Giá trӏ kinh tӃ ngành nuôi cá tra tҥi ViӋt Nam
1ăPGLӋn tích nuôi thӫy sҧn cӫa CҫQ7Kѫÿҥt 9.000 ha, sҧQOѭӧng 224.000 tҩQWăQJVRYӟLQăPWURQJÿyFiWUDFKLӃm khoҧng 80% [5]
Các sҧn phҭm tӯ cá tra hiӋQQD\ÿmFyPһt tҥi thӏ WUѭӡng cӫDKѫQTXӕc gia Chuӛi giá trӏ cӫDFiWUDFNJQJÿѭӧc nâng lên Tӯ EDQÿҫu chӍ FyFiWUDSKLOrÿӃn nay các nhà máy chӃ biӃQÿmiSGөng công nghӋ ÿӇ chiӃt xuҩt collagen tӯ da cá tra, dҫu cá, snack FiWUDăQOLӅn, cỏc phө phҭPNKiFFNJQJÿѭӧc tұn dөng làm bӝWFiô
Sau thӡi gian giҧm sâu kéo dài, giá cá tra nguyên liӋu, cá giӕng và giá xuҩt khҭu ÿӅXÿmWăQJWUӣ lҥLĈӃn cuӕi tháng 10/2020, giá cá tra nguyên liӋu tҥLĈӗng bҵng sông CӱX/RQJÿmWăQJOrQPӭc 21.000 - ÿӗng/kg ± mӭc giá có lãi FKRQJѭӡi nuôi Cùng vӟLÿyFiWUDJLӕQJFNJQJWăQJJLiNKiQKDQKGRWKLӃu nguӗn cung Sau mӝt thӡi gian dài chӍ quanh quҭn ӣ mӭc 15.000 ± ÿӗng/kg thì hiӋn nay, giá cá tra giӕng (loҥi 30 ± 35 con/kg) ӣ CҫQ7KѫÿmWăQJOrQ± ÿӗng/kg, gi~SQJѭӡi sҧn xuҩt có lãi khá cao Nguyên nhân khiӃn giá cá giӕng bұWWăQJOjGRTXêFy PѭDEmRWKӡi tiӃt bҩt lӧi nên viӋFѭѫQJQX{LEӏ hao hөt nhiӅu, dүQÿӃn nguӗn cung cá giӕng thiӃu hөt
7tQKÿӃn hӃt tháng 9/2020, diӋn tích thҧ nuôi cá tra tҥLĈӗng bҵng sông Cӱu Long ÿҥt 4.968 ha, bҵng 91% so vӟi cùng kǤ QăP7әng sҧQOѭӧQJFiWUDWKiQJÿҫu QăPѭӟFÿҥt trên 1 triӋu tҩn, bҵng 93,6% so vӟi cùng kǤ QăP[5]
Theo HiӋp hӝi chӃ biӃn và xuҩt khҭu thӫy sҧn ViӋt Nam, cá tra là mһt hàng có doanh sӕ xuҩt khҭu giҧm mҥnh; quý I (giҧm 29%), quý II giҧm 32%, tiӃp tөc giҧm 27% và 29% trong tháng 7 và tháng 8 Sang tháng 9, xuҩt khҭu cá tra tiӃp tөc giҧm 14% vӟi doanh sӕ ÿҥt 135 triӋX86'ÿѭDNӃt quҧ xuҩt khҭXONJ\NӃ WKiQJÿҫXQăPJLҧm 28% ÿҥt khoҧng 1 tӹ 86'7URQJNKLÿyWKiQJÿҫXQăPWăQJWUѭӣng xuҩt khҭu cá WUDOjÿҥt mӭc 1,6 tӹ USD [6]
Theo Tәng Cөc Thӫy sҧn, kim ngҥch xuҩt khҭXFiWUDWtQKÿӃQѭӟFÿҥt 1,12 tӹ USD, giҧm 27,5% so vӟi cùng kǤ QăP
Tình hình dӏch bӋnh gan thұn mӫ và bӋnh xuҩt huyӃt trên cá tra và bҩt cұp khi sӱ dөng kháng sinh
Tình hình dӏch bӋnh gan thұn mӫ trên cá tra
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 3
Vào thӡi gian giao mùa, khi mà nhiӋWÿӝ Qѭӟc chênh lӋch nhiӅu giӳDQJj\YjÿrP OjÿLӅu kiӋn thuұn lӧLÿӇ nhiӅu mҫm bӋnh phát triӇQÿһc biӋt là bӋnh gan thұn mӫ trên cá tra
BӋnh mӫ gan (bӋQK ÿӕm trҳng trên gan, thұn) trên cá tra, cá basa do nhóm vi khuҭn Edwardsiella ictaluri gây ra Vi khuҭn E ictaluri thuӝc hӑ Enterbacteriaceae là vi khuҭn gram âm, hình qXHNtFKWKѭӟc 1 x 2- ȝPNK{QJVLQKEjRWӱ, là vi khuҭn yӃm khí tùy tiӋn, phҧn ӭQJFDWDODVHGѭѫQJWtQKR[LGDVHkPWtQKNK{QJR[\KRiOrQPHQ WURQJP{LWUѭӡng glucose Có 1 - 3 Plasmid liên kӃt vӟi E ictaluri [7]
Hình 1 1 A Gan, thұn cá tra xuҩt hiӋQÿӕm trҳng, B Vi khuҭn E ictaluri nhuӝm gram (100X) [2]
TӕFÿӝ lây lan cӫa bӋnh gan thұn mӫ rҩt nhanh [8] Khi có mҫm bӋnh xâm nhұp khoҧng 3-4 ngày, toàn bӝ FiWURQJDRÿӅu bӏ nhiӉm bӋnh Tӹ lӋ cá chӃt cao có thӇ 100% ÿӕi vӟi cá bӝWѭѫQJJLӕng, tӯ 30 - ÿӕi vӟi cá thӏWYjÿmOjPJLҧPQăQJVXҩWÿiQJNӇ trong các hӋ thӕng nuôi [9]'RÿyFҫn có biӋn pháp phòng trӏ bӋnh tích cӵc Không GQJFѫTXDQQӝi tҥng, máu, mӫ và các sҧn phҭm phө cӫDFiÿӇ chӃ biӃn làm thӭFăQ trӣ lҥi cho cá, bӣi mҫm bӋnh sӁ tӗn tҥLOkXWURQJP{LWUѭӡQJQѭӟc và phát tán vi khuҭn gây bӋnh sang khu vӵc nuôi cá khác.
Tình hình dӏch bӋnh xuҩt huyӃt trên cá tra
BӋnh xuҩt huyӃt ӣ FiWUDWKѭӡng xuҩt hiӋn hҫXQKѭTXDQKQăPÿһc biӋt là khi cá bӏ sӕFP{LWUѭӡQJDRQX{LNK{QJÿҧm bҧo [2]
BӋnh xuҩt huyӃt xuҩt hiӋn ӣ hҫu hӃt các loài cá tra nuôi lӗng, bè, ao hӗ Qѭӟc ngӑt và ӣ tҩt cҧ FiFJLDLÿRҥn nuôi, bӋnh lây lan nhanh, cao (có thӇ ÿӃQWURQJWUѭӡng hӧp bӋnh nһng Ӣ ViӋt Nam, bӋnh xuҩt huyӃt do Aeromonas hydrophila xҧy ra quanh QăPWұSWUXQJYjRÿҫXPDNK{ÿһc biӋt là khi cá bӏ VWUHVVQKѭVDXNKLWUӡLPѭD%Ӌnh lây tӯ cá bӋnh sang cá khӓe trong cùng mӝt ao nuôi [10]
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 4
Vi khuҭn Aeromonas hydrophila thuӝc hӑ Aeromonadaceae [11] là vi khuҭn Gram õm, hỡQKTXHNtFKWKѭӟFWUXQJEuQKȝPợ-ȝPFyO{QJFyWKӇ di chuyӇn
Hình 1 2 A: Cá tra bӏ xuҩt huyӃt, B: vi khuҭn A hydrophila Gѭӟi kính hiӇQYLÿLӋn tӱ
Trong quá trình nuôi, các ao nuôi tích tө mùn bã, bùn, rác và các chҩt thҧi khác làm ô nhiӉm nguӗQQѭӟc, tiӅm ҭn các mҫm bӋQKÿӕi vӟLFiQX{LFiWKѭӡng bӏ nhiӉm bӋnh xuҩt huyӃt do vi khuҭn, gây thiӋt hҥi rҩt lӟn Do vұy, cҫn chú ý các dҩu hiӋu bӋnh lý và tác nhân gây bӋQKÿӇ phòng và trӏ bӋnh kӏp thӡi, góp phҫn giҧm thiӋt hҥi và phòng ngӯa dӏch bӋnh lây lan [7]
1.2.3 Bҩt cұp khi sӱ dөQJNKiQJVLQKWURQJÿiӅu trӏ dӏch bӋnh thӫy sҧn
ViӋc sӱ dөng kháng sinh bӯDEmLNK{QJÿ~QJFiFKFyWKӇ dүQÿӃn nhiӅu tác hҥi QKѭYLNKXҭn kháng thuӕc khiӃn viӋc phòng trӏ bӋnh không còn tác dөng; ҧQKKѭӣng trӵc tiӃSÿӃn sӭc khӓe cӫDQJѭӡi sӱ dөQJWKD\ÿәi hӋ vi sinh vұt tӵ nhiên, gây mҩt cân bҵng sinh thái hoһc gây hҥi cho các loài sinh vұt tӵ nhiên
ViӋt Nam có diӋn tích nuôi trӗng thӫy sҧQWăQJÿӅu qua tӯQJQăPWӯ QăP gҫQKDÿӃQQD\ÿmKѫQWULӋu ha và sҧQOѭӧQJWăQJOrQKѫQYӟi hai sҧn phҭm chӫ lӵc tôm và cá tra Chúng ta hiӋn có 567 nhà máy chӃ biӃn thӫy sҧn quy mô công nghiӋSÿiSӭng các tiêu chuҭn an toàn thӵc phҭPQKѭ+$&&3*036623KjQJ WUăPQKjPi\ÿ{QJOҥQKÿӫ tiêu chuҭn xuҩt khҭu sang EU, nhiӅu nhà máy, vùng nuôi ÿҥt chӭng nhұn tӵ nguyӋQQKѭ*OREDO*$3$6&%$3%5&YY.LPQJҥch xuҩt khҭu QăPÿҥWKѫQWӹ 86'KѫQOҫQVRQăPWUӣ thành mӝt trong nhӳQJQѭӟc xuҩt khҭu thӫy sҧn lӟn trên thӃ giӟi
Tuy nhiên, tình hình nhiӉPGѭOѭӧng kháng sinh vүQFKѭDÿѭӧc xӱ lý triӋWÿӇ 7tQKWUXQJEuQKWURQJJLDLÿRҥn này, mӛLQăP9LӋt Nam thiӋt hҥLKѫQWULӋu USD do hàng xuҩt khҭu thӫy sҧn bӏ trҧ lҥi [13].
