Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phát hiện và mô tả các gen mã hóa cassiicolin trên các chủng Corynes pora cassiicola (Berk&Curt.) Wei. phân lập tại Việt Nam

- Đánh giá tính gây độc nấm Corynespora cassiicola có độc tố cassiicolin và không có độc tố cassiicolin trên một số dòng vô tính DVT cao su nhóm 1 trong cơ cấu giống cao su 2015-2020 ở

-

VĂN THỊ MỸ LINH

PHÁT HIỆN VÀ MÔ TẢ CÁC GEN MÃ HOÁ cassiicolin

TRÊN CÁC CHỦNG Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei

PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2018

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bảo Quốc

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Thuý Hương

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Lương Thị Mỹ Ngân

Luận văn thạc sỹ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học

Thành phần hội đồng đánh giá Luận văn thạc sỹ gồm: 1 PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

2 PGS.TS Nguyễn Thuý Hương 3 TS Lương Thị Mỹ Ngân 4 TS Phan Thị Huyền 5 TS Hoàng Mỹ Dung Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Phát hiện và mô tả các gen mã hoá Cassiicolin trên các chủng Corynespora

cassiicola (Berk & Curt.) Wei phân lập tại Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định và phân nhóm gen mã hoá cassiicolin trên các chủng phân lập tại Việt Nam

- Đánh giá tính gây độc nấm Corynespora cassiicola có độc tố cassiicolin và

không có độc tố cassiicolin trên một số dòng vô tính (DVT) cao su nhóm 1 trong cơ cấu giống cao su 2015-2020 ở Việt Nam và xác định tính kháng bệnh của một số dòng vô tính cao su

- Xác định khả năng lây nhiễm chéo của 2 mẫu nấm Corynespora cassiicola phân lập từ cao su có độc tố cassiicolin và không có độc tố cassiicolin trên cây

đu đủ, cà chua và cây khoai mì

Nội dung nghiên cứu

- Ly trích DNA nấm Corynespora cassiicola

- Nhận biết các nhóm độc tố gen cassiicola bằng qui trình chạy PCR phát hiện gen cas

- Phân nhóm các gen mã hóa cassiicolin từ mẫu nấm phân lập và vẽ cây phát sinh loài

- Chủng bệnh bằng 2 mẫu nấm Corynespora cassiicola có độc tố cassiicolin và

không có độc tố cassiicolin phân lập từ cây cây cao su lên 7 dòng vô tính (DVT) cao su nhóm 1 trong cơ cấu giống cao su 2015-2020 ở Việt Nam và 3 cây ký chủ khác là khoai mì, đu đủ, cà chua bằng phương pháp lá tách rời

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 26/02/2018 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2018 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Bảo Quốc

Tp HCM, ngày 21 tháng 7 năm

TRƯỞNG KHOA

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Tp HCM đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi nói riêng và các bạn cùng thực hiện luận văn trong suốt thời gian thực hiện Luận văn tại Phòng thí nghiệm Bệnh học Người - Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tp Hồ Chí Minh, ngày 21tháng 7 năm 2018

Văn Thị Mỹ Linh

TÓM TẮT

Đề tài “Phát hiện và mô tả các gen mã hoá Cassiicolin trên các chủng

Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei phân lập tại Việt Nam với mục tiêu

nghiên cứu là xác định và phân nhóm gen mã hoá cassiicolin trên các chủng phân lập

tại Việt Nam, đánh giá tính gây độc nấm Corynespora cassiicola có và không có độc

tố cassiicolin trên một số dòng vô tính (DVT) cao su ở Việt Nam và xác định khả năng

lây nhiễm chéo của 2 mẫu nấm Corynespora cassiicola phân lập từ cao su có và

không có độc tố cassiicolin trên cây đu đủ, cà chua và cây khoai mì

CoryBT07, CoryDN22, CoryLK01, CoryQN01 mang gen cas mã hóa cho protein độc

tố cassiicolin và thuộc nhóm tương đồng gen cas2, 34 chủng phân lập còn lại thuộc

nhóm cas0 (không phát hiện gen cas) Chủng phân lập C cassiicola đại diện cho nhóm có gen cas2 là CoryQN01 và nhóm không phát hiện gen cas2 là CoryLK10 được đánh giá khả năng gây bệnh trên lá

đều gây bệnh trên 7 DVT cao su ở mức độ khác nhau tùy thuộc vào mức độ mẫn cảm của DVT, cả hai MPL đều có khả năng gây bệnh ở mức nặng trên DVT RRIV124 Cả 2 MPL có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh trên cây ký chủ khác là cây đu đủ, cà chua và khoa mì trong đó lá khoai mì nhiễm nặng hơn lá đu đủ và cà chua, có lẽ sự lây nhiễm chéo của các MPL trên cao su đối với cây trồng khác phụ thuộc vào khả năng xâm nhiễm của chủng nấm và độ mẫn cảm của cây ký chủ

Mặt khác kết quả chủng bệnh bằng mẫu phân lập CoryQN01 có diện tích vết bệnh (DTVB) cao hơn so với mẫu phân lập CoryLK10 cho thấy mẫu phân lập

CoryQN01 có có mức độ gây bệnh nặng hơn CoryLK01 trên các dòng vô tính và 3

cây ký chủ khác do đó có thể kết luận khả năng xâm nhiễm và gây bệnh của MPL

CoryQN01cao hơn so với MPL CoryLK10 do đó có liên quan đến sự hiện diện của

độc tố cassiicolin, chủng chứa độc tố gây bệnh nặng hơn chủng không có độc tố này

ABSTRACT

A study entitled "Detection and characterization of cassiicolin encoding genes

on Corynespora cassiicola strains (Berk & Curt.), Wei isolated in Vietnam" to

identify and classify genes encoding cassiicolin on isolates in Vietnam as well as to

evaluate fungal virulence from C.cassiicola isolates with and wothour cas2 gene on

some rubber clones and non-hosts such as papaya, tomato and cassava

The results of this study showed that there were 6 C.cassiicola isolates including CoryDC01, CoryKT01, CoryBT07, CoryDN22, CoryLK01, CoryQN01

having cas2 gene but not in other maintaining fungal isolates (cas 0) by using PCR and

phylogenetic analyses For the analysis of fungal virulence, two C.cassiicola isolates

with and without cas2 were used for detached leaf assays on selected rubber clones and non-hosts (papaya, tomato and cassava) Although various levels of fungal

virulence were observed on rubber clones and non-hosts, fungal isolate CoryQN01 was capable of causing disease index more than that of CoryLK10 Particularly,

RRIV124 showed the most sensitive to both fungal isolates incicating that this clone

was susceptible with C.cassiicola in comparison with other rubber clones

Additionally, both fungal isolates can cause the disease on non-hosts of which the serious disease index was observed in cassava more than that in papaya and tomato indicating those fungal isolates were not specific in rubber trees and depending on other mechanisms of fungal infection The comparison of fungal virulence between

CoryQN01 and CoryLK01 indicated that C.cassicola isolate with cas 2 gene can cause

the disease more than that of isolate without cas 2 indicating an important role of

cassiicolin gene in the fungal pathogenicity of C.cassiicola isolates in the rubber tree

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả

Văn Thị Mỹ Linh

Mục tiêu nghiên cứu 3

Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây cao su (Hevea Brasiliensis Mull Arg.) 4

1.1.1 Cây cao su và tầm quan trọng 4

1.1.2 Tình hình sâu bệnh hại trên cây cao su 5

1.2 Bệnh rụng lá cao su do nấm Corynespora cassiicola trên thế giới và Việt Nam 5 1.3 Sơ lược về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) C.T Wei 1950 9

1.3.1 Triệu chứng bệnh 9

1.3.2 Phân loại 10

1.3.3 Đặc điểm nấm Corynespora cassiicola 11

1.4 Độc tố cassiicolin do Corynespora cassiicola tiết ra 15

1.5 Tình hình nghiên cứu về C cassiicola trong và ngoài nước 18

1.5.1 Những nghiên cứu vế C cassiicola ngoài nước 18

1.5.2 Những nghiên cứu về C cassiicola trong nước 19

1.6 Phương pháp RT-PCR 20

1.7 Vai trò của vùng rDNA-ITS trong nghiên cứu đa dạng di truyền 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 22

2.2.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp ly trích DNA 27

2.3.2 Phương pháp PCR phát hiện gen cas 29

2.3.3 Phương pháp chủng bệnh Corynespora cassiicola trên lá cao su, đu đủ, khoai mì, cà chua tách rời 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết quả ly trích DNA từ các mẫu nấm 35

