Trong đó Lactobacillus là một chỉvi khuẩn quan trọng được sử dụng từ xưa đến nay trong các sản phẩm lên men, là chủngkhởi động trong nhiều quá trình lên men công nghiệp và cũng là một tr
ĐẶT VAN DE
TONG QUAN
1.1 Probiotic và một số hoạt tính căn bản
“Probiotic” bắt nguồn từ tiếng La tinh, có nghĩa là “cho cuộc sống” Thuật ngữ probiotic được sử dụng lần đầu tiên bởi Liley và Stillwell năm 1965, mô tả đây là những hợp chất ma một loài vi sinh vật tiết ra có thé kích thích sự phát triển một cơ thé khác Sperti (1971) định nghĩa probiotic là những chất chiết xuất từ các mô, có lợi cho cơ thể Năm 1974, Parker định nghĩa probiotic là những vi sinh vật và “chất” có vai trò cân băng hệ vi sinh vật đường ruột Định nghĩa nay cho thấy probiotic bao gồm cả vi sinh vật sống và các “chat”, các chất này có thể từ vi sinh vật hoặc không từ vi sinh vật Đến năm 1989, Fuller định nghĩa lai probiotic là “một loại thức ăn bố sung vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng đến cơ thể chủ thông qua việc tạo sự cân bang hệ vi sinh vật đường ruột” (Fuller, 1992) Trong định nghĩa nay có dé cập đến vai trò cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của probiotic, tuy nhiên nhiều nghiên cứu lại chỉ ra nhiều vai trò mới của probiotic không chỉ đối với đường ruột mà với rất nhiều quá trình chuyên hóa của cơ thé Vì vậy tổ chức FAO/WHO năm 2001 đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Những vi sinh vật sống khi đưa vào co thé với số lượng hợp lí sẽ mang lại lợi ích cho cơ thé chủ” (FAO/WHO,
Probiotic là những vi sinh vật có lợi, không sinh và không chứa độc tố cũng như chong chịu được với các điều kiện của môi trường đường ruột như pH thấp, muối mật, bám dính trên thành ruột Probiotic được sử dụng cho người chủ yếu gồm hai nhóm vi khuẩn lactic là Bifidobacteria (B longum, B infantis, B adolescentis) và vi khuân lactic GC thap nhu Enterococcus spp, Lactobacillus spp, Lactococcus spp, Leuconostoc spp,
Bang 1.1: Một số probiotic và nguồn thu nhận Chỉ vi khuân | Chung giông Nguôn phân lập Tham khảo
Lactobacillus | L kefir Kefir Carasi et al., 2014
L plantarum Kim chi Lee et al., 2014
L fermentum Dua cai Hué-VN Huong,Thuy, 2012
L paracasei subsp tolerans Tibetan kefir-Trung | Miao et al., 2014
L pentosus, L plantarum subsp Omegison-Han Oh, Jung, 2015 plantarum, L sakei subsp sakei quéc
L lactis subsp cremoris, L lactis Phomat Parente and Cogan, subsp lactis, L delbrueckii subsp 2004; Quigley et al., delbrueckii, L delbrueckii subsp 2011 lactis, L helveticus, L casei, L. plantarum, L salivarius,
Bifidobacteria | B longum, B breve, B bifidum Phan su, sta me Michelini et al., 2015
B aesculapii, B callithricos, B | Phân khỉ đuôi soc | Subramonian, 2016 reuteri con
Pediococcus | P pentosaceus, P acidilactici Omegison-Han Oh, Jung, 2015 quéc
Enterococcus | E faecalis Ruột ca nước ngọt | Allameh et al., 2014
E faecium Phân su trẻ so sinh | Kumar et al., 2015
Nam men Kluyveromyces marxianus Kefir Gabriela et al., 2013
Nhiều chủng khuẩn là những vi sinh thường trú trong đường ruột của người và động vật, được sử dụng làm probiotic cũng như chủng khởi động trong nhiều quá trình lên men.
Những chủng vi sinh vat này được thu nhận từ nhiều nguồn như miệng, sữa động vật, phân, dịch nhầy âm dao, sản phẩm lên men truyền thống (Bang 1.1) Dé tồn tại được trong môi trường đường ruột, probiotic có những cơ chế khác nhau dé thích nghỉ với điều kiện stress, đó là khả năng chịu được pH thấp, nông độ muối mật cao, khả năng bám dính và kháng khuẩn.
