Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chế tạo chế phẩm thực khuẩn thể PVN06 và thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra giống

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn nghiên cứu khoa học: PGS.TS Lê Phi Nga Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Thị Lệ Thủy

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 28 tháng 06 năm 2023

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 Chủ tịch: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng

2 Phản biện 1: TS Nguyễn Thị Lệ Thủy3 Phản biện 2: PGS TS Hoàng Anh Hoàng4 Ủy viên: PGS TS Lê Phi Nga

5 Thư ký: TS Phan Thị Huyền

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS TS Nguyễn Tiến Thắng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TÔ HUỆ NGỌC MSHV: 2070637 Ngày, tháng, năm sinh: 31/01/1998 Nơi sinh: BR-VT Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu chế tạo chế phẩm thực khuẩn thể PVN06 và thử nghiệm

hiệu quả phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra giống (A research to create PVN06

bacteriophage product and the trial of it against Bacillary necrosis of Pangasius)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nhiệm vụ: Xác định điều kiện chế tạo, bảo quản phage PVN06 và khả năng sử

dụng chế phẩm phage trong phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra

Nội dung:

1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo phage.

2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường đến quá trình bảo quản phage.

3. Đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn E ictaluri bằng chế phẩm phage

PVN06 trong môi trường TSB.

4. Đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm phage trong phòng bệnh gan thận mủở cá tra giống.

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 14/02/2022

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/06/2023V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS TS Lê Phi Nga

Tp HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2023

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS TS Lê Phi Nga

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã trang bị cho chúng em nền tảng kiến thức vững chắc trước khi bước vào đời, tiếp cận thực tế Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt đến cô Lê Phi Nga, là người trực tiếp hướng dẫn, góp ý tận tình giúp em hoàn thành Luận văn tốt nghiệp Cảm ơn cô đã định hướng, truyền đạt những kiến thức chuyên môn, những kinh nghiệm quý báu, cũng như luôn tận tình quan tâm, giúp đỡ em trong thời gian qua Ngoài ra em xin cảm ơn các anh chị và các bạn phòng lab 107, nhất là chị Trần Thị Thanh Xuân và bạn Lê Thị Mỹ Duyên đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm luận văn

Cảm ơn trường Đại học Bách Khoa đã cho em một môi trường học tập và rèn luyện bản thân Trong suốt quá trình học tập, thực hành ở trường không những trang bị cho em vốn kiến thức chuyên môn mà còn là những bài học làm người, kỹ năng sống cần thiết trên con đường phía trước Cảm ơn những mùa bài tập lớn, mùa thi, những bài thí nghiệm và cả những chương trình, chiến dịch tình nguyện của trường đã nuôi lớn tâm trí em từng ngày Cảm ơn những kỉ niệm gắn bó với mái trường này, em sẽ không bao giờ có thể trải qua lần nữa

Lời cuối cùng, em kính chúc quý thầy cô trường Đại học Bách Khoa dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công trong cuộc sống và sự nghiệp, cũng như luôn giữ ngọn lửa đam mê trong nghiên cứu và giảng dạy

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri gây ra là một trong những bệnh phổ

biến trên cá tra gây ra thiệt hại nặng nề Liệu pháp phage là một phương pháp tiềm năng trong việc kiểm soát vi khuẩn và phòng bệnh đang được nghiên cứu thay cho việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh Mục đích của luận văn là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo và bảo quản phage từ đó đánh giá hiệu quả sử

dụng chế phẩm PVN06 để kiểm soát vi khuẩn E ictaluri ở quy mô in vitro lẫn qui

mô in vivo Qua khảo sát, MOI, pH và nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06 MOI = 0.1, pH 6.0 và nhiệt độ từ 28-30℃ là các điều kiện giúp mật độ phage trong chế phẩm đạt được mức tối đa Trong khi đó, khi bổ sung ion Mg2+ và Ca2+ không làm tăng hiệu quả của quá trình chế tạo phage Ngoài ra, phage PVN06 bảo quản dễ dàng trong môi trường TSB ở 4℃ và nhiệt độ phòng

Trong thí nghiệm in-vitro khảo sát khả năng phage kiểm soát vi khuẩn cho thấy với hai nghiệm thức MOI = 0.1 và 1.0 phage PVN06 có thể kiểm soát sự tăng sinh của vi khuẩn lên đến hơn 10 giờ Đối với thí nghiệm in-vivo đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm phage PVN06 trong phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra giống được tiến hành với 21 nghiệm thức ở qui mô 20 lít với tổng số 20 con cá/bể và được lặp lại 3 lần Cá được cho ăn thức ăn được phun với chế phẩm phage với liều lượng 7.17±0.09, 8.17±0.09 và 9.17±0.09 log PFU/g mỗi ngày trước khi nhiễm khuẩn Cá được cảm nhiễm vi khuẩn 1 lần duy nhất trong suốt thử nghiệm với mật độ từ 3.01-7.01 logCFU/mL Một ngày sau cảm nhiễm, cá tiếp tục ăn thức ăn có trộn phage mỗi ngày cho đến hết thử nghiệm Tỷ lệ cá chết tích lũy được ghi nhận trong 14 ngày Kết quả

thử nghiệm cho thấy, vi khuẩn E ictaluri E1 gây ra các triệu chứng điển hình của

bệnh gan thận mủ trên cá với tỷ lệ cá chết tích lũy từ 36.7±2,9 đến 75.0±5,0%, tùy thuộc vào nồng độ vi khuẩn được sử dụng để gây nhiễm Cá ăn thức ăn có phage với 9.17±0.09 log PFU/g làm giảm đáng kể tỷ lệ chết, trong khi các nghiệm thức với 8.17±0.09 và 7.17±0.09 log PFU/g thì không Liều phage này giúp giảm 61.7 lần độc tính của vi khuẩn gây bệnh và tỷ lệ sống sót ở cá tăng 15–23.3% Nghiên cứu cho thấy phage PVN06 có hiệu quả bảo vệ cá tra giống với bệnh gan thận mủ

ABSTRACT

Bacillary necrosis of pangasius (BNP) is a disease caused by Edwarsiella

ictaluri bacteria in striped catfish Pangasianodon hypophthalmus that results in high

mortality rates Phage therapy is a potential method of bacterial control and disease prevention that is being studied instead of using antibiotics in the treatment of disease The purpose of the thesis is to investigate the factors affecting the phage preservation process and evaluate the effectiveness of using PVN06 in controlling bacteria both in vitro and in vivo After the survey, MOI, pH and temperature have affected PVN06 phage titer MOI = 0.1, pH 6.0 and temperature from 28℃ to 30℃ have the good conditions to produce phage PVN06 Besides that, ion Mg2+ and Ca2+ have not increase PVN06 phage titer Moreover, phage PVN06 can be easily produced and stored in TSB broth at 4℃ and room temperature

In the experiment to investigate the ability of phage to control bacteria, it was shown that with two treatments, MOI = 0.1 and 1.0, phage PVN06 could control the growth of bacteria for up to more than 10 hours In the experiment to evaluate the effectiveness of using PVN06 phage in the prevention of BNP, 21 treatments were carried out at 20 litter water with a total of 20 fishes/tank In an experimental trial, the phage was administered to fish by feeding phage-coated feed with doses of 7.17±0.09, 8.17±0.09 and 9.17±0.09 log PFU/g feed per day before bacterial infection Fish were infected by bacteria once with concentrations ranging from 3.01 to 7.01 log CFU/ml tank water A day after infection, phage treatment resumed at a rate of once per day until the end of the trial The results of the trial show that bacterial infection caused typical symptoms of BNP in fish with the cumulative fish death rate of 36.7±2.9 to 75.0±5.0%, depending on the bacterial concentration used for infection Phage treatment with 9.17±0.09 log PFU/g significantly reduced the mortality rate, while treatments with 8.17±0.09 and 7.17±0.09 log PFU/g did not This phage dose resulted in a 61.7-fold reduction in the toxicity of the bacterial pathogen and the survival rate of 15–23.3% in fish Our study has demonstrated that the bacteriophage PVN06 protected striped catfish from BNP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Tô Huệ Ngọc, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, khóa 2022 đợt 2, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường ĐH Bách Khoa – ĐHQG TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan công trình nghiên cứu là do chính tôi thực hiện, các số liệu là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS TS Lê Phi Nga

