Tổng quan
Bệnh gan thận mủ ở cá tra
2.1.1 Tình hình nuôi cá tra hi ệ n nay
Việt Nam là quốc gia có nhiều điều kiện thuận lợi trong phát triển ngành thủy sản Nước ta có đường bờ biển dài và vùng mặt nước nội địa lên đến 1.4 triệu ha nhờ hệ thống sông ngòi, đầm phá dày đặc giúp Việt Nam trở thành quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng 3 thế giới trong năm 2022 Nuôi cá tra để phục vụ cho sản xuất và xuất khẩu tập trung chủ yếu ở Đồng bằng Sông Cửu Long trong đó các tỉnh Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp là những vùng nuôi lớn nhất, chiếm hơn 75% tổng sản lượng cá cả nước và có gần 100 nhà máy sản xuất [3] Cá tra là một trong những mặt hàng thủy sản quan trọng của Việt Nam – chiếm 25.94% cơ cấu mặt hàng thủy sản xuất khẩu 5 tháng đầu năm 2022 (đứng thứ 2 sau mặt hàng tôm) được thể hiện ở hình 2.1, góp phần vào sự tăng trưởng của xuất khẩu thủy sản nói riêng và nền kinh tế đất nước nói chung Năm 2020, Việt Nam xuất khẩu cá tra sang 138 thị trường; top 4 thị trường nhập khẩu cá tra (2022) gồm: Mỹ, Trung Quốc - Hồng Kông, khối CPTPP (Hiệp định Đối tác toàn diện và tiến bộ xuyên Thái Bình Dươn), Châu Âu (EU); các thị trường tiềm năng khác như Brazil, Thái Lan, các tiểu Vương quốc Ả Rập Thống nhất – UAE, Anh… đều có sự tăng trưởng mạnh [3], [4]
Hình 2.1 Cơ cấu các mặt hàng thủy sản xuất khẩu 5 tháng đầu năm 2022 [5]
Năm 2022, sản xuất và xuất khẩu cá tra đã mang về những con số ấn tượng Theo tổng cục thủy sản, năm 2022, diện tích thả nuôi cá tra đạt 5500 ha, tăng 4% so với năm 2021; sản lượng thu hoạch đạt 1.6 triệu tấn, tăng 3.5%; kim ngạch xuất khẩu đạt 2.4 tỷ USD, tăng 70% so với năm 2021 [1]
Bên cạnh những thuận lợi về thị trường thì ngành nuôi và chế biến cá tra đang đối mặt với nhiều thách thức: cá tra giống chưa được kiểm soát tốt; giá thức ăn và các vật tư đầu vào tăng mạnh; bên cạnh đó do biến đổi khí hậu, xâm nhập mặn tiến sâu vào nội địa gây ảnh hưởng đến hoạt động nuôi cá tra; năm 2021 có 23 lô xuất khẩu cá tra bị cảnh báo về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm [6] Do đó, để đạt được các mục tiêu đề ra trong năm 2022, việc nuôi và sản xuất cá tra cần được kiểm soát, đảm bảo an toàn thực phẩm và chất lượng cá tra
2.1.2 D ị ch b ệ nh gan th ậ n m ủ trong nuôi cá tra
Ba tác nhân chính thường hay gây ra các bệnh truyền nhiễm trong quá trình nuôi cá tra ở ĐBSCL gồm: vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm; ngoài ra còn có một số loại bệnh khác như các hội chứng vàng da, bệnh trắng mang trắng gan… [7] Trong đó các bệnh do vi khuẩn gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi cá tra công nghiệp, đặc biệt Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila và Flavobacterium columnare là các tác nhân vi khuẩn phổ biến [8]
Bệnh gan thận mủ ở cá tra do vi khuẩn E ictaluri gây ra là một bệnh nguy hiểm và gây thiệt hại lớn cho người nông dân Bệnh xảy ra ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá nhưng gây thiệt hại nặng nề nhất là ở giai đoạn cá giống với tỷ lệ chết lên đến 100%, từ 30 – 50% đối với cá thịt [9]
Hình 2.2 Gan, thận, tỵ tạng của cá tra bị bệnh gan thận mủ [10]
Theo tổng cục Thống kê, năm 2021, 40 ha diện tích sản xuất giống và 7 ha nuôi thương phẩm tại An Giang và Đồng Tháp thiệt hại do dịch bệnh gan thận mủ; 5 tháng đầu năm 2022, có khoảng 153 ha diện tích sản xuất cá tra giống và nuôi thương phẩm tại các tỉnh Vĩnh Long, An Giang và Đồng Tháp bị thiệt hại, trong đó cá bị bệnh gan thận mủ gần 60 ha, chiếm gần 40% diện tích cá có dịch bệnh [2].