Bҩt cұp khi sӱ dөQJNKiQJVLQKWURQJÿLӅu trӏ dӏch bӋnh thӫy sҧn
ViӋc lҥm dөng hóa chҩt, kháng sinh có thӇ làm xuҩt hiӋn các chӫng kháng thuӕc (nhӡn thuӕFQrQNKLÿLӅu trӏ bӋQKFKRQJѭӡi sӁ không có hiӋu quҧ VӅ kinh tӃ, tác hҥi cӫa viӋc sӱ dөng chҩt cҩm, lҥm dөng thuӕc thú y, hóa chҩt, kháng sinh trong nuôi trӗng thӫy sҧn khiӃn nhiӅu lô hàng thӫy sҧn xuҩt khҭu cӫa các doanh nghiӋSQѭӟc ta bӏ Fѫ quan có thҭm quyӅQQѭӟc ngoài cҧnh báo tӗQGѭKyDFKҩt và bӏ trҧ vӅ, gây thiӋt hҥi lӟn vӅ kinh tӃĈLӅu này ҧQKKѭӣng trӵc tiӃSÿӃn các doanh nghiӋSYjQJѭӡi nuôi trӗng thӫy sҧn khiӃn hӑ ÿLrXÿӭng, thұm chí bӏ thua lӛ, phá sҧn [14].
Tәng quan vӅ thӵc khuҭn thӇ và liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ
Tәng quan vӅ thӵc khuҭn thӇ
%DFWHULRSKDJHVFzQÿѭӧc gӑi là thӵc khuҭn, là loҥi virus chӍ xâm nhiӉm và nhân lên trong tӃ bào vi khuҭn Chúng có mһt khҳSQѫLWURQJP{LWUѭӡQJYjÿѭӧc công nhұn là tác nhân sinh hӑc phong phú nhҩWWUrQWUiLÿҩW&K~QJY{FQJÿDGҥng vӅ NtFKWKѭӟc, hình thái và tә chӭc bӝ gen [5] [7] [11]
Tuy nhiên, tҩt cҧ ÿӅu bao gӗm mӝt bӝ JHQD[LWQXFOHLFÿѭӧc bӑc trong mӝt lӟp vӓ cӫa các protein capsid mã hóa phage, có chӭF QăQJ Eҧo vӋ vұt liӋu di truyӅn và làm WUXQJJLDQÿѭDQyYjRWӃ bào chӫ tiӃp theo Kính hiӇQYLÿLӋn tӱ ÿmFKRSKpSKuQKGXQJ chi tiӃt KjQJWUăPORҥi phage, mӝt sӕ trong sӕ FK~QJGѭӡQJQKѭFyÿҫu", "chân" và ÿX{L0һc dù có vҿ QJRjLQKѭYұy, các phage không di chuyӇn và phө thuӝc vào chuyӇQÿӝQJ%URZQÿӇ tiӃp cұn mөc tiêu cӫa chúng
Phage có thӇ WѭѫQJWiFYӟi vұt chӫ cӫa chúng bҵng cRQÿѭӡng tan hoһc tiӅm tan /\WLFSKDJHÿѭӧc biӃWOjOjPJLiQÿRҥn sӵ WUDRÿәi chҩt cӫa vi khuҭn và dүQÿӃn ly giҧi tӃ EjR1Jѭӧc lҥLSKDJHO\VRJHQLFFzQÿѭӧc gӑLOjSKDJH{Qÿӟi) có thӇ tích hӧp DNA cӫa chúng vào bӝ gen vұt chӫ YjGRÿyWKLӃt lұp mӕi quan hӋ lâu dài vӟi vұt chӫ vi khuҭn cӫa chúng (Hình 1.3B) [15]
Tӯng bӏ phӫ nhұQQJj\QD\QJѭӡLWDÿmFKҩp nhұn rӝng rãi rҵQJSKDJHÿmÿyQJ mӝt vai trò quan trӑng trong viӋFÿLӅu hòa các cӝQJÿӗng vi khuҭn trong mӑi hӋ sinh thái [16] Do cҩXWU~FÿѫQJLҧQYjWtQKÿһFWUѭQJFӫa vұt chӫ, thӵc khuҭn thӇ ÿmÿyQJ mӝt vai trò quan trӑQJWURQJOƭQKYӵc sinh hӑc phân tӱ và công nghӋ sinh hӑc GҫQÿk\KѫQWKӵc khuҭn thӇ ÿmWKXK~Wÿѭӧc sӵ quan tâm cӫa cӝQJÿӗng khoa hӑFÿһc biӋt là liӋu pháp phage, hӋ thӕng phát hiӋn, cҧm biӃn sinh hӑFGQJSKDJHSKѭѫQJWLӋn phân phӕi vҳc-xin và thұPFKtÿӇ sӱ dөng trong chҭQÿRiQEӋnh vi khuҭn.
LiӋu pháp thӵc khuҭn thӇ
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 6
Nhӳng lӧi ích cӫa liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ giҧi quyӃt nhӳng thiӃu sót cӫa kháng sinh Mӛi loҥi thӵc khuҭn thӇ sӁ chӍ tҩn công mӝt loҥi vi khuҭn nhҩWÿӏnh vì liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ vӟLѭXÿLӇPFyWtQKÿһc hiӋu cao [17]ĈLӅXQj\FyQJKƭDOjPӝt thӇ thӵc khuҭn có thӇ ÿѭӧc sӱ dөQJÿӇ nhҳm trӵc tiӃp vào vi khuҭn gây bӋnh Tuy nhiên, vүn có mӝWYjLWUѭӡng hӧp xâm nhiӉm chéo giӳa các loài vi khuҭQѬXÿLӇm cӫa liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ là thӵc khuҭn hoҥWÿӝng chӕng lҥi cҧ vi khuҭn và vi khuҭn kháng kháng sinh Chúng có thӇ ÿѭӧc sӱ dөng mӝt mình hoһc vӟi thuӕc kháng sinh và các loҥi thuӕc khác Các phage tӵ QKkQOrQYjWăQJVӕ OѭӧQJWURQJTXiWUuQKÿLӅu trӏ (có thӇ chӍ cҫn mӝt liӅu) Phage có thӇ ÿѭӧc phân lұp nhanh chóng, vì bҧn chҩt phә biӃn cӫa chúng và chúng có nhiӅu trong mӑi vùng sinh thái, làm giҧm chi phí phát triӇn cӫa chúng so vӟi kháng VLQK&K~QJNK{QJÿӝFÿӕi vӟLÿӝng vұt, thӵc vұWYjP{LWUѭӡng [18]
Bên cҥQKÿyOLӋu pháp sӱ dөng phage còn nhiӅu thách thӭc, vi khuҭn gây bӋnh phҧLÿѭӧF[iFÿӏnh rõ ràng, tính әQÿӏnh bӏ ҧQKKѭӣng bӣi các loҥi hóa chҩt hóa hӑc, hiӋu quҧ bӏ ҧQKKѭӣng bӣi tiӃn triӇn cӫa bӋnh, sӵ tӗQOѭXFӫa phage trong hӋ thӕng ao nuôi vүQFKѭDÿѭӧFÿiQKJLi Ĉӕi vӟi hoҥWÿӝng diӋt khuҭn cӫa chúng, các thӵc khuҭn thӇ trӏ liӋXÿѭӧc cho là tiêu diӋt vi khuҭn mөc tiêu cӫa chúng bҵng cách nhân lên bên trong và phân ly tӃ bào chӫ (tӭc là thông qua chu trình lytic) Tuy nhiên, các nghiên cӭu tiӃp theo cho thҩy rҵng không phҧi tҩt cҧ FiFSKDJHÿӅu sao chép giӕng nhau và có sӵ khác biӋt quan trӑng trong các chu kǤ ly giҧi cӫa phage lytic và lysogenic [19] (Hình 1.3.)