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả trong luận văn tốt nghiệp của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 06 năm 2023 Học viên thực hiện

Tô Huệ Ngọc

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Tính cấp thiết và ý nghĩa khoa học của đề tài 2

Chương 2 Tổng quan 3

2.1 Bệnh gan thận mủ ở cá tra 3

2.1.1 Tình hình nuôi cá tra hiện nay 3

2.1.2 Dịch bệnh gan thận mủ trong nuôi cá tra 4

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5

2.3 Các phương pháp phòng trị bệnh gan thận mủ 6

2.4 Liệu pháp phage 9

2.4.1 Khái niệm về phage 9

2.4.2 Ưu điểm 11

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến liệu pháp phage 12

2.5.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phage 13

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính ổn định của chế phẩm phage 15

2.5.3 Thử nghiệm chế phẩm phage trên cá 16

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 17

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22

3.2 Vật liệu 22

3.2.1 Vật liệu sinh học 22

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 22

3.2.3 Môi trường 24

3.2.4 Phương pháp đĩa thạch 2 lớp (plaque assay) 24

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06 26

3.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến bảo quản chế phẩm phage 27

3.3.7 Thử nghiệm chế phẩm phage trong phòng bệnh trên cá tra giống 28Chương 4 Kết quả và bàn luận 34

4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06 344.1.1 Ảnh hưởng của giá trị MOI đến quá trình chế tạo chế phẩm phage 34

4.1.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình chế tạo chế tạo chế phẩm phage

35

4.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chế tạo chế phẩm phage 36

4.1.4 Ảnh hưởng của cation đến quá trình chế tạo chế phẩm phage 37

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và các loại môi trường dinh dưỡng đến quá trình bảo quản phage PVN06 38

4.3 Thử nghiệm chế phẩm phage trong phòng bệnh 40

Danh mục công trình khoa học 49

Tài liệu tham khảo 50

Phụ lục 62

Phụ lục A Hóa chất và môi trường 62

Phụ lục B Phân tích thống kê các kết quả thí nghiệm 65

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BHI Brain heart infusion CFU Colony form units DNA Deoxyribonucleic Acid

EIA Edwardsiella ictaluri medium agar

EIM Edwardsiella ictaluri medium

LB Luria Bertani Broth MOI Multiplicity of infection P-BH Phage bất hoạt

PBS Phosphate Buffered Saline PFU Plaque form units

RNA Rinonucleic Acid SM Sodium Magnesium TSA Tryptic Soy Broth Agar TSB Tryptic Soy Broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Sự phân bố nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại kháng sinh khác

nhau có nồng độ thuốc từ 0.12 đến 128 µg/ml trên 64 chủng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri phân lập từ cá tra Pangasianodon hypophthalmus bệnh gan, thận mủ 8

Bảng 3.1 Các yếu tố và bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06 27

Bảng 3.2 Mô hình thử nghiệm chế phẩm phage trong phòng bệnh ở cá tra 29

Bảng B.1 Ảnh hưởng của MOI đến hiệu quả chế tạo chế phẩm PVN06 65

Bảng B.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chế tạo chế phẩm PVN06 66

Bảng B.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chế tạo chế phẩm PVN06 67

Bảng B.4 Ảnh hưởng của ion Mg2+ đến hiệu quả chế tạo chế phẩm PVN06 68

Bảng B.5 Ảnh hưởng của ion Ca2+ đến hiệu quả chế tạo chế phẩm PVN06 69

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cơ cấu các mặt hàng thủy sản xuất khẩu 5 tháng đầu năm 2022 3

Hình 2.2 Gan, thận, tỵ tạng của cá tra bị bệnh gan thận mủ 4

Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn E ictaluri 5

Hình 2.4 Cấu trúc phage T4 9

Hình 2.5 Chu trình sinh tan và tiềm tan của phage 10

Hình 2.6 Chế phẩm phage BAFADOR® 14

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu 25

Hình 4.1 Ảnh hưởng của MOI đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06 34

Hình 4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06 35

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chế tạo phage PVN06 36

Hình 4.4 Ảnh hưởng của ion Mg2+ và Ca2+ đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06 37

Hình 4.7 Hoạt tính của chế phẩm phage PVN06 trong môi trường TSB, BHI và EIM bảo quản ở 4℃ và nhiệt độ phòng (30℃) 39

Hình 4.8 Khả năng kiểm soát sự tăng sinh của vi khuẩn của phage PVN06 41

Hình 4.9 Phage PVN06 thôi giải từ thức ăn đi vào đệm SM 42

Hình 4.10 Mật độ phage PVN06 từ thức ăn đi vào nước nuôi cá thay đổi theo thời gian trong 15 ngày khảo sát 43

Hình 4.11 Tỷ lệ cá chết tích lũy trong thử nghiệm phòng bệnh 44

Hình 4.12 Dấu hiệu bệnh lý cá cảm nhiễm 46

Hình 4.13 Sản phẩm PCR phát hiện E ictaluri (407 bp) từ cá tra cảm nhiễm 47

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nghề nuôi và xuất khẩu cá tra ở Việt Nam, đặc biệt là các vùng ở Đồng bằng sông Cửu Long đã mang lại những lợi ích kinh tế lớn và có xu hướng không ngừng phát triển Theo Tổng cục Thủy sản, cả năm 2022, kim ngạch xuất khẩu cá tra đạt 2.4 tỷ USD [1] Trong vài năm trở lại đây, mô hình nuôi cá tra xuất khẩu ở Đồng bằng sông Cửu Long ngày càng nhân rộng, đem về một nguồn thu nhập lớn cho người dân ở đây Tuy nhiên, việc tăng trưởng một cách nhanh chóng của các vùng nuôi không theo quy hoạch, nuôi ở mật độ cao để gia tăng sản lượng dẫn đến ô nhiễm môi trường

nước, dịch bệnh xảy ra Trong đó bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

là một loại bệnh phổ biến ở cá tra, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất nuôi cũng như thiệt hại về mặt kinh tế [2]

Cho đến nay, kháng sinh vẫn là biện pháp được áp dụng nhiều nhất cho các loại bệnh do vi khuẩn gây ra Bên cạnh những thuận lợi về điều trị và phòng chống bệnh của kháng sinh thì sự kháng kháng sinh của vi khuẩn và dư lượng kháng sinh trong cá là những vấn đề gây trở ngại lớn trong việc sản xuất các loại sản phẩm làm từ cá Vì thế cần tìm ra một phương pháp mới không cần sử dụng kháng sinh và an toàn nhưng vẫn có thể phòng và trị bệnh gan thận mủ, và đó là liệu pháp phage

Phage là virus kí sinh và tiêu diệt vi khuẩn Sử dụng phage để kiểm soát bệnh cho vi khuẩn gây ra là một hướng nghiên cứu tiềm năng Do đó đề tài Thạc sĩ này được thực hiện thuộc lĩnh vực nghiên cứu tạo chế phẩm phage kiểm soát bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá tra

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng sản xuất, bảo quản và sử dụng chế phẩm từ phage PVN06 trong phòng bệnh gan thận mủ từ cá tra giống Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đã thực hiện các nội dung sau:

- Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình sản xuất

phage

- Đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng đến hoạt tính của chế phẩm trong quá trình bảo quản

- Đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn E ictaluri bằng chế phẩm phage

PVN06 trong môi trường TSB

- Đánh giá khả năng phòng bệnh gan thận mủ của chế phẩm phage đối với cá tra giống ở mô hình nhiễm bệnh

