Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên men bởi Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THAC SĨHọ tên học viên: LƯƠNG NGỌC ANH MSHV: 1570250 Ngày tháng năm sinh: 01/04/1992 Nơi sinh: Bình Thuận Chuyên ngành: Cong nghệ sinh học Mã số: 60420201TÊN ĐÈ TÀI: Nâ

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

LUONG NGOC ANH

NANG CAO CHAT LUONG SAN PHAM SUA CHUA

LEN MEN BOI Lactobacillus acidophilus

GIAU HOAT TINH KHANG OXY HOA

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hocMã số: 60 42 02 01

LUAN VAN THAC SI

TP HO CHI MINH, thang 07 nam 2018

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa —- ĐHQG —- HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THAC SĨ

Họ tên học viên: LƯƠNG NGỌC ANH MSHV: 1570250

Ngày tháng năm sinh: 01/04/1992 Nơi sinh: Bình Thuận

Chuyên ngành: Cong nghệ sinh học Mã số: 60420201TÊN ĐÈ TÀI:

Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên men bởi Lactobacillus acidophilus giàu

hoạt tính kháng oxy hóa.

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

Luận văn được thực hiện với mục đích sau:

- Nghiên cứu cơ bản về khả năng kháng oxy hóa của dòng vi khuẩn probiotic, cụ thểlà chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

- Thăm dò ứng dụng, tạo ra dòng sản phẩm sữa chua có thêm hoạt tính sinh học về

khả năng kháng oxy hóa.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/2018

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2018

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô hướng dẫn, PGS TS.Nguyễn Thúy Huong, Cô đã gợi mở ý tưởng dé tôi định hướng và xây dựng dé tàinghiên cứu này Trong suốt thời gian thực hiện, Cô đã tận tình hướng dan, độngviên tỉnh thần, giúp tôi vượt qua trở ngại để có thể hoàn thành luận văn Tôi xinchân thành cảm ơn Quý Thây Cô Khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học BáchKhoa đã truyền dạy những kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôitrong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại trường

Tôi cũng xin cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã chia sẻ tài liệu trong cáclĩnh vực liên quan, cũng như đóng góp các ý kiến để tôi hoàn thành đề tài nghiêncứu Xin cảm ơn gia đình đã động viên và tạo điều kiện cho tôi trong thời gian tập

trung vào luận văn này.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng cùng sự góp ý giúp đỡ của Thay Cô, tuy nhiênvới kiến thức còn hạn chế nên luận văn chắc chan không tránh khỏi những thiếu sót.Kính mong tiếp tục nhận được sự góp ý, nhận xét của Quý Thầy Cô và những người

có quan tâm dé luận văn được hoàn thiện hon.

Xin chân thành cảm on!

Lương Ngoc Anh

TOM TAT LUẬN VAN

Sự rối loan chuyển hóa do mat cân bang oxy hóa là nguyên nhân của nhiềubệnh lý trong cơ thé Lactobacillus acidophilus giúp giảm stress oxy hóa và thiết lậpcân băng hệ sinh thái vi sinh đường ruột Trong nghiên cứu nay, Lactobacillusacidophilus BK1, BK2, BK3 và BK4 đều sống sót trong môi trường pH 3, mudi mật0.3%, kháng khuẩn, khử cholesterol và sinh acid lactic Sinh khối và hoạt tính

khang oxy hóa cua Lactobacillus acidophilus BK4 trong de Man - Rogosa - Sharpe

(MRS) sucrose 6% được đại diện bang phương trình hồi quy theo phương pháp quyhoạch thực nghiệm Điều kiện lên men tối ưu được xác định theo phương pháp Box- Wilson gồm pH 5.1, nhiệt độ 36.6°C trong 40 giờ Sinh khối đạt 11.59 + 0.09 log(CFU/ml) (tăng 6.4%), tong nang luc khu dat 0.55 + 0.04 (tang 37.8%) va kha nangkhir 53.63% 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl (DPPH) (tang 12.02%) Sau 8 tuantheo dõi bao quản ở nhiệt độ 10°C, san phẩm sữa chua lên men bởi Lactobacillusacidophilus BK4 đạt tiêu chuẩn probiotic và có hoạt tính kháng oxy hóa cao

Từ khóa: Kháng oxy hóa, Lactobacillus acidophilus, Stress oxy hóa

ABSTRACT

Lactobacillus acidophilus reduces oxidative stress in the body and restoreintestinal microflora balance Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 and BK4

were able to survive in pH 3, 0.3% bile salt, resistant to bacterial, reduce cholesterol

and produce lactic acid In this study, we conducted fermentation experiment using

Lactobacillus acidophilus BK4 in MRS The glucose content in this medium isreplaced by 6% sucrose solution Optimal fermentation conditions were determined

by experimental planning method and Box - Wilson method including pH 5.1,

temperature at 36.6°C and reaction time in 40 hours At this fermentation

conditions, the biomass obtained was 11.59 + 0.09 log (CFU/ml) (6.4% increase).

Lactobacillus acidophilus BK4 showed that reducing power was 0.55 + 0.04(37.8% increase) and DPPH radical scavenging activities was 53.63% (12.02%

increase) Antioxidant of fermented milk by Lactobacilus acidophilus’ was

improved and maintained for 8 weeks at 10°C.

Key words: Antioxidant activity, Lactobacillus acidophilus, Stress oxidative

|

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan răng luận văn này là công trình nghiên cứu do tôi thực hiệndưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Thúy Hương Các số liệu, kết quả trong

luận văn được trình bày trung thực và khách quan Luận văn có tham khảo và sử

dụng các tài liệu khoa học được đăng tải trên các tạp chí, hội nghị được dé cap trongphan tài liệu tham khảo

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018

Học viên thực hiện

Lương Ngọc Anh

MỤC LỤCTÓM TAT LUẬN VĂTN << 5° << o1 mg vơ cư go emeree iLOT CAM DOAN 07 ).).) iiDANH MỤC CAC BANG uu.ccsssssssssssssssssssssssssssssessssesscssssssssessssesscsssessssssssessssssesssssssssesecaes VDANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH << sư xe emgecøoeseeersersoe viDANH MỤC CÁC ĐỎ 'T HỊ, 2-5-5 < S9 9x e9 re eøesevsesosee viiDANH MỤC CAC KI HIỆU VÀ CHỮ VIET TẮTT 2 e2 < se ssssessesess viii1067.100355 ÔỎ 1Chương 1 TONG (QUANN 2.5- << 5° #99921 vợ xe emeeeveesesesee 3

1.1 Quá trình lên men va san phẩm sữa chua eee 31.2 Giống Lactobacillus va Lactobacillus acidophilus 5 51⁄2.1 Vi khuẩn Lactobacillus ciccceccccccccccsccsessscssssesessesessssssssesessssssssesssssessssseseeseen 51.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus /131⁄/0)2)/1117 XE TT TY rraạẠỤỘŨ Ọ1.3 Quá trình oxy hóa và quá trình kháng oxy hóa trong cơ thể 13

1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa cua Lactobacillus acidophilus 16

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5 <-<¿ 21

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện - ©5255 2c rreererreee 212.2 Đối tượng nghiên cứu - + +52 S2 S2 S213 SE E21 12111 1 1E tre 212.3 Vật liệu và hóa chất - + 552 S2 S213 1212111215151 51111 te 212.3.1 Dụng cụ và thiét bị -c-c- S2 1 3 1 15131111 111111 1111011111111 1111 cye 212.3.2 H6achate.cccccccccccccsccscssssescssscsssscscscssscsescsssssssesssssssssessssseessessseseen 222.3.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh Vat eee csesesesessessseseesesesesesseeeseseeseees 22

2.4 Phương pháp nghiÊn €ứỨUu - - - (<< <5 1S ng 2424.1 Khảo sát các đặc tính của Lactobacillus acidophilus 25

242 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus

giàu hoạt tính kháng oxy hóÓa - - << 11000 30

2.4.3 Lên men sữa chua bởi chủng sàng lọc và đánh giá ôn định chất lượng sanphẩm sữa chua giàu hoạt tinh kháng oxy hóa + +5 +52 s+s+x£s+x+xzzscxez 332.5 Phương pháp phân tích và thu nhận kết qua -. -5- 35

lil

2.5.1 Phương pháp phân tích vi sinh - - << - S20 1 re 352.5.2 Phuong pháp phân tích hóa sinh + + sssssseeeeeeee 362.5.3 Phương pháp thăm dò cảm quann 5 5111 vree 362.54 Phương pháp quy hoạch thực nghiỆm - << 5 +5 S1 se 36

2.5.5 Phương pháp xử lý số liệu ¿+2 - + 2+2 +E+E+E£EEEE+E£ESEEEEEErErErkrrrreee 36

Chương 3 KET QUA VÀ BIEN LUẬN - 5° << se se sex seseesessesesevee 37

3.1 Khao sát các đặc tính của Lactobacillus qctlophilus 37

3.1.1 Đặc điểm sinh học của Lactobacillus aCIdODhHÏHS c «s2 37

3.1.2 Hoạt tính probiotic cơ bản cua Lactobacillus actlophilus 39

3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus

giàu hoạt tinh kháng oxy hóa - - - G SH ng 47

3.2.1 Sàng lọc yếu tố chính - + ¿SE +E+E£EE+ESEEEEEEEEEEEEEEEEkrkrkrrkrerreee 483.2.2 Tối ưu hóa hai hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa

¬— nnn EEE ELTA; EEDA E EEE EEE; ELLE EEE; EEE EE EEE EE EEE EEE; EEE EE; EERE EE EES 50

3.3 Lên men sữa chua bởi chúng vi khuẩn sang lọc và đánh gia On địnhchất lượng sản phẩm sữa chua probiotic giàu hoạt tinh kháng oxy hóa 553.3.1 Banh khá các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm sữa chua Lactobacillus