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 7
Hình 1 3 Phage và chu trình cӫa phage (A) Cҩu trúc cӫa mӝt phage; (B) Chu trình sinh tan và chu trình tiӅm tan [20]
7KHRFiFÿһFÿLӇPÿmQyLӣ trên, liӋu pháp phage mang lҥi hy vӑng cho phòng YjÿLӅu trӏ bӋnh so vӟLNKiQJVLQKWURQJWѭѫQJODL
Công nghӋ giҧi trình tӵ gene
Giҧi trình tӵ gen thӃ hӋ mӟi bҵng Illumina
Vào giӳa nhӳQJQăP6KDQNDU%DODVXEUDPDQLDQYj'DYLG.OHQHUPDQFҧ hai ÿmKuQKWKjQKêWѭӣng vӅ trình tӵ song song lӟn cӫa các lҫQÿӑc ngҳn trên pha rҳn bҵng cách sӱ dөQJÿҫu cuӕi có thӇ ÿҥRQJѭӧc [24] Sӵ phát triӇn cӫa Giҧi trình tӵ thӃ hӋ tiӃp theo (NGS) trong thұp kӹ TXDÿmWҥo ra mӝWOѭӧng dӳ liӋu trình tӵ FKѭDWӯQJFyFNJQJ QKѭNKҧ QăQJJLҧi trình tӵ nhanh chóng các mүu vұt quan tâm [25]
Quy trình giҧi trình tӵ thӃ hӋ tiӃp theo bao gӗPEDEѭӟFFѫEҧn: chuҭn bӏ WKѭYLӋn, giҧi trình tӵ và phân tích dӳ liӋu Tìm hiӇu kiӃn thӭFFѫEҧn cӫa tӯQJEѭӟc và khám phá cách lұp kӃ hoҥch quy trình làm viӋc NGS [26]
Nguyên lý cӫa hӋ thӕng Illumina là sӱ dөng pKѭѫQJSKiSWәng hӧp mҥch dùng FiFGHR[\QXFORVLGHWULSKRVSKDWHÿiQKGҩu huǤnh quang (dNTP)
Khác biӋt lӟn nhҩt vӟi kӻ thuұt giҧi trình tӵ Sanger là thay vì giҧi trình tӵ mӝt ÿRҥQÿѫQOҿ, kӻ thuұt này cho phép giҧi trình tӵ vӟi mӝWOѭӧng lӟQFiFÿRҥn DNA khác nhau song song tҥi cùng mӝt thӡLÿLӇPGRÿyWҥo ra mӝWOѭӧng lӟn thông tin dӳ liӋu [26]
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 9 Ĉһc biӋt, các hӋ thӕng giҧi trình tӵ cӫa Illumina sӱ dөng các deoxynucleotide triphosphate gҳn huǤnh quang có khҧ QăQJWKXұn nghӏch, tӯ ÿyWLӃt kiӋm thӡi gian và FKROѭӧng dӳ liӋXÿҫu ra vô cùng lӟn so vӟLSKѭѫQJSKiS6DQJHU
Quy trình giҧi trình tӵ thӃ hӋ tiӃp theo bao gӗPEDEѭӟFFѫEҧn: chuҭn bӏ WKѭYLӋn, nhân bҧn cluster, giҧi trình tӵ và phân tích dӳ liӋu
Chuҭn bӏ WKѭYLӋn là rҩt quan trӑQJÿӕi vӟi sӵ thành công cӫa quy trình làm viӋc
NGS cӫa bҥQ%ѭӟc này chuҭn bӏ các mүu DNA hoһF51$ÿӇ WѭѫQJWKtFKYӟi chҩt trình tӵ7KѭYLӋn giҧi trỡnh tӵ WKѭӡQJÿѭӧc tҥo bҵng cỏch phõn mҧQK'1$YjÿҫXảYjả cho cҧ KDLÿҫu Trong quy trỡnh giҧi trỡnh tӵ ,OOXPLQDFiFÿҫXảYjảQj\FKӭa cỏc trình tӵ bә VXQJFKRSKpSFiFÿRҥn DNA liên kӃt vӟi flow cell Các mҧnh vӥ VDXÿyFy thӇ ÿѭӧc khuӃFKÿҥi và tinh chӃ [27]
Nhân bҧn cluster ² Ĉӕi vӟi viӋc tҥo cөPWKѭYLӋQÿѭӧc tҧi vào flow cell trình tӵ bә sung cӫa adapter vӟLFiFROLJRQXFOHRWLGHÿmJҳn trên flow cell MӛLÿRҥn DNA mҥFKÿѫQÿmJҳn trên flow cell sӁ ÿѭӧc nhân bҧn tҥo thành các cluster nhӡ vào quá trình nhân bҧn bҳc cҫu Khi quá trình tҥo cөPFKѭDKRjQWҩt, các mүXÿmVҹQVjQJÿӇ sҳp xӃp theo trình tӵ [28]
7URQJEѭӟc giҧi trình tӵ cӫa dòng công viӋF1*6FiFWKѭYLӋQÿѭӧc tҧi vào mӝt ZRUNIORZYjÿѭӧFÿһt trên bӝ sҳp xӃp Các cөPÿRҥQ'1$ÿѭӧc khuӃFKÿҥi trong mӝt quá WUuQKÿѭӧc gӑi là tҥo cluster, dүQÿӃn hàng triӋu bҧn sao cӫa DNA sӧLÿѫQ7UrQKҫu hӃt các thiӃt bӏ giҧi trình tӵ Illumina, phân nhóm diӉn ra tӵ ÿӝng
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 10
Giҧi trình tӵ ² Hoá chҩt giҧi trình tӵ bao gӗm các deoxynucloside triphosphate ÿiQKGҩu huǤnh quang (dNTP) và các hóa chҩt cҫn thiӃWNKiFÿѭӧc nҥp vào flow cell Khi bҳWÿҫu phҧn ӭng tәng hӧp giҧi trình tӵ, 4 loҥLGHR[\QXFORVLGHWULSKRVSKDWHÿiQK dҩu huǤQK TXDQJ G173 ÿѭӧF ÿѭD YjR FQJ O~F NKL Vӵ bҳt cһp cӫa 1 trong 4 loҥi nucleotide xҧy ra, quá trình kéo dài sӁ tҥm thӡi ngӯng lҥi và tín hiӋu TXDQJWѭѫQJӭng vӟi tӯng loҥi nucleotide sӁ SKiWUDYjÿѭӧc chөp lҥi bҵng hӋ thӕQJFDPHUDÿӝ phân giҧi cao, cuӕi chu kǤ tәng hӧp phân tӱ huǤnh quang sӁ ÿѭӧc loҥi bӓ sҹn sàng cho chu kǤ tәng hӧp tiӃp theo [27]
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 11
Phân tích dӳ liӋu ² KӃt quҧ tӯ quá trình giҧi trình tӵ ÿѭӧc phân tích tùy theo mөF ÿtFK Vӱ dөQJ QKѭ SKkQ WtFK ÿD KuQK QXFOHRWLGH 613 KRһc xiF ÿӏnh chèn-xóa
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 12
LQGHOÿӑc sӕ ÿӃPÿӕi vӟi RNA methods, phân tích phát sinh loài hoһc phân tích hӋ JHQYjKѫQWKӃ nӳa
Lҳp ráp và chú giҧi
Unicycler là mӝt công cө mӟLÿӇ lҳp ráp bӝ gen tӯ sӵ kӃt hӧp cӫa các lҫQÿӑc ngҳn và dài, tҥo ra các tұp hӧp chính xác, hoàn chӍnh và tiӃt kiӋm chi phí Unicycler xây dӵng mӝt biӇXÿӗ lҳSUiSEDQÿҫu tӯ các lҫQÿӑc ngҳn bҵng cách sӱ dөng trình SPAdes và sau ÿy ÿѫQ JLҧn hóa biӇX ÿӗ bҵng cách sӱ dөng thông tin tӯ các lҫQ ÿӑc ngҳn và dài Unicycler sӱ dөng mӝt công cө ký hiӋu bán toàn cҫu mӟLÿѭӧc sӱ dөQJÿӇ FăQFKӍnh các lҫQÿӑc dài vӟi biӇXÿӗ lҳp ráp Các thӱ nghiӋm cho thҩy Unicycler có thӇ lҳp ráp FiFÿѭӡng viӅn lӟQKѫQYӟi ít lӛi lҳSUiSKѫQVRYӟi các trình lҳp ráp hӛn hӧp khác, ngay cҧ NKL³GHSWK´ÿRҥQÿӑFGjLYjÿӝ chính xác thҩp Ĉҫu tiên Unicycler tұp hӧSFiFEjLÿӑc ngҳn thành mӝt biӇXÿӗ lҳSUiSFyÿӝ chính [iFFDRYjÿѭӧc kӃt nӕLVDXÿyGӵng biӇXÿӗ bҵQJFiFEjLÿӑc dài NӃu phҥPYLÿӑc dài Ojÿӫ, nó có thӇ tҥo ra mӝt lҳp ráp hoàn chӍnh vӟi mӝWÿѭӡng nét trên mӛi bҧn sao BiӇu ÿӗ lҳp ráp hҥn chӃ FiFÿѭӡQJÿLFyWKӇ có qua các vùng lһp lҥLFKRSKpS8QLF\FOHUÿҥt ÿѭӧc tӹ lӋ lҳp ráp sai thҩS'RÿyQyOjPӝt nhà lҳSUiSOêWѭӣng mà ӣ ÿyÿӝ chính xác vӅ cҩu trúc cӫa viӋc lҳp ráp là rҩt quan trӑng ĈӇ tӕLÿDKyDYLӋc dӉ sӱ dөng, Unicycler gói gӑn toàn bӝ ÿѭӡng dүn cӫa nó (Hình 1.8.) trong mӝt lӋnh duy nhҩt và tӵ ÿӝQJ[iFÿӏnh các tham sӕ cҩp thҩSÿӇ QJѭӡi dùng có thӇ PRQJÿӧi kӃt quҧ tӕt vӟLFjLÿһt mһFÿӏnh Ӣ ÿk\8QLF\FOHVӱ dөng Bowtie2 và 3LORQÿӇ ³8QLF\FOHB3ROLVK´ lҳp ráp bҵng cách sӱ dөng các liên kӃWÿӑc ngҳn, giҧm tӹ lӋ lӛi nhӓÿѭӧF[iFÿӏnh bӣL3LORQ*HQRPLF&RQVHQVXVYj)UHH%D\HVÿӗng thӡLÿiQKJLi viӋc lҳp ráp bҵng ALE [29]