1.1.2 Một số hoạt tính của probiotic
1.1.2.1 Khả năng chịu pH thấp pH của dịch dạ dày từ khoang 1,8-3,5, phù hợp cho hoạt động của các enzyme tiêu hóa như pepsin (Gowri et al., 2014) Khi probiotic vao tới dạ dày, tín hiệu pH thấp kích thích hoạt động của hàng loạt enzyme và hệ thống phòng vệ tế bảo chống chịu với điều kiện stress Trong điều kiện acid cao, hoạt động của kênh vận chuyển H”/ATPase tăng lên nhằm tăng tốc độ chuyên H* ra khỏi tế bào, các acid béo không no được tăng cường tông hợp dé bảo vệ tế bao (Shobharani et al., 2014) Nghiên cứu sự biểu hiện của các protein của vi khuan Lactobacillus reuteri trong điều kiện nuôi cây ở các pH thấp khác nhau cho thay các protein tăng biểu hiện thuộc vào một số nhóm như: protein vận chuyến, dich mã, chuyền hóa nucleotide và tổng hop amino acid, tong hop năng lượng, cân bằng acid và stress (Lee et al., 2008) Có sự tăng và giảm biểu hiện cua hàng loạt gene trong tế baoBifidobacterium longum subsp longum BBMN68 dé đáp ứng với điều kiện stress Trong môi trường acid, tế bào tổng hợp hàng loạt chất làm lá chắn chống lại sự xâm nhập của ion H”, bao gồm acid béo, peptidoglycan, polysaccharide ngoại bào Khi ion H* xâm nhập qua màng tế bào, có 4 đáp ứng chính bao gồm: enzyme xuyên mang FoF1-ATPase được kích hoạt và thông qua hoạt động của mình tiễn hành bơm HT ra khỏi tế bào, NH3 được tao boi chu trình cysteine-cystathione trung hỏa ion H'*, tế bào kích thích sự hoạt động của hệ thong NER-UVA và NER-VSR bảo vệ, sửa sai DNA và kích thích đáp ứng của toàn bộ hệ thống tế bào đối với điều kiện stress (Jin et al., 2012).
1.1.2.2 Khả năng chịu muối mật Mật là dung dịch có màu vàng xanh, thành phan chính bao gồm acid mật, cholesterol, phospholipid và sắc tô Acid mật thuộc nhóm acid steroid là thành phan chủ yếu của dịch mật chiếm khoảng 80%, acid mật nồi với taurine hoặc glycine, là cau trúc của muối mật.
Mật được tong hợp ở tế bao gan và được chuyền vao ta trang sau khi thức ăn đưa vào tới ruột non Dịch mật có vai trò hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, nhũ tương hóa chất béo thành dạng micelle Dịch mật còn có tác dụng như chất tây rửa sinh học, ức chế và tiêu diệt vi khuân gây hại thông qua cơ chế phân hủy màng tế bao của tác nhân xâm nhập (Begley et al.,
Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase (BSH) được tìm thấy ở nhiều chung vi khuân đường ruột như Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Clostridium, Bacteroides Gây đột bién gene BHS ở các chủng vi khuan Lactobacillus hoang dai cho thay tế bao trở nên mẫn cam với dịch mật, kha năng tôn tai trong điều kiện có muối mật giảm xuống (Begley et al., 2006) Enzyme BSH đóng vai trỏ quan trọng trong thủy phân muối mật Sản phâm sau thủy phân cung cấp một phan năng lượng cho hoạt động của vi khuẩn Amino acid thủy giải từ dich mật là nguồn carbon, nitrogen, glycine được chuyền hóa thành ammoniac va carbon dioxide, còn taurine thì chuyển thành ammoniac, carbon dioxide va sulfate Hoạt động cua enzyme con là tín hiệu kích thích các hoạt động của tế bao dap ứng với điều kiện stress Khi bổ sung dịch mật vào môi trường lên men 7. rhamnosus GG thay có sự kích hoạt biểu hiện của các cơ chế bảo vệ tế bao trước điều kiện stress, tác động lên hợp chất acid béo, thay đổi bề mặt tế bào, độ day của lớp polysaccharide ngoại bao (Reyes-Nava et al., 2014) Nghiên cứu sự thay đổi của protein trong tế bao đáp ứng điều kiện có dịch mật đối với L reuteri CRL1098 thay có các protein thay đối chủ yếu thuộc về các nhóm chuyên hóa nucleotide va glycerolipids, phiên ma và dịch ma, sửa sai DNA (Bustos et al., 2015).
Hang ngày có hàng chục triệu vi khuân đã bị cuốn trôi ra ngoài qua các hoạt động day thức ăn, nhu động ruột từ ruột non đến ruột gia và thai phân, vi vậy chìa khóa dé tổn tại được trong ruột chính là sự bám dính lên thành ruột cơ thé chủ (Gibson et al., 2014).