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là: (i) Phage PVN06 được chính tôi (Tô Huệ Ngọc) phân lập từ mẫu bùn ao được báo cáo trong luận văn tốt nghiệp đại học năm

2020 và (ii) chủng vi khuẩn E ictaluri E1 phân lập năm 2015 được cung cấp bởi

Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ

Đề tài ứng dụng các đối tượng nghiên cứu trên để chế tạo chế phẩm phage và sử dụng chế phẩm này trong phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra giống

1.4 Tính cấp thiết và ý nghĩa khoa học của đề tài

Liệu pháp phage là một liệu pháp có ý nghĩa quan trọng trong việc thay thế kháng sinh trong quá trình phòng và trị bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá Do đó sự ổn định và khả năng kiểm soát vi khuẩn của phage là cần thiết để ứng dụng phage trong thực tế

Kết quả đề tài luận văn là một phần nghiên cứu “Nghiên cứu những yếu tố cơ sở nhằm đề xuất quy trình tạo chế phẩm thực khuẩn thể phòng bệnh do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra” thuộc Đại học Quốc gia Tp HCM, mã số

562-202020-1, do PGS TS Lê Phi Nga chủ nhiệm Đề tài là cơ sở khoa học để ứng

dụng phage phòng và trị bệnh ở cá tra do vi khuẩn E ictaluri gây ra trong thực tế

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Bệnh gan thận mủ ở cá tra

2.1.1 Tình hình nuôi cá tra hiện nay

Việt Nam là quốc gia có nhiều điều kiện thuận lợi trong phát triển ngành thủy sản Nước ta có đường bờ biển dài và vùng mặt nước nội địa lên đến 1.4 triệu ha nhờ hệ thống sông ngòi, đầm phá dày đặc giúp Việt Nam trở thành quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng 3 thế giới trong năm 2022 Nuôi cá tra để phục vụ cho sản xuất và xuất khẩu tập trung chủ yếu ở Đồng bằng Sông Cửu Long trong đó các tỉnh Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp là những vùng nuôi lớn nhất, chiếm hơn 75% tổng sản lượng cá cả nước và có gần 100 nhà máy sản xuất [3] Cá tra là một trong những mặt hàng thủy sản quan trọng của Việt Nam – chiếm 25.94% cơ cấu mặt hàng thủy sản xuất khẩu 5 tháng đầu năm 2022 (đứng thứ 2 sau mặt hàng tôm) được thể hiện ở hình 2.1, góp phần vào sự tăng trưởng của xuất khẩu thủy sản nói riêng và nền kinh tế đất nước nói chung Năm 2020, Việt Nam xuất khẩu cá tra sang 138 thị trường; top 4 thị trường nhập khẩu cá tra (2022) gồm: Mỹ, Trung Quốc - Hồng Kông, khối CPTPP (Hiệp định Đối tác toàn diện và tiến bộ xuyên Thái Bình Dươn), Châu Âu (EU); các thị trường tiềm năng khác như Brazil, Thái Lan, các tiểu Vương quốc Ả Rập Thống nhất – UAE, Anh… đều có sự tăng trưởng mạnh [3], [4]

Hình 2.1 Cơ cấu các mặt hàng thủy sản xuất khẩu 5 tháng đầu năm 2022 [5]

Năm 2022, sản xuất và xuất khẩu cá tra đã mang về những con số ấn tượng Theo tổng cục thủy sản, năm 2022, diện tích thả nuôi cá tra đạt 5500 ha, tăng 4% so

với năm 2021; sản lượng thu hoạch đạt 1.6 triệu tấn, tăng 3.5%; kim ngạch xuất khẩu đạt 2.4 tỷ USD, tăng 70% so với năm 2021 [1]

Bên cạnh những thuận lợi về thị trường thì ngành nuôi và chế biến cá tra đang đối mặt với nhiều thách thức: cá tra giống chưa được kiểm soát tốt; giá thức ăn và các vật tư đầu vào tăng mạnh; bên cạnh đó do biến đổi khí hậu, xâm nhập mặn tiến sâu vào nội địa gây ảnh hưởng đến hoạt động nuôi cá tra; năm 2021 có 23 lô xuất khẩu cá tra bị cảnh báo về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm [6] Do đó, để đạt được các mục tiêu đề ra trong năm 2022, việc nuôi và sản xuất cá tra cần được kiểm soát, đảm bảo an toàn thực phẩm và chất lượng cá tra

2.1.2 Dịch bệnh gan thận mủ trong nuôi cá tra

Ba tác nhân chính thường hay gây ra các bệnh truyền nhiễm trong quá trình nuôi cá tra ở ĐBSCL gồm: vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm; ngoài ra còn có một số loại bệnh khác như các hội chứng vàng da, bệnh trắng mang trắng gan… [7] Trong đó các bệnh do vi khuẩn gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi cá tra

công nghiệp, đặc biệt Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila và

Flavobacterium columnare là các tác nhân vi khuẩn phổ biến [8]

Bệnh gan thận mủ ở cá tra do vi khuẩn E ictaluri gây ra là một bệnh nguy hiểm

và gây thiệt hại lớn cho người nông dân Bệnh xảy ra ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá nhưng gây thiệt hại nặng nề nhất là ở giai đoạn cá giống với tỷ lệ chết lên đến 100%, từ 30 – 50% đối với cá thịt [9]

Hình 2.2 Gan, thận, tỵ tạng của cá tra bị bệnh gan thận mủ [10]

Theo tổng cục Thống kê, năm 2021, 40 ha diện tích sản xuất giống và 7 ha nuôi thương phẩm tại An Giang và Đồng Tháp thiệt hại do dịch bệnh gan thận mủ; 5 tháng đầu năm 2022, có khoảng 153 ha diện tích sản xuất cá tra giống và nuôi thương phẩm tại các tỉnh Vĩnh Long, An Giang và Đồng Tháp bị thiệt hại, trong đó cá bị bệnh gan thận mủ gần 60 ha, chiếm gần 40% diện tích cá có dịch bệnh [2]

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc chi Edwardsella, được phân loại vào họ

Enterobacteriaceae, được biết đến là tác nhân gây bệnh cho nhiều loại vật chủ khác

nhau và đặc biệt là gây thiệt hại cho cá [11] Có ba loài thuộc chi này gồm có: E

hoshinae, E ictaluri và E tarda, trong đó E ictaluri và E tarda có nhiều điểm tương

đồng về đặc điểm di truyền [12]

Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn E ictaluri (A) Nhuộm Gram tế bào dưới kính hiển vi

quan học, độ phóng đại x1000, (B) Khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSB agar, 28℃, (C) Khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường EIM agar,

28℃, 28℃ [13]

Vi khuẩn E ictalluri là vi khuẩn Gram âm, có dạng que, mảnh và có kích thước

biến đổi (2.0 – 3 μm) (Hình 2.3A), phát triển tốt ở 26 - 30℃, di động yếu hoặc không di động khi nhiệt độ trên 30℃ Vi khuẩn có thể đi vào cá thông qua mũi, đường tiêu hóa và từ hậu môn của cá Sau khi xâm nhập vào vật chủ, vi khuẩn di chuyển đến não, gan, thận gây ra nhiễm trùng máu, viêm gan, viêm thận,… chỉ sau 1-2 tuần xâm

nhiễm Về hình thái khuẩn lạc, vi khuẩn E ictaluri khi được nuôi cấy trên môi trường TSB agar phát triển sau 48 giờ ở 28℃, có màu trắng sữa, lồi được thể hiện ở hình

2.3B và trên môi trường EIA sau 24-48 giờ ở 28℃ tạo thành các khuẩn lạc nhỏ, có màu xanh lá [14, 15]