/13171)2)/1117AEEEEPPP(g(gẶaỔÔỔÔÝOỐ 56

33.2 Đánh gia kha năng bảo toàn hoạt tính probiotic cua Lactobacillus

acidophilus trong sản phẩm sữa chua trong 8 tuần bảo quản -. - 57

3.3.3 Đánh giá khả năng bảo toàn hoạt tính kháng oxy hóa cua Lactobacillus

acidophilus trong sản phẩm sữa chua trong 8 tuần bảo quản -. - 583.3.4 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa trong sản phẩm với một số sản phẩm

sữa chua probiotic trên thị trường Việt Nam - - s S2 ee 58

Chương 4 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ 5 <5 sex ssseesesesecee 60

4.1 Kết luận - L5 1 1 1 1212121111 11111 010111011101 01 20011101010 604.2 Kiến nghị, C55111 1 v1 12 111111111111 11 0111012120110 60

TÀI LIEU THAM KHÁOO 5 << S92 xxx sevxvsesesese V

310800069555 ,ôÔ xi

DANH MỤC CÁC BANG

Bang 3.1 Khả năng khử cholesterol của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 sau 150 phút nuôi cấy . ¿- ¿6 52 SE E2 E311 21 211112111 cxee 43Bang 3.2 Kha năng kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 vaBK4 với các vi khuẩn chỉ thi eecsecseesseesssesseesseesseesseesseecseecseesseesseeseessesesesesesesnees 44

Bang 3.3 Hoạt tính khang oxy hóa cua Lactobacillus acidophilus BK4 trong môi

trường MRS có nông độ sucrose 6%, 8% và 1ÚÕ% + 2522222 £e+terecxcree 49Bang 3.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y} 50Bang 3.5 Bước chuyển động di của các yếu tố hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y, 52Bang 3.6 Thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y¡ 52

Bảng 3.7 Ma trận quy hoạch thực nghiệm của hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy

¡02 :-: -::AOÔỞOÔỞOƠLOỎ 53

Bang 3.8 Bước chuyén động di của các yếu tô hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy

¡021 — A 54

Bang 3.9 Thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm mục tiêu hoạt tinh kháng oxy hóa Y>

Bảng 3.10 Các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm sữa chua Lactobacillus

CLODHHHÏHLS SG SG kh 56

Bang 3.11 Mật độ vi khuan, hoạt tính kháng khuẩn va khả năng khử cholesterol củasản phẩm sữa chua trong 8 tuân theo dõi bảo quản ở nhiệt độ 10°C 57Bang 3.12 Hoạt tính kháng oxy hóa của sản phẩm sữa chua trong 8 tuân theo dõi

bao quan 6 nhiét dO LOCC occ 58

Bang 3.13 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa giữa san phẩm sữa chua Lactobacillusacidophilus BK4 và hai sản pham sữa chua probiotic thương mại 59

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tật -« «se 15Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tong quát - - 2 2 +5+£+S££*+E+£££x+xvzecxcxeei 24Hình 2.2 Sơ đồ quy trình lên men sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa

Hình 3.1 Hình thái đại thé (A), vi thé (B) của Lactobacillus acidophilus BK1 .37Hình 3.2 Hình thái đại thé (A), vi thé (B) của Lactobacillus acidophilus BK4 .37Hình 3.3 Vòng kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus BK4 với Escherichia

coli ATCC 8739 (A) và Bacillus cereus ATCC 11778 (B) 44

Hình 3.4 Sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 56

DANH MỤC CÁC ĐỎ THỊ

Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus BKI, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường MRS theo thời ø1an 5 S2 39

Đồ thị 3.2 Khả năng chịu pH thấp của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường SGJ theo thời øØ1an - 5< 11 1 ke 40

Đồ thị 3.3 Khả năng chịu muối mật của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

va BK4 trong môi trường SIF theo thời Ø1an - «5 << 1 1s cee 42

Đồ thị 3.4 Kha năng sinh acid lactic của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3

và BK4 trong môi trường MRS theo thời gian . 5 5S 1s ke 45

Đồ thị 3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3và BK4 trong môi trường MRS theo phương pháp tổng năng lực khử (A) và phương

pháp khử DPPH (B) (1 1S re 46

Đồ thị 3.6 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus BK4 trong môitrường MRS có nông độ sucrose 6%, 8% và 1% ¿22c x2E2EEErErkrerree 48

Vil

DANH MỤC CÁC KI HIỆU VA CHỮ VIET TAT

CFU Colony Forming UnitEPS Exopolysaccharide

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

GRAS Generally Recognized As Safe

DPPH 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl

LAB Lactic Acid Bacteria

MRS de Man - Rogosa - Sharpe

MT Mỗi trườngOD Optical DensitySGJ Simulated Gastric JuiceSIF Simulated Intestinal Fluid

RNS Reaxtive Nitrogen Species

ROS Reactive Oxygen Species

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

MO DAU

Sữa là nguồn thực phẩm quý giá cung cấp các chất dinh dưỡng can thiết chosức khỏe của con người Ngày 01/06/2001, Tổ chức Lương thực và Nông nghiệpLiên Hiệp Quốc (FAO) đã khởi xướng ngày Sữa thế giới nhằm khuyến khích tiêuthụ sữa hăng ngày như một phần của chế độ ăn uống lành mạnh Trong quá trình sửdụng, con người đã đa dạng hóa nhiều sản phẩm từ sữa như phô mai, bơ, kem, sữalên men, và nâng cấp chúng từ sản phẩm truyền thông trở thành các sản phẩmhiện đại được sản xuất theo dây chuyền công nghiệp Trong đó, sữa chua là sanphẩm của quá trình lên men lactic của vi khuẩn lactic với mục dich ban dau là tăng

cường hương vi và kéo dai thời gian bảo quản sữa [1].

Các vi khuẩn lactic thông qua quá trình lên men sẽ nâng cao chất lượng cũngnhư số lượng các protein, chất béo, vitamin, khoáng chất trong sữa, giúp tăng cườnghệ thống miễn dịch, hỗ trợ hệ cơ xương, giúp hệ tiêu hóa hấp thu các dưỡng chất tốtnhất [2] Đặc biệt, những vi khuẩn lactic được công nhận là probiotic, khi b6 sungvào cơ thé sẽ cải thiện toàn diện sức khỏe của con người Các probiotic sẽ củng côthành ruột, cân băng hệ vi khuẩn đường ruột, giảm các rỗi loạn liên quan đến đườngtiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa các bệnh dị ứng, nhiễm khuẩn, làmchậm quá trình phát triển của ung thư và hỗ trợ sức khỏe tim mạch [1].Lactobacillus acidophilus là một trong những vi khuẩn lactic được thương mại hóatrong chế biến thực phẩm Các chủng Lactobacillus acidophilus đã được đưa vàocác sản phẩm sữa ở Mỹ va Đức vào những năm cuối của thập niên 1960 nhằm nângcao chất lượng sản phẩm [3] Ngoài những hoạt tính điển hình của một probiotic,

Lactobacillus acidophilus còn có kha năng sinh enzyme lactase, giup giảm các triệuchứng không dung nap lactose trong sữa động vật và khả năng khử cholesterol trongmau [4].

Ngày nay, môi trường sống của con người càng trở nên 6 nhiễm do các tácđộng trực tiếp của hóa chất, khói thuốc, bức xạ, hay gián tiếp thông qua thực phẩm,thậm chí do dùng một số dược phẩm chữa bệnh cũng trở thành những tác nhân gâystress oxy hóa cho cơ thể Trạng thái stress oxy hóa làm thoái hóa tế bào, gây ungthư và gây ra các bệnh lý trong cơ thể như viêm nhiễm các cơ quan, bệnh tim mạch,bệnh thần kinh, thoái hóa mat, và biểu hiện sớm nhất là hiện tượng lão hóa da

|

Việc tăng cường hoạt tính kháng oxy hóa trong thực phẩm hang ngày là rất cần thiết

đề ho trợ, tăng khả năng đáp ứng của cơ thê trước các tác động xâu từ môi trường.

Năm 1993, các nghiên cứu trên vi khuẩn lactic đã phát hiện ra các chất có hoạttính kháng oxy hóa, với khả năng ức chế hơn 70% hoạt động oxy hóa Những nămgan day, các thử nghiệm in-vitro va in-vivo sử dung Lactobacillus acidophilus đãcho thay vai trò quan trọng của chúng trong hoạt động kháng oxy hóa của cơ thé

bệnh nhân [5].

Một trong những giải pháp an toàn và mang tính chủ động trong việc giảm

stress oxy hóa, cải thiện các bệnh lý trong cơ thể là sử dụng các thực phẩm có lợi,giàu hoạt tính kháng oxy hóa, giúp cân bằng hệ sinh thái vi sinh đường ruột Vì vậy,ngoài các công dụng về sữa chua đã được biết đến, thì việc sử dụng vi khuẩn

probiotic và tăng hoạt tính kháng oxy hóa mở ra một hướng mới cho thị trường sữalên men, đáp ứng nhu câu ngày càng cao của con người.

Từ những ly do trên, dé tài “Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên

men boi Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính khang oxy hóa” được thực hiện

với mục tiêu nghiên cứu cơ bản về khả năng kháng oxy hóa của dòng vi khuẩnprobiotic, cụ thé là chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, từ đó thăm dò ứngdụng, tạo ra dòng sản phẩm sữa chua có thêm hoạt tính sinh học về khả năng kháng

oxy hóa.

Nội dung nghiên cứu của dé tài bao gôm:

- Khao sát các thông số giống Lactobacillus acidophilus như đặc tính sinh

học, hoạt tính probiotic và hoạt tính kháng oxy hóa.