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 13
Hình 1 8 Quy trình hoҥWÿӝng cӫa Unicycler [29]
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 14
Chú giҧi cҩu trúc vӟi công cө %/$671WUrQFѫVӣ dӳ liӋu NCBI Gӗm các thông sӕ: x 0D[VFRUHĈLӇm cao nhҩt khi so sánh vӟi trình tӵ ÿHPVRViQKYjWUuQKWӵ WURQJFѫVӣ dӳ liӋu x Total score: tәQJÿLӇm cӫa các trình tӵ tӯ mӝWFѫVӣ dӳ liӋu bҳt cһp vӟi trình tӵ ÿHP VR ViQK *Li WUӏ ³7RWDO VFRUH´ Qj\ NKiF JLi WUӏ ³0D[ FRUH´ WURQJ trownfg hӧp nhiӅu phҫn khác nhau trong trình tӵ cӫa CSDL bҳt cһp vào nhiӅu vùng khác nhau cӫa trình tӵ phân tích x Query cover: mӭFÿӝ bao phӫ cӫa trình tӵ ³TXHU\´VRYӟi trình tӵ tìm thҩy x E-YDOXH([SHFWHGYDOXHÿk\OjJLiWUӏ biӇu thӏ cho xác xuҩt cӫa trình tӵ subject xuҩt hiӋn ngүu nhiên, vì vұy giá trӏ này càng nhӓ WKuÿӝ tin cұy cӫa trình tӵ subject càng cao Ví dө( FyQJKƭDOjWUuQKWӵ tìm kiӃPÿѭӧc do ngүu nhiên chiӃm 1 trong 20 trình tӵ xuҩt hiӋn trong kӃt quҧ x Per ident: mӭFÿӝ WѭѫQJÿӗng giӳa trình tӵ ³TXHU\´YjWUuQKWӵ ³VXEMHFW´ tìm thҩy x Accession: sӕ hiӋu cӫa trình tӵ WuPÿѭӧc.
Tình hình nghiên cӭXWURQJYjQJRjLQѭӟc
HiӋQQD\WURQJQѭӟc vүQFKѭDFyF{QJWUuQKQJKLrQFӭXSKkQWtFKYjVRViQKÿһc WtQKJHQRPHÿiQKJLiWtQKDQWRjQYӅ mһt genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi vi khuҭn Edwardsiella ictaluri chӍ FyFiFÿiQKJLiGӵa trên thӱ nghiӋm thӵc tӃ GRÿyFy thӇ bӓ VyWFiFJHQHÿӝc, gene kháng kháng sinh
VӅ ÿiQKJLiWtQKDQWRjQYӅ mһt genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi vi khuҭn
Aeromonas hydrophila vӟi công trình nghiên cӭu cӫa Tu, V Q và cӝng sӵ, 2020, tác giҧ ÿm[iFÿӏnh trình tӵ bӝ gene thӵc khuҭn thӇ tҩQF{QJÿһc hiӋu vi khuҭn Aeromonas hydrophila bҵng kӻ thuұt giҧi trình tӵ gene thӃ hӋ mӟi
Vì vұ\WURQJQѭӟc cҫn thêm các công trình nghiên cӭu phân tích genome cӫa thӵc khuҭn thӇ gây bӋnh quan trӑng trên cá tra
Các nghiên cӭu tiêu biӇXÿiQKJLiÿһc tính genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu cho Aeromonas hydrophila vàEdwardsiella ictaluri WUrQFiFORjLFiNKiFYjÿѭӧc tәng hӧp theo bҧng 1.1
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 15
Tuy nhiên, hiӋn nay vүQFKѭDFyQJKLrQFӭXSKkQWtFKÿһc tính genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi vi khuҭn Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri gây bӋnh quan trӑng trên cá tra
Bҧng 1 1 Các nghiên cӭXSKkQWtFKÿһc tính genome trên thӵc khuҭn thӇ Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri
STT Nghiên cӭu Tác giҧ Nӝi dung nghiên cӭu
Isolation, characterization and genomic analysis of vB-AhyM-AP1, a lytic bacteriophage infecting
Phân lұS [iF ÿӏQK ÿһc ÿLӇm và phân tích bӝ gen cӫa vB-AhyM-AP1, mӝt xҥ khuҭn lytic lây nhiӉm
Characterization and genome sequencing of three Aeromonas hydrophila - specific phages, CF8, PS1, and PS2
3KkQ WtFK ÿһc tính genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi
Aeromonas hydrophila phân lұp trên cá trôi trҳQJFiWU{LÿHn
Isolation, characterization, and Application of a
Bacteriophage Infecting the Fish Pathogen
Phân lұS SKkQ WtFK ÿһc ÿLӇm genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi
Aeromonas hydrophila phân lұp tӯ mүu môi WUѭӡng
Yj ÿһc tính genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi
Aeromonas hydrophila trên mүu bӋnh phҭm lâm sàng
Genomic characterization of a novel virulent phage infecting the Aeromonas
3KkQ WtFK ÿһc tính genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 16 hydrophila isolated from rainbow trout
Aeromonas hydrophila phân lұp trên Cá hӗi vân
Complete genome sequences of Aeromonas and Pseudomonas phages as a supportive tool for development of antibacterial treatment in aquaculture
3KkQ WtFK ÿһc tính genome cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿһc hiӋu vӟi
Pseudomonas QKѭ Pӝt công cө trong viӋc phát triӇn giҧi pháp xӱ lý vi khuҭn trong nuôi trӗng thӫy sҧn
Characterization and genomic analyses of
Aeromonas hydrophila phages AhSzq-1 and
AhSzw-1, isolates representing new species within the T5virus genus
3KkQ WtFK ÿһc tính và bӝ gen cӫa các phage
AhSzq-1 và AhSzw-1, các phân lұSÿҥi diӋn cho các loài mӟi trong chi T5virus
Comparative genomics of the fish pathogens
So sánh bӝ gen cӫa mҫm bӋnh cá Edwardsiella ictaluri 93-146 và
Resistant Edwardsiella ictaluri Strain MS-17-156
3KkQ WtFK ÿһc tính genome cӫa phage
Edwardsiella ictaluri kháng thuӕc MS-17-156
Sequence of Edwardsiella ictaluri Isolate RUSVM-1
3KkQ WtFK ÿһc tính genome hoàn chӍnh cӫa
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 17
Tilapia (Oreochromis niloticus) in the Western
RUSVM-1 phân lұp tӯ cá rô phi sông Nile (Oreochromis niloticus) ӣ Tây bán cҫu
Sequence of Edwardsiella piscicida Isolate S11-285
Catfish (Ictalurus punctatus) in Mississippi,
Trình tӵ bӝ gen hoàn chӍnh cӫa Edwardsiella piscicida Isolate S11-285 ÿѭӧc phөc hӗi tӯ cá da WUѫQIctalurus punctatus) ӣ Mississippi, Hoa KǤ
3KkQ WtFK ÿһc tính genome cӫa phage
Edwardsiella ictaluri ÿѭӧc phân lұp tӯ nguӗn Qѭӟc ӣ Nhұt Bҧn
146, a Strain Associated with a Natural Channel
146, mӝt chӫng có liên TXDQ ÿӃn mӝt vө bùng phát bӋnh nhiӉm trùng ÿѭӡng ruӝt cӫDFiGDWUѫQ ӣ kênh tӵ nhiên.