3.2 Kết quả PCR phát hiện gen cas của các chủng nấm Corynespora cassiicola 36

3.3 Kết quả chủng bệnh corynespora cassiicola trên lá cao su, đu đủ, cà chua, khoai mì tách rời 45

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 63

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

: kilobase : Mẫu phân lập

Hình 1.4 Hình thái nấm Corynespora cassiicola 12

Hình 1.5.Trình tự amino acid của các tương đồng của protein cassicolin Trình

tự cassolin trưởng thành được in đậm, trình tự tín hiệu được gạch chân [23] 17

Hình 1.6 Vị trí nhân bản và đặc tính của gen cassiicoline [37] 17 Hình 2.1 Những con số trên bản đồ tương ứng với số thứ tự nguồn nấm ở bảng 3.1

Hình 3.1 Kết quả điện di trên gel agarose phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp

primer ITS1-ITS4 với các mẫu được đánh số 1-16 lần lượt là vị trí của các chủng 36

Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp

primer F1-R1CasU3-4-5 với các mẫu được đánh số 1-8 lần lượt là vị trí của các chủng 38

Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp

primer F1-R1CasU1-2-6 với các mẫu được đánh số 1-10 lần lượt là vị trí của các chủng 40

Hình 3.4 Kết quả điện di trên gel agarose phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp

primer F18-R27 với các mẫu được đánh số 8 lần lượt là vị trí của các chủng: DC01; 2-LK01; 3-DN22; 4-BT07; 5-KT01; 6-QN01; 7-LK03; 8-LK04 Trong đó 1-6 là các mẫu có xuất hiện band chuyên biệt khi thực hiện PCR với cặp primer F1-R1CasU1-2-6; 7-8 là các mẫu đối chứng âm 41

1-Hình 3.5 Kết quả điện di trên gel agarose phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp

primer F18-R27 với các mẫu được đánh số 8 lần lượt là vị trí của các chủng: DC01; 2-LK01; 3-DN22; 4-BT07; 5-KT01; 6-QN01; 7-LK03; 8-LK04 Trong đó 1-6 là các mẫu có xuất hiện band chuyên biệt khi thực hiện PCR với cặp primer F1-R1CasU1-2-6; 7-8 là các mẫu đối chứng âm 41

1-Hình 3.6 Kết quả điện di trên gel agarose phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp

primer F18-R27 với các mẫu được đánh số 8 lần lượt là vị trí của các chủng: DC01; 2-LK01; 3-DN22; 4-BT07; 5-KT01; 6-QN01; 7-LK03; 8-LK04 Trong đó 1-6 là các mẫu có xuất hiện band chuyên biệt khi thực hiện PCR với cặp primer F1-R1CasU1-2-6; 7-8 là các mẫu đối chứng âm 42

1-Hình 3.7 Kết quả giải trình tự gen cas2 chủng CoryBT07 bởi dịch vụ vụ của Hãng 1st

Base (Singapore) 43

Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh các trình tự gen mã

hóa cho các tương đồng gen cas Chỉ số bootstrap được chú thích trên mỗi nhánh

44

Hình 3.9 Mức xâm nhiễm và gây bệnh của MPL CoryLK10 trên lá của một số DVT

cao su, đu đủ, khoai mì và cà chua ở điều kiện phòng thí nghiệm tại ngày thứ 5 bằng phương pháp lá cắt rời phương pháp lá cắt rời 48

Hình 3.10 Mức xâm nhiễm và gây bệnh của MPL CoryLK10 trên lá của một số DVT

cao su, đu đủ, khoai mì và cà chua ở điều kiện phòng thí nghiệm tại ngày thứ 5 bằng phương pháp lá cắt rời 49

Hình 3.11 Đánh giá cấp bệnh khi gây nhiễm C Cassiicola trên lá cao su tách

rời 51

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ diện tích vết bệnh theo ngày gây nhiễm chủng CoryLK0l 46 Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ diện tích vết bệnh theo ngày gây nhiễm chủng CoryQN0l 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các mẫu nấm Corynespora Cassiicola sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với mồi ITS1-ITS 28

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với mồi ITS1-ITS4 28

Bảng 2.4 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 2.5 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR phát hiện gen cas 30

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát hiện gen cas 30

Bảng 2.7 Accession number các trình tự DNA của các dạng tương đồng gen cas 31

Bảng 2.8 Bảng ghi nhận cấp bệnh khi chủng bệnh 33

Bảng 3.1 Đánh giá cấp bệnh của 02 chủng nấm CoryQN0l và CoryLK10 trên7 dòng vô tính cao su, đu đủ, khoai mì, cà chua 51

MỞ ĐẦU

Cây cao su (Hevea brasiliensis) là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế

cao Diện tích trồng loại cây này ở nước ta đang tăng dần qua các năm, theo số liệu năm 2017 của Tập đoàn Cao su Việt Nam diện tích trồng cao su trên cả nước là 971.600 ha [70] Cây cao su đang được mở rộng ra trồng ở những vùng có điều kiện bất thuận (vùng ngoài truyền thống) như các tỉnh ở miền Bắc, và được xem xét thay thế cho một số cây lâm nghiệp ít mang lại hiệu quả kinh tế cao [3] Với diện tích ngày càng được mở rộng thì vấn đề bệnh hại trên cây cao su hiện là mối quan tâm lớn, vì bệnh hại không những làm kéo dài thời k kiến thiết cơ bản mà còn ảnh hưởng đến sản lượng của vườn cây nếu đang ở độ tu i khai thác

Bệnh lá được xem là có tác hại lớn nhất và c ng là yếu tố quan trọng hạn chế đến phát triển và mở rộng diện tích cao su trên toàn thế giới Các bệnh lá được quan

tâm là bệnh cháy lá nam Mỹ (SALB), phấn trắng (do nấm Oidium hevea), héo đen đầu lá (do nấm Colletotrichum), đốm mắt chim (Drechslera heveae), và bệnh rụng lá cao su do nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei gây ra Trong các loại bệnh trên, nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei phân bố rộng khắp thế giới, cho

đến nay loài nấm này đã được ghi nhận ở hơn 80 quốc gia bao gồm Australia, Austria,

Brazil, British Solomon Islands, Bolivia, Corynespora cassiicola có ph ký chủ rộng,

loài nấm này có khả năng gây bệnh cho hơn 300 loài thực vật bao gồm các loài cây ăn quả, rau quả, ng cốc, cây lâu năm, cây rừng và các loại cây cảnh [32]

Đến nay các nòi (dòng) nấm C cassiicola từ các ký chủ khác nhau đã được

phát hiện Tuy nhiên, không phải nòi (dòng) nấm nào c ng có khả năng lây nhiễm chéo cho toàn bộ ph ký chủ của các nòi khác [48] Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su được ghi nhận lần đầu tiên tại vườn ươm ở Sierra Leon và các mẫu nấm đã được Mason và Deighton thu thập vào năm 1936 [65] Sau đó, bệnh tiếp tục được ghi nhận ở Ấn Độ [55], Indonesia [63], Brazil [33], Thái Lan [49] và Bangladesh [53] Đến nay, bệnh đã xuất hiện ở hầu hết các nước trồng cao su Năm 1998, bệnh được ghi nhận ở Việt Nam [10] và vào năm 2006, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su c ng đã được phát hiện ở đảo Hải Nam, Trung Quốc [32]

Ban đầu bệnh rụng lá Corynespora được xem là bệnh gây hại không đáng kể ở

vườn nhân và chỉ xuất hiện trên một vài dòng vô tính cao su Càng ngày bệnh này càng trở nên nghiêm trọng và trở thành đại dịch ở nhiều quốc gia Năm 1975, dịch bệnh rụng lá Corynespora nghiêm trọng xảy ra ở Malaysia trên dòng vô tính RRIM 725, gây rụng lá nghiêm trọng, sau đó lây nhiễm cho một số dòng vô tính khác như RRIC 103, FX 25, KRS 21, PPN 2058, PPN 2444 và PPN 2447 Từ đó, bệnh rụng lá Corynespora được xem là bệnh hại chính trên cây cao su ở Malaysia và bệnh có xu hướng đi từ miền nam lên miền bắc Peninsular Malaysia Ở Sri Lanka, chỉ một năm sau lần phát hiện đầu tiên, bệnh rụng lá Corynespora đã trở thành dịch bệnh và kéo dài từ năm 1986 đến 1988 Hơn 4.000 ha cao su mà chủ yếu là dòng vô tính RRIC 103 và một vài dòng vô tính mẫn cảm khác đã bị nhiễm bệnh nghiêm trọng Chính phủ Sri Lanka đã phải chi ra hơn 530.000 đô la Mỹ để bồi thường cho khoảng 3.000 hộ tiểu điền bị ảnh hưởng để loại bỏ các dòng vô tính này và trồng lại bằng các dòng vô tính kháng bệnh [36]