- Tối ưu hóa quá trình lên men phòng thí nghiệm đảm bảo hoạt tính

probiotic và hoạt tính khang oxy hóa cua Lactobacillus acidophilus nhưđịnh dưỡng môi trường, pH môi trường, nhiệt độ lên men và thời gian lên

men.- Lén men sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa và đánh giá 6n

định chất lượng sản phẩm

Chương 1 TONG QUAN

1.1 Quá trình lên men va sản phầm sữa chuaCác thực phâm lên men đã được biệt đên từ rat sớm trong quá trình phát triêncủa con người Rat khó dé thiệt lập nguôn gôc chính xác của việc sản xuat sản phầmlên men, theo thời gian và theo các tiên bộ khoa học, các sản phầm lên men dân

được đánh giá an toàn để sử dụng.Năm 1990, Adams định nghĩa “lên men” là thuật ngữ dùng để mô tả hình thứctrao đổi chất của vi sinh vật làm biến đổi hợp chất hữu cơ, thường là cáccarbohydrate Quá trình lên men là một phương tiện để bảo quản thực phẩm với chiphí thấp Ví dụ như quá trình lên men sữa tạo phô mai có thời gian bảo quản lâuhơn sữa không lên men, giảm thời gian chế biến thức ăn như đậu nành hay ngô lênmen, so với sử dụng hạt thông thường Các đặc tính cảm quan của thực phẩm cũng

được cải thiện và phong phú hơn Đôi khi, quá trình này còn loại bỏ hoặc giảm hàm

lượng các chất không mong muốn như các yếu tố gây day hơi trong đậu nành, cácchất độc trong thức ăn và làm tăng chất lượng của thực phẩm [2]

Cac thuc pham lên men trên thị trường được chứng nhận an toàn (GRAS) chongười sử dụng, rất phong phú và đa dạng tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu sản xuất

như lúa my, lúa mạch, ngô, săn, đậu nành, rau, cá, sữa, va vi sinh vật được sử

dụng cho quá trình lên men Một số vi sinh vật thường dùng trong lên men như

Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum lên men tách vỏ hạt cà phê,

cacao, Corynebacterium manihot lên men bột san thành gari, Aspergillus oryzae lên

men đậu tương thành miso, Pediococcus cerevisiae lên men dua chuột thành dua

mudi, Aspergillus oryzae lên men đậu tương thành nước cham, Acetobacter xylinumlên men nước dừa thành thạch dừa, vi khuẩn lactic lên men các loại rau thành kim

chi hay lên men sữa thành các sản phâm sữa chua hay pho mai,

Các phương pháp lên men chính đã sử dụng trong vi sinh thực phẩm là lênmen lactic và ethanol Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acidlactic nhờ vi sinh vật như nắm men, nắm sợi và điển hình là vi khuẩn lactic (LAB).Mỗi LAB khác nhau có cơ chế lên men đường khác nhau Căn cứ vào sản phẩm lênmen chia LAB thành hai nhóm Nhóm LAB lên men đồng hình phân giải đường

3

theo con đường đường phân EMP (Embden — Meyerhof — Parnas) cho sản phẩmchủ yếu là acid lactic chiếm 90% đến 98% Chỉ một phần nhỏ pyruvate đượcdecacboxyl hóa và chuyển thành acid acetic, ethanol, aceton va CO, [6] Mức độ taothành các sản phẩm phụ phụ thuộc vào sự có mặt của oxy Phương trình tóm tắt quátrình lên men đồng hình như sau:

C4H:zOs + 2ADP + 2Pi > 2CHzCHOHCOOH + 2ATP

(Giucose) (Acid lactic)

Trong quá trình lên men di hình, do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đườngEMP là aldolase và triozophosphat — merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình

phân giải glucose xảy ra theo con đường PP (Pentose - Phosphat) [6] Quá trình

chuyển hóa trizophosphat thành acid lactic giống như lên men đồng hình Sản phẩmcủa quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic chiếm 40%, còn có các sảnphẩm khác như acid succinic (10%), ethanol (20%), acid acetic (10%) và các chấtkhí (20%) [7] Phương trình tóm tắt quá trình lên men di hình như sau:

(Glucose) (Acid lactic) (Ethanol)

Qua quá trình lên men lactic, chat lượng cũng như số lượng của các protein,vitamin, khoáng chất trong thực phẩm tăng đáng kế trên cùng một trọng lượng khô,giúp hệ tiêu hóa hoạt động tốt hon, chất dinh dưỡng từ thực phẩm được hap thu tốt

hơn [2].

Sữa chua là thức ăn được chế biến bằng cách lên men sữa dưới tác dụng của vikhuẩn lactic Trên thế giới, có trên 400 loại sữa chua khác nhau [7] Tùy theo mụcđích sản xuất mà sữa chua được phân loại dựa theo hàm lượng chất béo như cao,

trung bình hoặc thấp; theo tính chất vật lý như dạng bột khô, đông lạnh, bán ran

hoặc dạng lỏng: theo hương vị như hương vi tự nhiên, b6 sung hoa quả hoặc hươngliệu; theo vi sinh vật sống được bồ sung như probiotic hay các vi sinh vật điều trị;theo phương pháp sản xuất như chế biến trước hay sau quá trình lên men [7]

Sữa chua chứa các thành phan chính là protein, chất béo, carbohydrate, cáckhoáng chất và vitamin thiết yếu, giúp tăng cường sức khỏe cho người sử dụng Các

lợi ích của sữa chua được chứng minh rõ ràng vào cuối những năm 1800 đầu nhữngnăm 1990 bởi nhiều nghiên cứu, quan sát và giải thích của Moro và Metchnikoff.Một số lợi ích của sữa chua đến sức khỏe con người có thé kế đến như bổ sung cácchất dinh dưỡng, điều hòa trao đối chất đường ruột, phòng ngừa và điều trị nhiềubệnh về hệ tiêu hóa, tăng khả năng kháng khuẩn và nâng cao hệ miễn dịch của cơthé [7].

Trong sản xuất truyền thong, những vi khuẩn lactic thường được sử dung débảo quản sữa Trong quy mô công nghiệp, sữa chua được sản xuất với những kĩthuật tiên tiễn đã hạn chế được sự xâm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn làmảnh hưởng chất lượng sản phẩm so với phương pháp truyền thống Ngày này, với sựphát triển của công nghệ, các sản phẩm sữa chua đã được phân bố ồn định trong thịtrường người tiêu dùng càng quan tâm hơn đến các sản phẩm có giá trị chức năngbổ sung vào khẩu phan ăn hằng ngày

1.2 Giống Lactobacillus va Lactobacillus acidophilus1.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus

Năm 1780, Sheele lần dau tiên phát hiện ra Lactobacillus và đến năm 1865,Bergey đã sắp xếp Lactobacillus trong khóa phân loại vi khuẩn [8] như sau:

Gidi: Bacteria Bộ: Eubacteriales

Nganh: Firmicutes Họ: Lactobacillaceae

Lop: Bacilli Giỗng: Streptococcus va LactobacillusLactobacillus thuộc nhóm vi khuẩn lactic (Lactobacillaceae), thường có dạnghình que, Gram dương, không hình thành bào tử, không chứa sắc tố, catalase âmtính và vi hiếu khí Lactobacillus là một trong những lợi khuẩn quan trọng chiếm ưuthế trong hệ sinh thái đường ruột, nhất là trong ruột non

Nhu cau dinh dưỡng cơ bản của Lactobacillus bao gồm:

- Nhu câu dinh dưỡng carbon, Lactobacillus sử dụng được rat nhiêu loạicarbohydrate nhờ quá trình lên men đông hình và dị hình giúp xây dựng câutrúc tê bào, sinh ra các acid hữu cơ, các acid amin làm nguồn cung cap nang

lượng.

- Nhu cau dinh dưỡng nito, phần lớn Lactobacillus không thé sinh tổng hopđược các chất hữu cơ phức tạp có chứa nito nên chúng đòi hỏi nguồn nito cósan trong môi trường Các acid amin có thé được đồng hóa dưới dạng peptit

nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào hay nội bào.

- Nhu câu vitamin rat can cho sự sinh trưởng cua Lactobacillus, các vitamin biảnh hưởng bởi nhiêu yêu to như nhiệt độ nuôi cây, lượng CO, ban dau, pH va

thế oxy hóa khử của môi trường.- Nhu cau về các muối khoáng, các hợp chất vô cơ đa lượng và vi lượng như

đồng, natri, kali, photpho, lưu huỳnh rất cần thiết cho quá trình sống của

Lactobacillus, đặc biệt là sắt, mangan và magie có tác động tích cực đến sựphát triển của Lactobacillus

- Cac chat hữu cơ khác như acid acetic, acid oleic và acid citric cũng có những

anh huong nhất định đến tốc độ sinh trưởng cua Lactobacillus [9]

Ngoài nhu câu về dinh dưỡng co bản, sự phát triên cua Lactobacillus còn biảnh hưởng bởi các yêu tô môi trường sông như nhiệt độ, pH môi trường, sự trao đôi

oxy, nông độ đường hay nông độ NaCl:- Ba số Lactobacillus sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5°C — 45°C, nhiệt

độ sinh trưởng tối ưu từ 20°C - 40°C Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều

ảnh hưởng đền ket câu và chức năng của té bào vi khuân.- _ Hoạt động cua Lactobacillus, đặc biệt là hệ enzyme cua chúng, chịu tac động

mạnh của sự thay đối pH môi trường Giá trị pH tối ưu cho sinh trưởng củaLactobacillus là pH 5.6 đến pH 6.2, sau quá trình lên men, pH môi trườngkhoảng từ pH 3.2 đến pH 3.5

- Tuy thuộc vào đặc điểm sinh lý của mỗi loài và mỗi giai đoạn phát triển khácnhau mà nhu cầu oxy của Lactobacillus là khác nhau, tuy nhiên, phần lớnLactobacillus hoạt động tốt trong điều kiện hiếu khí

- Nồng độ đường trong môi trường lên men tỉ lệ thuận với hàm lượng acidlactic sinh ra Tuy nhiên, khi nồng độ đường tăng quá cao sẽ gây co nguyên

sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào, từ đó, hàm lượng acid lactic

fermentum, Lactobacillus plantarum,

Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi dùng với số lượng thích hợp sẽmang lại những lợi ích sức khỏe cho cơ thé chủ [5] Năm 1907, Elie Metchnikoff đãđạt giải Nobel khi chứng minh được việc tiêu thụ Lactobacillus qua các sản phẩmsữa lên men sẽ hạn chế các nội độc tố của nhiều vi sinh vật đường ruột [10].Lactobacillus được công nhận là probiotic, được bố sung trong thực phẩm hangngày Những lợi ích cho sức khỏe của chúng được thé hiện thông qua khả năng hỗtrợ hệ thống tiêu hóa của con người Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus plantarum giúp tăng cường hệ lợi khuẩn, có vai trò quan trọng trong

việc tăng cường chức năng đường ruột [5, 11].