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc chi Edwardsella, được phân loại vào họ
Enterobacteriaceae, được biết đến là tác nhân gây bệnh cho nhiều loại vật chủ khác nhau và đặc biệt là gây thiệt hại cho cá [11] Có ba loài thuộc chi này gồm có: E hoshinae, E ictaluri và E tarda, trong đó E ictaluri và E tarda có nhiều điểm tương đồng về đặc điểm di truyền [12]
Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn E ictaluri (A) Nhuộm Gram tế bào dưới kính hiển vi quan học, độ phóng đại x1000, (B) Khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSB agar, 28℃, (C) Khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường EIM agar,
Vi khuẩn E ictalluri là vi khuẩn Gram âm, có dạng que, mảnh và có kích thước biến đổi (2.0 – 3 μm) (Hình 2.3A), phát triển tốt ở 26 - 30℃, di động yếu hoặc không di động khi nhiệt độ trên 30℃ Vi khuẩn có thể đi vào cá thông qua mũi, đường tiêu hóa và từ hậu môn của cá Sau khi xâm nhập vào vật chủ, vi khuẩn di chuyển đến não, gan, thận gây ra nhiễm trùng máu, viêm gan, viêm thận,… chỉ sau 1-2 tuần xâm nhiễm Về hình thái khuẩn lạc, vi khuẩn E ictaluri khi được nuôi cấy trên môi trường TSB agar phát triển sau 48 giờ ở 28℃, có màu trắng sữa, lồi được thể hiện ở hình 2.3B và trên môi trường EIA sau 24-48 giờ ở 28℃ tạo thành các khuẩn lạc nhỏ, có màu xanh lá [14, 15]
Ngoài gây bệnh gan thận mủ cho cá tra ở Việt Nam, E ictaluri còn được biết đến như một tác nhân gây bệnh dẫn đến thiệt hại cho nền kinh tế ở một số loài thủy sản một số nước khác Loài này gây bệnh trên cá trê Clarius batrachus ở Thái Lan, cá trê vàng Pelteobagrus fulvidraco ở Trung Quốc, cá Ayu ở Nhật Bản và một số loại cá da trơn khác ở Mỹ như Ictalurus furcatus và Noturus gyrinus, cá rô phi Oreochromis niloticus ở sông Nile,… với tỉ lệ chết từ 10 - 90% [14] Mức độ gây thiệt hại của vi khuẩn E ictaluri là cao, do đó cần có các biện pháp phòng ngừa và điều trị nhằm giảm ảnh hưởng của vi khuẩn này trong công tác nuôi trồng thủy hải sản.