Tại Việt Nam, bệnh Corynespora được phát hiện lần đầu tiên trên cây cao su kiến thiết cơ bản lẫn khai thác vào tháng 8 năm 1999 tại Trạm Thực nghiệm Cao su Lai Khê Đến tháng 9/1999, bệnh được phát hiện ở các khu vực trồng cao su khác ở Đông Nam Bộ, chủ yếu là hai dòng vô tính RRIC 103 và RRIC 104 trên vườn chung tuyển Triệu chứng đặc trưng của bệnh được tìm thấy ở cây cao su thời k kiến thiết cơ bản lẫn cây cao su trưởng thành Dòng vô tính LH 88/372 (con lai của RRIC 110 x GU 1479), RRIC 103 và RRIC 104 được xác định là rất mẫn cảm với bệnh Các dòng vô tính PB 235, RRIM 600, VM 515 và RRIC 110 là những dòng vô tính bị nhiễm bệnh nhẹ Toàn bộ cây cao su bị nhiễm bệnh nặng đều bị loại bỏ [15] Tháng 1 năm 2000, bệnh bùng phát và lây lan nhanh chóng tại công ty cao su Lộc Ninh, hơn 200 ha cao su đang trong thời k kiến thiết cơ bản của dòng vô tính RRIC 104 rụng lá hoàn toàn, buộc phải thanh lý và thiêu hủy để hạn chế mầm bệnh lây lan Các khu vực ghi nhận có bệnh Corynespora là Tây Nguyên, Đông Nam Bộ Từ lúc phát hiện cho đến nay, số lượng dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên rất đáng kể Theo số liệu điều tra của bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, năm 2006, 148/148 dòng vô tính được điều tra bị nhiễm bệnh với mức độ nặng nhẹ khác nhau [5]

Các nghiên cứu thực hiện ở hiện ở các quốc gia khác, cách phòng chống dịch bệnh hiện đang được sử dụng là sử dụng hóa chất phòng trị và loại bỏ các dòng vô tính mẫn cảm, trồng các dòng vô tính kháng bệnh Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất

phòng trị có chi phí cao và tốn nhiều công lao động, nhưng chưa thật sự hiệu quả Hiện nay, kiểm soát bệnh bằng biện pháp di truyền đang được mong đợi sẽ mang lại hiệu quả cao hơn Trong kiểm soát bằng biện pháp di truyền mà chủ yếu là chọn tạo giống

kháng bệnh, những hiểu biết về cơ chế gây bệnh của Corynespora cassiicola là rất quan trọng và cần thiết Một trong những yếu tố gây bệnh của Corynespora cassiicola phát hiện mới gần đây là độc tố cassiicolin được mã hóa bởi gen cas của các chủng

nấm Vì vậy việc phát hiện, mô tả những gen này góp phần vào việc hiểu được cơ chế gây bệnh của nấm gây rụng lá với cây cao su, từ đó tìm ra phương pháp cho việc kiểm soát bệnh hiệu quả

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định và phân nhóm gen mã hoá cassiicolin trên các chủng Corynespora

cassiicola phân lập tại Việt Nam

- Đánh giá tính gây độc nấm Corynespora cassiicola có độc tố cassiicolin và không

có độc tố cassiicolin trên một số dòng vô tính (DVT) cao su nhóm 1 trong cơ cấu giống cao su 2015-2020 ở Việt Nam và xác định tính kháng bệnh của một số dòng vô tính cao su

- Xác định khả năng lây nhiễm chéo của 2 mẫu nấm C cassiicola phân lập từ cây

cao su có độc tố cassiicolin và không có độc tố cassiicolin trên lá cây đu đủ, cà chua và khoai mì

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được hai mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài này như sau:

- Nhận biết các nhóm độc tố gen cassiicola bằng qui trình chạy PCR phát hiện gen cas

- Phân nhóm các gen mã hóa cassiicolin từ mẫu nấm phân lập và vẽ cây phát sinh loài

- Chủng bệnh bằng 2 mẫu nấm Corynespora cassiicola phân lập từ cây cây cao su

lên 7 dòng vô tính (DVT) cao su nhóm 1 trong cơ cấu giống cao su 2015-2020 ở Việt Nam bằng phương pháp lá tách rời

- Chủng bệnh bằng 2 mẫu nấm Corynespora cassiicola phân lập từ cây cây cao su

lên 3 cây ký chủ khác là đu đủ, khoai mì và cà chua bằng phương pháp lá tách rời

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây cao su (Hevea Brasiliensis Mull Arg.)

1.1.1 Cây cao su và tầm quan trọng

Cây cao su (H brasiliensis.) thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae), có nguồn gốc từ

vùng nhiệt đới, lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ), được H Wickham du nhập vào châu Á và châu Phi năm 1876 Từ khi được du nhập vào Đông Nam Á, diện tích cây cao su tại vùng này được phát triển rất nhanh, dẫn đầu là Malaysia, kế đến là Indonesia, Thái Lan [6]

1.500 - 2.000 mm/năm và số ngày mưa tốt nhất là 100 - 150 ngày/năm Số giờ chiếu sáng được ghi nhận thích hợp cho cây cao su là 1.800 - 2.800 giờ/năm [6]

Tại Việt Nam, năm 1877, hai cây cao su được du nhập do Pierre trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài Gòn), nhưng sau đó hai cây này chết Ông Seeligmann gởi về Sài Gòn 50 cây cao su và chỉ còn sống 5 cây vào tháng 12 năm 1881, tiếp theo đợt 2 vào tháng 6 năm 1883, nhưng tất cả các cây cao su nói trên đều không tồn tại và phát triển được do nhiều nguyên nhân Đến năm 1897, sau một số lần thất bại tiếp theo của ông Raul trong việc du nhập và trồng cao su vào nước ta, bác sĩ Yersin đã thành công và vườn cao su đầu tiên được ông trồng tại Suối Dầu – Nha Trang [10] Đầu thế kỷ 20, các vườn cao su được trồng tại Đông Nam Bộ và đến đầu thập kỷ 50, cây cao su được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở phía Bắc [10] Đến

và xuất khẩu 1.395.000 tấn đến hơn 80 thị trường, chiếm thị phần thế giới khoảng 12%, chỉ sau Thái Lan (38%) và Indonesia (27%) [70]

Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày cho sản lượng mủ cao, phẩm chất mủ tốt nhất trong các loại cây có nhựa mủ Cao su là một trong bốn nguyên liệu cơ bản của nền công nghiệp hiện đại (than đá, gang thép, dầu hỏa, cao su) [6] [10]

Cao su vốn là hydratcacbon cao phân tử (C5 H8), là chất dẻo có độ bền cơ học cao, tính đàn hồi lớn Gỗ cao su được dùng làm ván ép, đồ gia dụng, bàn ghế và nguyên vật liệu chế biến giấy Hạt cao su có chứa tinh dầu, tỷ lệ khoảng 47% trọng

lượng hạt, được dùng làm sơn mài, xà phòng, chế biến nhựa dán gỗ Ngoài ra, nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ đất và làm cân bằng hệ sinh thái, phủ xanh đồi núi trọc, tăng độ ẩm không khí, chắn gió và qua quang hợp làm sạch bầu không khí [6] Cho đến nay nó đã và đang góp phần rất lớn vào nguồn xuất khẩu và tạo công ăn

việc làm cho người lao động, đặc biệt là ở khu vực Đông Nam Á [4] 1.1.2 Tình hình sâu bệnh hại trên cây cao su

Cao su c ng bị rất nhiều loại mầm bệnh tấn công như nấm, côn trùng… Do được trồng chủ yếu trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa phong phú nên cây bị rất nhiều loại bệnh gây hại, nhất là những loại bệnh do nấm gây ra [5]

Hiện nay, ở Việt Nam chưa phát hiện bệnh do vi khuẩn và virus trên cây cao su Các loại bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sản xuất cao su có thể kể đến như bệnh phấn

trắng (Oidium heveae), bệnh rựng lá Corynespora (Corynespora cassiicola), héo đen đầu lá (Collectotrichum gloeosporioides), rụng lá mùa mưa (Phytopthora palmivora và Phytopthora botryosa), đốm mắt chim (Drechslera heveae), loét sọc mặt cạo (Phytopthora palmivora và Phytopthora botryosa), nấm hồng (Corticium

salmonicolor), bệnh rễ nâu (Phellinus noxius) và bệnh nứt vỏ (Botryodiploidia theobromae) [5]

Mặc dù mới được phát hiện vào năm 1999, nhưng bệnh Corynespora do nấm

Corynespora cassiicola (Berk and Curt.) Wei gây ra đã nhanh chóng được xem là

loại bệnh nguy hiểm nhất trên cây cao su ở nước ta [4] Do loài nấm này có khả năng gây hại quanh năm trên mọi tu i lá, mọi giai đoạn sinh trưởng của cây Là một trong những nguyên nhân làm cây chậm phát triển, kéo dài thời k kiến thiết cơ bản thêm 1 – 2 năm và ảnh hưởng trực tiếp đến việc làm giảm sản lượng mủ từ 20-30% đối với

vườn khai thác [3]