Hệ tiêu hóa ngoài vai trò hấp thụ các chất dinh dưỡng, còn đóng vai trò là cơquan miễn dịch của cơ thể, là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lạicác tác nhân gây bệnh xâm nhiễm Hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột chứa từ 10!”

đến 10'* vi sinh vật, với 1000 đến 1150 loài cùng chung sống [5 12] Dựa vào sự

tác động đối với hệ tiêu hóa, hệ vi sinh vật đường ruột được chia thành ba nhómchính bao gồm lợi khuẩn như Lactobacillus và Bifidobacteria, vi khuan gây bệnhnhư Clostridia và một số vi khuẩn khác thuộc Bacteroides trung tính, không có lợicũng như có hại Khi hệ sinh thái mất cân bằng, các vi khuẩn gây hại phá hủy biểumô đường ruột, làm cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến giảm sự hấp thụ cácchất dinh dưỡng, chúng sản sinh ra các cơ chất gây độc, làm suy yếu hệ thông miễndich, làm tăng chu trình tế bào và tiêu tốn năng lượng cơ thể Các lợi khuẩn như

7

probiotic với những đặc điêm sinh lý giúp tang khả năng cạnh tranh với vi khuângây hại, sẽ cân băng hệ vi sinh vật, bảo vệ bê mặt của đường tiêu hóa chong lại cácvi sinh vật xâm nhiêm, điều hòa hệ miên dich của cơ thê, hô trợ hap thu các chat

dinh dưỡng và tong hợp các protein, vitamin [12].Trong nhiều nghiên cứu cho thấy, khi cho những bệnh nhân rối loạn tiêu hóasử dụng probiotic chứa thành phần vi khuẩn Lactobacillus acidophilus,Bifidobacterium bifidum va Bifidobacterium breve sẽ làm gia tăng số lượng củaLactobacillus và giảm số lượng của Escherichia coli trong ruột, giảm thời gian dichuyển qua ruột cua Salmonella Còn khi cho bệnh nhân bị bệnh bạch cầu sử dụngsản phẩm chứa Bifidobacterium và Lactobacillus acidophilus, hệ vi khuan đường

ruột và nắm men sẽ được phục hồi Trong khi sử dụng thuốc chữa trị bệnh bạch cầu

sẽ làm chết một số vi sinh vật có lợi trong đường ruột [4]

Probiotic giúp phòng ngừa và chữa trị bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng trong cơ

thể Khi sử dung Lactobacillus rhamnosus dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông

khô thì khoảng 95% trẻ em giảm triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy trong một ngày và

không còn tiêu ra máu sau ngày thứ hai chữa trị Những bệnh nhân nhiễm trùng

đường hô hap và đường niệu thường có lượng Candida ở trong phân cao (mật độ10° CFU/g phân) Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, sô lượng Candida giảmđáng ké và sự nhiễm trùng cũng giảm [5] Các chủng probiotic khác nhau có nhữngtác động khác nhau lên môi trường đường ruột, lên chức năng của hàng rào biểu mô

và niêm mạc [13].

Các Lactobacillus trong chế phâm probiotic còn có khả năng kháng các dòngtế bào gây ung thư thông qua việc làm giảm các enzyme nitroreductase,azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiễn ung thư thành chất gây ung thutrong cơ thé [4] Khi cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung và bệnh nhân ung thư bangquang sử dung Lactobacillus casei Shirota với liều lượng thích hợp, sẽ giúp tăngquá trình thoái hóa khối u trong điều trị phóng xạ, giúp kéo dài sự sống, ngăn chặnSự Suy giảm các tế bào bạch cầu, đồng thời, ngăn chặn sự tái phát của khối u [5].Các nghiên cứu năm 2012 được tổng hợp bởi Makrides đã cho thấy khả năng điềuhòa miễn dịch toàn diện của Lactobacillus Chế phẩm sinh hoc probiotic có thé

được sử dụng như chất phụ trợ trong hóa trị liệu ung thư hứa hẹn hướng phòng ngừavà hỗ trợ điều trị ung thư Probiotie cũng có vai trò quan trọng trong công tác phòngchồng ung thư đại tràng [13].

Bên cạnh đó, probiotic còn có khả năng ngăn chặn bệnh tiểu đường và bệnhcao huyết áp Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy, khi cho chuột sử dụngLactobacillus casei sẽ làm giảm tỷ lệ tiểu đường của chuột bệnh nhưng không gây

ảnh hưởng trên chuột bình thường Lactobacillus rhamnous và Lactobacillus

gasseri giup diéu hda hoat dong điều tiết hormone, cải thiện các bệnh về chuyển

hóa lipid [5].

Đặc biệt, năm 1993, Kaizu và cộng su đã phat hiện ra hoạt tính khang oxy hóa

của Lactobacillus, với khả năng ức chế hơn 70% hoạt động oxy hóa Dịch nuôi cayLactobacillus delbrueckii bảo vệ được té bào Caco-2 bị tôn thương do HO; [5, 13].Lactobacillus plantarum C88 có khả năng khử gốc hydroxyl lên đến 53.05% va khảnăng sống sót đến 30% trong môi trường ImM H;O› trong 8 giờ, cải thiện tình trạng

stress oxy hóa do D - galactose trên chuột Sữa dê lên men bởi Lactobacillus

plantarum va Lactobacillus paracasei chéng lại sự phát triển của dòng tế bào ungthư HeLa Những thử nghiệm in-vitro cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa từLactobacillus helveticus ức chễ các dòng té bào ung thư như HepG-2, BGC-823 vaHT-29 [5] Ngoài ra, việc b6 sung các peptide từ sữa chua cũng giúp tăng hamlượng chất kháng oxy hóa nội sinh trong cơ thé, gây chết tế bào ung thư ma khônglàm ảnh hưởng đến các tế bào bình thường [14, 15]

Hoạt tinh kháng oxy hóa tạo ra bởi các chủng Lactobacillus giúp phòng chốngung thư và giảm các bệnh lý liên quan đến stress oxy hóa Vì vậy, tăng hoạt tínhkháng oxy hóa trong thực phẩm nói chung và sữa chua nói riêng đang ngày cảng

được quan tâm nghiên cứu.

1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus1.2.2.1 Đặc điểm sinh lý của Lactobacillus acidophilus

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được Moro phân lập đầu tiên vào năm

1900 từ phân su của trẻ sơ sinh Sau đó, Lactobacillus acidophilus được phân loạivà mô tả các đặc điêm về trao đôi chât cũng như chức năng của chúng trong thực

9

phẩm Lactobacillus acidophilus là vi khuân Gram dương, có dạng hình que, kíchthước (0,6 - 0,9)um x (1,5 - 6,0)um, đứng riêng rẽ, xếp theo cặp hoặc tạo thành

chuỗi ngăn, không di động, không tạo bào tử, không sinh độc tố [7, 16] Phương

thức sinh sản của Lactobacillus acidophilus là chia đôi hay trực phân Mặc dù chỉ

sinh sản cận hữu tính nhưng Lactobacillus acidophilus vẫn có bién đổi di truyềntrong tế bào thông qua tái tổ hợp di truyền [17] Theo Bergey, vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus được phân loại như sau [8]:

Gidi: Bacteria Ho: Lactobacillaceae

Nganh: Firmicutes Giỗng: Lactobacillus

Lop: Bacilli Loai: Lactobacillus acidophilus

Bộ: Eubacteriales

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có kha năng lên men đồng hình va dị hình,trong đó những loài lên men đồng hình chiếm ưu thế hơn Các vi khuẩn này sốngchủ yếu trong ruột, miệng và âm đạo Lactobacillus acidophilus có phan ứngcatalase và chuyển hóa nitrat thành nitrit âm tính, chúng có khả năng lên men cả

đường lactose, glucose, sucrose, maltose va mannose [17].

Lactobacillus acidophilus là vi khuan hiéu khí, chịu nhiệt, chúng có thé sốngtrong điều kiện nhiệt độ lên đến 45°C Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng củaLactobacillus acidophilus là 37°C, pH toi ưu cho sự tăng trưởng dao động trongkhoảng pH 5.5 đến pH 6 [7]

Môi trường nuôi cây chuẩn cho Lactobacillus acidophilus thường phải rat giàuacid amin va vitamin như peptone, trypton, dich chiết nắm men, dịch chiết thịt bò,ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleate, sodium acetate và mudi magie kích thích sự

tăng trưởng Môi trường MRS là môi trường chon lọc Lactobacillus Trên moi

truờng thạch MRS, khuẩn lạc có đường kính từ 2mm đến 5mm, dang tron, lồi, màutrăng đục, vành déu va không sinh chất tạo màu Trong môi trường thạch sâu, khuẩnlạc nhỏ và có hình dạng không ôn định Trong môi trường thạch nghiêng, khuẩn lạccó màu trang đục, hơi khô và phát triển giới hạn theo vết cay [7]

1.2.2.2 Đặc tinh probiotic của vi khuẩn Lactobacillus acidophilusTương tự như các vi khuẩn Lactobacillus, hoạt động probiotic củaLactobacillus acidophilus thông qua các cơ chế phân tử là khả năng cạnh tranh loạitrừ, đôi kháng vi khuẩn và điều chỉnh miễn dịch của chủ thé [18].