Những tế bào biểu mô ruột được bao phủ bởi một lớp màng nhay, đây là môi trường sinh hóa phức hop, giàu glycoprotein (mucins), peptide kháng khuẩn, kháng thể immunoglobulin và nhiều loại protein khác Mucin bao gồm dang gel (MUC2,
MUCSAC, MUCSB, MUC6) và dạng xuyên màng (MUCI, MUC3, MUC4, MUC12,
MUC13, MUC16, MUC17), trong đó MUC2 thì phổ biến ở ruột non và ruột kết Mucins giàu Ser/Thr và được liên kết với N-acetylgalactosamine, tạo thành mạng lưới cho sự liên kết của nhiều phức hop oligosaccharide khác: N-acetylglucosamine, galactose, fructose và sialic acid, những phân tử đường trung tính được gan thêm nhóm sulfur (Bergstrom et al., 2013) Thanh phan glycan phong phú là vị trí bám dính cho những vi sinh vật đáp ứng được môi trường đường ruột và có yếu tố phù hợp cho việc bám dính.
Nhận thấy có sự thay đối cau trúc của màng nhây ruột mỗi khi có sự viêm nhiễm, đây có thể là nguyên nhân hoặc kết quả của sự thay đổi hệ vi sinh vật bám trên màng ruột Điều này cho thay mucin glycan là một phan quan trọng trong cơ chế chọn vi sinh vật bám dính trong đường ruột.
Lactobacillus bam dính lên niêm mạc ruột nhờ các protein nhay nhớt-bám dính (mucus- binding protein- MUB) Sự trải dai của các MUB trên bề mặt tế bào cho phép có nhiều vị trí bám dính lên mucin glycan của niêm mạc ruột hơn Trong khi mỗi tiểu phần MUB có cau trúc giống với protein bề mặt của vi khuẩn gây bệnh thì tổ chức tong thé của MUB lại giải thích được cơ chế của quá trình bám dính lên niêm mạc ruột nhờ vào diện tích tiếp xúc với màng nhay lớn, và tương tác với các thụ thé trên lớp nhây (Etzold et al., 2014) Một trong số những enzyme này là sortase A, có vai trò phân tach threonine và glycine trong motif LPXTG, tạo liên kết cộng hóa trị giữa nhóm carboxyl của threonine và nhóm amino của màng tê bào vi khuân Khi gây đột biên ức chê và tăng cường biêu hiện của gene hmpref0536_ 10255 mã hóa cho Sortase A, kết quả cho thay tương ứng có sự giảm va tăng biểu hiện kha năng bám dính của L reuteri lên tế bao Caco-2 (Jensen et al., 2014).
1.1.2.4 Khả năng kháng khuẩn Uc chế và tiêu diệt những vi khuẩn gây hại là một hoạt tính đặc trưng của probiotic dé ton tại trong đường ruột Những lợi khuân này phát triển nhiều co chế kháng khuẩn có hại bao gồm:
Kích thích sự phát triển cua hệ vi sinh vật có lợi Khả năng một loại lợi khuẩn như Bifidobacterium tác động tiêu diệt vi khuẩn có hại thì khó xảy ra, tuy nhiên khi cơ thể có một hệ lợi khuẩn thì có kha năng day lùi các vi khuẩn gây bệnh xâm nhập Probiotic thêm vao đường ruột giúp làm giảm sự phát triển của các Enterobacteriaceae (Shigella và Escherichia), đồng thời kích thích sự phát triển của vi sinh ngành Firmicutes, đa số thuộc chi Anaerotruncus (Grazul et al., 2016).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm Đề tài được thực hiện từ tháng 6/2016 đến tháng 8/2017
Các thí nghiệm được thực hiện ở phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, thuộc bộ môn
Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố H6 Chí Minh 2.2 Vật liệu và thiết bị sử dụng
Các mẫu rau quả lên men gồm cải chua, dưa gia, cà pháo, kim chi, nem chua, được thu thập từ các chợ và siêu thị trong thành phố Hồ Chí Minh, mẫu được phân tích trong vòng 24 giờ sau khi mang về phòng thí nghiệm.
2.2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng Môi trường de Man, Rogosa and Sharpe broth-MRS lỏng (glucose 20 g/l, cao nam men
5 g/l, cao thịt 10 g/l, peptone 10 g/I, natri acetate 5 g/l, triamonium citrate 2 g/l, K2HPO4
2 g/l, MgSOa.7H20 0,2 g/l, MnSO4.H20 0,2 g/l, Tween 80 1 g/l), dang thạch được bổ sung agar 2%.
Môi trường Luria-Bertani broth-LB lỏng (pepton 1 g/l, yeast extract 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l), dang thạch được bồ sung agar 2%.
Thuốc nhuộm Gram, muối mật, đệm potassium phosphate, 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), potassium ferricyanide K3[Fe(CN)6], trichloroacetic acid CC]I:COOH, ferric chloride FeCl.
Vi khuẩn gây bệnh: Salmonella typhimurium ATCC 19111 va Listeria monocytogences
Thiết bị sử dụng: Một số thiết bi thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh: tủ ủ, tủ cay, nôi hấp, tủ say, máy ly tâm, máy đo mật độ quang.