Các phương pháp phòng trị bệnh gan thận mủ
Để có thể giảm thiểu thiệt hại của bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri gây ra cần phải có những phương án phòng bệnh ngay từ đầu, chất lượng giống nuôi, chất lượng nguồn nước và ao nuôi, thức ăn cho cá, theo dõi cá định kỳ,… cần được kiểm soát kỹ lưỡng [7] Ngoài ra, vaccine cũng được sử dụng trong công tác phòng bệnh gan thận mủ trên cá như vaccine “ALPHA JECT® Panga 1” (licenses 4/2013) Tuy nhiên, các loại vaccine cho thời gian miễn dịch không dài Ngoài ra, những phương pháp khác sử dụng các loại vaccine bất hoạt để phòng ngừa bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn E ictaluri cho cá tra ở Việt Nam cũng đã được thử nghiệm nhiều nhưng chưa có kết quả về lâu dài [16]
Khi cá có dấu hiệu bệnh hay dịch bệnh bùng phát thì kháng sinh là lựa chọn đầu tiên được người nuôi cá tra sử dụng Sử dụng kháng sinh có nhiều lợi ích như dễ tìm trên thị trường, dễ sử dụng và hiệu quả nhanh chóng Song, việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát, sự thiếu hiểu biết của người nuôi thủy sản về kháng sinh và đặc điểm khó phân hủy của nó đã gây ra nhiều tác hại
Thứ nhất, sử dụng kháng sinh vượt qua mức cho phép có thể làm tồn đọng trong sản phẩm cá đưa ra thị trường gây ra nhiều vấn đề Vấn đề đầu tiên có thể kể đến đó là ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, đặc biệt là sản phẩm xuất khẩu Quý I/2021, Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (NAFIQAD) báo cáo rằng có tổng cộng 8 lô hàng thủy sản xuất khẩu bị trả về do dư lượng kháng sinh [17] Tiếp theo, dư lượng kháng sinh có thể từ sản phẩm đi vào cơ thể của người sử dụng, từ đó thúc đẩy kháng kháng sinh của hệ vi khuẩn, gây dị ứng và một số bệnh lý khác đối với người tiêu dùng [18, 19, 20]
Thứ hai, sử dụng kháng sinh quá mức thì lượng dư thừa từ thức ăn và phân cá lắng xuống đáy hồ và có thể lẫn vào bùn đáy hoặc đi theo nguồn nước lan truyền sang các khu vực khác Dư lượng kháng sinh này sẽ gây áp lực chọn lọc tự nhiên và từ đó làm thay đổi hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và hình thành các vi khuẩn kháng kháng sinh [18]
Thứ ba, sử dụng sai cách và dư thừa kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đặc biệt trong nuôi cá đã gây ra khả năng kháng kháng sinh ở vi khuẩn Đáng nói, khi vi khuẩn gây bệnh kháng lại kháng sinh sẽ gây ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình phòng trị bệnh [18] Với vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá tra có hiện tượng kháng lại nhiều loại kháng sinh được thể hiện trong bảng 2.1, ta thấy được đa số vi khuẩn E ictaluri kháng với streptomycin (83% chủng vi khuẩn), với oxytetracycline (81%) và trimethoprim (71%) Ngoài ra, hiện tượng kháng thuốc kháng sinh trên nhóm flourquinolone lần đầu tiên tìm thấy trên vi khuẩn E ictaluri như flumequin (8% chủng vi khuẩn), acid oxolinic (6%) và enrofloxacin (5%) Đặc biệt, hầu hết các chủng vi khuẩn E ictaluri có khả năng kháng thuốc tự nhiên đối với colistin (100% chủng vi khuẩn) với MIC ≥ 128 μg/ml Điều đáng lưu ý là hiện tượng đa kháng thuốc
(kháng ít nhất là 3 loại thuốc) của vi khuẩn E ictaluri là 73 % chủng vi khuẩn [21]
Tóm lại, việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát làm dư lượng kháng sinh tạo ra nhiều hệ lụy như tạo ra các chủng vi khuẩn đa kháng khó kiểm soát, người sử dụng hấp thụ một lượng kháng sinh không nhỏ từ thực phẩm ăn uống hàng ngày gây dị ứng, ngộ độc, đồng thời ngăn cản việc xuất khẩu thủy sản ra các nước tiềm năng như các nước Liên minh Châu Âu, Mỹ, Úc,… Một biện pháp mới vừa giúp điều trị bệnh gan thận mủ ở cá tra vừa đảm bảo an toàn thực phẩm giúp ngành nuôi cá tra phát triển bền vững và xuất khẩu sang các nước lớn cần được nghiên cứu Liệu pháp phage là tiềm năng lớn để ngăn cản sự phát triển của bệnh và hướng tới phát triển bền vững
Bảng 2.1 Sự phân bố nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại kháng sinh khác nhau cú nồng độ thuốc từ 0.12 đến 128 àg/ml trờn 64 chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra Pangasianodon hypophthalmus bệnh gan, thận mủ [21].