1.2 Bệnh rụng lá cao su do nấm Corynespora cassiicola trên thế giới và Việt Nam

Nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei phân bố rộng khắp thế giới

Cho đến nay loài nấm này đã được ghi nhận ở hơn 80 quốc gia bao gồm Australia, Austria, Brazil, British Solomon Islands, Bolivia, Brunei, Bulgaria, Burma, Cameroon, Cambodia, Canada, Ceylon, China, Colombia, Congo, Cuba, Thailand, Togo, Trinidad and Tobago, Uganda, USA, US Virgin Islands, Venezuela [19]; Bangladesh [53]; Vietnam [16]; Gabon [31]; Korea [34]; Italy [23]; Argentina, Barbados, South Africa,

Taiwan, United Kingdom [36];

Corynespora cassiicola có ph ký chủ rộng, loài nấm này có khả năng gây bệnh

cho hơn 300 loài thực vật bao gồm các loài cây ăn quả, rau quả, ng cốc, cây lâu năm, cây rừng và các loại cây cảnh [36] Các loại cây trồng ph biến và có giá trị kinh tế bị

nấm C cassiicola tấn công gồm có đu đủ (Carica papaya), dưa leo (Cucumis sativus), đậu nành (Glycine max), cao su (Hevea brasiliensis), cà chua (Lycopersicon

esculentum) [65]; dứa (Ananas comosus), cọ dầu (Elaeis guineensis), khoai mì

(Manihot esculenta) [18]; bông (Gossypium spp.), chuối (Musa sp.) [19]; đậu phộng (Arachis hypogea), cà phê (Coffea arabica), sầu riêng (Durio zibethinus), thuốc lá (Nicotiana tabacum), tiêu (Piper nigrum), khoai tây (Solanum tuberosum), ca cao (Theobroma cacao), [36]

Hình 1.1 Bệnh Corynespora trên dưa leo và đậu nành

Một số loài cây cảnh ph biến là ký chủ của C cassiicola gồm có euphorbia (Euphorbia sp.), cây sung (Ficus sp.), cây ba đậu hay còn gọi là kh sâm (Codiaeum

veriegatum) [30]; cây chùm ớt (Bignonia sp.), hoa cúc (Chrysanthemum sp.), dâm bụt

(Hibiscus sp.), hoa lài (Jasminum sp.), hoa lạc tiên (Passiflora sp.) [36]

Đến nay các nòi (dòng) nấm C cassiicola từ các ký chủ khác nhau đã được

phát hiện Tuy nhiên, không phải nòi (dòng) nấm nào c ng có khả năng lây nhiễm chéo cho toàn bộ ph ký chủ của các nòi khác [48] Năm 1974, Onesirosan và các cộng sự quan sát thấy rằng các nguồn nấm từ dưa leo, đậu nành và cà chua có độc tính mạnh ở cà chua và cà tím nhưng chỉ có độc tính trung bình trên cây mè và cây bông vải Trong khi đó, các nguồn nấm từ hai loài cỏ dại ph biến ở Nigeria lại có độc tính mạnh trên cây bông vải Trong một nghiên cứu khác, 15 nguồn nấm C cassiicola được phân lập từ vài loài ký chủ khác nhau được chủng lên 12 loài cây trồng ký chủ khác

nhau Kết quả cho thấy có sự khác biệt về ph ký chủ của các nguồn nấm và tính mẫn cảm của các ký chủ đối với các nguồn nấm khác nhau c ng có sự khác biệt [46]

Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su được ghi nhận lần đầu tiên tại vườn ươm ở Sierra Leon và các mẫu nấm đã được Mason và Deighton thu thập vào năm 1936 [65] Sau đó, bệnh tiếp tục được ghi nhận ở Ấn Độ [55]; Sri Lanka và Cameroon [28][35]; Malaysia [41]; Nigeria [35]; Indonesia [63]; Brazil [33]; Thái Lan [49]; và Bangladesh [53] Đến nay, bệnh đã xuất hiện ở hầu hết các nước trồng cao su Năm 1998, bệnh được ghi nhận ở Việt Nam [16] và vào năm 2006, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su c ng đã được phát hiện ở đảo Hải Nam, Trung Quốc [32]

Ban đầu bệnh rụng lá Corynespora được xem là bệnh gây hại không đáng kể ở vườn nhân và chỉ xuất hiện trên một vài dòng vô tính cao su Càng ngày bệnh này càng trở nên nghiêm trọng và trở thành đại dịch ở nhiều quốc gia Năm 1975, dịch bệnh rụng lá Corynespora nghiêm trọng xảy ra ở Malaysia trên dòng vô tính RRIM 725, gây rụng lá nghiêm trọng, sau đó lây nhiễm cho một số dòng vô tính khác như RRIC 103, FX 25, KRS 21, PPN 2058, PPN 2444 và PPN 2447 Từ đó, bệnh rụng lá Corynespora được xem là bệnh hại chính trên cây cao su ở Malaysia và bệnh có xu hướng đi từ miền nam lên miền bắc Peninsular Malaysia (RRIM, 2000) Ở Sri Lanka, chỉ một năm sau lần phát hiện đầu tiên, bệnh rụng lá Corynespora đã trở thành dịch bệnh và kéo dài từ năm 1986 đến 1988 Hơn 4.000 ha cao su mà chủ yếu là dòng vô tính RRIC 103 và một vài dòng vô tính mẫn cảm khác đã bị nhiễm bệnh nghiêm trọng Chính phủ Sri Lanka đã phải chi ra hơn 530.000 đô la Mỹ để bồi thường cho khoảng 3.000 hộ tiểu điền bị ảnh hưởng để loại bỏ các dòng vô tính này và trồng lại bằng các dòng vô tính kháng bệnh [36]

Ở Indonesia, sau khi phát hiện bệnh vào năm 1980, bệnh rụng lá Corynespora đã dần lan sang các vùng trồng cao su khác Từ năm 1996, bệnh Corynespora đã xuất hiện ở tất cả các vùng trồng cao su ở nước này Trong những năm 1980, gần 1.200 ha cao su đã bị nhiễm bệnh nặng, trong đó 400 ha phải bị loại bỏ hoàn toàn với thiệt hại kinh tế lên đến 200 tỉ Rupiah (hơn 20 triệu đô la Mỹ) [36]

Ở Ấn Độ, từ năm 1996 toàn bộ các vùng trồng cao su đều xuất hiện bệnh Corynespora Dịch bệnh rụng lá Corynespora được ghi nhận lần đầu tiên tại Viện nghiên cứu cao su Ấn Độ (RRII) và Trạm Nghiên cứu Giống cao su ở Nam Karnataka [54] Kế tiếp, vào năm 1999, bệnh Corynespora trở nên nghiêm trọng với tỉ lệ bệnh lên

đến 50 – 70 % ở một số vùng trồng cao su Hơn 10.000 ha cao su bị ảnh hưởng và phải phun thuốc diệt nấm [27]

Tại Thái Lan, bệnh rụng lá Corynespora lần đầu tiên được ghi nhận vào năm 1985 [49] Dòng vô tính RRIC 103 và KRS 21 là hai dòng vô tính bị nhiễm bệnh và bị thiệt hại nặng nhất Từ năm 2000, bệnh xuất hiện ở tất cả các vùng trồng cao su ở Thái Lan [13]

Tháng 8 năm 1999, bệnh Corynespora được phát hiện ở Việt Nam ngay tại Trạm Thực nghiệm cao su Lai Khê thuộc Viện Nghiên cứu cao su Việt Nam (RRIV) Đến tháng 9/1999, bệnh được phát hiện ở các khu vực trồng cao su khác ở Đông Nam Bộ, chủ yếu là hai dòng vô tính RRIC 103 và RRIC 104 trên vườn chung tuyển Triệu chứng đặc trưng của bệnh được tìm thấy ở cây cao su thời k kiến thiết cơ bản lẫn cây cao su trưởng thành Dòng vô tính LH 88/372 (con lai của RRIC 110 x GU 1479), RRIC 103 và RRIC 104 được xác định là rất mẫn cảm với bệnh Các dòng vô tính PB 235, RRIM 600, VM 515 và RRIC 110 là những dòng vô tính bị nhiễm bệnh nhẹ Toàn bộ cây cao su bị nhiễm bệnh nặng đều bị loại bỏ [16] Tháng 1 năm 2000, bệnh bùng phát và lây lan nhanh chóng tại công ty cao su Lộc Ninh, hơn 200 ha cao su đang trong thời k kiến thiết cơ bản của dòng vô tính RRIC 104 rụng lá hoàn toàn, buộc phải thanh lý và thiêu hủy để hạn chế mầm bệnh lây lan Các khu vực ghi nhận có bệnh Corynespora là Tây Nguyên, Đông Nam Bộ Từ lúc phát hiện cho đến nay, số lượng dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên rất đáng kể Theo số liệu điều tra của bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, năm 2006, 148/148 dòng vô tính được điều tra bị nhiễm bệnh với mức độ nặng nhẹ khác nhau[4]