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
J Khuan lac trên môi trường chon lọc
Phân lập Quan sát đại thé, vi thé |
Phan ứng sinh hóa đặc trưng
Bám dính probiotic cơ bản x
Khao sat hoat tinh Tổng năng lực khử kháng oxi hóa Bắt gốc tự do DPPH À4 Định danh chủng tiềm
Bao quan và lập tư liêu bộ giốn năng q ập su bộ giông
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
2.3.2 Thuyết minh sơ đồ 2.3.2.1 Thu thập mau và phân lập vi khuẩn Lactobacillus
Một số mẫu thực phẩm lên men như Kim Chi, Cà Pháo, Cải Chua, Dưa Giá, Dưa Chuột muối được thu thập từ một số chợ và siêu thị trong thành phố Hỗ Chí Minh (xem phụ lục) Sản phẩm thương mại Yakult được sử dụng dé phân lập chủng Lactobacillus casei Shirota, chủng khuân nay được dùng làm chủng tham khảo cho các thí nghiệm sàng lọc hoạt tính probiotic Mẫu được tiền tăng sinh trong 10 ml môi trường MRS lỏng qua đêm ở 37°C trước khi phân lập Quá trình phân lập được thực hiện băng cách pha loãng thập phân đến 10°, trải lên môi trường MRS thạch và ủ 6 37°C trong thời gian từ 24 đến 48 giờ Sau đó làm thuần nhiều lần và thực hiện một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng của Lactobacillus Chọn những chủng có hình que, Gram dương, catalase 4m tính, vi hiéu khí, không di dong, giống được giữ lạnh 5-8°C trên ống nghiệm thạch nghiêng.
2.3.2.2 Khao sát hoạt tinh probiotic co bản
Các hoạt tính probiotic co bản được khảo sát in-vitro nhằm sang lọc những chủng vi khuẩn vừa phân lập có khả năng chịu được các điều kiện cực đoan trong đường ruột Các thử nghiệm được thực hiện bao gồm khả năng chịu pH thấp và muối mật, khả năng tự bám dính và hoạt tính kháng khuẩn Những chủng Lactobacillus cho thay có hoạt tính probiotic cao được tuyén chọn dé thực hiện các khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa. a Khả năng chịu acid và muối mật
1 ml giống được nuôi tăng sinh cấp hai ở 37°C trong 24 giờ trong 50 ml MRS lỏng Ly tâm 4000 rpm trong 15 phút thu nhận sinh khối, hòa lại sinh khối trong 5 ml đệm phosphate pH 6,5 Chuyển lần lượt 1 ml sinh khối vào các chai chứa 10 ml môi trườngMRS pH 2,5 có bố sung muối mật 0,3% và chai môi trường MRS lỏng pH 6,5 làm đối chứng Ủ các chai ở 37°C trong 3 giờ, sau đó pha loãng đến 107 và trải đĩa để kiểm tra mật độ tế bào Xác định phần trăm khả năng sống sót của tế bảo theo công thức:
(Mi/Mo)*100% trong đó: M1: mật độ tế bào ở điều kiện pH 2,5 và muối mật 0,3%, Mo: mật độ tế bao ở điều kiện pH 6,5.
Các chủng có khả năng chịu được pH thấp kèm theo muối mật được sử dụng trong các thử nghiệm tiếp theo. b Kiếm tra kha năng tự bám dính
Hoạt tính tự bám dính của màng tế bào thể hiện đặc tính bám dính của chung vi khuan đó Phương pháp kiểm tra được thực hiện theo Kos va cộng sự (2003) Vi khuẩn sau khi được tăng sinh cấp hai trong 30 ml môi trường MRS lỏng, ly tâm 4000 rpm trong 15 phút thu lay sinh khối Sinh khối được rửa hai lần trong dung dịch đệm PBS pH 6,5 rồi hòa lại trong 4 ml đệm Quá trình tự bám dính được thực hiện trong thời gian 5 giờ Ở thời điểm 0 giờ, mẫu được vortex 10 giây, sau đó hút 0,1 ml mẫu hòa với 3,9 ml đệm, do OD 600 nm Sau đó tai mỗi thời điểm 1, 2, 3, 4 5 giờ, hút 0,1 ml dịch phía trên cua mẫu hòa với 3,9 ml đệm, đo OD 600 nm Phần trăm kha năng tự bám dính được tính theo công thức: [1-(A/Ao)]*100%, trong đó Ao: giá trị OD đo được ở thời điểm 0 giờ,
At: giá tri OD đo ở các thời gian 1, 2, 3, 4, 5 gid (Kos et al., 2003). c Hoạt tính kháng khuẩn
Khảo sát khả năng của vi khuẩn Lactobacillus kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh bang phương pháp đục lỗ thạch Hai đại diện vi khuẩn gây bệnh Gram dương và Gram âm sử dụng bao gồm Salmonella typhimurium ATCC 19111 va Listeria monocytogences ATCC 14028 duoc sử dung lưu giữ tại ngân hàng giống của bộ môn Công nghệ sinh học, trường đại học Bách khoa.