Ngoài gây bệnh gan thận mủ cho cá tra ở Việt Nam, E ictaluri còn được biết

đến như một tác nhân gây bệnh dẫn đến thiệt hại cho nền kinh tế ở một số loài thủy

sản một số nước khác Loài này gây bệnh trên cá trê Clarius batrachus ở Thái Lan, cá trê vàng Pelteobagrus fulvidraco ở Trung Quốc, cá Ayu ở Nhật Bản và một số loại cá da trơn khác ở Mỹ như Ictalurus furcatus và Noturus gyrinus, cá rô phi

Oreochromis niloticus ở sông Nile,… với tỉ lệ chết từ 10 - 90% [14] Mức độ gây

thiệt hại của vi khuẩn E ictaluri là cao, do đó cần có các biện pháp phòng ngừa và

điều trị nhằm giảm ảnh hưởng của vi khuẩn này trong công tác nuôi trồng thủy hải sản

2.3 Các phương pháp phòng trị bệnh gan thận mủ

Để có thể giảm thiểu thiệt hại của bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri gây

ra cần phải có những phương án phòng bệnh ngay từ đầu, chất lượng giống nuôi, chất lượng nguồn nước và ao nuôi, thức ăn cho cá, theo dõi cá định kỳ,… cần được kiểm soát kỹ lưỡng [7] Ngoài ra, vaccine cũng được sử dụng trong công tác phòng bệnh gan thận mủ trên cá như vaccine “ALPHA JECT® Panga 1” (licenses 4/2013) Tuy nhiên, các loại vaccine cho thời gian miễn dịch không dài Ngoài ra, những phương pháp khác sử dụng các loại vaccine bất hoạt để phòng ngừa bệnh nhiễm khuẩn do vi

khuẩn E ictaluri cho cá tra ở Việt Nam cũng đã được thử nghiệm nhiều nhưng chưa

có kết quả về lâu dài [16]

Khi cá có dấu hiệu bệnh hay dịch bệnh bùng phát thì kháng sinh là lựa chọn đầu tiên được người nuôi cá tra sử dụng Sử dụng kháng sinh có nhiều lợi ích như dễ tìm trên thị trường, dễ sử dụng và hiệu quả nhanh chóng Song, việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát, sự thiếu hiểu biết của người nuôi thủy sản về kháng sinh và đặc điểm khó phân hủy của nó đã gây ra nhiều tác hại

Thứ nhất, sử dụng kháng sinh vượt qua mức cho phép có thể làm tồn đọng trong sản phẩm cá đưa ra thị trường gây ra nhiều vấn đề Vấn đề đầu tiên có thể kể đến đó là ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, đặc biệt là sản phẩm xuất khẩu Quý I/2021, Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (NAFIQAD) báo cáo rằng có tổng cộng 8 lô hàng thủy sản xuất khẩu bị trả về do dư lượng kháng sinh [17] Tiếp theo, dư lượng kháng sinh có thể từ sản phẩm đi vào cơ thể của người sử dụng, từ đó thúc đẩy kháng kháng sinh của hệ vi khuẩn, gây dị ứng và một số bệnh lý khác đối với người tiêu dùng [18, 19, 20]

Thứ hai, sử dụng kháng sinh quá mức thì lượng dư thừa từ thức ăn và phân cá lắng xuống đáy hồ và có thể lẫn vào bùn đáy hoặc đi theo nguồn nước lan truyền sang các khu vực khác Dư lượng kháng sinh này sẽ gây áp lực chọn lọc tự nhiên và từ đó làm thay đổi hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và hình thành các vi khuẩn kháng kháng sinh [18]

Thứ ba, sử dụng sai cách và dư thừa kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đặc biệt trong nuôi cá đã gây ra khả năng kháng kháng sinh ở vi khuẩn Đáng nói, khi vi khuẩn gây bệnh kháng lại kháng sinh sẽ gây ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình phòng

trị bệnh [18] Với vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá tra có hiện tượng kháng lại nhiều loại kháng sinh được thể hiện trong bảng 2.1, ta thấy được đa số vi khuẩn E

ictaluri kháng với streptomycin (83% chủng vi khuẩn), với oxytetracycline (81%) và

trimethoprim (71%) Ngoài ra, hiện tượng kháng thuốc kháng sinh trên nhóm

flourquinolone lần đầu tiên tìm thấy trên vi khuẩn E ictaluri như flumequin (8%

chủng vi khuẩn), acid oxolinic (6%) và enrofloxacin (5%) Đặc biệt, hầu hết các

chủng vi khuẩn E ictaluri có khả năng kháng thuốc tự nhiên đối với colistin (100%

chủng vi khuẩn) với MIC ≥ 128 μg/ml Điều đáng lưu ý là hiện tượng đa kháng thuốc

(kháng ít nhất là 3 loại thuốc) của vi khuẩn E ictaluri là 73 % chủng vi khuẩn [21]

Tóm lại, việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát làm dư lượng kháng sinh tạo ra nhiều hệ lụy như tạo ra các chủng vi khuẩn đa kháng khó kiểm soát, người sử dụng hấp thụ một lượng kháng sinh không nhỏ từ thực phẩm ăn uống hàng ngày gây dị ứng, ngộ độc, đồng thời ngăn cản việc xuất khẩu thủy sản ra các nước tiềm năng như các nước Liên minh Châu Âu, Mỹ, Úc,… Một biện pháp mới vừa giúp điều trị bệnh gan thận mủ ở cá tra vừa đảm bảo an toàn thực phẩm giúp ngành nuôi cá tra phát triển bền vững và xuất khẩu sang các nước lớn cần được nghiên cứu Liệu pháp phage là tiềm năng lớn để ngăn cản sự phát triển của bệnh và hướng tới phát triển bền vững

Bảng 2.1 Sự phân bố nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại kháng sinh khác

nhau có nồng độ thuốc từ 0.12 đến 128 µg/ml trên 64 chủng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri phân lập từ cá tra Pangasianodon hypophthalmus bệnh gan, thận mủ [21]

2.4 Liệu pháp phage

2.4.1 Khái niệm về phage

Phage là một loại virus đặc biệt chỉ xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn nhưng không gây bệnh cho người và động vật Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được phát hiện bởi Frederick W.Twort (1915) và Félix d’Hérelle (1917) Có hàng ngàn loại phage tồn tại, mỗi loại phage chỉ lây nhiễm cho một hoặc một vài loại vi khuẩn Phage khi xâm nhiễm vi khuẩn, chúng sẽ sử dụng vật chất bên trong vi khuẩn để sinh sản do chúng không có bộ máy tổng hợp protein cũng như tổng hợp bộ gen

Cấu trúc của phage

Siphoviridae và Podoviridae [23] Phage thuộc Caudovirales là nhóm phage được

nghiên cứu nhiều nhất Các phage có đuôi bao gồm ba thành phần chính: phần đầu là vỏ capsid bao quanh vật liệu di truyền của phage, tiếp đến là phần đuôi và cuối cùng

là các chân bám nằm ở cuối đuôi (Hình 2.3) [24]

Phage có thể là phage ôn hòa hay phage độc tùy vào cơ chế xâm nhiễm của chúng là sinh tan hay tiềm tan (Hình 2.6) Quá trình xâm nhiễm của một phage bắt đầu bằng việc phage hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn sau đó chúng đưa vật liệu di truyền vào tế bào chủ Đối với chu trình sinh tan, bộ gen của phage điều khiển bộ máy vi khuẩn để tạo ra các enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp vật liệu di truyền và protein của chính phage đó; cuối cùng, enzyme lysozyme của phage được tạo ra và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn giải phóng các hạt phage mới ra ngoài môi trường tìm kiếm vi khuẩn khác để xâm nhiễm (Hình 2.6) Ngược lại với chu trình sinh tan, đối với chu trình tiềm tan, sau khi xâm nhiễm phage sẽ không phá hủy tế bào vi khuẩn ngay lập tức mà sẽ cài vật liệu di truyền của chúng vào bộ gen của vi khuẩn và bộ gen của phage sẽ được nhân lên cùng bộ gen của vi khuẩn; những phage tiềm tan có thể chuyển sang chu trình sinh tan và phá hủy tế bào khi gặp stress do các yếu tố môi trường hay điều kiện chuyển hóa của tế bào vi khuẩn [25]