Cạnh tranh loại trừ là đặc tinh dau tranh sinh tổn điển hình của các vi sinh vật.Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thay ở các vi sinh vat đường ruột là cạnh tranhvị trí bám dính Lactobacillus acidophilus có khả năng bám dính vào tế bào biểu môruột, chồng lại sự loại bỏ của nhu động ruột Chúng cư ngụ và nhân lên trong ruột,

khóa chặt các vi trí thụ cảm và ngăn can sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh

như Escherichia coli, Salmonella, Campylobacteria Ngoài ưu thé cạnh tranh vi trí,Lactobacillus acidophilus trong quá trình sinh trưởng, phát triển sẽ cạnh tranhnguồn cơ chất quan trọng cho phát triển của các vi khuân có hại Khi tiêu thụmonosaccharide, Lactobacillus acidophilus đã cạnh tranh nguồn dinh dưỡng chính,ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn gây bệnh viêm đại trang Clostridiumdifficile, đồng thời bat hoạt thụ thé gây độc tố của chúng [18]

Cùng với cơ chế cạnh tranh loại trừ, Lactobacillus acidophilus cồn có hoạttính kháng khuân gây ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn có hại, tạo nên sự cân bằng hệsinh thái đường ruột Lactobacillus acidophilus có khả năng chỗng lại nhiều vikhuẩn gây bệnh khác nhau, tạo vòng kháng khuan từ 10mm đến 16mm và khả năngbên vững với 40 loại kháng sinh Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theonhiều cơ chế khác nhau như sản sinh ra các chất bacteriocin, làm giảm độ pH bởitạo ra các acid hữu cơ hay làm giảm độc tố Do bản chất protein, không gây độc vàdé dàng điều khiến bởi các enzyme phân hủy protein nên việc sử dụng bacteriocinan toàn hơn các kháng sinh tong hợp Đối với các sản phẩm thực phẩm, các

bacteriocin và các hợp chất tương tự bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus

acidophilus được xem là chất ức chế tự nhiên, được sử dụng để tăng thời hạn sửdụng của sản phẩm thay thế cho các chất bảo quản hóa học [19] Lactobacillusacidophilus có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn gây viêm loét dạ dày

Helicobacter pylori ca trong thí nghiệm in-vitro và in-vivo [20].

Trong quá trình sinh trưởng, phát triển trong ruột, Lactobacillus acidophilusgiúp tăng khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng, khử các chất có khả năng gây ung

11

thư, tong hop nhiéu loai vitamin thiét yếu, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng

khả năng dé kháng cho cơ thé vật chủ Trong một nghiên cứu ở những trẻ em bị tiêuchảy, Rotavirus nhân lên trong tế bào hình trụ, làm cho phân đỉnh của nhung mao bịbào mòn dẫn đến một phan màng nhay của ruột bi phá hủy Sử dung Lactobacillusacidophilus va Lactobacillus reuteri sẽ làm giảm một nua số trẻ em bị nhiễmRotavirus và giúp tăng cường hệ thống miễn dịch nhờ cảm ứng tao kháng théImmunoglobulin A (IgA) của cơ thé [4] Nhiều thí nghiệm được thực hiện bởi các

nhà nghiên cứu Hoa Ky đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có kha nănglàm giảm bệnh táo bón Lactobacillus acidophilus sẽ tăng cường hoạt động của các

protein liên kết giúp giảm sự hình thành các vết loét trên ruột Lactobacillusacidophilus cũng giúp giảm tác động của các tác nhân dị ứng lên cơ thể thông quacải thiện chức năng thành ruột, phân hủy chat gây di ứng, kích thích IgA [21]

Lactobacillus acidophilus ngoài các đặc tính có lợi của một probiotic điển

hình, chúng còn có các đặc tính đặc trưng riêng cho loài giúp cải thiện các bệnh lý

cơ thé Đối với những người thiếu men phân giải đường lactose, đặc biệt là trẻ sosinh và người cao tuổi, khi sử dụng sữa động vật và các sản phẩm từ sữa động vật,đường lactose không được tiêu hóa sẽ chuyển xuống ruột già dẫn đến hội chứng đaubung, day hơi và tiêu chảy Enzyme ÿ - galactosidase do Lactobacillus acidophilustạo ra, giúp phân giải lactose thành glucose va galactose, giúp người sử dung có thétiêu hóa và hấp thu được các dinh dưỡng từ sữa động vat [4] Nam 2010, Ismail vàcộng sự khi khảo sát sự ảnh hưởng của nguôn carbon lên quá trình tong hợp enzyme

lactase 6 Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS, hoạt tính enzyme lactasethu được khi su dung “acid whey” là 12.29U/g, “sweet whey” là 9.83U/g va lactosela 8.6U/g [22].

Cholesterol là thành phan quan trọng của màng tế bào và là tiền chat dé tonghợp vitamin D và nhiều loại hormone trong cơ thể Trong một ngày, trung bình cơthể người tổng hợp khoảng 8mg cholesterol và dùng 4mg cholesterol dé tổng hợpmuối mật, vì vậy, bất kì lượng cholesterol nào được đưa vào cơ thể cũng trở nên dưthừa và gây hại cho cơ thể Cholesterol dư thừa là nguyên nhân chính gây xơ vữađộng mạch vành, gây ra chứng dau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, suy tim và đột quy[23] Các Lactobacillus acidophilus có khả năng khử cholesterol trong co thé theo

cơ chế gan cholesterol lên mang tế bào, ức chế sự tạo thành cau trúc micellce củacholesterol, tiết enzyme thủy phân muối mật bile salt hydrolase, đồng thời kíchthích sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột khác cũng có khả năng khử

cholesterol Lactobacillus acidophilus va Lactobacillus casei giúp giảm cholesterol

trong co thé Lactobacillus acidophilus va Lactobacillus plantarum làm giảmcholesterol và tryglyceride trong máu và tăng cường hệ lợi khuẩn đường ruột [5].Chung Lactobacillus acidophilus K301 giúp điều chỉnh nồng độ mRNA và proteincủa các gen, làm giảm lượng cholesterol trong máu và mở ra tiềm năng điều trị cho

bệnh xơ vữa động mạch [23].

Đặc biệt, Lactobacillus acidophilus còn có khả năng tạo ra các chất kháng oxy

hóa là các polysaccharide ngoại bào, phản ứng với các tác nhân gây stress oxy hóa

trong cơ thể Các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillusacidophilus sẽ được trình bày cụ thé trong mục 1.4

Trong sản xuất các sản phẩm probiotic, việc lựa chọn chủng giống đóng vaitrò hết sức quan trọng nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng cảm quan tốt hoặc khônggây ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm Chủng probiotic phải có khả năng sốngsót qua quá trình sản xuất và 6n định trong quá trình bao quản sản phẩm Dé đượcthương mại hóa trong chế biến thực phẩm probiotic, các chủng vi khuẩnLactobacillus acidophilus phải đáp ứng các tiêu chuẩn probiotic của FAO [24] Batiêu chí cơ bản của quá trình sàng lọc chủng probiotic bao gôm tiêu chí an toàn, tiêuchí chức năng và tiêu chí kỹ thuật Lactobacillus acidophilus có nguồn gốc từngười, các thử nghiệm in-vitro va in-vivo cho kết quả an toàn cho người sử dụng[7] VỀ tiêu chí chức năng, Lactobacillus acidophilus sử dụng phải có khả năngchồng chịu điều kiện pH thấp của dịch dạ dày, nồng độ muối mật trong ruột non vàkhả năng kháng khuẩn Lượng probiotic cần có trong sản phẩm tai thời điểm tiêuthụ ít nhất là 10° CFU/ml đến 10’ CFU/ml dé đạt được những lợi ích cho sức khỏengười sử dụng Mật độ tế bao probiotic thỏa mãn theo tiêu chuẩn probiotic trong sảnphẩm sữa chua là 10° CFU/ml [25]

1.3 Quá trình oxy hóa va quá trình kháng oxy hóa trong cơ thể

Quá trình oxy hóa là phản ứng giữa nguyên tử oxy và các electron chưa ghép

cặp Các gốc tự do là các dẫn xuất dạng khử của oxy (ROS) và nito (RNS) Đây là

13

những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử có tính oxy hóa mạnh, có khả năng

phản ứng với nhiều hợp chất trong tế bào Các ROS thường gặp như anionsuperoxyde (O;), hydrogen peroxyde (H;O;), gốc hydroxyl (OH) và các RNSthường gặp như oxyde nitrice (NO), peroxynitrite (ONOO) là sản phẩm của cácquá trình chuyển hóa sinh học cơ bản của cơ thể Các ROS và RNS cũng được tạora từ các nguồn ngoại sinh là các hóa chất, khói thuốc, thuốc an thân hoặc các bức

xạ mặt trời [5, 26].

Trong cơ thể sinh vật, ROS và RNS được khống chế ở mức độ vừa phải nhờcác chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme (catalase, superoxyde dismutase,glutathione peroxydase, ) và các chất kháng oxy hóa không có bản chất enzyme(vitamin C, vitamin E, tocopherol, peroxidase) được bồ sung hoặc tạo ra từ hệ thốngkháng oxy hóa Hệ thong kháng oxy hóa trong cơ thé hoạt động theo bốn con đườnglà tạo phức làm mat khả năng xúc tác của các kim loại chuyển tiếp, làm gián đoạncác phản ứng lan truyền, làm giảm nông độ các ROS va RNS [26]

Stress oxy hóa là sự mat cân bang giữa quá trình oxy hóa va quá trình khángoxy hóa trong co thể Nguyên nhân có thé do các chất oxy hóa tăng cao, hệ thôngkháng oxy hóa suy giảm hoặc các tiền chất kháng oxy hóa nội sinh không đủ đápứng nhu cầu cơ thể Các ROS và RNS tăng vượt mức sẽ gây nên các quá trình thoáihóa tế bào như quá trình lipid màng tế bào, protein, enzyme và DNA Các tế bào vàmô bị tốn thương sẽ dẫn đến các bệnh lý như tiểu đường, béo phì, tim mạch, thoáihóa thần kinh, lão hóa và ung thư [27] Đối với hệ tiêu hóa nói riêng, các phản ứngoxy hóa khử liên tục gây ton thương niêm mac ruột, làm xuất hiện các triệu chứngviêm mãn tính như viêm loét da day, viêm đại trang, Mối liên hệ giữa stress oxyhóa và bệnh tật được trình bày tổng quát qua sơ đô hình 1.1 [5] Với điều kiện môitrường ngày càng ô nhiễm, các rỗi loạn chuyển hóa này sẽ ngày càng tăng, gây ảnh

hưởng lớn đền sức khỏe và chât lượng cuộc sông của con người.