Tang sinh cấp hai ở 37°C trong 24 giờ vi khuân Lactobacillus trong 30 ml MRS lỏng, ly tâm 4000 rpm trong 15 phút thu nhận dịch nổi Tăng sinh các chủng vi khuẩn gây bệnh qua đêm trên 10 ml môi trường LB lỏng, pha loãng đến 10 và trải lên các đĩa thạch LB,sau đó duc lỗ thạch tạo giếng bang 1 ống nhựa vô trùng, bơm dịch nỗi của các chủng
Lactobacillus cần kiêm tra lên và ủ ở 37°C trong 48 giờ Do kích thước vùng kháng khuẩn và đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chủng Lactobacillus cần kiểm tra
2.3.2.3 Khao sát hoạt tính kháng oxi hóa của những chúng Lactobacillus có hoạt tính probiotic cao
Các thử nghiệm kha năng kháng oxi hóa của những chung Lactobacillus có hoạt tính probiotic cao bao gém các phản ứng: bắt gốc tự do DPPH và tong năng lực khử Các phản ứng được thực hiện đối với dịch ngoại bào vi khuẩn Vi khuẩn được tăng sinh cấp hai trong 10 ml dịch môi trường MRS ở 37°C trong 24 giờ trước khi thực hiện thí nghiệm. a Phản ứng bắt gốc tự do DPPH
Các chất có hoạt tính kháng oxi hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dich DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Khả năng này được xác định bằng cách đo độ hấp thu tai bước sóng 517 nm Dịch ngoại bào vi khuẩn được thu nhận bang phương pháp ly tâm lạnh 13000 rpm trong 5 phút Quy trình thực hiện bằng cách thêm 460 ul ethanol và 1.5 ml DPPH 250 uM vào 40 ul mẫu, ủ tôi trong 30 phút ở nhiệt độ phòng va đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm DPPH 250 uM được chuẩn bị bằng cách hòa 19,72 mg DPPH với ethanol 99% và định mức lên 200 ml, thuốc thử được chứa trong chai tối và sử dụng trong ngày (Arora, Chandra, 2011) Mẫu trăng là mẫu chứa dung môi, thuốc thử và môi trường MRS vô trùng.
Phan trăm khả năng bắt gốc tự do: [(Ablank —Amiu)/Ablank]* 100% b Tổng năng lực khứ
Khả năng khử có liên quan đến hoạt động kháng oxi hóa và phản ánh được khả năng kháng oxi hóa của một chất Hợp chất có năng lực khử thé hiện ở khả năng cho electron và khử các hợp chất oxi hóa sinh ra trong các quá trình chuyển hóa năng lượng Dịch canh trường vi khuẩn được ly tâm 4000 rpm trong 20 phút dé loại bỏ sinh khối 2,5 ml dung dich sau ly tâm được hòa với 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate pH 6,6 và
2,5 ml dung dich potassium ferricyanide K3[Fe(CN)ô] 1% Hỗn hợp được ủ trong bề điều nhiệt ở 50°C thời gian 20 phút Sau thời gian phan ứng, thêm vào 2,5 ml dung dịch trichloroacetic acid CClaiCOOH 10% Ly tâm hỗn hợp ở 650 rpm trong 10 phút Lay 5 ml dịch nỗi hòa với 5 ml nước cất và 1 ml dung dịch ferric chloride FeCl; 0,1% Do độ hấp thu ở bước sóng 700 nm Mẫu trăng là mẫu môi trường MRS đã hấp vô trùng, thực hiện các bước tương tự như trên Năng lực khử càng cao khi độ hấp thu càng cao
2.3.2.4 Định danh chủng vi khuẩn tiềm năng Chung khuẩn có hoạt tinh probiotic và khả năng kháng oxi hóa cao được định danh bang phương pháp giải trình tự 16S rRNA tại công ty TNHH thương mại Nam Khoa.
2.3.2.5 Báo quản chúng giống Tăng sinh cấp hai chủng giống cần bảo quản trong 10 ml môi trường MRS lỏng ở 37°C trong thời gian 24 giờ Sinh khối tế bao được thu nhận băng cách ly tâm lạnh 13000 rpm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi Thực hiện thao tác vô trùng thêm dung dich bảo vệ tế bao (đã được hấp khử trùng) gồm: glycerol 10 g/l, lactose 5 g/l, cao nam men 0,5 g/l Tron đều dé tao dịch huyền phù, sau đó bảo quan ở nhiệt độ -70°C.
2.3.3 Phương pháp xử lí số liệuCác thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lí bang Excel và thé hiện giá trị trung bình kèm theo độ lệch chuẩn.