Mөc tiêu và nӝi dung nghiên cӭu cӫDÿӅ tài
Mөc tiêu
1 Bә sung vào bӝ VѭXWұp phage Edwardsiella ictaluri phân lұp tӯ mүu bùn
2 TuyӇn chӑn dòng phage Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri dӵa
Nӝi dung nghiên cӭu
ĈӇ ÿҥWÿѭӧc mөc tiêu nêu trên thì các nӝi dung cҫn thӵc hiӋn gӗm:
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 18
3 Phân lұp và khҧRViWÿһc tính vi sinh cӫa thӵc khuҭn thӇ Edwardsiella ictaluri gây bӋnh trên cá tra tӯ mүu bùn x Phân lұp x ;iFÿӏnh phә xâm nhiӉm x Khҧo sát hoҥt tính xâm nhiӉm
4 3KkQWtFKÿһFÿLӇm genome cӫa thӵc khuҭn thӇ x Phân tích genome thӵc khuҭn thӇ kháng Aeromonas hydrophila phân lұp ӣ ViӋW1DPWUѭӟFÿk\YjVRViQKYӟi genome cӫa PVN02 cùng phân lұp ӣ ViӋW1DPÿmF{QJEӕ 2020 x Phân tích genome thӵc khuҭn thӇ kháng Edwardsiella ictaluri phân lұp ӣ ViӋt Nam hiӋQFKѭDFyF{QJEӕ nào
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 19
Vұt liӋu
ĈӕLWѭӧng nghiên cӭu
Chӫng vi khuҭQ ÿѭӧc sӱ dөng trong thí nghiӋm phân lұp thӵc khuҭn thӇ là
Edwardsiella ictaluri E1 do khoa bӋnh hӑc thӫy sҧQĈҥi Hӑc CҫQ7KѫFXQJFҩp
MүXEQÿѭӧc thu nhұn tӯ ao nuôi cá tra cӫa tӍnh CҫQ7Kѫ
Chӫng vi khuҭQÿѭӧc sӱ dөng trong thí nghiӋP[iFÿӏnh phә xâm nhiӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ là Edwardsiella ictaluri E3-1, Edwardsiella ictaluri E4-2, Edwardsiella ictaluri E5-3, Edwardsiella ictaluri E6-4 do khoa bӋnh hӑc thӫy sҧQĈҥi Hӑc CҫQ7Kѫ cung cҩp
&ѫsӣ dӳ liӋu thô cӫa thӵc khuҭn thӇ PVN03, PVN04, PVN05, PVN06, PVN07, PVN08 do nhóm nghiên cӭu bӝ môn Công nghӋ Sinh hӑc cӫD7UѭӡQJĈҥi hӑc Bách Khoa TP.HCM cung cҩp.
Hóa chҩWP{LWUѭӡng, thiӃt bӏ và dөng cө
Ĉѭӧc trình bày tҥi phө lөc 7 cӫa luұQYăQ
Thí nghiӋm 1: Phân lұp và khҧRViWÿһc tính vi sinh cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿӕi kháng vi khuҭn Edwardsilla ictaluri gây bӋnh trên cá tra tӯ mүu bùn
Phân lұSYj[iFÿӏQKÿһc tính thӇ thӵc khuҭQÿӕi kháng vi khuҭn Edwardsilla ictaluri ÿѭӧc thӵc hiӋQQKѭsau:
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 20
Thu và xӱ lý mүu
DӵDWUrQSKѭѫQJSKiSWKXPүu bùn cho phân lұp phage
Nguyên tҳc: TiӃn hành thu mүu bùn ӣ mӛi ao hoһc khu vӵc nuôi cá MүXÿѭӧc giӳ lҥnh ӣ 4 o &WUѭӟc khi tiӃn hành phân lұp
%ѭӟc 1: Cho 5 g mүu bùn vào ӕng falcon có chӭD P/ Qѭӟc cҩt và bә sung chloroform vӟi tӹ lӋ 5% v/w (khoҧQJX/6DXÿyWUӝQÿӅu hӛn hӧp bҵng cách vortex trong vòng 5 phút
%ѭӟc 2: Hӛn hӧSÿѭӧc ly tâm lҫn 1 vӟi tӕFÿӝ 4000 rpm trong 10 phút ӣ nhiӋWÿӝ
SKzQJÿӇ loҥi bӓ lӟp bùn và mӝt phҫn chloroform Dӏch sau ly tâm lҫn 1 sӁ ÿѭӧc thu
Thu và xӱ lý mүu bùn Phân lұp thӵc khuҭn thӇ
Chӑn và tinh sҥch thӵc khuҭn thӇ
KhҧRViWÿһc tính cӫa thӵc khuҭn thӇ (Hoҥt tính xâm nhiӉm và phә xâm nhiӉm)
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 21 vào các eppendorf 1.5 mL và tiӃp tөc ly tâm lҫn 2 vӟi tӕFÿӝ 10000 rpm, 5 phút, ӣ 4 0 C nhҵm loҥi bӓ vi khuҭQYjOѭӧng chloroform còn lҥi
%ѭӟc 3: Dӏch sau ly tõm lҫn 2 sӁ ÿѭӧc lӑc qua màng lӑc 0.22 àm Dӏch lӑFÿѭӧc thu lҥi và chuҭn bӏ cho các thí nghiӋm tiӃp theo.
Phân lұp thӵc khuҭn thӇ
Hình 2 3 Phân lұp thӵc khuҭn thӇ
%ѭӟc 1: Hỳt 100 àL dӏch lӑc sau quỏ trỡnh xӱ lý mүu và 200 àL vi khuҭn E ictaluri cho vào ӕng nghiӋm có chӭDP/P{LWUѭӡQJ76%DJDUÿmQҩu chҧy và giӳ ӣ 40 0 &9RUWH[Yjÿә hӛn hӧSOrQÿƭDWKҥch LB 1.5 % agar Ӫ ÿƭDTXDÿrPӣ nhiӋWÿӝ phòng
%ѭӟc 2: KiӇm tra sӵ hiӋn diӋn cӫDFiFYzQJVLQKWDQWUrQÿƭDWKҥFKWKHRSKѭѫQJ pháp thҥch hai lӟp cӫa Mazzocco và cӝng sӵ [30]
Làm giàu phage có trong d͓ch l͕c
%ѭӟc 1: 1 mL dӏch lӑc sau quỏ trỡnh xӱ lý mүu sӁ ÿѭӧc bә sung cựng vӟi 500 àL vi khuҭn E ictaluri vào falcon có chӭDP/P{LWUѭӡng TSB Nuôi lҳFTXDÿrPYӟi tӕFÿӝ lҳc 150 rpm, nhiӋWÿӝ SKzQJ/ѭӧng phage trong dӏch lӑc sӁ ÿѭӧc làm giàu
%ѭӟc 2: Hút dӏch nuôi cҩy cho vào eppendorf 1.5 mL và ly tâm 10000 rpm, 4 0 C,
KiӇm tra vòng sinh tan Ly tâm
Plaque assay KiӇm tra vòng sinh tan
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 22
%ѭӟc 3: Hút dӏch ly tâm lӑc qua màng lӑFPYjÿѭӧFOѭXWUӳ trong eppendorf
%ѭӟc 4: 100 àL dӏch lӑFÿѭӧc thӵc hiӋn plaque assay
%ѭӟc 5: KiӇm tra sӵ xuҩt hiӋQYzQJVLQKWDQWUrQÿƭDWKҥch
NӃu có sӵ xuҩt hiӋQYzQJVLQKWDQWUrQÿƭDWKҥch thì hút vòng sinh tan tӯ mӛi mүu OѭXWUӳ YjR60EXIIHUÿӇ tinh sҥch
KӃt quҧ PRQJÿӧi: Có sӵ xuҩt hiӋQYzQJWDQWUrQÿƭDWKҥch
ChӍ WLrX ÿiQK JLi Sӵ hiӋn diӋn cӫa thӵc khuҭn thӇ xâm nhiӉm vi khuҭn
Edwardsiella ictaluri trong mүXÿѭӧFÿiQKJLiWK{QJTXDVӵ xuҩt hiӋn cӫa các vòng sinh
WDQWUrQÿƭDWKҥch LB 1.5% agar trong thí nghiӋm plaque assay.