Từ nhu cau cân bang chuyển hóa trong cơ thé, nhiều nghiên cứu và ứng dụng

chất kháng oxy hóa tổng hợp đã được thực hiện, tuy nhiên, chúng có một số tác

dụng phụ như nguy cơ tổn thương gan và tạo ra các chất ung thư Vì vậy, các hợpchất tự nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa, không gây hại cho cơ thể là định hướngphát triển cho việc ứng dụng chất kháng oxy hóa trong thực phẩm

Ỷ Ụ

Chất oxy hóa Enzyme kháng oxy Chất kháng oxy hóa

tăng cao hóa hoạt động kém mắt hoạt tính

x=

Vv

Cân bằngstress oxy hóa

| ’

Co thé khỏe BENH LYmanh

Hình 1.1 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh ly trong co thé.Chất kháng oxy hóa chiết xuất từ thực vật làm tăng khả năng kháng oxy hóacủa huyết tương và làm giảm nguy co mac một số bệnh như ung thư, tim mạch vađột quy [29] Tuy nhiên, chúng thường tôn tại dưới dạng liên kết với các phân tửkhác, vì vậy hoạt tính kháng oxy hóa không cao Nhiều công trình nghiên cứu đãcho thay quá trình lên men của Lactobacillus phân cắt các liên kết nay, qua đó hàmlượng hợp chất có tính kháng oxy hóa tăng lên Lactobacillus plantarum phân catliên kết glucoside giữa hợp chất phenolic và các phân tử đường, giải phóng các

phenolic tự do [5] Đậu nành lên men bởi Lactobacillus với enzyme

-galactosidase, thủy phân liên kết glucoside giữa isoflavone va phân tử đường, giảiphóng từ 83.9% đến 98.4% isoflavone làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa trong sanphẩm hơn so với sữa đậu nành không lên men [30]

Trong các sản phẩm lên men sữa, các Lactobacillus còn phân cắt các proteinsữa nhờ hoạt tinh enzyme protease, tạo thành các peptide ngăn có hoạt tính sinh họcnhư khả năng kháng khuẩn, giảm cholesterol, kích thích miễn dịch và hoạt tínhkháng oxy hóa [28] Các peptide ngắn khoảng 5 đến 11 amino acid ki nước, với tínhkhử cao, có thé loại bỏ các gốc tự do, bắt giữ các gốc lipid peroxyl và các ion kimloại [5] Vì vậy, khi lựa chọn chủng giống trong sản xuất sữa lên men, chủng

15

Lactobacillus có kha năng phân giải protein càng cao, càng giải phóng nhiều

peptide, giúp tăng hoạt tính kháng oxy hóa trong sữa [31].Ngoài ra, các Lactobacillus ngoài quá trình lên men đường tạo thành acid

lactic, chúng còn tong hợp nên các exopolysaccharides (EPS) có hoạt tinh khángoxy hóa EPS là các polysccharide ngoại bào, liên kết lỏng lẻo với bề mặt tế bàohoặc tiết ra môi trường bên ngoài, là rào chan giúp tế bào chống lại stress acid thấpnhờ giảm sự vận chuyên H” vào trong tế bào Các EPS này giúp nâng cao sức khỏenhư tăng lượng chất kháng oxy hóa nội sinh, cải thiện trí nhớ, ngăn chặn sự chết củacác tế bào đại thực bào và chống viêm [5, 32, 33]

Trong quá trình lên men, tùy thuộc vào vi sinh vật lựa chọn làm giống, thànhphan của môi trường tăng trưởng và các yếu tố tăng trưởng, điều kiện chế biến baogom nhiệt độ va thời gian lên men mà các EPS thu nhận được va hoạt tính khang

oxy hóa của chúng là khác nhau Cac chung Lactobacillus có họat tính kháng oxy

hóa cao như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

paracasei va Lactobacillus helveticus Hon hop EPS được thu nhận và tinh sạch sau

quá trình lên men cua Lactobacillus helveticus MB2-1 với don phan từ glucose,

galactose, mannose là khác nhau, đồng thời hoạt tinh kháng oxy hóa của chúng

cũng khác nhau, phụ thuộc vào từng giai đoạn lên men [5].

Những chat kháng oxy hóa được Lactobacillus tong hợp trong quá trình lênmen cho thay có tiềm năng của chúng trong việc nghiên cứu va thương mại hóa cácsản phẩm, thực phẩm chức năng giàu hoạt tính kháng oxy hóa

1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus

Hoạt tính kháng oxy hóa của các vi khuẩn Lactobacillus đã được nghiên cứutừ những năm dau thé ki 21 Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóacủa Lactobacillus acidophilus mới được quan tâm trong những năm gần đây

Năm 2011, tác giả Wu và cộng sự đã tiến hành lên men sữa gầy b6 sung dichchiết khoai lang tím (pomoea batalas) bang các chủng vi khuẩn lactic như

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii va Lactobacillus gasseri.

Khoai lang tím chứa nhiều dinh dưỡng cần cho cơ thé như vitamin, khoáng chat,chất xơ và đặc biệt là anthocyanin có hoạt tính kháng oxy hóa Hàm lượng

anthocyanin và hoạt tính kháng oxy hóa thu được sau lên men không những cao hơn

so với dịch chiết ban đầu mà đồng thời còn giúp ngăn chặn sự chết của các tế bàođại thực bào Nghiên cứu này đã cho thay tiềm năng dé phát triển các sản phẩm thựcphẩm chức năng khác nhau từ sữa lên men [33 |

Năm 2012, tác giả Zubaidah và cộng sự khi tiếp tục các nghiên cứu từ năm2010 đã tiến hành so sánh hoạt tính kháng oxy hóa trong cám gạo và sữa tách béo

lên men bởi Lactobacillus plantarum B2, Lactobacillus plantarum ]2, Lactobacillus

acidophilus và Lactobacillus casei Kết quả cho thay, cả bốn chủng vi khuẩn LABđều giúp tăng hoạt động kháng oxy hóa trong các sản phẩm lên men Trong đó, hoạt

tính khang oxy hóa trong sữa tách béo lên men sử dung Lactobacillus acidophilus

là 30.42% tăng cao hon Lactobacillus plantarum B2 là 2S.48%, sử dụngLactobacillus casei tăng cao hon Lactobacillus plantarum J2 tương ứng là 30.13%va 29.19% [34, 35].

Cũng trong năm 2012, một thử nghiệm ngẫu nhiên, độc lập của Ejtahed va

cộng sự được tiễn hành trên những bệnh nhân bị bệnh tiểu đường type 2 được sửdụng sữa chua bé sung Lactobacillus acidophilus so với nhóm đỗi chứng chỉ đượcsử dụng sữa chua thông thường Kết quả sau sáu tuần, bệnh nhân sử dụng sữa chua

Lactobacillus acidophilus đã giảm hàm lượng glucose trong máu, tăng hoạt độngcủa enzyme superoxide dismutase va glutathione peroxidase hơn so với nhóm cònlại Probiotic đóng vai trò thực sự quan trọng trong hoạt động khang oxy hóa của cơ

Cũng trong năm 2013 này, tác giả Amdekar và cộng sự đã tiến hành nghiên

cứu lâm sàng trên chuột, nhăm đánh giá khả năng chông viêm của các EPS sinh ra

17

bởi Lactobacillus casei va Lactobacillus acidophilus Hoạt tính kháng oxy hóa tu

hai chủng vi khuẩn này giúp giảm stress oxy hóa trong hoạt dịch (p<0,0001), giảmsố điểm viêm khớp (p<0.05) và chéng lại các collagen gây ra viêm khớp (p<0.05)hiệu quả hơn so với sử dụng thuốc chống viêm Indomethacin [32]

Năm 2014, nghiên cứu của Ghany và cộng sự được tiễn hành để đánh giá hoạttính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus trong việc chỗng ung thư biểu môEhrlich Ascites Carcinoma (EAC) Các hop chat EPS hóa học va EPS củaLactobacillus acidophilus cho kết quả tương đương trong việc ức chế sự tăng sinhcủa các tế bào EAC Với 700ug/mI EPS bố sung, khả năng xâm nhập của EPS trongcả hai trường hợp vào các dòng tế bào EAC là tương đương (99% và 93%) EPSđược sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus cho thay hiệu quả chống ung thư mạnhmẽ trong cơ thé [13]

Nhiều nghiên cứu ứng dụng hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillusacidophilus trong thực phẩm được tiến hành trong năm 2015 Papademas và cộngsự trong nghiên cứu so sánh khả năng probiotic của hai chủng vi khuẩn trong lênmen sữa, kết quả cho thay Lactobacillus acidophilus tạo vòng kháng khuẩn đối vớiSalmonella typhimurium lớn hơn Lactobacillus fermentum Đồng thời, sau 24 gid,hoạt tinh kháng oxy hóa khi lên men sữa bang Lactobacillus acidophilus (65 4 + 4.7

umol/ml) cao hon Lactobacillus fermentum (46.0 + 5.1 umol/ml) [38].