Do khả năng làm rụng lá hàng loạt trên cây cao su, nấm C cassiicola làm giảm

đáng kể sản lượng của vườn cao su khai thác, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành trồng cao su ở nhiều nước Do tầm quan trọng của dịch bệnh, t chức CFC (Common Fund for Commodities) đã tài trợ cho dự án “Cải tiến chiến lược phòng chống dịch bệnh Corynespora trên cây cao su” Dự án có sự tham gia hợp tác của Viện Nghiên cứu Cao su như Ấn Độ, Thái Lan, Sri Lanka, Indonesia, Doanh nghiệp cây công nghiệp Myanmar và một Trung tâm Kỹ thuật Cao su của Gabon Nội dung của dự án là (1) Thử nghiệm những biện pháp canh tác và chế độ phân bón thích hợp để kiểm soát bệnh; (2) Áp dụng biện pháp phòng trừ bệnh t ng hợp; (3) Huấn luyện công tác quản lý bệnh cho nông dân, tiểu điền Trong đó bao gồm cả một nội dung được thực

hiện hàng năm là tập huấn chiến lược quản lý và phương pháp, nghiên cứu đánh giá bệnh Corynespora trên cây cao su cho cán bộ nghiên cứu của các Viện thành viên thuộc Hiệp Hội Nghiên cứu và Phát triển Cao su Quốc Tế (IRRDB) [4] Do vậy những

nghiên cứu về nấm C cassiicola hiện đang được đẩy mạnh ở nhiều nước trồng cao su

Vì vậy, những nghiên cứu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su tại Việt Nam không những tạo thêm nguồn tư liệu cho các nghiên cứu về bệnh cây trong nước mà còn b sung thêm tư liệu để cùng với các quốc gia khác mở rộng hiểu biết về tác nhân gây bệnh, từ đó đề xuất những biện pháp quản lý bệnh hiệu quả

1.3 Sơ lƣợc về nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) C.T Wei 1950

1.3.1 Triệu chứng bệnh

Trên cây cao su, nấm C cassiicola gây bệnh chủ yếu trên lá đặc biệt là dọc theo

cảm với nấm bệnh hơn so với lá già Triệu chứng bệnh đầu tiên có màu đen xám, đốm nâu hoặc những đốm tròn không đều có màu nâu sang hoặc màu trắng ở giữa, còn

lan rộng thành vết bệnh tròn hoặc mỏng như giấy có đường kính từ 2 – 8 mm và có màu xám đen Vết bệnh nhỏ và tròn hoặc đi kèm với sự mất màu của gân lá nằm gần vết bệnh, tạo nên triệu chứng “xương cá” hay “đường ray xe lửa” Sự xuất hiện của các triệu chứng bệnh tùy thuộc vào độ mẫn cảm của các dòng vô tính và điều kiện thời tiết [52,14]

Hình 1.2 Bệnh Corynespora trên cây cao su

Đối với các dòng vô tính mẫn cảm, triệu chứng bệnh ph biến nhất là các vết bệnh hình xương cá Tuy nhiên, một số dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh khác xa triệu chứng bệnh đặc trưng Đối với dòng vô tính RRIC 110, lá bị nhiễm bệnh có

những vết bệnh giống với vết bệnh phấn trắng lâu ngày Triệu chứng bệnh Corynespora trên dòng vô tính RRIC 132 tương tự như vết bệnh đốm mắt chim do

nấm Drechslera heveae gây ra Ngoài các triệu chứng bệnh kể trên, một số dòng vô

tính còn xuất hiện các đường kẻ màu đen trên gân thứ cấp và sơ cấp (ví dụ như RRIC 133) [20] Lá bị nhiễm bệnh dần chuyển sang màu vàng hoặc quăn queo và khô lại trước khi rụng Lá thường rụng ngay cả khi còn xanh, không có vết bệnh nào trên lá mà chỉ có cuống lá bị nhiễm bệnh Nếu thân và cành bị nhiễm bệnh sẽ dẫn đến hiện tượng nứt vở và khô cành Những vết sọc đứng màu đen xuất hiện trên lớp gỗ khi loại bỏ lớp vỏ bị nhiễm bệnh [52] [14]

Có 3 yếu tố dẫn đến sự phát sinh bệnh trên cây cao su gồm:

Lớp: Dothidiomycetes, Bộ: Pleosporales,

Họ: Corynesporascaceae,

Chi: Corynespora

Loài: Corynespora cassiicola

Trước đây nấm còn có nhiều tên gọi khác nhau như Helminthosporium cassiicola Berk & Curt.; H papayae H Syd.; H vignae Olive, apud Olive, Bain & Lefebvre;

Cercospora melonis Cooke; C vignicola Kawamura; Corynespora melonis (Cooke)

Lindau [2] [19]

1.3.3 Đặc điểm nấm Corynespora cassiicola

1.3.3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Corynespora cassiicola

Theo Chee (1988), kích thước trung bình của đính bào tử phân lập từ cây cao su là 64,4 x 5,52 µm (23,42 – 132,6 x 2,60 – 7,80 µm) [36] Bào tử nảy mầm tạo ra một hoặc nhiều ống mầm, nhưng các ống mầm thường mọc nhiều ở các tế bào tận cùng của bào tử Có sự biến thiên về kích thước và hình dạng của đính bào tử phân lập từ lá cao su bị nhiễm bệnh ngoài tự nhiên và nuôi cấy trên môi trường Potato Sucrose Agar (PSA) Đính bào tử phân lập từ lá cao su thường dài, thon và có hình que trong môi trường nuôi cấy nhưng có đáy hơi rộng [15]

Theo Spencer và Walters (1969), sự khác nhau về hình thái học của nấm một phần là phụ thuộc vào sự khác nhau của điều kiện sống ở mức độ loài Các mẫu nấm

C cassiicola phân lập từ các ký chủ khác nhau thì có sự khác biệt rất lớn về đặc điểm

nuôi cấy [61] Theo Phan Thành D ng (2004), khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu Khuẩn lạc biến thiên rất lớn về tốc độ sinh trưởng, hình thái, độ dày, độ mịn và màu sắc, mặc dù được phân lập từ một bào tử duy nhất Sự đa dạng về hình thái của bào tử được ghi nhận không chỉ giữa các mẫu phân lập nấm mà còn trong cùng một mẫu phân lập nấm [2]

Hình 1.3 Hình thái bào tử nấm C cassiicola (bào tử đính và cuống bào tử đính) [19]

Dung (1995) quan sát thấy rằng, khuẩn lạc biến thiên rất lớn về tốc độ sinh trưởng, hình thái, độ dày, độ mịn và màu sắc, trên môi trường PDA và PSA, khuẩn lạc nấm có màu xám đến nâu Bào tử trên vết bệnh c ng như trên môi trường nhân tạo có sự biến thiên rất lớn về hình dạng và kích thước Sự đa dạng về hình thái của bào tử

được ghi nhận không chỉ giữa các nguồn nấm mà còn trong cùng một nguồn nấm Bào

tử có dạng bầu dục, dài, thẳng hoặc cong lưỡi liềm Kích thước bào tử biến thiên rất lớn với chiều dài thay đ i từ 17 - 942 µm và chiều rộng thay đ i từ 3,9 - 16,8 µm Bào

Hình 1.4 Hình thái nấm Corynespora cassiicola

A: Khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA, B: Sợi nấm và bào tử (một vạch trên thước đo tương ứng với 10 µm), C: Bào tử nảy mầm (một vạch trên thước đo tương

1.3.3.2 Đặc điểm sinh lý của nấm Corynespora cassiicola

Ngoài tự nhiên bào tử phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 - 11 giờ Sau thời gian mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh hoặc trong đất với thời gian dài, trên lá

Trái với ngoài tự nhiên, nấm này rất khó sinh bào tử trên môi trường nhân tạo Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc thay đ i tùy vào điều kiện nuôi cấy Nấm phát triển ở

C [15]

90% là thích hợp nhất để C cassiicola hình thành bào tử Tuy nhiên, sự hình thành bào

tử vẫn có thể xảy ra ở ẩm độ 80, 90 và 100% [39] Trên môi trường nhân tạo, số lượng bào tử thay đ i tu theo nguồn nấm, có nguồn sản xuất trên 100.000 bào tử/đĩa petri trong khi có nguồn lại không tạo bào tử Số lượng bào tử hình thành trên các môi trường có sự biến thiên lớn [29]