KÉT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ một số loại thực phẩm lên men Một số thực phẩm lên men truyền thống của nước ta bao gồm cải chua, kim chỉ, dưa giá, dưa ca, nem chua, mẻ, được dung trong thí nghiệm phân lập vi khuẩn Lactobacillus Kết quả thu nhận được 29 chủng vi khuẩn định danh ban dau là Lactobacillus, trong đó có 6 chủng nguồn từ cải chua, 2 chủng từ ca pháo, 2 chủng từ dưa giá đỗ, 17 chủng từ kim chi, 1 chủng từ nem chua, 1 chủng từ sản phẩm thương mai (sản phẩm Yakult) Chon những chủng khác nhau dựa trên sản phẩm lên men khác nhau và sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc, hình thái té bào, độ bắt màu tim trong quá trình nhuộm Gram Đặc điểm sinh hóa của 29 chủng vi khuẩn phân lập được đáp ứng các yêu cầu của chi vi khuẩn Lactobacillus gồm hình que, Gram dương, catalase âm, vi hiéu khi, không di động Mot số mô tả và hình ảnh được ghi nhận trong bảng 3.1 Ching thương mai duoc sử dung trong nghiên cứu này là chủng Lactobacillus casei Shirota phan lập từ sản phẩm sữa chua uống Yakult Day là chủng khuan probiotic đã được chứng nhận an toàn và được sử dụng rộng rãi Chủng khuẩn này được sử dụng như chủng tham khảo cho những thí nghiệm sang lọc hoạt tính probiotic.
Lên men là quá trình phân giải chậm carbohydrate nhờ vi sinh vật hoặc enzyme tạo thành các hợp chất hữu cơ khác, đồng thời có sản phẩm rượu hoặc acid hữu cơ Trong nhiều trường hop, phương pháp lên men được giữ bí mật và truyền lại trong gia đình qua các thế hệ, vì vậy sản phẩm lên men có những đặc điểm khác biệt Sử dụng nguyên liệu, phương pháp va thời gian lên men khác nhau, các sản phẩm sẽ cho được hương vị riêng.
Hệ vi sinh vật trong sản phẩm lên men cũng sẽ có những đặc thù về chủng, cũng như về mật độ hoạt động trong quá trình tạo thành sản phẩm.
Các sản phẩm lên men lactic phô bién ở Việt Nam và nhiều quốc gia khác trên thé giới,nghiên cứu cho thấy với tinh đa dạng về nguồn nguyên liệu và phương pháp lên men ở những địa phương, vùng miễn khác nhau, có sự phong phú về các sản phẩm, qua đó hệ vi sinh vật cũng đa dạng không kém Lactobacillus thuộc nhóm vi khuẩn lactic, có hình que, Gram dương, không tạo bào tử, không chứa sắc t6, catalase âm tính và là những vi khuẩn vi hiếu khí Lactobacillus là vi khuẩn lên men chủ yếu trong nhiều sản phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam và trên thế giới Trong ngành công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn lactic nói chung, cũng như Lactobacillus nói riêng được sử dụng làm chủng khởi động trong nhiều quá trình lên men công nghiệp Với những vai trò đối với sức khỏe và khả năng ứng dụng trong công nghiệp như vậy nhiều nghiên cứu thực hiện bước phân lập và tuyển chon Lactobacillus như: công trình của Hoang Quốc Khanh va cộng sự năm
2011 phan lập được 12 chung Lactobacillus có hoạt tính probiotic từ phân trẻ sơ sinh
(Hoàng Quốc Khánh et al., 2012) Nghiên cứu của Shokryazdan và cộng sự năm 2014 phân lập từ nhiều nguồn như sữa, phân su, sản phẩm lên men truyền thống, từ 1400 chung vi khuẩn lactic sàng loc thu được 9 chung, định danh là Lactobacillus có hoạt tính probiotic, được sử dụng khảo sát khả năng kháng khuẩn (Shokryazdan et al., 2014).
Với mục tiêu chọn những chủng giống có hoạt tinh probiotic cao, chúng tôi chú trọng sàng lọc lẫy những chủng chịu được điều kiện khắc nghiệt trong đường ruột Để bước đầu nhận định về hoạt tính probiotic của một chung vi sinh vật, các khảo sát về khả năng chịu pH thấp, muối mật cũng như hoạt tính bám dính và hoạt tính kháng khuẩn là điều cần thiết vì đây là những đặc tính co bản của một chủng vi sinh vật khi muốn tổn tại được trong đường ruột Mặc dù các thử nghiệm in-vitro thì không mô phỏng hoàn toàn điều kiện thực tế trong đường ruột, nhưng những kết qua này cũng góp phan tạo cơ sở cho các thí nghiệm in-vivo.