Hình 2.5 Chu trình sinh tan và tiềm tan của phage: (1) Phage gắn vào tế bào vi

khuẩn và bơm bộ gen vào bên trong, (2) Bộ gen phage đi vào chu trình sinh tan hoặc chu trình tiềm tan, (3a) Bộ gen mới của phage và protein được tổng hợp và lắp

ráp, (4a) Tế bào vỡ ra và phóng thích các hạt phage mới, (3b, 4b) Các bước của chu trình tiềm tan: Sự kết hợp giữa bộ gen phage với bộ gen vi khuẩn, vi khuẩn vẫn tiếp

tục nhân mật số

Nhìn chung, chỉ có phage sinh tan được sử dụng để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn vì khả năng ly giải ngay lập tức tế bào chủ cũng như tránh các tác động tiêu cực có thể xảy ra của các phage tiềm tan như tăng cường độc lực của vi khuẩn, bảo vệ tế bào vi khuẩn chủ khỏi sự xâm nhiễm của các phage sinh tan khác [26] Trong khi phage tiềm tan có thể được sử dụng để chẩn đoán bệnh do sự tích hợp bộ gene của chúng vào bộ gene tế bào vi khuẩn chủ [27]

2.4.2 Ưu điểm

Hiện nay, tình trạng dịch bệnh trên thủy sản do vi khuẩn gây ra đang là vấn đề gây thiệt hại cho người canh tác Sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh mang lại hiệu quả nhanh chóng nhưng không bền vững do kháng sinh tấn công toàn bộ quần thể vi khuẩn mà nó tiếp xúc và việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát làm dư lượng kháng sinh tạo ra nhiều hệ lụy như tạo ra các chủng vi khuẩn đa kháng nguy hiểm, người sử dụng hấp thụ một lượng kháng sinh không nhỏ từ thực phẩm ăn uống hàng ngày gây dị ứng, ngộ độc [28], đồng thời găn cản việc xuất khẩu thủy sản ra các nước tiềm năng như các nước Liên minh Châu Âu, Mỹ, Úc,… [29] Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng vaccine trong phòng bệnh nhưng vaccine cho hiệu quả bảo vệ trong thời gian rất ngắn và không mang lại hiệu quả cao [30] Với các biện pháp dùng kháng sinh hay vaccine thì liệu pháp phage có ưu điểm chỉ tiêu diệt vi khuẩn đích (hoặc các vi khuẩn cùng một họ) và cách sử dụng đơn giản cho thủy sinh nên được xem là một giải pháp tiềm năng để ngăn cản sự phát triển của bệnh và hướng tới phát triển bền vững [31, 32]

Những ưu điểm của liệu pháp phage gồm:

Đầu tiên, liệu pháp phage mang tính đặc hiệu cao: chỉ tác động tới một hoặc một vài vi khuẩn cùng loài nên không gây bất lợi cho các vi khuẩn khác do đó hạn chế ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật môi trường cũng như hệ vi sinh trong động vật thủy

Thứ tư, số lượng phage trong tự nhiên rất lớn, chúng có mặt khắp mọi nơi, với tổng số khoảng 1031 Việc phân lập và tìm kiếm một phage mới dễ dàng hơn (có thể chỉ mất một hoặc vài tuần) so với tìm một loại kháng sinh mới hay vaccine [32]

Thứ năm, khả năng chống chịu của phage với các điều kiện môi trường cao và khác nhau ở mỗi loại phage Hầu như các phage đều có thể được phân lập từ môi trường có chứa vi khuẩn chủ, thậm chí ở những nơi có điều kiện nhiệt độ cao, pH thấp, … [33]

Và cuối cùng, chúng ta có thể sử dụng phage để xâm nhiễm các loại vi khuẩn kháng kháng sinh

Thứ ba, hiệu quả sử dụng phage tùy thuộc vào tiến triển của bệnh

Cuối cùng, tính ổn định của mỗi phage là khác nhau và chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, do đó việc ứng dụng phage vào thực tế cần được nghiên cứu kỹ lưỡng

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến liệu pháp phage

Để liệu pháp phage có thể ứng dụng được trong thực tế, chế phẩm phage cần

đáp ứng một số yêu cầu sau:

Độc lực: Phage phải có độc lực li giải vi khuẩn, không tồn tại dưới dạng prophage Đây được xem là yêu cầu hàng đầu trong quá trình lựa chọn các dòng phage trong nghiên cứu và ứng dụng [35]

An toàn: Phage không có chứa bất kỳ gene kháng sinh và có phổ ký chủ cụ thể [34]

Đặc tính xâm nhiễm: Phage phải có phổ xâm nhiễm rộng, chu kỳ xâm nhiễm lớn [33]

Mật độ phage: Trong chế phẩm phage phải đủ cao để đạt được hiệu quả kiểm soát vi khuẩn [33]

Ổn định hoạt tính: Chế phẩm phage phải ổn định hoạt tính trong thời gian nhất định [33]

Để biết được chế phẩm phage có thể ứng dụng được trong thực tế cần xác định một số yếu tố tác động đến phage như pH, nhiệt độ, môi trường nuôi,… Hơn nữa là cần làm rõ cách thức đưa phage vào cơ thể động vật thủy sinh như tiêm, cho vào nước nuôi hay thức ăn Vì vậy, một chế phẩm phage nhất thiết phải được đánh giá hiệu quả ở quy mô in vitro và in vivo

2.5.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phage

Trong những năm gần đây, một số báo cáo đã đề cập về tính hiệu quả của phage trong nông nghiệp và thủy sản Mặc dù một số sản phẩm phage đã được thương mại hóa, nhưng vẫn chưa đạt được một quy trình sản xuất phage hiệu quả, liên tục và có thể kiểm soát được [36] Một trong các sản phẩm phage được thương mại trên thị trường đó là BAFADOR® của công ty Proteonpharma (Hình 2.7) được đưa ra thị

trường nhằm mục đích chống lại các bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp và

Pseudomonas spp gây ra ở cá Chế phẩm phage BAFADOR® chứa hỗn hợp phage cocktail (5 loại) với mật độ khoảng 108 PFU/mL, được bảo quản ở nhiệt độ 2-10℃, được sử dụng bằng cách trộn với thức ăn của cá hoặc đổ trực tiếp vào nước ao (áp

dụng cho cá giống) [37] Tuy nhiên, chế phẩm phage ở Việt Nam chỉ mới được nghiên cứu và chưa có bất kỳ chế phẩm nào trên thị trường Phage được tạo ra trong phòng thí nghiệm có thể coi là một quy trình dễ dàng và phương pháp được xác định rõ ràng; tuy vậy, các quy trình tạo phage gặp nhiều khó khăn khi mở rộng quy mô

Bản chất của phage là cần có vi khuẩn chủ để tạo ra phage mới Do đó, quá trình sản xuất phage không chỉ bị chi phối của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo phage mà còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn chủ [36] Các yếu tố ảnh hưởng đến vi khuẩn chủ gồm tốc độ tăng trưởng, mật độ vi khuẩn và hoạt động về trao đổi chất Đối với phage, cần hiểu rõ các đặc điểm cơ bản của chúng gồm thời gian tiềm ẩn, chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân Ngoài ra,

tỉ lệ đầu vào của số lượng phage so với số lượng vi khuẩn, hay còn gọi là tỷ số MOI,

có ý nghĩa quan trọng trong quá trình tạo phage mới - MOI quá cao hay quá thấp đều có tác động tiêu cực đến hệ số nhân của phage cũng như năng suất sản xuất [38] Ngoài ra, quá trình sản xuất còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố tác động từ môi trường bên ngoài Các yếu tố này bao gồm nhiệt độ, pH và thời điểm bổ sung phage