Tinh sҥch và tҥo stock thӵc khuҭn thӇ
Hình 2 4 Tinh sҥch thӵc khuҭn thӇ
Bӕ trí thí nghiӋm tinh sҥch
%ѭӟc 1: Thӵc khuҭn thӇ hút tӯ YzQJVLQKWDQÿѭӧc phân phӕi vào SM buffer Ӫ
%ѭӟc 2: Hỳt 100 àL dӏch phage và 200 àL vi khuҭn E ictaluri cho vào ӕng nghiӋm có chӭDP/P{LWUѭӡQJ76%DJDUÿmQҩu chҧy và giӳ ӣ 40 0 C) Vortex Yjÿә hӛn hӧp OrQÿƭDWKҥch LB 1.5 % agar Ӫ ÿƭDTXDÿrPӣ nhiӋWÿӝ phòng
%ѭӟc 3: Hút riêng lҿ các vòng sinh tan có hình thái khác nhau vào SM buffer
Thӵc hiӋn thí nghiӋm trên 3 lҫn vӟi mӛi loҥLKuQKWKiLYzQJVLQKWDQNKiFQKDXÿӇ thu các thӵc khuҭn thӇ riêng biӋt
3KkQSKӕLYjR60EXIIHU Ӫ &TXDÿrP +~WPӝWYzQJVLQKWDQ
&KӑQWӯQJGzQJ WKӵFNKXҭQWKӇÿѫQOҿ
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 23
Hình 2 5 Tҥo stock thӵc khuҭn thӇ
Bӕ trí thí nghiӋm tҥo stock thӵc khuҭn thӇ
%ѭӟc 1: Thӵc hiӋQ SODTXH DVVD\ ÿӇ tҥR ÿƭD Fy YzQJ VLQK WDQ FDR Yӟi mӛi dòng thӵc khuҭn thӇ WKXÿѭӧc
%ѭӟc 2: ChӑQÿƭDFyPұWÿӝ vòng sinh tan cao, bә sung SM buffer, ӫ TXDÿrPӣ nhiӋt ÿӝ 4 o C
%ѭӟc 3: Phҫn thҥch T6%DJDUÿѭӧc làm nhuyӉQYjÿӗng nhҩt vӟLÿӋm SM
%ѭӟc 4: Thêm chloroform (CHCl3) vào hӛn hӧp sao cho nӗQJÿӝ CHCl3 khoҧng 5% vortex hӛn hӧp trong 5 phút Ӫ ӣ nhiӋWÿӝ phòng trong 2 giӡ
%ѭӟc 5: Ly tâm hӛn hӧp tҥLUSPWURQJSK~WÿӇ loҥi bӓ phҫn thҥch TSB 0.4% agar, thu dӏch nәi
%ѭӟc 6: Ly tâm tҥi 10000 rpm, 4 o C trong 5 phút và thu phҫn dӏch nәi
%ѭӟc 7: Lӑc dӏch nәi vӟi màng lӑc 0.22 um, thu stock
%ѭӟc 8: KiӇm tra nӗQJÿӝ thӵc khuҭn thӇ trong dӏFKWKXÿѭӧc bҵng cách pha loãng và thӵc hiӋQSODTXHDVVD\ÿӃm sӕ YzQJVLQKWDQKuQKWKjQKWUrQÿƭDWKҥch
KӃt quҧ PRQJÿӧi: Vӟi mӛi mүu thӵc khuҭn thӇ phân lұSÿѭӧc, WKXÿѭӧc stock có nӗQJÿӝ 10 8 - 10 10 PFU/mL.
Khҧo sát hoҥt tính xâm nhiӉm cӫa các thӵc khuҭn thӇ ÿmSKkQOұp 23 2.2.6 ;iFÿӏnh phә xâm nhiӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ
&KӑQÿƭDFyPұWÿӝYzQJVLQKWDQFDR Ӫ &TXD ÿrP 7KӵFKLӋQSODTXHDVVD\YӟLGzQJWKӵFNKXҭQWKӇ ÿѫQOҿ ĈӗQJQKҩW ӪYӟL
/\WkP /ӑFYjÿӏQKOѭӧQJ
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 24
Hoҥt tính xâm nhiӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ ÿѭӧFÿiQKJLiWK{QJTXDFiFWLrXFKtVDX ဨChu kì lây nhi͍m cͯa thc khu̱n th͋: là khoҧng thӡi gian tính tӯ khi mӝt hҥt thӵc khuҭn thӇ bҳWÿҫu xâm nhiӉm tӃ bào vi khuҭQFKRÿӃn khi tӃ bào bӏ ly giҧi và các hҥt thӵc khuҭn thӇ mӟLÿѭӧc giҧi phóng ဨH s͙ nhân: Sӕ Oѭӧng hҥt thӵc khuҭn thӇ ÿѭӧc giҧi phóng tӯ mӝt tӃ bào bӏ xâm nhiӉm HӋ sӕ QKkQÿѭӧF[iFÿӏnh tҥi thӡLÿLӇm có sӵ JLDWăQJÿӝt biӃn thӵc khuҭn thӇ trong thӡi gian ngҳn nhҩt
Hình 2 6.Khҧo sát hoҥt tính xâm nhiӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ
%ѭӟc 1: Nuôi dӏch vi khuҭn E ictaluri WURQJP{LWUѭӡng TSB vӟi nӗQJÿӝ ban ÿҫu là 5% v/v, lҳc әn nhiӋt ӣ 30 0 C, 150 rpm tӟi khi OD600 ÿҥt 0.1
%ѭӟc 2: Bә sung vào dӏch nuôi cҩy trên mӝt thӇ tích thӵc khuҭn thӇ thӓa MOI 0.01 (Multiplicity of infection - Tӹ lӋ giӳa sӕ Oѭӧng thӵc khuҭn thӇ và sӕ Oѭӧng vi khuҭn) Lҳc әn nhiӋt ӣ 30 0 C, 150 rpm trong 10 phút
Bә sung thӵc khuҭn thӇ vӟi MOI = 0.01 Ӫ
Ly tâm Thu sinh khӕi
Bә VXQJP{LWUѭӡng Lҩy mүu theo tӯng thӡLÿLӇm Ĉӏnh Oѭӧng
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 25
%ѭӟc 3: Sau 10 phút tiӃn hành li tâm dӏch nuôi cҩy trên ӣ 10000 rpm, 4 0 C, 5 phút Phҫn dӏch nәLÿѭӧc bҧo quҧn ӣ 4 0 C, phҫn còn lҥLÿѭӧc hòa tan vӟLP{LWUѭӡng TSB và tiӃp tөc nuôi lҳc әn nhiӋt ӣ 30 0 C, 150 rpm
Tҥi MOI = 0.01 có thӇ xem mӝt tӃ bào vi khuҭn bӏ xâm nhiӉm bӣi mӝt hҥt thӵc khuҭn thӇ'RÿyVӕ Oѭӧng tӃ bào vi khuҭn bӏ xâm nhiӉPWѭѫQJÿѭѫQJYӟi sӕ Oѭӧng hҥt thӵc khuҭn thӇ xâm nhiӉm tӃ bào và bҵng sӕ Oѭӧng thӵc khuҭn thӇ bә VXQJEDQÿҫu trӯ cho sӕ Oѭӧng thӵc khuҭn thӇ có trong dӏch nәi
70, 75, 80, 85, 90 phỳt, hỳt 10 àL hӛn hӧSÿHPSKDORmQJOҫn vӟi SM buffer lҥnh
Ly tõm dӏch pha loóng ӣ 10000 rpm, 4 0 C, 5 phỳt rӗi thu lҩy 500 àL dӏch nәi tiӃn hành Plaque Assay ӣ các nӗQJÿӝ thích hӧp Ӫ ÿƭDTXDÿrPӣ nhiӋWÿӝ phòng
%ѭӟc 5: ĈӃm sӕ vòng sinh tan trên mӛLÿƭDWKҥFK6DXÿy[iFÿӏnh sӕ Oѭӧng phage trong dӏch nuôi cҩy tҥi thӡLÿLӇm t
%ѭӟc 6: DӵQJÿѭӡng cong biӃQÿәi sӕ Oѭӧng thӵc khuҭn thӇ/ sӕ Oѭӧng tӃ bào vi khuҭn bӏ xâm nhiӉm theo thӡi gian
Cách tính: sӕ SKDJHÿѭӧc hҩp thө hay sӕ Oѭӧng vi khuҭn nhiӉm phage bҵng sӕ SKDJHEDQÿҫu trӯ sӕ phage tӵ do sau hҩp phө; TӍ lӋ hҩp thө là tӍ lӋ phҫQWUăPVӕ phage ÿѭӧc hҩp thө chia cho sӕ SKDJHEDQÿҫXNtFKWKѭӟc ly giҧi cӫa phage (burst size, là sӕ SKDJHÿѭӧc phóng thích ra tӯ mӝt tӃ bào vi khuҭn nhiӉm phage) bҵng sӕ phage trung bình ӣ pha әQÿӏQKWUrQÿѭӡQJFRQJVLQKWUѭӣng chia cho sӕ phage trung bình ӣ pha lag; thӡi gian tiӅm ҭQOjÿLӇm giao cӫa pha lag vӟLÿӝ dӕFÿѭӡQJFRQJVLQKWUѭӣng [31] KӃt quҧ PRQJÿӧi: ChӑQÿѭӧc dòng thӵc khuҭn thӇ có hoҥt tính xâm nhiӉm mҥnh Thӵc khuҭn thӇ ÿѭӧc xem là có hoҥt tính xâm nhiӉm mҥnh khi có thӡi gian mӝt chu kǤ xâm nhiӉm ngҳn và/hoһc sӕ Oѭӧng thӵc khuҭn thӇ sinh ra tӯ mӝt tӃ bào vi khuҭn lӟn Ĉk\ÿѭӧc xem là mӝt trong nhӳng tiêu chí chӑn lӑc thӵc khuҭn thӇ thích hӧSÿӇ kiӇm soát vi khuҭn gây bӋnh.