Bang 3.1: Hình anh một số chủng Lactobacillus trong bộ sưu tập phân lập được
Lac 3 Khuân lạc mờ, trăng nhạt, ướt Tê bào hình que, rời rạc
Lac 8 = Khuân lạc trăng nhạt, tròn lôi Tê bao lấ que ngăn, kêt chùm |
Lac 16 Khuan lac trang duc, bong Té bao hinh que ngăn, két đôi
Lac 29 Khuân lạc trăng sữa, tròn, lôi Tê bào hình que dài, kêt đám
Lac 33Khuân lạc trăng trong, không nhớt, viên không đêu Tê bào tím đậm, que dai
3.2 Kết qua sang lọc các hoạt tinh probiotic co bản
3.2.1 Kha năng chịu pH thấp và mudi mật Một trong những tính chất quan trọng của chủng vi sinh vat probiotic là khả năng sống sót được trong môi trường đường ruột Trước khi cư trú thường xuyên trong bề mặt niêm mạc ruột, những chủng vi sinh vật nay cần sống sót được qua môi trường khắc nghiệt của da day, và ruột non, đó là kha năng chịu được pH thấp và muối mật.
Kết qua thí nghiệm khảo sát kha năng chịu pH thấp và mudi mật được thé hiện trong bảng 3.2 Tất cả các chủng vi khuẩn Lactobacillus phan lập được đều có khả năng chịu được điều kiện pH 2,5 và 0,3% muối mật, khả năng sống sót đạt hơn 60%, trong đó 22 chủng Lactobacillus có phan trăm sống sót lớn hơn 85% Ching Lac 29 vượt trội nhất, phân trăm sống sót đạt trên 94% Chủng Lac 29 và Lac 23 có khả năng chịu đựng điều kiện pH thấp và muối mật cao hon chủng L casei Shirota.
Thực hiện thí nghiệm khảo sát khả năng chịu pH thấp, chúng tôi chọn pH 2,5 vì đây là giá tri trung bình cua pH dich dạ dày Chúng tôi chọn nông độ muối mật 0,3% vì mặc dù nông độ muối mật thay đôi phụ thuộc vào chế độ ăn uống, nông độ của dịch tụy và thé trạng của từng người, trong nhiều nghiên cứu, giá trị 0,3% được sử dung trong xác định hoạt tính probiotic của Lactobacillus (Shokryazdan et al., 2014).
Nghiên cứu cho thay vi khuẩn Lactobacillus có khả năng đáp ứng khác nhau đối với pH thấp trong các khoảng thời gian khác nhau, hầu hết chịu đựng yếu tại pH 1 sau 2 giờ ủ, đối với pH 2 thì khả năng sống sót trung bình, phát triển hầu như tốt trong điều kiện pH
3 và 4 (Jin et al., 1998) Trong nghiên cứu thực hiện trên 29 chung Lactobacillus phan lập từ các sản phẩm lên men truyền thống của Hy Lạp, kết quả cho thấy hầu hết sức sống của các chủng không bị ảnh hưởng bởi điều kiện pH 3 và muối mật 0,3% (Maragkoudakis et al., 2006) Tương tự, 23 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sản phẩm men tiêu hóa và sữa người cũng có khả năng chống chịu tốt dưới điều kiện pH 3 trong thời gian 3 giờ(Nguyễn Hữu Hiền, Nguyễn Phước Hiệp, 2014).
Bang 3.2: Kết qua khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật
Nguồn Mật độ tế bào Khả năng STT | Kíhiệu chủng | phân lập (Log10CFU/ml) sống sót pH 2.5+0.3% pH 6.5 (%) muối mật
1 Lac 29 Kim Chỉ 8,21+ 0,53 8,69+0,30 94,47 2 Lac 23 Cai chua 8,74 +0,03 9,44+0,01 92,51 3 L casei Shirota Yakult 8,30 + 0,62 9,00+0,79 92,20 4 Lac 7 Cai chua 7,66+0,03 8,42+0,24 91,01 5 Lac 6 Cai chua 7,39+0,25 8,17+0,24 90,42 6 Lac 34 Kim chi 7,78+0,16 8,66+0,35 89,87 7 Lac 21 Kim chi 7,81+0,05 8,73+40,17 89,45 8 Lac 28 Dưa gia 8,32+0,51 9,32+0,59 89,22 9 Lac 15 Kim chi 7,43+1,44 8,35+1,57 89,07 10 Lac 5 Cai chua 7,55+0,01 8,49+0,19 88,91 11 Lac 9 Ca Phao 7,83+0,02 8,85+0,05 88,44 12 Lac 4 Cai chua 7,61+0,18 8,63+0,38 88,17 13 Lac 8 Ca phao 7,81+0,14 8,87+0,05 88,08 14 Lac 14 Kim chi 7,74+0,10 8,79+0,16 88,05 15 Lac 30 Kim chi 8,17+0,38 9,28+0,64 87,99 16 Lac 11 Kim chi 7,86+0,03 8,94+0,06 87,84 17 Lac 33 Kim chi 8,13+0,44 9,29+0,55 87,49 18 Lac 16 Kim chi 8,07+0,48 9,25+0,66 87,25 19 Lac 3 Cai chua 7,23+0,39 8,29+0,24 87,19 20 Lac 19 Kim chi 7,7740,17 8,97+0,09 86,62 21 Lac 20 Kim chi 7,60+0,38 8,78+0,22 86,48 22 Lac 10 Nem chua 7,44+0,30 8,73+0,22 85,26 23 Lac 12 Kim chi 7,26+0,41 8,66+40,22 83,78 24 Lac 26 Dua gia 7,62+0,42 9,32+0,59 81,76 25 Lac 17 Kim chi 6.45+0.54 §,34+0,77 77,31 26 Lac 13 Kim chi 5,83+40,38 7,61+0,29 76,62 27 Lac 27 Dua gia 5,52+0,06 7,52+0,07 73,34 28 Lac 32 Kim chi 5,93+0,04 8,55+0,24 69,40
Sau thí nghiệm sang loc những chủng chịu được điều kiện pH thấp va mudi mật, từ 29 chung Lactobacillus phan lập được, chúng tôi chọn được 20 chủng có phan tram sống sót cao nhất dé tiếp tục thực hiện những thí nghiệm kế tiếp.