Liệu pháp phage
Phage là một loại virus đặc biệt chỉ xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn nhưng không gây bệnh cho người và động vật Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được phát hiện bởi Frederick W.Twort (1915) và Félix d’Hérelle (1917) Có hàng ngàn loại phage tồn tại, mỗi loại phage chỉ lây nhiễm cho một hoặc một vài loại vi khuẩn Phage khi xâm nhiễm vi khuẩn, chúng sẽ sử dụng vật chất bên trong vi khuẩn để sinh sản do chúng không có bộ máy tổng hợp protein cũng như tổng hợp bộ gen
Phage có cấu trúc khá đơn giản, protein chiếm 60% bao bọc xung quang vật liệu di truyền RNA hay DNA, chiếm 40% [22] Mặc dù có hàng ngàn phage tồn tại trong môi trường tuy nhiên các phage thường thuộc Caudovirales (chiếm đến 96%) là phage có đuôi và vật liệu di truyền là DNA mạch kép gồm có ba họ Myoviridae, Siphoviridae và Podoviridae [23] Phage thuộc Caudovirales là nhóm phage được nghiên cứu nhiều nhất Các phage có đuôi bao gồm ba thành phần chính: phần đầu là vỏ capsid bao quanh vật liệu di truyền của phage, tiếp đến là phần đuôi và cuối cùng là các chân bám nằm ở cuối đuôi (Hình 2.3) [24]
Phage có thể là phage ôn hòa hay phage độc tùy vào cơ chế xâm nhiễm của chúng là sinh tan hay tiềm tan (Hình 2.6) Quá trình xâm nhiễm của một phage bắt đầu bằng việc phage hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn sau đó chúng đưa vật liệu di truyền vào tế bào chủ Đối với chu trình sinh tan, bộ gen của phage điều khiển bộ máy vi khuẩn để tạo ra các enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp vật liệu di truyền và protein của chính phage đó; cuối cùng, enzyme lysozyme của phage được tạo ra và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn giải phóng các hạt phage mới ra ngoài môi trường tìm kiếm vi khuẩn khác để xâm nhiễm (Hình 2.6) Ngược lại với chu trình sinh tan, đối với chu trình tiềm tan, sau khi xâm nhiễm phage sẽ không phá hủy tế bào vi khuẩn ngay lập tức mà sẽ cài vật liệu di truyền của chúng vào bộ gen của vi khuẩn và bộ gen của phage sẽ được nhân lên cùng bộ gen của vi khuẩn; những phage tiềm tan có thể chuyển sang chu trình sinh tan và phá hủy tế bào khi gặp stress do các yếu tố môi trường hay điều kiện chuyển hóa của tế bào vi khuẩn [25]
Hình 2.5 Chu trình sinh tan và tiềm tan của phage: (1) Phage gắn vào tế bào vi khuẩn và bơm bộ gen vào bên trong, (2) Bộ gen phage đi vào chu trình sinh tan hoặc chu trình tiềm tan, (3a) Bộ gen mới của phage và protein được tổng hợp và lắp ráp, (4a) Tế bào vỡ ra và phóng thích các hạt phage mới, (3b, 4b) Các bước của chu trình tiềm tan: Sự kết hợp giữa bộ gen phage với bộ gen vi khuẩn, vi khuẩn vẫn tiếp tục nhân mật số
Nhìn chung, chỉ có phage sinh tan được sử dụng để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn vì khả năng ly giải ngay lập tức tế bào chủ cũng như tránh các tác động tiêu cực có thể xảy ra của các phage tiềm tan như tăng cường độc lực của vi khuẩn, bảo vệ tế bào vi khuẩn chủ khỏi sự xâm nhiễm của các phage sinh tan khác [26] Trong khi phage tiềm tan có thể được sử dụng để chẩn đoán bệnh do sự tích hợp bộ gene của chúng vào bộ gene tế bào vi khuẩn chủ [27]