2.2.6 ;iFÿӏnh phә xâm nhiӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ
;iFÿӏnh khҧ QăQJOk\QKLӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ vӟi các chӫng vi khuҭn khác QKDXÿѭӧc thӵc hiӋn bҵng kӻ thuұt spot test Sӵ lây nhiӉPÿѭӧFÿiQKJLiWK{QJTXDVӵ xuҩt hiӋn cӫa khu vӵc ly giҧi
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 26
Chuҭn bӏ dӏFK WăQJ VLQK TXD ÿrP FiF YL NKXҭn: Edwardsiella ictaluri E 1 ,
Edwardsiella ictaluri E 3-1 , Edwardsiella ictaluri E 4-2 , Edwardsiella ictaluri E 5-3 , Edwardsiella ictaluri E 6-4
Stock thӵc khuҭn thӇ tinh sҥFKÿѭӧc (10 8 ± 10 10 PFU/ml) ĈƭD/%DJDUӕng nghiӋP76%DJDUZYÿѭӧc làm nóng chҧy và әn nhiӋt ӣ 40 0 C
%ѭӟc 1: Hút 1ml vi khuҭQÿHPÿLO\WkPYzQJSK~W o C, hút bӓ 800ul dӏch nәi
%ѭӟc 2: Hỳt 200 àL dӏch vi khuҭQÿmF{ÿһc) cho vào ӕng nghiӋm cú chӭa 2.5
P/P{LWUѭӡQJ76%DJDUÿmQҩu chҧy và giӳ ӣ 40 0 C)
%ѭӟc 3: 9RUWH[Yjÿә hӛn hӧSOrQÿƭDWKҥch LB 1.5 % agar xoay nhҽ ÿӇ lӟp thҥch trҧLÿӅu lên bӅ mһWÿƭDÿӇ yên trong 10 phút
%ѭӟc 4: Hỳt 2 àL dӏFKSKDJHYjRÿƭDP{LWUѭӡng vӟi tӯng nӅn vi khuҭn cҫn khҧo
%ѭӟc 5: Ӫ ÿƭDTXDÿrPӣ nhiӋWÿӝ phòng
%ѭӟc 6: Ĉӕi chӭQJkPÿѭӧc sӱ dөQJOjÿӋP60ÿӕi chӭQJGѭѫQJOjÿƭDP{L
WUѭӡng vӟi nӅn vi khuҭn E1 ÿѭӧc bә sung các dòng thӵc khuҭn thӇ
ChӍ tiêu theo dõi: Quan sát sӵ xuҩt hiӋn khu vӵc ly giҧLÿѭӧc hình thành nên nӅn vi khuҭQÿtFK
Thí nghiӋP3KkQWtFKÿһFÿLӇm genome cӫa thӵc khuҭn thӇ
Genome sau nhân bҧn cӫa thӵc khuҭn thӇ PVN03, PVN04, PVN05, PVN06, PVN0391ÿѭӧc giҧi trình tӵ sӱ dөQJWKѭYLӋn là Nextera XT, paried end, vӟi kích WKѭӟc 150 bp trên hӋ thӕQJ,OOXPLQD1H[W6HTYjÿѭӧc tiӃn hành bӣi the Microbial Genome Sequencing Center (Pittsburgh, PA, USA).
KiӇm tra và xӱ lý dӳ liӋu thô
ViӋc kiӇm tra dӳ liӋXÿҫu vào là cҫn thiӃt cho quá trình phân tích vì nó kiӇm tra, ÿiQKJLiFKҩWOѭӧQJFyÿҥt chuҭQÿӇ tiӃp tөc quá trình phân tích tiӃp theo
Mӕi quan hӋ giӳDÿLӇm chҩWOѭӧng Q cӫa hӋ máy Illumina và xác xuҩt lӛi trong quá trình ҩQÿӏnh QXFOHRWLGHÿѭӧF[iFÿӏQKQKѭVDX
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 27
Dӳ liӋu thô sau khi giҧi trình tӵ ÿҫu tiên sӁ ÿѭӧc kiӇPWUDÿiQKJLiFKҩWOѭӧng bҵng phҫn mӅm FastQC v0.11.9 [32] Phҫn mӅm sӁ phân tích, cung cҩp các thông sӕ thӕQJNrFѫEҧn vӅ dӳ liӋu
6DXÿyGӳ liӋu thô sӁ ÿѭӧc xӱ lý bҵng phҫn mӅm Trimmomatic v0.39 [33]: x Loҥi bӓ các adapter x Loҥi bӓ các trình tӵ có chҩWOѭӧng 50)
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 67
KӃt luұn
Tӯ kӃt quҧ nghiên cӭu cho thҩ\ÿmSKkQOұSÿѭӧc 13 dòng thӵc khuҭn thӇ tӯ mүu bùn có khҧ QăQJ[kPQKLӉm vi khuҭn Edwardsiella ictaluri, sau quá trình tҥo stock thì WKXÿѭӧFVWRFNSKDJHÿҥt tӯ 10 8 -10 10 PFU/ml
Trong thí nghiӋP[iFÿӏnh hoҥt tính xâm nhiӉPÿѭӧc thӵc hiӋn trên 5 thӵc khuҭn thӇ WURQJÿyFyGzQJSKDJH01FyFKXNǤ lây nhiӉm và hӋ sӕ nhân tӕt nhҩt là 100 phút, 160.52 ± 3.12
Trong 13 dòng thӵc khuҭn thӇ phân lұSÿѭӧc có dòng phage M18N có xuҩt hiӋn hoҥt tính ly giҧi trên cҧ 5 dòng vi khuҭn và có phә ký chӫ rӝng nhҩt Dòng phage M7N, M20N, M23N, M24N, M26N có phә ký 4/5 dòng vi khuҭn là: Edwardsiella ictaluri E1,
Edwardsiella ictaluri E3-1, Edwardsiella ictaluri E4-2, Edwardsiella ictaluri E5-3 Còn lҥi, 7 dòng phage là M5N, M8N, M9N, M14N, M19N, M21N và M25N có phә ký chӫ 2/5 dòng vi khuҭn là: Edwardsiella ictaluri E1, Edwardsiella ictaluri E3-1
Cùng vӟi thӇ thӵc khuҭn PVN02 [50], bӝ gen cӫa nhӳng phage PVN03, PVN04, PVN05 là trình tӵ bӝ gen hoàn chӍQKÿҫu tiên cӫa phage nhiӉm Aeromonas hydrophila ӣ FiGDWUѫQWҥi ViӋt Nam
Bӝ gen cӫa nhӳng phage PVN06, PVN07, PVN08 là trình tӵ bӝ gen hoàn chӍnh ÿҫu tiên cӫa phage nhiӉm Edwardsiella ictaluri ӣ FiGDWUѫQWҥi ViӋt Nam
Trong nghiên cӭu này, toàn bӝ trình tӵ bӝ gen cӫa ba thӵc khuҭn A hydrophila mӟi nKѭ391391391YjE ictaluri mӟLQKѭ391391391ÿm ÿѭӧc phân tích có thӇ ӭng dөng trӏ bӋnh trên cá tra.