Phan Thành D ng (1995) cho rằng nấm C cassiicola được phân lập từ cây cao

su nảy mầm trên môi trường PSA nhiều hơn trên môi trường Potato Dextrose Agar

(PDA) và Rubber Leaf Extract Agar (RLEA) [15] Chee (1988) cho rằng C cassiicola phân lập từ cây cao su (H brasiliensis) nuôi trên môi trường PSA được đặt trong bóng

tối 3 ngày, sau đó đặt dưới ánh sáng 3 ngày ở 26ºC thì bào tử đính hình thành nhiều hơn [36]

1.3.3.3 Khả năng tồn tại của nấm Corynespora cassiicola

Nấm C cassiicola là tác nhân gây ra bệnh đốm lá trên các loại cây trồng bằng

cách sống và lan truyền mầm bệnh trên đồng ruộng Ở các vườn trồng cao su, sự có mặt của các loại cỏ giúp tăng sự sống của mầm bệnh nên kiểm soát các loại cỏ có thể

giảm bớt được sự tác động của bệnh Ngoài ra, nấm C cassiicola có thể sống trên tất

cả các bộ phận của cây cao su bị nhiễm bệnh và xác bã cây trồng dưới dạng sợi nấm có màu nâu đậm Mushrif (2006) cho rằng nấm có thể sống trên các loại cây trồng còn sót lại trên đồng ruộng c ng như trên xác bã cây trồng và xác bã giun tròn [41] Bào tử có khả năng tồn tại trong đất với thời gian dài Trên lá cao su khô, nấm vẫn có thể tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh trong khoảng 3 tháng [2]

1.3.3.4 Quá trình xâm nhiễm

Theo Situmorang và cộng sự (1996), khả năng xâm nhiễm và gây bệnh cho lá cây

cao su của nấm C cassiicola phụ thuộc vào các giai đoạn sinh trưởng của lá Nấm gây

bệnh trên cao su ở vườn ươm, vườn nhân, vườn cây kiến thiết cơ bản và cả vườn cao su kinh doanh Lá non dưới 4 tuần tu i là giai đoạn mẫn cảm nhất đối với bệnh Bệnh xuất hiện trên cây cao su khai thác trong suốt thời k ra lá mới [60]

cao hơn 35oC thì sự phát triển của mầm bệnh sẽ bị ức chế Sailajadevi và cộng sự (2005) quan sát thấy rằng, bệnh xuất hiện và gây hại nặng khi thời gian chiếu sáng nhiều hơn 8 giờ/ngày, kết quả này phù hợp với ghi nhận trước đây của Rajalekshmy và cộng sự (1996), cây cao su ở vườn ương được che bóng thì bệnh ít xảy ra hoặc chỉ xảy ra ở mức độ nhẹ [4]

Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử nấm bắt đầu nảy mầm Ống mầm được hình thành ở hai đầu và đôi khi xuất hiện ở các vách ngăn của bào tử Dưới điều kiện tối thích, bào tử nảy mầm trong 3 giờ Sự nảy mầm của bào tử diễn ra thuận lợi nhất ở

Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí kh ng, bên cạnh đó nấm còn tiết ra men cellulozase giúp phân huỷ màng tế bào Trong quá trình sinh trưởng nấm còn tiết ra độc tố cassiicolin, hợp chất này rất độc cho cây cao su nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân chính của lá c ng đủ gây rụng lá [2] Theo Nugewela và cộng sự

quang hợp ở lá bị nhiễm bệnh [17] Theo Radziah và cộng sự (1996), bào tử tồn tại trong không khí có tương quan nghịch với lượng mưa, bào tử được phóng thích nhiều hơn ở thời k có ẩm độ không khí thấp [51] Ở Việt Nam, bệnh Corynespora xảy ra trong điều kiện nhiệt độ 19,7 -

có 20 ngày mưa/tháng [5] Theo Situmorang và cộng sự (1984), cây cao su trồng ở những vùng có vĩ độ

thấp thường bị nấm Corynespora cassiicola xâm nhiễm và gây hại nặng Điều này có

lẽ do ở những nơi vĩ độ cao thì có nhiệt độ thấp làm kìm hãm sự phát triển của nấm bệnh [60] Jayasinghe (2000) c ng ghi nhận rằng, ở độ cao trên 300 m thì cây cao su c ng ít bị bệnh Corynespora hơn [29]

Mức độ mẫn cảm đối với bệnh thay đ i ở các DVT cao su và đặc tính này biến đ i theo không gian và thời gian Theo Tan và cộng sự (1992) các DVT PB 235, PB 260, PB 28/59, PB 280, PB 330, PM 10, RRIM 701, RRIM 908 và RRIM 926 nhiễm bệnh từ nhẹ đến trung bình, trong khi trước đó các DVT này được xem là kháng bệnh Sự nhiễm bệnh trên DVT RRIM 600 ngày càng trầm trọng [62] Theo Jayasinghe và Silva (1996), RRIC 110 ban đầu được xem là kháng bệnh nhưng sau đó là DVT mẫn cảm [28] Theo Sinulingga và cộng sự (1996); Breton và cộng sự (1996), mức độ nhiễm bệnh của hai DVT PB 260 và GT 1 thay đ i theo vùng địa lý PB 260 là DVT kháng bệnh tại châu Á nhưng lại bị nhiễm bệnh nặng tại châu Phi Ngược lại, GT 1 là DVT mẫn cảm tại Malaysia và Indonesia nhưng lại kháng bệnh tại châu Phi [58] [11]

Bên cạnh đó, mức độ mẫn cảm đối với bệnh trên một DVT c ng biến thiên giữa điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện ngoài đồng ruộng [15]

Bệnh Corynespora đang trở thành mối đe doạ thật sự đối với ngành cao su toàn

cầu Diễn biến của bệnh ngày càng phức tạp do nấm C cassiisola có khả năng hình

thành nhiều nòi sinh lí mới để phá vỡ tính kháng bệnh của một số DVT cao su Theo Hashim và Jeyanayayi (1999), Malaysia đã phát hiện hai nòi sinh lí của nấm trên cây cao su Nòi 1 tấn công các DVT như RRIM 600, GT 1 và IAN 873 nhưng không xâm nhiễm trên các DVT mới như RRIM 2000 và PB 260 Trong khi nòi 2 lại tấn công trên hai DVT RRIM 600 và PB 260 [25]

1.4 Độc tố cassiicolin do Corynespora cassiicola tiết ra

Năm 1997, Breton đã tìm ra độc tố cassiicolin do nấm Corynespora cassiicola

tiết ra trong quá trình gây bệnh trên lá cao su Phát hiện này đã tạo một bước ngoặt lớn trong công tác chọn tạo các dòng vô tính cao su kháng bệnh Corynespora Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đã dựa vào độc tố này để xác định tính kháng bệnh của những dòng vô tính cao su một cách nhanh chóng và hiệu quả hơn so với phương pháp truyền thống [69]

Cassiicolin là loại độc tố đặc hiệu ký chủ (host-selective toxin HST) tiết ra bởi

Corynespora cassiicola, nó chỉ tạo ra vết bệnh trên cây ký chủ mẫn cảm, và không

tạo ra bất k triệu chứng nào trên những loại cây trồng không phải là ký chủ [69]

Theo Liyanage và Liyanage (1986) cho thấy C cassiicola sản xuất độc tố trong

môi trường t ng hợp, D’Auzac (2000) đã tinh sạch và xác định các đặc điểm sinh hóa

học của độc tố bởi C cassiicola, gây ra các triệu chứng bệnh của Corynespora khi nhiễm trên lá non và lá trưởng thành của các dòng vô tính H brasiliensis mẫn cảm

[35] Kết quả tương tự được ghi nhận bởi Breton và cộng sự, dịch lọc môi trường nuôi cấy làm héo rất nhanh lá cao su và gây hoại tử lá của các dòng vô tính mẫn cảm Breton đặt tên là cassiicolin, vai trò của cassiicolin trong việc gây bệnh được chứng minh và cassiicolin là cần thiết và dường như là yếu tố quyết định đặc tính gây bệnh

của C cassiicola [22] Sự di chuyển của độc tố dọc theo gân lá đã làm cho gân lá mất

màu và tạo ra triệu chứng đặc trưng là xương cá Nếu nhỏ một giọt độc tố này lên trên mô lá đã được gây vết thương trước thì nó c ng tạo ra những triệu chứng bệnh giống như phương pháp lây bệnh nhân tạo thông thường [22]