Hình 2.6 Chế phẩm phage BAFADOR® [37]

pH là một yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm, sao chép nội bào và nhân lên của phage Các nghiên cứu cho thấy, ở pH 6-8 là tối ưu cho hầu hết các phage, trong khi đó pH có tính acid (pH<5) và pH kiềm (pH>10) sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả

tạo phage [34] Do đó, cần lựa chọn môi trường có pH phù hợp với phage để có thể đạt được năng xuất cao nhất

Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ của phage lên thành tế bào của vi khuẩn chủ Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều có thể ức chế hoặc làm chậm quá trình hấp phụ và sao chép của phage [39, 40], điều này gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của quá trình sản suất phage Do đó, duy trì điều kiện nhiệt độ thích hợp trong quá trình sản xuất để đảm bảo quá trình hấp phụ và tạo ra phage mới luôn đạt hiệu suất cao

Và đặc biệt, điều quan trọng trong quá trình sản xuất là phải chọn được môi trường phù hợp đồng thời cho sự phát triển của vi khuẩn, sự xâm nhiễm của phage và nhân bản phage mới

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính ổn định của chế phẩm phage

2.5.2.1 pH

Sự thay đổi của pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mà còn cả sự ổn định của thực khuẩn thể, các phage khác nhau sẽ có khoảng pH hoạt động khác nhau [41] Nói chung, các thực khuẩn thể thường ổn định ở pH từ 5 đến 9, ở pH thấp hơn 4 và pH trên 9 phage sẽ bị mất hoạt tính của nó [41] Ma và cộng sự năm 2016 đã báo cáo rằng phage phiAxp-3 xâm nhiễm vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans đã thể hiện hoạt động xâm nhiễm cao nhất ở pH trung

tính, giảm 90,25% và 75,76% khi pH lần lượt là 4.0 và 10 [42] Tương tự, phage được

phân lập từ nước thải kháng Enterobacter cloacae cho thấy pH tối ưu là 7.0 và phage

hoạt động kém ở pH 6.0 và 8.0; trong khi đó pH dưới 5.0 và trên 9.0 không nhận thấy phage còn hoạt động [43] Theo nghiên cứu của Akhwale và cộng sự năm 2019, các chủng phage được phân lập từ trầm tích ở hồ Elmenteita được ủ trong các điều kiện pH khác nhau trong 6 giờ cho thấy rằng, các phage không hoạt động ở pH 2.0 và 4.0; khoảng pH từ 7.0 trở lên cho thấy sự hoạt động ổn dịnh của phage và cao nhất là ở pH 10, tuy nhiên pH cao hơn 12 thì hoạt động của phage giảm [44]

2.5.2.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có thể ảnh hưởng lớn đến sự ổn định của phage, đặc biệt là về khả năng lây nhiễm và khả năng sống sót của nó Nói chung, các phage luôn có một phạm vi nhiệt độ thích hợp để hoạt động tối ưu và sản sinh ra phage mới Nếu nhiệt độ nằm ngoài phạm vi này, phage có thể không lây nhiễm được vật chủ của nó hoặc có thể trở nên kém ổn định hơn [41, 45] Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, chỉ một lượng nhỏ các hạt thể thực khuẩn đưa vật liệu di truyền của chúng vào tế bào chủ, do đó lượng phage được sản sinh ra rất ít [46] Mặc khác, ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, thời gian tiềm ẩn của phage có thể được kéo dài hơn và đặc biệt lớp vỏ capsid sẽ bị phân hủy [46]

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng khoảng nhiệt độ ổn định là đặc trưng cho từng phage và khác nhau phụ thuộc vào các phage phân lập từ nguồn nào Theo như nghiên cứu của Nikapitiya và cộng sự năm 2019 phage ASP-1 ổn định ở nhiệt độ từ 4 đến 50℃ trong 1 giờ [47], nhưng hoạt tính của phage φZH1 và φZH2 giảm ở

nhiệt độ trên 40°C [48] Phage DRL-P1 - thuộc họ Myoviridae, được phân lập từ nước thải – xâm nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cho thấy độ ổn định của nó

trong khoảng nhiệt độ rộng (4 - 40℃) [49] Do đó, tương tự như vi khuẩn chủ, nhiệt độ cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc tác động đến hoạt động và khả năng xâm nhiễm của phage trong môi trường [50]

2.5.3 Thử nghiệm chế phẩm phage trên cá

Hiện nay đã có một số nghiên cứu sử dụng chế phẩm phage trên cá Một số cách để đưa phage vào cá như tiêm phage vào cá, bổ sung phage vào bể nuôi hay cho cá ăn thức ăn có phage, trộn phage vào thức ăn của cá… [51]

Với phương án trộn phage vào thức ăn cần xác định phần trăm phage hấp phụ vào hạt thức ăn, cũng như phần trăm phage thất thoát từ thức ăn ra ngoài môi trường nước cần được khảo sát Đồng thời mật độ khuẩn làm cho cá chết cũng như mức độ bảo vệ của phage đối với cá cũng cần được khảo sát

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Một số nghiên cứu đã phân lập và xác định đặc tính của phage Từ đó, các phage được nghiên cứu thêm về tiềm năng ứng dụng trong phòng và điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra như bệnh trắng đuôi, nhiễm trùng ruột, nhiễm trùng máu, … Các nghiên cứu đầu tiên nghiên cứu về phage điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên thủy sản phải kể đến Wu và cộng sự vào năm 1981 đã sử dụng phage AH1 trong điều trị bệnh do

vi khuẩn Aromonas hydrophila gây ra, tiếp đến năm 1982, Wu và Chao đã ứng dụng phage ET-1 điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella tarda gây ra

Năm 2000, Park và các cộng sự đã phân lập và xác định đặc tính của phage đặc

trưng cho vi khuẩn Pseudomonas plecoglossicida gây bệnh trên cá ayu (Plecoglossus

altivelis) từ các con cá bị bệnh và nước ao nuôi [52] Đồng thời trong nghiên cứu của

Park và Naiki vào năm 2003, hai phage PPpW-3 và PPpW-4 đã được khảo sát tác dụng bảo vệ trên cá thông qua đường ăn cho thấy phage giúp cho tỷ lệ chết ở cá giảm

đáng kể [5] Bộ gen của phage xâm nhiễm vi khuẩn P plecoglossicida được phân

tích trình tự do Kawato và cộng sự thực hiện năm 2014 cho thấy tiềm năng ứng dụng liệu pháp phage thông qua đường ăn làm giảm tỷ lệ chết ở cá ayu khi bị nhiễm khuẩn

P plecoglossicida [53]

Nghiên cứu được thực hiện ở Ấn Độ bởi Khairnar và cộng sự (2013) sử dụng

phage cho điều trị bệnh loét da do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây ra trên bề mặt da của cá trê (Clarias gariepinus) và cho thấy khả năng ngăn chặn tình trạng tổn

thương da ở cá trê sau 8 - 10 ngày điều trị [54]

Các nghiên cứu về phân lập và xác định phage xâm nhiễm vi khuẩn Vibrio

harveyi đã có nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện [55, 56, 57] Đồng thời, các nhóm

nghiên cứu khác đã thực hiện các khảo sát đặc điểm cũng như ứng dụng phage trong

kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn Vibrio parahaemolyticus [58, 59]

Một số nghiên cứu về liệu pháp phage trong kiểm soat bênh u nhọt (furnunculosis) - một loại bệnh gây nhiễm trùng máu và có thể chết bởi vi khuẩn

Aromonas salmonicida gây ra ở cá hồi do Imbeault và cộng sự thực hiện vào năm

2006 cho thấy việc bổ sung phage HER 110 làm chậm quá trình khởi phát bệnh trong 7 ngày [60] Một nghiên cứu khác của Silva và cộng sự năm 2016 về phage xâm

nhiễm vi khuẩn A salmonicida trên cá hồi cho thấy sau 6 giờ bể cá được xử lý với phage AS - A đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn A salmonicida và sau 72 giờ cá

hồi giống có tỷ lệ chết thấp (36%) [61].Năm 2012, Kim và cộng sự đã phân lập, phân

tích đặc điểm và trình tự gen của phage PAS - 1 xâm nhiễm vi khuẩn A salmonicida

từ các mẫu bùn lắng của ao nuôi cá hồi ở Hàn Quốc, cho thấy hiệu quả làm giảm sự phát triển của vi khuẩn trong thí nghiệm in vitro [62]