3.2.2 Hoạt tính tự bám dính
20 chủng Lactobacillus có phần trăm sống sót tốt nhất trong điều kiện pH 2,5 va muối mật 0,3% được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát khả năng tự bam dính và kháng khuẩn.
Khả năng tự bám dính được đánh giá qua phan trăm tự bám dính sau các mốc thời gian
Sau 5 giờ thực hiện thi nghiệm cho thay kha năng tự bám dính các chủng vi khuẩn tăng dan theo thời gian và thay đổi tùy theo từng chủng, chủng Lac 28 cho thay kha năng bám dính cao nhất, đạt 71% Các chủng còn lại có hoạt tính bám dính dao động từ 20% đến 50% Độ tự kết dính của các chủng khuẩn khác nhau tùy theo từng ching, có những chủng thời điểm 1 giờ giá trị OD đo được cao, nhưng sau 5 giờ độ giảm OD không nhiều băng những chủng khác Điều này giúp so sánh được khả năng bám dính của các chủng với nhau Dién hình là chủng Lac 28 va Lac 30, thời điểm 1 giờ phan trăm tự bám dính của chủng Lac 28 là 19,81%, của chủng Lac 30 là 36,67%, chủng Lac 30 cao gan gấp đôi chủng Lac 28, tuy nhiên sau 5 giờ, phần trăm tự bám dính của chủng Lac 28 là 71,35%, trong khi đó phần trăm tự bám dính cua chung Lac 30 chỉ đạt 54,01% Sau 5 giờ thực hiên thí nghiệm, có 15 chủng Lactobacillus cho kết quả bám tự bám dính tốt hon chủng tham khảo L casei Shirota Kết quả được thé hiện trên bảng 3.3.
KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
4.1 Kết luận Từ một số sản phẩm lên men lactic truyền thong, chúng tôi đã phân lập được 29 chủng
Lactobacillus Sau quá trình sang lọc thu nhận được 8 chung có hoạt tính probiotic cao.
Trong đó chọn được hai chủng có hoạt tính kháng oxi hóa cao nỗi trội, được định danh là L plantarum và L brevis.
Hai chung probiotic Lactobacillus có hoạt tính khang oxi hóa cao hiện dang được bao quản tại Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách khoa TP H6 Chí Minh
4.2 Kiến nghị Thực hiện thêm một số khảo sát sâu hơn về hoạt tính probiotic đối với 8 chủng Lactobacillus có hoạt tinh probiotic cao như khảo sát kha năng sống sót ở những điều kiện pH thấp hon và muối mật cao hon, khả năng đồng bám dính và bám dính lên tế bào biểu mô ruột mô phỏng, khả năng kháng khuẩn đối với một số chủng vi khuẩn gây hại khác, đặc biệt là các chủng có khả năng kháng kháng sinh. Đánh giá sâu hơn khả năng kháng oxi hóa của hai chủng vi khuẩn tiém năng qua những thử nghiệm oxi hóa khác, đồng thời đánh giá khả năng khả năng kháng oxi hóa nội bào.
Khảo sát khả năng kháng oxi hóa của hai chủng vi khuẩn trong điều kiện stress và thăm dò khả năng trở thành thực phẩm chức năng có hoạt tính kháng oxi hóa của hai chủng vi khuẩn đã chọn.
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BÓ
Các kêt quả của nghiên cứu đã được công bô:
I Tran Thi Ngoc Diep, Nguyen Thuy Huong “Isolation, selection of Lactobacillus strains with probiotic and antioxidant activities” Journal of science, Ho Chi Minh city university of education, Vol 14, No 9 (2017): 170-178
2 Tran Thi Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Huong “Tống quan về hoạt tính kháng oxi hóa cua Lactobacillus” Tap chi khoa học, trưởng đại học su phạm Thanh phố Hồ Chí