Hiện nay, tình trạng dịch bệnh trên thủy sản do vi khuẩn gây ra đang là vấn đề gây thiệt hại cho người canh tác Sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh mang lại hiệu quả nhanh chóng nhưng không bền vững do kháng sinh tấn công toàn bộ quần thể vi khuẩn mà nó tiếp xúc và việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát làm dư lượng kháng sinh tạo ra nhiều hệ lụy như tạo ra các chủng vi khuẩn đa kháng nguy hiểm, người sử dụng hấp thụ một lượng kháng sinh không nhỏ từ thực phẩm ăn uống hàng ngày gây dị ứng, ngộ độc [28], đồng thời găn cản việc xuất khẩu thủy sản ra các nước tiềm năng như các nước Liên minh Châu Âu, Mỹ, Úc,… [29] Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng vaccine trong phòng bệnh nhưng vaccine cho hiệu quả bảo vệ trong thời gian rất ngắn và không mang lại hiệu quả cao [30] Với các biện pháp dùng kháng sinh hay vaccine thì liệu pháp phage có ưu điểm chỉ tiêu diệt vi khuẩn đích (hoặc các vi khuẩn cùng một họ) và cách sử dụng đơn giản cho thủy sinh nên được xem là một giải pháp tiềm năng để ngăn cản sự phát triển của bệnh và hướng tới phát triển bền vững [31, 32]
Những ưu điểm của liệu pháp phage gồm: Đầu tiên, liệu pháp phage mang tính đặc hiệu cao: chỉ tác động tới một hoặc một vài vi khuẩn cùng loài nên không gây bất lợi cho các vi khuẩn khác do đó hạn chế ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật môi trường cũng như hệ vi sinh trong động vật thủy sinh [32]
Thứ hai, phage có khả năng nhân lên sau khi xâm nhiễm vi khuẩn Phage có thể nhân lên từ một phage ban đầu thành hàng trăm phage mới trong thời gian ngắn [33]
Thứ ba, hạn chế sự xuất hiện của các vi khuẩn kháng kháng sinh Do phage có khả năng tiến hóa cùng với vi khuẩn và có thể sử dụng nhiều loại phage khác nhau để kháng vi khuẩn kháng phage [31]
Thứ tư, số lượng phage trong tự nhiên rất lớn, chúng có mặt khắp mọi nơi, với tổng số khoảng 10 31 Việc phân lập và tìm kiếm một phage mới dễ dàng hơn (có thể chỉ mất một hoặc vài tuần) so với tìm một loại kháng sinh mới hay vaccine [32]
Thứ năm, khả năng chống chịu của phage với các điều kiện môi trường cao và khác nhau ở mỗi loại phage Hầu như các phage đều có thể được phân lập từ môi trường có chứa vi khuẩn chủ, thậm chí ở những nơi có điều kiện nhiệt độ cao, pH thấp, … [33]
Và cuối cùng, chúng ta có thể sử dụng phage để xâm nhiễm các loại vi khuẩn kháng kháng sinh
Liệu pháp phage cũng có những hạn chế nhất định [34] gồm:
Hạn chế đầu tiên của chế phẩm phage là vi khuẩn gây bệnh cần được xác định rõ ràng từ đó mới phân lập được phage xâm nhiễm vi khuẩn đích
Thứ hai là phage khi ở số lượng quá cao có khả năng gây kích ứng hệ thống miễn dịch của con người và vật nuôi, do đó chúng có thể bị đào thải ra ngoài
Thứ ba, hiệu quả sử dụng phage tùy thuộc vào tiến triển của bệnh
Cuối cùng, tính ổn định của mỗi phage là khác nhau và chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, do đó việc ứng dụng phage vào thực tế cần được nghiên cứu kỹ lưỡng.