Năm 2015, Low cùng cộng sự nghiên cứu đánh giá chat lượng, hoạt tính khángoxy hóa của kem probiotic Lactobacillus acidophilus được làm băng đường tinhluyện sucrose và đường chưa tinh luyện fructose ở nồng độ 15%, 18% và 21%(w/w) Kem đường fructose 18% cho kha năng song sot cua Lactobacillusacidophilus cao nhất Hoạt tính kháng oxy hóa của kem đường fructose có xu

hướng cao hơn so với kem đường sucrose Tuy nhiên, không có sự khác biệt cảmquan giữa kem probiotic với các mức đường khác nhau [39].

Năm 2016, tác giả Hougaard và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp

chất polyphenolic va peptide lên sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillusacidophilus khi nuôi cay trên môi trường Brain - Heart - Infusion và de Man -Rogosa - Sharpe Kết quả khi b6 sung các chất kháng oxy hóa giúp giảm hình thành

các gốc tự do, thúc đây sự phát triển và tăng hoạt tính probiotic của vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus [40].

Từ tiềm năng kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus, nhiều nghiên cứuđã được thực hiện nhằm tăng hiệu suất thu EPS và hoạt tính kháng oxy hóa củaEPS Trong nghiên cứu của Qi Liu năm 2016, một chủng đột biến Lactobacillusacidophilus có hàm lượng EPS cao được sàng lọc băng đột biến hóa học (0.2%diethyl sulfate) Các điều kiện nuôi cay là 0.6ml/I Tween 80, dipotassium hydrogenphosphate 3.6g/I và tratodium citrate 4.1 g/l, năng suất EPS tối đa thu được là 3.96 +0.08g/1 Các điều kiện khai thác là nồng độ cồn 70%, tỷ lệ thu hồi 1:3.6 và thời gianchiết 31 giờ, năng suất chiết EPS tối đa là 1.48 + 0.23g/1 Sau quá trình tối ưu, EPScủa các chủng đột biến đạt 5.12 + 0.73 g/l, cao hon 3.8 lần so với đối chứng chỉ đạt1.05 + 0.06g/1 [41] Các kết quả đã chỉ ra răng, quá trình sàng lọc và tối ưu giúptăng đáng kế sản lượng EPS, hứu hẹn một quy mô công nghiệp lớn hơn

Năm 2016, tác giả Nazari cùng cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa

nội bào và ngoại bào của Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp khử Fe”.Kết quả cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của Lactobacillus acidophilus tăng dangkế sau 24 và 72 giờ, giúp hạn chế các tốn thương tế bào do stress oxy hóa [42]

Cũng trong năm này, Deepak và cộng sự đã chứng minh các EPS thu nhận từ

Lactobacillus acidophilus có khả năng ức ché sự phát triển của các tế bào ung thu

trực trang [1].

Nam 2017, két qua nghiên cứu cua Jianmin và cộng su đã thu được ham lượng

IgA, hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính cua superoxide dismutase trong niềm mac

ruột, huyết thanh va gan của nhóm gà nuôi uống Lactobacillus acidophilus tăng lênđáng ké so với nhóm còn lại (p<0.05) Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có thểtăng cường chức năng miễn dịch của đường ruột và khả năng kháng oxy hóa của gà

nuối [43].

Đến nay, các nghiên cứu đã đi sâu hơn vào việc so sánh hoạt tính kháng oxyhóa của Lactobacillus acidophilus với các chủng vi khuẩn khác trong từng sảnphẩm thực phẩm Tháng 1 năm 2018, Ronghao Chen đã tiễn hành các thí nghiệmxác định những thay đổi của sản phẩm, đặc biệt là hoạt tính kháng oxy hóa trong

quá trình lên men nước ép đu đủ cua hai chung Lactobacillus acidophilus và

19

Lactobacillus plantarum Nước ép sau lên men bang hai chủng vi khuẩn này cónhững thay đổi tương tự về pH và hàm lượng đường sau 48 giờ Một lượng lớn cáchợp chất thơm và acid hữu cơ được tạo ra, đặc biệt là acid lactic tương ứng là543.18mg/100ml và 571.29mg/100ml Những kết quả phân tích hoạt tính kháng oxyhóa theo bốn phương pháp cho thấy quá trình lên men nước ép đu đủ bangLactobacillus acidophilus va Lactobacillus plantarum có thé cải thiện dinh dưỡng

và hiệu quả sử dụng của san phầm [44].

Tháng 2 năm 2018, Padghan va cộng sự đã bồ sung sữa chua Dahi NCDC-167(BD4) và sữa chua kết hợp Dahi NCDC-167 (BD4), Lactobacillus acidophilusNCDC-15 trong chế độ ăn của chuột bach tạng Kết qua cho thay, các enzymekháng oxy hóa trong chuột tăng Đông thời, hiệu quả kháng oxy hóa của sữa chuasử dung Lactobacillus acidophilus cao hơn nhiều so với sữa chua chỉ sử dung Dahi

NCDC-167 (BDA4) [45].

Tóm lai, sự mat cân bằng oxy hóa là nguyên nhân gây ra các bệnh lý trong cơthé Các vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là Lactobacillus có vai trò quan trọng trongviệc chong lại quá trình oxy hóa và tăng cường hệ miễn dịch cơ thé Vi khuẩnLactobacillus acidophilus là vi khuẩn probiotic thông dung trong lên men thựcphẩm, cải thiện dinh dưỡng và hiệu quả sử dụng của thực phẩm Các vì khuẩn nàycó khả năng sinh chất kháng oxy ngoại bào, hoạt tính kháng oxy hóa tương tự chấtkháng oxy hóa tổng hợp, có phan hiệu quả và an toàn hon trong việc giảm stressoxy hóa, ức chế tế bào ung thư, kháng khuẩn và chong viêm Ngoài ra, các chấtkháng oxy hóa trong môi trường nuôi cấy giúp thúc day sự phát triển và tăng cườngcác hoạt tính probiotic của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Các sản phẩm từ sữa, đặc biệt là sữa chua đã trở thành thực phẩm bồ sungthông dung trong bữa ăn hang ngày bởi những lợi ích toàn diện cho sức khỏe.Lactobacillus acidophilus là giống khởi động đã được dùng trong sản xuất sữachua theo quy mô công nghiệp Lactobacillus acidophilus cho thấy tiềm năng trongsử dụng làm giống khởi động quá trình lên men tạo thực phẩm chức năng probiotic

giàu hoạt tính kháng oxy hóa.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Các khảo sát được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộcbộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa -

Đại học Quốc gia thành phố Hỗ Chí Minh.Thời gian thực hiện thí nghiệm từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017.2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gdm bộ bốn chủng vi khuẩn Lactobacillusacidophilus (BK1, BK2, BK3 và BK4) có nguồn gốc từ giống vi sinh vật chuẩn

thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Dai học Bach

khoa - Dai học Quốc gia thành phố Hỗ Chí Minh.2.3 Vật liệu và hóa chất

2.3.1 Dung cu và thiết bịCác dụng cụ thí nghiệm vi sinh phổ biến trong phòng thí nghiệm được sử dụngnhư ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, que cấy vòng, que cấy trải, cốc thủy tỉnh, bìnhtam giác, ống dong, pipet và pipetman

Các thiết bị phục vụ nghiên cứu bao gồm:- Bé điều nhiệt Sanofi aventis BHS - 2

- Can điện tu Sartorius CP 2202 S và Boeco

- _ Kính hién vi quang hoc Olympus- May do quang pho CT - 2200 Spectroiphotometer- _ Máy lắc ôn nhiệt Stuart SI 150

- May ly tâm Hettich zentrifugen Mikro 22 R

- May phá vỡ tế bao bang siêu âm- _ Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV85- _ pH kế Eutech instruments pH 510- Tu ấm Incucell/ CO; incubator/ Mco - 18Aic- Tủ cấy vô trùng cấp 2

- _ Tủ sấy Memmert

21

2.3.2 Hóa chấtCác hóa chất phục vụ nghiên cứu bao gồm:- _ Hóa chất nhuộm Gram gém crystal violet, lugol, alcohol 90% và fucshin.- Hóa chat dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng khử cholesterol của

Lactobacillus acidophilus gom KOH 33%, ethanol 95%, hexane, nước cấthai lần, 0 - phthalaldehyde va H2SOx

- Hóa chat dùng trong thí nghiệm khảo sát kha năng sinh acid lactic củaLactobacillus acidophilus gồm NaOH 0.2N (8g NaOH trong 1000ml nướccất hai lần) và phenolphtalein 1% (0.01g phenolphtalein trong 10ml ethanol

+ Sắt (III) clorua 0.1% (1.67g FeCl;.6H2O trong 1000ml nước cất hai lần).+ Acid ascorbic sigma 1.5% (0.015g CeHgO¢ trong Iml nước cất hai lần).- Hóa chất dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng khử gốc tự do của

Lactobacillus acidophilus bao gồm:

trong 15 phút và bao quản ở nhiệt độ phòng, thời gian sử dụng trong vòng 14 ngày.

[MT01] Môi trường MRS - Broth dùng để nhân giống, nuôi cấy và khảo sát

Lactobacillus acidophilus.

Pepton 10g (NH¿)sC¿H:O> 2gil

Cao thịt I0g1 MgSOx.7H¿O 0.2g/

Cao nam men Sg/l MnSOx.4H¿O 0.05g1

Glucose I0g1 Tween 80 Iml

K,HPO, 2¢/I Nước cất 1000ml

Lactobacillus acidophilus.

Cholesterol 100g¢/I [MTO1] 1000ml

Muối mật 3g/1 pH 2.0[MT06] Môi trường Nutrient Broth dùng dé tăng sinh và nuôi cây Bacillus cereus

ATCC 11778.