Sử dụng độc tố tinh khiết cho thấy độc tố cassiicolin có vai trò chọn lọc ký chủ

trong quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của nấm C cassiicola Độ nhạy của dòng vô

tính cao su với độc tố casiicolin có mối tương quan chặt với tính mẫn cảm của dòng vô tính đó với mầm bệnh, điều này đã được chứng minh khi dùng một nguồn nấm từ Philippines Nồng độ độc tố cao có thể vượt qua tính kháng của GT1, dòng vô tính có biểu hiện tính kháng bệnh ở độc tố nồng độ thấp Do vậy, tính kháng bệnh của các dòng vô tính không phải là bất biến và có vẻ như còn có mối liên hệ chặt chẽ với nồng độ độc tố được thử nghiệm Lượng độc tố tiết ra từ 11 nguồn nấm được phân lập từ các nước khác nhau có mối tương quan thuận với với khả năng gây bệnh của chúng Mặc dù các kết quả nghiên cứu trên cần được kiểm tra lại, sử dụng nhiều nguồn nấm hơn nữa, nhưng hiện tại việc sử dụng độc tố cassiicolin trong tuyển chọn giống kháng bệnh vẫn được xem là một biện pháp lý tưởng [11]

Tiền thân của cassicolin là một protein gồm 58 amino acid, trong đó bao gồm 17 amino acid là peptide tín hiệu, các peptide này có thể là cần thiết để tiết độc tố ra ngoài thành tế bào nấm, một vùng gồm 14 amino acid có thể đóng vai trò như là nhân tố trợ giúp trong quá trình tiết, và đầu tận cùng C 27 amino acid tương ứng với trình tự cassiolin trưởng thành [64] Trình tự amino acid của cassiicolin như sau: PyroGlu-T-CVSCVNFGNGFCGDNCGNSWACSGC, với T là threonine glycosyl hóa và không có trình tự nào tương đồng với trình tự amino acid của cassiicolin khi sử dụng chương trình NCBI BLAST [71]

Gen mã hóa cho cassicolin được tìm thấy là biểu hiện trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, ngay trước khi xuất hiện các triệu chứng bệnh đầu tiên [37] Có 6 tương đồng của cas gồm cas1, cas2, cas3, cas4, cas5 và cas6 được xác định bởi PCR từ các mẫu bệnh phân lập từ các ký chủ khác nhau và nguồn gốc địa lý khác nhau [38] Trong một vài trường hợp, 2 tương đồng gen cas được phát hiện trong cùng một mẫu phân lập Tuy nhiên, 53% mẫu phân lập được kiểm tra phát hiện không có gen cas, mặc dù chúng vẫn gây bệnh trên cây cao su, cho thấy rằng, các tác nhân gây bệnh khác ngoài cassicolin có thể liên quan tới khả năng gây bệnh của chúng

Cas1 MKYLPILISAFVAAVAAAPQDPSAVAPVLPRQTCVSCVNFGNGFCGDNCGNSWACSGC

Cas2 MKYLPIFISAFVAAVAAVPQGPSAAAAAILPRQSCVSCVDFGNGFCGDNCGNSWACSGC

Cas3 MKYLPILISAFVAAITAAPQDPSAVAPLLPRQSCVSCVNFGNGFCGDNCGNSWACSG

Cas4 MKYLPILISAFVAAVTAAPQDPSAVAPLLPRQSCVSCVNFGNGFCGDNCGNSWACSGC Cas5 MKYLPILISAFVAAVAAAPQDPSAVAPLLPRQSCVSCVNFGNGFCGDNCGNSWACSGC Cas6 MKYFPILISAFVAAVAAAPQGPSAVAAAVLPRQTCAFCEYFGNGYCGNTCTGDSWACSN

+ -+ -+ -+ -+ -+ - 1 11 21 31 41 51

Hình 1.5 Trình tự amino acid của các tương đồng của protein cassicolin Trình tự

cassolin trưởng thành được in đậm, trình tự tín hiệu được gạch chân [38] Các tương đồng protein của cassicolin đều có cấu trúc tương tự nhau Độ tương đồng về trình tự so với cas 1 của các tương đồng cas 5, cas 2, cas 6 lần lượt là 96%, 84% và 76% Khi so sánh vùng trưởng thành của protein cassiicolin cas1, 2, 3, 4 và 5 có sự tương đồng, trong khi đó, cas 6 có sự khác biệt cao Cas 3, 4 và 5 có vùng trưởng thành tương đồng nhau đến 100% [38]

Hình 1.6 Vị trí nhân bản và đặc tính của gen cassiicoline [37]

Hiện nay, phương pháp sử dụng độc tố cassiicolin đã được ứng dụng để tuyển non dòng vô tính kháng bệnh Corynespora ở Ấn Độ Nhưng điểm cần lưu ý là độc tố cassiicolin không thể vượt qua rào cản là lớp biểu bì của lá Do vậy, phương pháp ứng dụng độc tố để lây bệnh nhân tạo, tuyển non dòng vô tính cao su kháng bệnh lá còn được gọi là phương pháp Leaf puncture bioassay (phương pháp tạo vết thương), tức cần phải gây vết thương trước khi chủng bệnh Ngoài ra, một phương pháp ứng dụng độc tố khác để tuyển non dòng vô tính kháng bệnh Corynespora là Leaf wilt bioassay (đánh giá mức độ héo r của lá) Sử dụng phương pháp này, các lá chét được cắt trong nước để bỏ phần cuống lá, sau đó chuyển ngay vào những ống nghiệm có chứa độc tố

Nhìn chung, sử dụng độc tố tinh sạch để tuyển non dòng vô tính kháng bệnh

Corynespora có nhiều thuận lợi hơn sử dụng bào tử C cassiicola (1) Phản ứng sau khi

lây nhiễm nấm thường nhạy cảm với môi trường hơn là các phản ứng với độc tố (2) Kết quả phân tích bằng độc tố có thể có ngay trong vòng 24h do đó có thể tiến hành đối với nhiều dòng vô tính trong thời gian ngắn (3) Các nước chưa bị bệnh Corynespora vẫn có thể tuyển chọn các dòng vô tính kháng bệnh mà không cần phải có nguồn nấm (4) Sự khác biệt giữa các nguồn nấm có thể được nghiên cứu thông qua trao đ i độc tố đã tinh sạch và tạo kháng thể chống lại cassiicolin bằng cách hạn chế

nguy cơ du nhập nòi C cassicola mới [4]

1.5 Tình hình nghiên cứu về C cassiicola trong và ngoài nước 1.5.1 Những nghiên cứu vế C cassiicola ngoài nước

Cho đến nay, C cassiicola được nghiên cứu khá nhiều ở các nước trên thế giới, với ph ký chủ rộng, C cassiicola có khả năng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau Ngoài những nghiên cứu về tình hình và khả năng gây hại của C cassiicola ở các khu vực khác nhau C cassiicola trên các ký chủ khác nhau c ng đã được nghiên

cứu và so sánh mức độ khác biệt về di truyền và tìm hiểu khả năng nhận biết các dòng

C cassiicola, c ng như mức độ và khả năng gây độc của C cassiicola Kết quả của

những nghiên cứu này cho thấy, tính độc của C cassiicola ngày càng phát triển đa dạng và rất biến thiên, khả năng gây độc của C cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau tùy theo giai đoạn sinh trưởng C cassiicola có khả năng t ng hợp các

enzyme phân giải pectin và enzyme phân giải cellulose ngoài cơ chế biến dưỡng độc tố [50]

Silva và cộng sự (1995) tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của 05 mẫu

nấm C cassiicola trên các ký chủ khác nhau (đu đủ, mimosa, húng tây) bằng kỹ thuật

phân tích đa hình RFLP trên vùng ITS (internal transcribed space) của ribosome DNA

và đa hình các đoạn DNA khuếch đại từ DNA t ng số Các chủng Corynespora có thể được phân biệt so với các loài lân cận thuộc giống Helmithosporum dựa vào kích

thước của đoạn ITS được khuếch đại, tuy nhiên, không thể phân biệt rõ vì vùng ITS của các mẫu phân lập có kích thước giống nhau và khi phân cắt bằng enzyme cắt giới hạn lại cho những kết quả giống nhau Phân tích cụm của 218 các phân đoạn DNA khuếch đại cho thấy, 5 mẫu phân lập được xếp vào 3 nhóm di truyền khác nhau, tương ứng với nguồn gốc ký chủ và đặc điểm hình thái khác nhau Sử dụng các kỹ thuật phân

tử này có thể mở rộng để nghiên cứu biến dị trong cùng mẫu phân lập của C.cassicola trên cây cao su ở Sri Lanka, nơi mà các chủng C cassiicola có độc tính cao đã xuất

hiện đe dọa nghiêm trọng ngành công nghiệp cao su thiên nhiên ở nước này [57]