KiӃn nghӏ
Các kӃt quҧ là dӳ liӋu quan trӑQJÿӇ tiӃp tөc nghiên cӭu và ӭng dөng thӵc khuҭn thӇ WURQJÿLӅu trӏ bӋnh gan thұn mӫ trên cá tra
Mӝt vài kiӃn nghӏ: x TiӃp tөc khҧo sát sinh hӑc và phân tích genome cӫa 13 thӵc khuҭn thӇ ÿm phân lұp x Phân tích tính an toàn cӫa 2 nhóm thӵc khuҭn thӇ Aeromonas hydrophila
PVN03, PVN04, PVN05 và Edwardsiella ictaluri PVN06, PVN07, PVN08 khi ӭng dөng vào thӵc tӃ
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 68
T Q Vinh, N L H Nhan, T T T Xuan, L P Nga and H A Hoang, ³Genomic analysis of Aeromonas hydrophila bacteriophages isolated in striped catfish farms in the Mekong delta,´ Vietnam Academia Journal of Biology, vol
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 69
[1] -2OLYHLUD)&DVWLOKR$&XQKDDQG0-3HUHLUD³%DFWHULRSKDJHWKHUDS\DVD EDFWHULDOFRQWUROVWUDWHJ\LQDTXDFXOWXUH´Aquaculture International, vol 20, no
5 Springer, pp 879±910, Sep 04, 2012, doi: 10.1007/s10499-012-9515-7 [2] T T Dung "BӋnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và quҧn lý dӏch bӋnh trong nuôi," Báo cáo nghiên cӭu cӫa Khoa Thӫy SҧQ7UѭӡQJĈҥi hӑc Cҫn 7Kѫ2019
[3] 1 6 2OVHQ 1 % +HQGULNVHQ / + +DQVHQ DQG : RW ³$ 1HZ +LJK- Throughput Screening Method for Phages: Enabling Crude Isolation and Fast ,GHQWLILFDWLRQ RI 'LYHUVH 3KDJHV ZLWK 7KHUDSHXWLF 3RWHQWLDO´ https://home.liebertpub.com/phage, vol 1, no 3, pp 137±148, Sep 2020, doi:
[4] H Brüssow, C Canchaya, and W.-' +DUGW ³3KDJHV DQG WKH (YROXWLRQ RI
%DFWHULDO3DWKRJHQVIURP*HQRPLF5HDUUDQJHPHQWVWR/\VRJHQLF&RQYHUVLRQ´
Microbiol Mol Biol Rev., vol 68, no 3, pp 560±602, Sep 2004, doi:
[5] T Liêm "Ӭng dөng công nghӋ ÿӇ nâng giá trӏ ngành cá tra." Internet: https://bnews.vn/ung-dung-cong-nghe-de-nang-gia-tri-nganh-ca- tra/176692.html, Jun 29, 2021
[6] C Long "Giá cҧ WăQJ QKѭQJ QJѭӡi QX{L ÿm NLӋt sӭc." Internet: https://vnexpress.net/gia-ca-tra-tang-nhung-nguoi-nuoi-da-kiet-suc-
[7] /&D ³%Ӌnh gan thұn mӫ trên ci WUD´ ,QWHUQHW https://tepbac.com/disease/full/16/benh-gan-than-mu-tren-ca-tra.htm, Jun 29,
[8] 9HPLGLP ³%Ӌnh mӫ gan ӣ cá." Internet: Internet: https://thuysanvietnam.com.vn/benh-mu-gan-o-ca/, Jun 29, 2021
[9] L V HұX³3DQJDSUR-HB1 chӃ phҭm sinh hӑc phòng bӋnh gan thұn mӫ trên cá tra giӕng.´ ,QWHUQHW KWWSVZZZKFPELRWHFKFRPYQYLQHZV6DQ- pham/pangapro-hb1-che-pham-sinh-hoc-phong-benh-gan-than-mu-tren-ca-tra- giong-580.html, Jun 29, 2021
[10] H KiӅX³%LӋn pháp kӻ thuұt phòng, chӕng bӋnh xuҩt huyӃt trên cá tra." Internet:
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 70 https://tongcucthuysan.gov.vn/vi-vn/nuôi-trӗng-thӫy-sҧn/-phòng-chӕng-dӏch- bӋnh/doc-tin/005948/2016-09-22/bien-phap-ky-thuat-phong-chong-benh-xuat- huyet-tren-ca-tra, Jun 29, 2021
[11] N T HiӅQ³1JKLrQFӭu di truyӅn hӑc các chӫng Aeromonas hydrophila gây bӋnh WUrQFiWUD´
[12] $$EHURXPDQG+-RR\DQGHK³$5HYLHZRQ2FFXUUHQFHDQG&KDUDFWHUL]DWLRQ RIWKH$HURPRQDV6SHFLHVIURP0DULQH)LVKHV´World J Fish Mar Sci., vol 2, no 6, pp 519±523, 2010, Internet: https://www.researchgate.net/publication/312898449, Jun 19, 2021
[13] + 7kP ³.LӇP VRiW 'ѭ Oѭӧng kháng sinh trong thuӹ sҧQ´ ,QWHUQHW http://www.tdcbinhthuan.vn/bai-viet/kiem-soat-du-luong-khang-sinh-trong- thuy-san-100.html, Jun 29, 2021
[14] CөF 7K~ < ³7ic hҥL NKy Oѭӡng tӯ viӋc lҥm dөng thuӕF NKiQJ VLQK´ ,QWHUQHW http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/tac-hai-kho-luong-tu-viec-lam-dung-thuoc- khang-sinh.aspx, Jun 29, 2021
[15] 3 ' 7 0\ ³1JKLrQ Fӭu phӕi trӝn thӵc khuҭn thӇ nhҵm kiӇm soát vi khuҭn
Edwardsiella ictaluri gây bӋnh gan thұQ´
[16] +$+RDQJ777;XDQ/31JDDQG'7+2DQK³6HOHFWLRQRISKDJHV to control aeromonas hydrophila-an infectious agenW LQ VWULSHG FDWILVK´
Biocontrol Sci., vol 24, no 1, pp 23±28, 2019, doi: 10.4265/bio.24.23
[17] *35LFKDUGV³%DFWHULRSKDJHUHPHGLDWLRQRIEDFWHULDOSDWKRJHQVLQDTXDFXOWXUH DUHYLHZRIWKHWHFKQRORJ\´Bacteriophage, vol 4, no 4, p e975540, Dec 2014, doi: 10.4161/21597081.2014.975540
[18] M T Moghadam et al.³+RZSKDJHVRYHUFRPHWKHFKDOOHQJHVRIGUXJUHVLVWDQW EDFWHULD LQ FOLQLFDO LQIHFWLRQV´Infection and Drug Resistance, vol 13 Dove
Medical Press Ltd., pp 45±61, 2020, doi: 10.2147/IDR.S234353
[19] $ 6XODNYHOLG]H = $ODYLG]H DQG - 0RUULV ³%DFWHULRSKDJH WKHUDS\´
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol 45, no 3 pp 649±659, 2001, doi:
[20] E Chukeatirote, W Phongtang, J Kim, A Jo, L.-S Jung, and J Ahn, ³6LJQLILFDQFH RI EDFWHULRSKDJHV LQ IHUPHQWHG VR\EHDQV $ UHYLHZ´Biomol Concepts, vol 9, no 1, pp 131±142, Jan 2018, doi: 10.1515/BMC-2018-0012
HVTH: Nguy͍n Lê Hoài Nhân Trang 71
[21] 6'LHJR³*Lҧi trình tӵ DNA thӃ hӋ mӟi và các ӭng dөng trong y tӃ, sӭc khoҿ´ pp 50±51, 2018
[22] Ĉ 7 +RjQJ ³&{QJ 1JKӋ Giҧi Trình Tӵ Gen ThӃ HӋ Mӟi - Next Generation 6HTXHQFLQJ´ ,QWHUQHW KWWSVWDSFKLVLQKKRFFRPJLDL-trinh-tu-gen-the-he- moi.html, Jun 29, 2021
[23] $0.URSLQVNL³3UDFWLFDODGYLFHRQWKHRQH-step growth curve´LQMethods in
Molecular Biology, vol 1681, Humana Press Inc., 2018, pp 41±47
[24] ³ ,QWURGXFWLRQ WR 1H[W *HQHUDWLRQ 6HTXHQFLQJ -