Cao thịt I.5g1 NaCl Sg/l

Cao nam men 1 5Sg/l Nước cất I1000ml

Pepton 5ø] pH 74

[MT07] Môi trường Nutrient Broth - Agar dùng dé khảo sát hoạt tính kháng khuẩncủa Lactobacillus acidophilus và giữ giỗng Bacillus cereus ATCC 11778, thànhphan tương tự như [MT06], bố sung 15% agar

23

[MT08] Môi trường Lysogeny Broth dé tăng sinh và nuôi cay Escherichia coli

[MT10] Môi trường sữa tươi tiệt trùng Vinamilk dùng dé lên men tạo san phẩm sữa

chua bởi Lactobacillus acidophilus.

2.4 Phương pháp nghiền cứu

Các thí nghiệm trong dé tài được bé trí tổng quát theo sơ đồ hình 2.1

Khao sát đặc tính sinh học

Cette us acidophilus

Tuyén chon `4Sang lọc hoạt tinh probiotic

Sang loc hoat tinh khang oxy hoa

\

Tối ưu hóa sinh khối và hoạt tinh Sang lọc yêu tô chính

kháng oxy hóa

Tối ưu hóa hai hàm mục tiêu

Sản phâm sữa chua Đánh giá ôn định chất lượng sản pham

giàu hoạt tính kháng oxy hogsữa chua giàu hoạt tính kháng oxy hóa

Hình 2.1 Sơ đồ bồ trí thí nghiệm tổng quát

2.4.1 Khảo sát các đặc tính của Lactobacillus acidophilus2.4.1.1 Khao sát đặc tinh sinh hoc

Mục đích khảo sát đặc tính sinh hoc dé kiểm tra tính thuần va hình dang vikhuẩn, khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó lựa chon thời điểm thunhận sinh khối cao nhất cho quá trình lên men

a Quan sát đại thểNguyên tắc: Vi khuẩn LAB khi phát triển trong môi trường MRS sẽ hình thànhcác dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài

Tiến hành thí nghiệm: Lactobacillus acidophilus được nuôi cây trong [MT0I],ủ ở nhiệt độ 37C trong 48 giờ, quan sát và nhận xét các đặc điểm hình thái, màusắc, kích thước, tinh chất bé mặt của khuẩn lac, chọn lọc khuẩn lạc đặc trưng

b Quan sát vi thểNguyên tắc: Quan sát tế bào vi khuẩn theo phương pháp nhuộm Gram của

Hans Christan Gram (1884) [8].

Tiến hành thí nghiệm: Lactobacillus acidophilus được nuôi cấy trong ốngnghiệm chứa [MTO1], ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ, cố định vết bôi vi khuẩn vànhuộm thuốc nhuộm theo thứ tự gentian, lugol, rửa bang alcohol 90° va nhuộmfucshin, quan sát tiêu bản với vật kính dầu x100 và ghi nhận khả năng bat màuGram của vi khuẩn

c Khảo sát đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus

Nguyên tac: Quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật ở điều kiện nuôicấy tĩnh gdm bốn pha là pha lag, pha log, pha cân bang và pha suy vong Trong lên

men, tùy mục đích sử dụng đê lựa chọn thời diém ngưng nuôi cây vi sinh vat.

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thé tích cây 10% trong ống nghiệmchứa 10ml [MTO1], ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thé tích cay

10% trong bình tam giác chứa 100ml [MT0I], ủ ở nhiệt độ 37°C, đo mật độ quang

ODa¡o sau mỗi 2 giờ Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị mật độ quangOD,¡o và mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml)) Từ đó suy ra mat độ vi khuẩn (log

25

(CFU/ml)) tương ứng với giá trị mật độ quang ODa¡o tại mỗi thời điểm, vẽ đường

cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus [42].

Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban dau từ số liệu của độ pha loãng D;

được tính theo công thức sau:

Ệ FU ) — 4¡.D;

mi) VTrong do: A; là số khuẩn lạc trung bình trên ba dia Petri

D, là độ pha loãng thứ i

V là thé tích (ml) dịch nuôi cây được cây vào mỗi đĩa Petri

2.4.1.2 Sang lọc hoạt tinh probiotic

Muc dich sang loc hoat tinh probiotic dé kiém tra kha năng chịu đựng môitrường acid da dày, nông độ muối mật trong ruột non, nồng độ cholesterol, khả năngsinh acid lactic và khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh đường ruột của các chủngLactobacillus acidophilus, từ đó lựa chọn chủng vi khuẩn cho các thí nghiệm sau

a Khao sát kha năng chịu môi trưởng acid da day nhân tạo (SG)

Nguyên tắc: Theo phương pháp của Zhou va cộng sự (2009) [43], dựa vào khanăng chịu pH thấp va khả năng tôn tại sau thời gian tiêu hóa ở dạ dày của các chủng

Lactobacillus acidophilus.

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thé tích cấy 10% trong ống nghiệmchứa 10ml [MTO1], ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thé tích cay

10% trong bình tam giác chứa 50ml [MT03], ủ ở nhiệt độ 37°C, đo mật độ quang

ODạ¡o tại các thời điểm 0 phút, 30 phút, 60 phút và 90 phút Mẫu đối chứng là 10%vi khuẩn trong 50ml [MTOI]

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml)).b Khao sát kha năng chịu nong độ mudi mật 0.3% (SIF)Nguyên tắc: Theo phương pháp của Shokryazdan và cộng sự (2014) [47], duavào khả năng chịu muối mật va khả năng ton tại sau thời gian tiêu hóa ở ruột noncủa các chủng Lactobacillus acidophilus Vi khuân di chuyên trong hệ tiêu hóa từ

da dày đến ruột non, là nhưng nơi có pH thấp, vì vậy, thí nghiệm này được thiết kế

ở pH thấp nhằm mô phỏng gan với môi trường thực tế.Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thé tích cấy 10% trong ống nghiệmchứa 10ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thể tích cay10% trong ống nghiệm chứa 10ml [MT04], ủ ở nhiệt độ 37°C, đo mật độ quangODạ¡o tại các thời điểm 0 giờ, 2 giờ và 4 gid Mẫu đối chứng là 10% vi khuẩn trong

50ml [MTOII.

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn (log (CFU/ml))

c Khao sát kha năng khứ cholesterol

Nguyên tac: Theo phương pháp của Noh và cộng sự (1997) [48], định lượng

cholesterol còn lại trong môi trường và khả năng sông sót của vi khuân.

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thể tích cấy 10% trong ống nghiệmchứa 10ml [MT01], ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thé tích cấy10% trong ông nghiệm chứa 10ml [MT05] ở nhiệt độ 37°C trong 150 phút Ly tâmdịch nuôi cây 4000 vòng trong 20 phút U 1ml dich ly tâm với ImlI KOH 33% và2ml ethanol ở nhiệt độ 60°C trong 15 phút BO sung 3ml hexane, vortex Tiếp tụcthêm 2ml nước cất, vortex Hòa tan Iml lớp hexane vào 2ml 0-phthalaldehyde trong10 phút, thêm 0.5ml H;SO¿, vortex Mẫu đối chứng là môi trường [MT05] khôngchứa vi khuẩn Do mật độ quang OlDszo nm

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng cholesterol (ug/ml) trong môi trường và mật độ

vi khuẩn (log (CFU/ml)).d Khảo sát hoạt tính kháng khuẩnNguyên tắc: Theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Papademas vàcộng sự (2015) [38], hoạt tính ức chế vi khuẩn chỉ thị của các chung probiotic đượcbiểu hiện khi đường kính vòng vô khuẩn rộng từ 2mm so với lỗ thạch

Tiến hành thí nghiệm: Cay 10% giống trong ống nghiệm chứa 10ml [MTO1], ủở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Trải 1001 Bacillus cereus ATCC 11778 nuôi cây 12giờ trên dia Petri chứa 15ml [MTO7], đục giếng thạch đường kính 5mm Bồ sung50/1 giỗng Lactobacillus acidophilus vào giéng thạch, ủ ở nhiệt độ 4°C trong 15

27

phút dé dịch huyền phù tế bào khuếch tán trong giếng và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24giờ dé vi khuẩn phát triển Tiền hành tương tự với Escherichia coli ATCC 8739 trênđĩa Petri chứa 15ml [MT09] Mẫu đối chứng là [MTO1] không chứa vi khuẩn.

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng vô khuẩn xuất hiện xung quanh giếng

thạch D — d (mm).

e Khao sát kha năng sinh acid lactic

Nguyên tac: Theo phương pháp chuẩn độ Thorner [44], dựa vào phan ứng giữaacid lactic va dung dịch NaOH 0.2N, làm đổi màu thuốc thử phenolphthalein 1% từkhông mau sang mau hồng nhạt

Tiến hành thí nghiệm: Nhân giống cấp 1, thé tích cây 10% trong ống nghiệmchứa 10ml [MTO1], ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Nhân giống cấp 2, thé tích cay

10% trong bình tam giác chứa 100ml [MTO1], ủ ở nhiệt độ 37°C Pha loãng 10ml

giống trong 20ml nước cất hai lần, thêm 1 — 2 giọt phenolphthalein 1%, tiễn hànhchuẩn độ băng dung dịch NaOH 0.2N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bềntrong 1 phút Mẫu đối chứng là [MT01] không chứa vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng acid lactic trong môi trường (3a), được tính

băng độ Thorner (°T) theo công thức sau:

»a = (V — W).0.9

Trong đó: V là số mililit NaOH 0.1N dùng dé trung hòa 10ml dịch nuôi cay

V, là số mililit NaOH 0.1N dùng để trung hòa 10ml dịch đối chứng

2.4.1.3 Sang lọc hoạt tính kháng oxy hóaMục đích: Hoạt tính kháng oxy hóa sẽ được xác định thông qua khả năng khử

ion Fe”” trong phân tử K;[Fe(CN),] và khử ion H* trong gốc tự do DPPH Từ đó,lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng oxy hóa cao cho các thí nghiệm tiếp

theo.

a Xác định tong năng lực khửNguyên tắc: Theo phương pháp của Lee-Wen Chang và cộng sự (2002), nănglực khử tỉ lệ thuận với độ hấp thu anh sang [49]