Các yếu tố ảnh hưởng đến liệu pháp phage
Để liệu pháp phage có thể ứng dụng được trong thực tế, chế phẩm phage cần đáp ứng một số yêu cầu sau: Độc lực: Phage phải có độc lực li giải vi khuẩn, không tồn tại dưới dạng prophage Đây được xem là yêu cầu hàng đầu trong quá trình lựa chọn các dòng phage trong nghiên cứu và ứng dụng [35]
An toàn: Phage không có chứa bất kỳ gene kháng sinh và có phổ ký chủ cụ thể [34] Đặc tính xâm nhiễm: Phage phải có phổ xâm nhiễm rộng, chu kỳ xâm nhiễm lớn [33]
Mật độ phage: Trong chế phẩm phage phải đủ cao để đạt được hiệu quả kiểm soát vi khuẩn [33] Ổn định hoạt tính: Chế phẩm phage phải ổn định hoạt tính trong thời gian nhất định [33] Để biết được chế phẩm phage có thể ứng dụng được trong thực tế cần xác định một số yếu tố tác động đến phage như pH, nhiệt độ, môi trường nuôi,… Hơn nữa là cần làm rõ cách thức đưa phage vào cơ thể động vật thủy sinh như tiêm, cho vào nước nuôi hay thức ăn Vì vậy, một chế phẩm phage nhất thiết phải được đánh giá hiệu quả ở quy mô in vitro và in vivo
2.5.1 Các y ế u t ố ảnh hưởng đế n quá trình s ả n xu ấ t phage
Trong những năm gần đây, một số báo cáo đã đề cập về tính hiệu quả của phage trong nông nghiệp và thủy sản Mặc dù một số sản phẩm phage đã được thương mại hóa, nhưng vẫn chưa đạt được một quy trình sản xuất phage hiệu quả, liên tục và có thể kiểm soát được [36] Một trong các sản phẩm phage được thương mại trên thị trường đó là BAFADOR ® của công ty Proteonpharma (Hình 2.7) được đưa ra thị trường nhằm mục đích chống lại các bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp và Pseudomonas spp gây ra ở cá Chế phẩm phage BAFADOR ® chứa hỗn hợp phage cocktail (5 loại) với mật độ khoảng 10 8 PFU/mL, được bảo quản ở nhiệt độ 2-10℃, được sử dụng bằng cách trộn với thức ăn của cá hoặc đổ trực tiếp vào nước ao (áp dụng cho cá giống) [37] Tuy nhiên, chế phẩm phage ở Việt Nam chỉ mới được nghiên cứu và chưa có bất kỳ chế phẩm nào trên thị trường Phage được tạo ra trong phòng thí nghiệm có thể coi là một quy trình dễ dàng và phương pháp được xác định rõ ràng; tuy vậy, các quy trình tạo phage gặp nhiều khó khăn khi mở rộng quy mô
Bản chất của phage là cần có vi khuẩn chủ để tạo ra phage mới Do đó, quá trình sản xuất phage không chỉ bị chi phối của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo phage mà còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn chủ [36] Các yếu tố ảnh hưởng đến vi khuẩn chủ gồm tốc độ tăng trưởng, mật độ vi khuẩn và hoạt động về trao đổi chất Đối với phage, cần hiểu rõ các đặc điểm cơ bản của chúng gồm thời gian tiềm ẩn, chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân Ngoài ra, tỉ lệ đầu vào của số lượng phage so với số lượng vi khuẩn, hay còn gọi là tỷ số MOI, có ý nghĩa quan trọng trong quá trình tạo phage mới - MOI quá cao hay quá thấp đều có tác động tiêu cực đến hệ số nhân của phage cũng như năng suất sản xuất [38] Ngoài ra, quá trình sản xuất còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố tác động từ môi trường bên ngoài Các yếu tố này bao gồm nhiệt độ, pH và thời điểm bổ sung phage
Hình 2.6 Chế phẩm phage BAFADOR ® [37] pH là một yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm, sao chép nội bào và nhân lên của phage Các nghiên cứu cho thấy, ở pH 6-8 là tối ưu cho hầu hết các phage, trong khi đó pH có tính acid (pH10) sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả tạo phage [34] Do đó, cần lựa chọn môi trường có pH phù hợp với phage để có thể đạt được năng xuất cao nhất
Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ của phage lên thành tế bào của vi khuẩn chủ Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều có thể ức chế hoặc làm chậm quá trình hấp phụ và sao chép của phage [39, 40], điều này gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của quá trình sản suất phage Do đó, duy trì điều kiện nhiệt độ thích hợp trong quá trình sản xuất để đảm bảo quá trình hấp phụ và tạo ra phage mới luôn đạt hiệu suất cao
Và đặc biệt, điều quan trọng trong quá trình sản xuất là phải chọn được môi trường phù hợp đồng thời cho sự phát triển của vi khuẩn, sự xâm nhiễm của phage và nhân bản phage mới
2.5.2 Các y ế u t ố ảnh hưởng đế n tính ổn đị nh c ủ a ch ế ph ẩ m phage
Sự thay đổi của pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mà còn cả sự ổn định của thực khuẩn thể, các phage khác nhau sẽ có khoảng pH hoạt động khác nhau [41] Nói chung, các thực khuẩn thể thường ổn định ở pH từ
5 đến 9, ở pH thấp hơn 4 và pH trên 9 phage sẽ bị mất hoạt tính của nó [41] Ma và cộng sự năm 2016 đã báo cáo rằng phage phiAxp-3 xâm nhiễm vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans đã thể hiện hoạt động xâm nhiễm cao nhất ở pH trung tính, giảm 90,25% và 75,76% khi pH lần lượt là 4.0 và 10 [42] Tương tự, phage được phân lập từ nước thải kháng Enterobacter cloacae cho thấy pH tối ưu là 7.0 và phage hoạt động kém ở pH 6.0 và 8.0; trong khi đó pH dưới 5.0 và trên 9.0 không nhận thấy phage còn hoạt động [43] Theo nghiên cứu của Akhwale và cộng sự năm 2019, các chủng phage được phân lập từ trầm tích ở hồ Elmenteita được ủ trong các điều kiện pH khác nhau trong 6 giờ cho thấy rằng, các phage không hoạt động ở pH 2.0 và 4.0; khoảng pH từ 7.0 trở lên cho thấy sự hoạt động ổn dịnh của phage và cao nhất là ở pH 10, tuy nhiên pH cao hơn 12 thì hoạt động của phage giảm [44]
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng lớn đến sự ổn định của phage, đặc biệt là về khả năng lây nhiễm và khả năng sống sót của nó Nói chung, các phage luôn có một phạm vi nhiệt độ thích hợp để hoạt động tối ưu và sản sinh ra phage mới Nếu nhiệt độ nằm ngoài phạm vi này, phage có thể không lây nhiễm được vật chủ của nó hoặc có thể trở nên kém ổn định hơn [41, 45] Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, chỉ một lượng nhỏ các hạt thể thực khuẩn đưa vật liệu di truyền của chúng vào tế bào chủ, do đó lượng phage được sản sinh ra rất ít [46] Mặc khác, ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, thời gian tiềm ẩn của phage có thể được kéo dài hơn và đặc biệt lớp vỏ capsid sẽ bị phân hủy [46]
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng khoảng nhiệt độ ổn định là đặc trưng cho từng phage và khác nhau phụ thuộc vào các phage phân lập từ nguồn nào Theo như nghiên cứu của Nikapitiya và cộng sự năm 2019 phage ASP-1 ổn định ở nhiệt độ từ 4 đến 50℃ trong 1 giờ [47], nhưng hoạt tính của phage φZH1 và φZH2 giảm ở nhiệt độ trên 40°C [48] Phage DRL-P1 - thuộc họ Myoviridae, được phân lập từ nước thải – xâm nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cho thấy độ ổn định của nó trong khoảng nhiệt độ rộng (4 - 40℃) [49] Do đó, tương tự như vi khuẩn chủ, nhiệt độ cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc tác động đến hoạt động và khả năng xâm nhiễm của phage trong môi trường [50]
2.5.3 Th ử nghi ệ m ch ế ph ẩ m phage trên cá
Hiện nay đã có một số nghiên cứu sử dụng chế phẩm phage trên cá Một số cách để đưa phage vào cá như tiêm phage vào cá, bổ sung phage vào bể nuôi hay cho cá ăn thức ăn có phage, trộn phage vào thức ăn của cá… [51]
Với phương án trộn phage vào thức ăn cần xác định phần trăm phage hấp phụ vào hạt thức ăn, cũng như phần trăm phage thất thoát từ thức ăn ra ngoài môi trường nước cần được khảo sát Đồng thời mật độ khuẩn làm cho cá chết cũng như mức độ bảo vệ của phage đối với cá cũng cần được khảo sát.
