,9), nêncarbon này là C-21 Carbon metylen (dc 45,9) có proton cho tương quan với C-13nên nó là C-19.

Bảng 3.1:Dữ liệu phổ'H-NMR, ÝC-NMR tương quan HMBC của PF-01

Vị trí Loại 5c HMBC

ồn (ppm) 1 13

C/H Carbon (ppm) H— ®c

1 —CH,— 1,62 (2H, m) 38,5 C-52 —CH,— 1,60 (2H, m) 27,2 C-33 >CH-OH 3,23 (1H, dd, J=11; 4) 79,1 C-14 >C< 388

5 >CH- 0,72 (1H, m) 553

6 —C H;ạ— 184

1,68 (1H, m)7 —CH,— 32,7 C-6

1,55 (1H, m)8 >C< 3939 >CH- 1,55 (1H, m) 477 C-2610 >C< 37,1

11 -CHz- 1.9 (2H, m) 234 C-1212 -CH= 528(1H.t) 1227 C-9, 1413 =C< 1436

14 >C< 41,715 -CHz- 1,61 (1H, m) 27,716 -CHz- 1,61 (1H, m) 23,0 C-1517 >C< 46,5

18 >CH- | 2,84 (1H, dd, J=14,5; 3,5) A12| C-12, 13,14,16,17

19 —~CH,- OTOH.) 45.9 C-13

1,62 (1H, m)20 >C< 1,23 (2H, m) 30721 -CHz- 1,60 (1H, m) 33,9

22 —~CH,— 32,5 C-16, 21, 28

23 —~CH; 0,99 (3H, s) 28,1 C-3,4,5,24

24 —~CH, 0,78 (3H, s) 15,6 C-3,4,5,2425 —~CH, 0,91 (3H, s) 153 C-5,9, 10

26 —~CH; 0,76 (3H, s) 17,1 C-7,9, 14

27 -CHạ 1,13 (3H, s) 25,9 C-8, 13, 1428 >C=O

29 -CHa 0,90 (3H, s) 33,1 C-20, 30

30 —~CH; 0,93 (3H, s) 23,6 C-20

5 >CH- 55.3 >CH- 55,2

6 -CH;- 184 -CH;- 18,37 -CH;- 32,7 -CH;- 32,68 >C< 393 >C< 3939 >CH- 47/7 >CH- 47610 >C< 37,1 >C< 37,0II -CH;- 234 -CH;- 23.112 —CH= 122,7 —CH= 122113 =C< 143,6 =C< 143.414 >C< 41,7 >C< 41,615 -CH;- 27,7 -CH;- 27,716 -CH;- 23.0 -CH;- 23417 >C< 46,5 >C< 46.618 >CH- 41,2 >CH- 41319 -CH;- 45,9 -CH;- 45,820 >C< 30,7 >C< 30621 -CH;- 33,9 -CH;- 33,622 -CH;- 32,5 -CH;- 32,3

23 —CH3; 28,1 —CH3; 28,124 —CH3; 15,6 —CH3; 15,6

` Lá ~ oN Aw ` Lá ye xe oN 2 22 Lá Fax A

Từ các dữ liệu trên, va so sánh với tai liệu tham khảo L L chúng tôi nhậndanh chất PF-01 là acid oleanolic

Phổ 'H-NMR (500MHz, CDCI;-MeOD) (phụ lục 2.1) của hop chất PF-02 có

một proton cua carbon olefin [ồn 5.32 (1H, m, H-6)|, một proton cua carboncarbinol có [ồn 3,43 (1H, m, H-3)] và một proton cua carbon anomer có [dy 4,22(1H, d, J=8,0 Hz, H-1`)|.

Phổ '“C-NMR (125MHz, CDCl;-MeOD) (phụ luc 2.5) cho các mũi ứng với

sự hiện diện cua 35 carbon, trong đó có hai carbon olefin [dc 1404 (C-5)] và [dc

121,1 (C-6)], điều này phù hợp với phổ 'H-NMR có mũi cộng hưởng tại ồn 5.32

tương ứng với H-6.

Bên cạnh đó, phổ C-NMR còn cho thấy có mũi cộng hưởng của carbonanomer [dc 100.8 (C-1’)] Các mũi cộng hưởng trong vùng 6c từ 61,1 đến 100,8 ứng

với sáu mũi carbon của đường glucose.

Ngoài ra, phố DEPT 90 và 135 (phụ lục 2.9) cho thấy có 14 carbon metin, 6carbon metyl, 12 carbon metilen và 3 carbon tứ cấp

Từ phô ‘H-NMR và '°C-NMR cho thấy hợp chất PF-02 có dang là một sterolglucosid So sánh số liệu phố C-NMR của phan aglycon trong hợp chất PF-02 với@'sitosterol (bảng 3.3) cho thấy có sự tương đồng Đồng thời dữ liệu phố của phanđường trong hợp chất PF-02 khớp với đường D-glucose (bảng 3.4), do đó chúng tôiđề nghị cau trúc của hợp chất PF-02 là f-sitosterol-3-O-£ -D-glucopyranosid