Qi và cộng sự (2009) phát triển kỹ thuật Nested-PCR để phát hiện nhanh

Corynespora cassiicola Nghiên cứu được tiến hành trên 17 mẫu phân lập trên lá tách

rời của bốn dòng vô tính cao su khác nhau (PR 107, Dafeng95, RRIM 600 và Reyan 33-97) Nồng độ DNA thấp nhất có thể được phát hiện bởi Nested-PCR là 168 fg, trong khi đó, nồng độ thấp nhất cho PCR là 16,7 pg Do đó, độ nhạy của phản ứng khi so sánh với phản ứng PCR thông thường tăng gấp 100 lần Bên cạnh đó, tác nhân gây bệnh có thể được phát hiện 3 ngày sau khi tiến hành chủng bệnh nhân tạo [50]

7-1.5.2 Những nghiên cứu về C cassiicola trong nước

Hiện nay, những nghiên cứu về bệnh rụng lá Corynespora ở Việt Nam là chưa nhiều Các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc đánh giá tình hình bệnh, nghiên cứu tính

kháng của một số dòng vô tính cao su và đánh giá đa dạng di truyền của C cassiicola

Nguyễn Đôn Hiệu và cộng sự (2014) nghiên cứu đa dạng di truyền và khả năng gây bệnh của 38 chủng nấm phân lập từ các ký chủ khác nhau gồm cao su, lá giang, xoài, bí ngô và cây vừng từ các vùng khác nhau của Việt Nam, bằng kỹ thuật giải trình tự vùng ITS rDNA và chỉ thị phân tử ISSR Một nucleotide đa hình tại base thứ 135 (Cytosine/Thymine) của vùng ITS-rDNA khác biệt ở 38 chủng phân lập và được chia thành hai nhóm Trong khi đó, 88 band DNA khuếch đại bởi chỉ thị ISSR c ng tạo ra cây phát sinh loài và chia thành hai nhóm chính Nghiên cứu c ng chỉ ra rằng, các mẫu phân lập từ các kí chủ khác nhau có độc lực khác nhau Mặc dù được xếp vào cùng

nhóm phân loại di truyền, C cassiicola phân lập từ đu đủ không gây bệnh đối với bí

đao, trong khi đó, mẫu phân lập từ cây bí đao lại gây bệnh cho cây đu đủ Mẫu phân lập từ bí đao và đu đủ đều có khả năng gây bệnh cho tất cả các dòng vô tính cao su được thử nghiệm Điều này chứng tỏ rằng, mối quan hệ di truyền của các mẫu phân lập phụ thuộc vào vùng địa lý hơn là phụ thuộc vào vật chủ [44]

V Thị Qu nh Chi (2005) tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền Corynespora

cassiicola của 32 dòng vô tính cao su đang được trồng ở Việt Nam, sử dụng quy trình

chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR Tuy nhiên 7 nguồn nấm C cassiicola được nghiên cứu đều không có sự

khác biệt [1]

1.6 Phương pháp RT-PCR

RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) là một phương pháp tiêu chuẩn được sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện gen RT-PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA (DNA mạch đơn) lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA và cDNA ít bị thoái hóa hơn so với mRNA [67]

RT-PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR, tuy nhiên trước khi thực hiện phản ứng khuếch đại có thêm giai đoạn t ng hợp cDNA (complementary DNA) từ sợi mRNA khuôn mẫu Giai đoạn này được thực hiện nhờ enzyme reverse transcriptase, enzyme phiên mã ngược được phân lập từ retrovirus Nếu cung cấp một primer bắt cặp với mRNA, enzyme reverse transcriptase sẽ thực hiện phản ứng phiên mã ngược, t ng hợp nên một sợi DNA b sung với sợ mRNA khuôn, gọi là cDNA Sau khi được tạo ra, sợi cDNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại DNA thông thường [67, 7]

1.7 Vai trò của vùng rDNA-ITS trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Gen RNA ribosome (còn gọi là ribosome DNA hoặc rDNA) được mã hóa bởi DNA trong nhân tế bào và ty thể, các rRNA kết hợp với các phân tử protein chuyên biệt tạo thành các ribosome có chức năng trong t ng hợp protein Các rDNA trong nhân tế bào được xếp thành một chuỗi các đơn vị lặp lại nối tiếp nhau, chứa nhiều vùng bảo tồn và biến động ừên khắp toàn bộ chiều dài cùa chúng [66] Tùy theo hệ số lắng mà các rDNA được phân biệt với nhau và vùng rDNA của nhân tế bào thường bao gồm ba gen (18S, 5.8S và 28S) cách nhau bời những vùng gọi là ITS (internal transcribed spacer) và được xếp thành một chuỗi các đơn vị lặp lại nhiều lân Mỗi một đơn vị lặp lại gồm có một vùng phiên mã và một vùng không phiên mã, vùng phiên mã của các gen 18S, 5.8S và 28S mã hóa cho các rRNA tương ứng Vùng giữa gen 18S và 5.8S và vùng giữa gen 5.8S và 28S lần lược được gọi là ITS1 và ITS 2 (internal transcribe spacer 1, 2) Giữa các bản sao của gen rRNA có một vùng gọi là IGS (intergenic spacer) Các vùng spacer, đặc biệt là vùng IGS, thường biến đ i đáng kể ngay cả trong cùng loài [12]

Trình tự Nucleotide của các gen rRNA đã được áp dụng trong nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài ở mức phân loại khác nhau của nhiều sinh vật Các vùng spacer, rDNA chứa những vùng bảo tồn cao (18S, 5.8S, 28S) c ng như những vùng ít bảo tồn (ITS) và những vùng biến động (IGS) Các vùng ITS của các đơn vị lặp lại của

rDNA trong nhân luôn biến động nhất và có thể khác nhau giữa các loài và các quần thể Vì vậy, vùng rDNA-ITS được xem là hữu ích cho việc tìm hiểu về các m i quan hệ di truyền và phân loại các kiểu biến động trong nấm Trình tự cùa vùng này c ng được sử dụng để phát hiện và định lượng sự biến động của nhiều loài hoặc nhóm nấm [66, 12]

Hiện nay, vùng rDNA-ITS có lẽ là vùng được giải trình tự rộng rãi nhất ở các loài nấm Đây là công cụ hữu dụng nhất cho phân tích hệ thống phân từ ở mức độ giữa các loài vả kề cả trong cấp độ cùng loài, chẳng hạn như để xác định sự phát sinh các nòi địa lý mới Do mức độ biến dị của nó cao hơn cắc vùng di truyền khác của rDNA [Small Sub Unit 18S (SSU) và Large Sub Unit 25-28S (LSU)], sự biến dị của các đoạn lặp lại rDNA riêng biệt có thể được quan sát trong vùng ITS Thêm vào đó, các mồi chuẩn ITS 1 và ITS4 được sử dụng ở hầu hết các phòng thí nghiệm, một vài primer phân nhóm chuyên biệt được mô tả cho phép khuếch đại chọn lọc các trình tự của nấm [7]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Bệnh Học Người, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Mẫu nghiên cứu

2.2.1.1 Chủng nấm Corynespora cassiicola

Đối tượng khảo sát là gen gây độc cas hiện diện trên nấm C cassiicola gây hại cây cao su, 40 mẫu nấm Corynespora cassiicola do Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Viện Nghiên

cứu Cao su Việt Nam cung cấp và có nguồn gốc như trong Bảng 2.1, và Hình 2.1

Bảng 2.1 Các mẫu nấm Corynespora Cassiicola sử dụng trong nghiên cứu

STT

Tên mẫu

Dòng vô tính

Năm thu thập

17 CoryDP01 Lô 10, Tân Hưng, Đồng Phú, Bình Phước RRIV4 2010

Hình 2.1 Những con số trên bản đồ tương ứng với số thứ tự nguồn nấm ở bảng 2.1

2.2.1.2 Lá cao su non, lá đu đủ, khoai mì, cà chua

Lá cao su non (10 – 15 ngày tu i kể từ thời điểm hé chồi), lá có màu xanh nhạt, không có sự hiện diện bệnh của 7 dòng vô tính cao su trong cơ cấu giống cao su năm 2016 - 2020: RRIV 1, RRIV 106, RRIV 114, RRIV 209, PB 255, RRIV 124, RRIV 103 được sử dụng cho thí nghiệm gây nhiễm trên lá cao su tách rời Lá cao su được thu thập tại Vườn nhân - Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam

Lá đu đủ, khoai mì, cà chua ở giai đoạn chuẩn bị thành thục, không có sự hiện điện của bệnh, được thu thập từ vườn rau của các hộ nông dân

2.2.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: Môi trường thạch PDA, môi trường thạch PSA, môi trường NA, môi

trường CM, Agarose (Invitrogene, Mỹ), TBE 10X, 6X gel loading dye (BioLabs, Anh), 1 kb DNA ladder N3232S (Biolabs, Anh), ethanol 96% (Merck, Đức), ethanol 70%,

Cách nấu môi trường PSA:

cất hai lần đun sôi trong 30 phút