Liệu pháp phage trong ứng dụng kiểm soát bệnh do vi khuẩn Streptococcus

iniae gây ra ở cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) được thử nghiệm đầu tiên

bởi Matsuoka và cộng sự năm 2007 Thử nghiệm tiến hành bằng cách phân lập phage từ các con cá chết, sau đó thử nghiệm hiệu quả bảo vệ của phage thông qua việc tiêm

phage và vi khuẩn S iniae qua màng bụng của cá và 1 giờ sau đó tiêm phage cocktail,

sau 2 tuần thí nghiệm thu được tỷ lệ cá chết ở nghiệm thức có phage thấp hơn nghiệm thức đối chứng (tỷ lệ sống lên đến gần 85%) [63]

Flavobacterium psychrophilum là vi khuẩn gây ra bệnh xuất huyết trên cá hồi,

tỷ lệ chết cá từ 50% đến 60%, gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi cá hồi trên thế giới Đồng thời với tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn này mà các nghiên cứu về

phage nhằm kiểm soát bệnh do vi khuẩn F psychrophilum gây ra được thực hiện

Năm 2008, Stenholm và cộng sự đã tiến hành phân lập và xác định đặc điểm về hình

thái, bộ gen,… của phage xâm nhiễm vi khuẩn F psychrophilum [64] Sau đó, Castillo và cộng sự (2012), đã tiến hành phân lập phage xâm nhiễm vi khuẩn F

psychrophilum và thử nghiệm khả năng bảo vệ của phage đối với cá hồi bằng cách

tiêm đồng thời vi khuẩn và phage (MOI = 10) qua màng bụng của cá, kết quả cho thấy phage có khả năng làm giảm tỷ lệ tử vong của cá là 13%, với tỷ lệ chết cao nhất là 67% so với nghiệm thức đối chứng tỷ lệ chết cao nhất là 80% [65] Năm 2013,

Madsen và cộng sự đã thực hiện khảo sát sự phát tán và tồn tại của phage F

psychrophilum trong cá và trong môi trường Thí nghiệm này chỉ ra rằng những con

cá tiêm đồng thời phage và vi khuẩn thì phage tồn tại lâu hơn so với cá chỉ được tiêm phage; bên cạnh đó, trong môi trường nước, các nhà nghiên cứu nhận thấy pH có ảnh hưởng đến sự tồn tại của phage, phage tồn tại ở pH 4.5 - 7.5 và sau 55 ngày thì mật độ phage giảm 104 lần so với ban đầu [66]

Phage xâm nhiễm vi khuẩn Flavobacterium columnare lần đầu được phân lập

và xác định đặc điểm từ các ao nuôi cá nước ngọt ở Phần Lan bởi Laanto và cộng sự (2011) [67] Cũng trong năm 2011, Prasad và cộng sự đã phân lập phage xâm nhiễm

F columnare từ nước ao và bùn lắng của các vùng khác nhau ở miền Bắc Ấn Độ,

tiếp đó là khảo sát khả năng bảo vệ của phage bằng cách tiêm phage vào cá, cho cá ăn thức ăn tẩm phage và bổ sung phage vào nước ao nuôi (MOI = 100), tất cả các cách này đều làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn trong huyết thanh, mang, gan và thận của cá (thấp hơn 103 CFU/mL) sau 6 giờ thử nghiệm [68]

Vi khuẩn Vibrio anguillarum gây ra bệnh nhiễm trùng máu ở cá hồi Đại Tây

Dương Higuera và cộng sự (2013) đã phân lập phage xâm nhiễm vi khuẩn trên; đồng thời, nhóm nghiên cứu này đã khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn, kết quả cho thấy phage có khả năng tăng tỷ lệ sống của cá lên 100% (MOI: 1 và 20) so với cá không bổ sung phage tỷ lệ sống chưa đến 10% [69], và đây là báo cáo đầu tiên về phage

trong việc bảo vệ cá chống lại sự lây nhiễm của vi khuẩn V anguillarum

Walakira và cộng sự (2008) là nhóm nghiên cứu đầu tiên trên thế giới công bố

phân lập và xác định đặc điểm cả phage xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, đây là vi khuẩn gây ra bệnh gan thận mủ trên cá nheo (Ictalurus punctatus

Rafinesque) tại Mỹ Các báo cáo sau đó do Carrias và cộng sự (2011), Yasuike và

cộng sự (2014) tiến hành phân tích bộ gen của phage xâm nhiễm E ictaluri đã chứng

minh tiềm năng của chúng như một liệu pháp sinh học chống lại bệnh do vi khuẩn gây ra [70, 71]

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Hiện nay các nghiên cứu về phage ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá còn rất hạn chế Nhóm nghiên cứu của Hoàng Anh Hoàng cùng

cộng sự năm 2018 đã phân lập, khảo sát hoạt tính và giải mã bộ gen của phage MK7 [72] Phage MK7 được phân lập từ gan, thận của cá tra thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, có chu kì xâm nhiễm là 45 phút với hệ số nhân là 50, đồng thời MK7 cho kết

quả thử nghiệm ức chế vi khuẩn E icrtaluri trong môi trường tổng hợp là 15 giờ và

trong nước ao là 51 giờ

Sau đó, Từ Quang Vinh và cộng sự (2020) thực hiện giải trình tự bộ gen hoàn

chỉnh của phage PVN02 chống lại bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas

hydrophila gây ra [73] Nghiên cứu này đã xác nhận rằng PVN02 là một thực khuẩn

thể mới có khả năng được sử dụng như một tác nhân để kiểm soát A hydrophila trên

cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam Sau đó, nhóm của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự (2021) đã tiến hành khảo sát khả năng phòng bệnh và bảo vệ của phage PVN02 ở cá tra [74] Thử nghiệm được tiến hành trên đối tượng cá tra giống

(Pangasianodon hypophthalmus) khoảng 10g trọng lượng bằng cách cho cá ăn thức

ăn viên công nghiệp có phun dịch phage Sau thử nghiệm, tỷ lệ cá chết cao nhất là 68,3 ± 2,9% với mật độ vi khuẩn cao nhất, ngược lại tỷ lệ cá chết ở mật độ vi khuẩn cao nhất giảm đáng kể xuống 8,33 ± 2,9% hoặc 16,67 ± 2,9% khi bổ sung phage với mật độ log 6,2 ± 0,09 hoặc log 4,2 ± 0,09 PFU/g

Ngoài ra, năm 2020 được 7 phage kháng vi khuẩn E ictaluri được tôi phân lập

từ mẫu bùn ao nuôi cá tra (luận văn đại học) trong đó có phage PVN06 đã xác định một số đặc điểm của phage này gồm phổ xâm nhiễm; chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân lần lượt là 65 phút, 53 ± 10; tách chiết genome và xác định genome phage vB - EiM - PVN06 là DNA mạch kép

Như vậy, đã có một số nghiên cứu thử nghiệm in vivo về khả năng bảo vệ của phage đối với thủy sản chống lại những bệnh do vi khuẩn gây ra, bao gồm tiêm phage vào cá, bổ sung phage vào bể nuôi, cho thủy sản ăn thức ăn có chứa phage,… Ngoài ra, sự kết hợp các phage với nhau (phage cocktail) nhằm làm tăng hiệu quả chống lại vi khuẩn gây bệnh tỏ ra hiệu quả hơn sử dụng phage đơn lẻ [75, 76, 77] Mỗi cách ứng dụng đều có ưu nhược điểm khác nhau, nó phụ thuộc vào bản chất của vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, một số phương pháp không khả thi ở quy mô nuôi thủy sản lớn

Tiêm phage sẽ không áp dụng khi việc nuôi với hàng ngàn con cá hoặc nuôi trồng ốc, sò hay hải sâm… Bổ sung phage vào bể nuôi cá ở quy mô lớn gần như rất tốn kém vì ở quy mô lớn cần đến thể tích dịch phage lớn với mật độ cao mới có thể giúp phòng và điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra Bên cạnh đó, sự tồn tại của phage còn phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ, nồng độ muối,…) nên khi cho phage vào bể chưa chắc đem lại hiệu quả về phòng trị bệnh cũng như hiệu quả kinh tế [41, 78] Việc xác định phương thức ứng dụng và liều lượng phage cần sử dụng rất quan trọng để đem lại một liệu pháp phage hiệu quả trong ứng dụng cũng như về mặt kinh tế [51]

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian thực hiện thí nghiệm: từ tháng 2 năm 2021 đến tháng 06 năm 2022

- Thí nghiệm in – vitro (Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo,

bảo quản chế phẩm phage PVN06 và khả năng ức chế vi khuẩn E ictaluri của chế phẩm phage PVN06): Phòng thí nghiệm Sinh học P107B2 – Trường đại học Bách

Khoa, địa chỉ 268 Lý Thường Kiệt, Phường 14, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh

- Thí nghiệm in – vivo (Đánh giá hiệu quả của chế phẩm phage PVN06 trong

phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra giống): kết hợp với GS TS Đặng Thị Hoàng

Oanh, khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ

- Erlen thủy tinh 250 mL

HOÀNG)

- Tủ đông -20℃ (Sanyo)

- Tủ lạnh 4℃ (Panasonic) - Máy li tâm (Eppendorf)

- Máy lắc tròn GFL 3005, máy lắc ổn nhiệt (JISICO)

- Máy PCR (BioRad) - Bộ điện di (BioRad)

- Máy quang phổ UV-Vis (ChromTech)

- Máy đo pH (HANNA) - Micropipette (Sartorius)

- Màng lọc vô trùng 0.22 µm (Membrane Solution)

- Nồi hấp autoclave (Hirayama) - Bếp khuấy từ gia nhiệt (Stuart) - Cân điện tử (Sartorius)

3.2.3 Môi trường

- Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) - Môi trường Brain heart infusion (BHI)

- Môi trường Edwardsiella ictaluri medium (EIM)

- Môi trường Luria Bertani (LB) - Đệm Sodium - Magnesium (SM) - Đệm Phosphate Buffered Saline (PBS)

Thành phần môi trường và hóa chất được trình bày cụ thể ở phụ lục A

3.2.4 Phương pháp đĩa thạch 2 lớp (plaque assay)

Phương pháp đĩa thạch 2 lớp (plaque assay) nhằm xác định trực tiếp số lượng phage xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn chủ qua đêm (18-20 giờ) trong môi trường TSB Tiến hành bổ sung 200 µL dịch tăng sinh vi khuẩn vào ống môi trường TSA đã làm tan (giữ ở nhiệt độ 40-45℃) Tiếp theo bổ sung 100 µL dịch phage đã pha loãng để định lượng theo nồng độ pha loãng Đổ hỗn hợp trên vào đĩa thạch LB và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng, ghi nhận và tính toán lượng phage theo công thức:

Mật độ phage (PFU

mL) = Số vòng sinh tan ×

Hệ số pha loãng× 10

Trong đó: Số vòng sinh tan là số lượng vòng sinh tan đếm được trên đĩa thạch

3.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với 3 nội dung chính như được mô tả ở Hình 3.1: - Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06 - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến bảo quản chế phẩm phage PVN06 - Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm phage PVN06 trên cá tra

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Phage PVN06

Chế tạo chế phẩm phage

Bảo quản chế phẩm

phage PVN06

Hiệu quả của chế phẩm phage PVN09 trong phòng bệnh gan thận mủ

(in vitro & in vivo)

Chế phẩm phage PVN06

MOI, pH, nhiệt độ, cation: Mg2+

& Ca2+

Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng:

Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng:

pH, nhiệt độ, môi trường dinh dưỡng: TSB, BHI, EIM

3.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06

Các yếu tố đánh giá:

- Mật độ phage trong chế phẩm của quá trình chế tạo (PFU/mL)

- Yếu tố khảo sát gồm: giá trị MOI, nhiệt độ, pH và cation (Mg2+ và Ca2+)

Thiết kế thí nghiệm:

3.3.5.1 Chuẩn bị vi khuẩn E ictaluri E1 và phage PVN06

Vi khuẩn E ictaluri E1 được tăng sinh qua đêm (trong vòng 18 giờ) trong ống

falcon 50mL Sau đó, dịch nuôi cấy sẽ được đo giá trị OD600 và bổ sung vào bình nuôi cấy (erlen 250mL chứa 40mL môi trường TSB) sao cho OD600 đạt 0.5 (~109 CFU/mL) nhằm đảm bảo sự đồng nhất trong tất cả các thí nghiệm

Phage PVN06 được tạo stock và sau đó, stock phage được kiểm tra lại mật độ (PFU/mL) trước khi thực hiện các thí nghiệm bằng phương pháp thạch hai lớp (Mục 3.2.4)

3.3.5.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo phage

Các yếu tố cần khảo sát bao gồm: giá trị MOI, pH, nhiệt độ và cation (Mg2+ và Ca2+)

Tiến hành tăng sinh vi khuẩn E ictaluri E1 (đã hoạt hóa qua đêm) trong môi

trường dinh dưỡng TSB ở điều kiện (như trong bảng 3.1) cho tới OD600 ~ 0.1 Tiếp theo, bổ sung phage PVN06 với giá trị MOI cần thiết (theo bảng 3.1) Đồng nuôi cấy vi khuẩn và phage trong 5 giờ và thu dịch nổi, ly tâm 10 000 rpm ở 4℃ và khảo sát mật độ phage tạo thành (PFU/mL) bằng phương pháp thạch hai lớp (Mục 3.2.4)

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và kết quả được phân tích bằng phần mềm Excel và SPSS 20

Bảng 3.1 Các yếu tố và bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến

quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06

Yếu tố cố định

Yếu tố thay đổi

x x x 0; 0.2; 0.4;

0.6; 0.8; 1.0 x

Ca2+: 0 mM

x x x x 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0

3.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến bảo quản chế phẩm phage

Thiết kế thí nghiệm:

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng đến quá trình bảo quản phage

Chuẩn bị chế phẩm phage: Vi khuẩn E ictaluri được tăng sinh trong 3 loại môi

trường dinh dưỡng khác nhau gồm TSB, BHI, EIM (nuôi lắc 150 rpm, 30℃) cho đến khi OD600=0.1 Sau đó, thực hiện bổ sung phage với MOI = 0.1 Sau 5 giờ xâm nhiễm, tiến hành thu chế phẩm bằng cách ly tâm và lọc qua màng lọc 0.45 µm để loại bỏ hết vi khuẩn Chế phẩm phage sẽ được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (khoảng 4℃) và nhiệt độ phòng (khoảng 25-30℃) Chế phẩm sẽ được khảo sát hàng tuần bằng phương pháp đĩa thạch 2 lớp (Mục 3.2.4) trong 3 tháng và lặp lại 3 lần, được xử lý thống kê

Vi khuẩn E ictaluri được nuôi cấy trong môi trường TSB ở 150 rpm, 30℃ đến

OD600=0.1 thì tiến hành bổ sung phage với các MOI khác nhau (0.01, 0.1, 1.0) Thí nghiệm thực hiện trong 10 giờ, mỗi giờ thu 1 mL dịch khuẩn và phage được đo mật độ quang OD600 và xác định mật độ phage tự do bằng phương pháp đĩa thạch hai lớp (Mục 3.2.4)

Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần và xử lý thống kê bằng phần mềm Excel

và SPSS 20