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.6.1 Tình hình nghiên c ứ u trên th ế gi ớ i
Một số nghiên cứu đã phân lập và xác định đặc tính của phage Từ đó, các phage được nghiên cứu thêm về tiềm năng ứng dụng trong phòng và điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra như bệnh trắng đuôi, nhiễm trùng ruột, nhiễm trùng máu, … Các nghiên cứu đầu tiên nghiên cứu về phage điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên thủy sản phải kể đến Wu và cộng sự vào năm 1981 đã sử dụng phage AH1 trong điều trị bệnh do vi khuẩn Aromonas hydrophila gây ra, tiếp đến năm 1982, Wu và Chao đã ứng dụng phage ET-1 điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella tarda gây ra
Năm 2000, Park và các cộng sự đã phân lập và xác định đặc tính của phage đặc trưng cho vi khuẩn Pseudomonas plecoglossicida gây bệnh trên cá ayu (Plecoglossus altivelis) từ các con cá bị bệnh và nước ao nuôi [52] Đồng thời trong nghiên cứu của
Park và Naiki vào năm 2003, hai phage PPpW-3 và PPpW-4 đã được khảo sát tác dụng bảo vệ trên cá thông qua đường ăn cho thấy phage giúp cho tỷ lệ chết ở cá giảm đáng kể [5] Bộ gen của phage xâm nhiễm vi khuẩn P plecoglossicida được phân tích trình tự do Kawato và cộng sự thực hiện năm 2014 cho thấy tiềm năng ứng dụng liệu pháp phage thông qua đường ăn làm giảm tỷ lệ chết ở cá ayu khi bị nhiễm khuẩn
Nghiên cứu được thực hiện ở Ấn Độ bởi Khairnar và cộng sự (2013) sử dụng phage cho điều trị bệnh loét da do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây ra trên bề mặt da của cá trê (Clarias gariepinus) và cho thấy khả năng ngăn chặn tình trạng tổn thương da ở cá trê sau 8 - 10 ngày điều trị [54]
Các nghiên cứu về phân lập và xác định phage xâm nhiễm vi khuẩn Vibrio harveyi đã có nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện [55, 56, 57] Đồng thời, các nhóm nghiên cứu khác đã thực hiện các khảo sát đặc điểm cũng như ứng dụng phage trong kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn Vibrio parahaemolyticus [58, 59]
Một số nghiên cứu về liệu pháp phage trong kiểm soat bênh u nhọt (furnunculosis) - một loại bệnh gây nhiễm trùng máu và có thể chết bởi vi khuẩn
Aromonas salmonicida gây ra ở cá hồi do Imbeault và cộng sự thực hiện vào năm
2006 cho thấy việc bổ sung phage HER 110 làm chậm quá trình khởi phát bệnh trong
7 ngày [60] Một nghiên cứu khác của Silva và cộng sự năm 2016 về phage xâm nhiễm vi khuẩn A salmonicida trên cá hồi cho thấy sau 6 giờ bể cá được xử lý với phage AS - A đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn A salmonicida và sau 72 giờ cá hồi giống có tỷ lệ chết thấp (36%) [61].Năm 2012, Kim và cộng sự đã phân lập, phân tích đặc điểm và trình tự gen của phage PAS - 1 xâm nhiễm vi khuẩn A salmonicida từ các mẫu bùn lắng của ao nuôi cá hồi ở Hàn Quốc, cho thấy hiệu quả làm giảm sự phát triển của vi khuẩn trong thí nghiệm in vitro [62]
Liệu pháp phage trong ứng dụng kiểm soát bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra ở cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) được thử nghiệm đầu tiên bởi Matsuoka và cộng sự năm 2007 Thử nghiệm tiến hành bằng cách phân lập phage từ các con cá chết, sau đó thử nghiệm hiệu quả bảo vệ của phage thông qua việc tiêm phage và vi khuẩn S iniae qua màng bụng của cá và 1 giờ sau đó tiêm phage cocktail, sau 2 tuần thí nghiệm thu được tỷ lệ cá chết ở nghiệm thức có phage thấp hơn nghiệm thức đối chứng (tỷ lệ sống lên đến gần 85%) [63]
Flavobacterium psychrophilum là vi khuẩn gây ra bệnh xuất huyết trên cá hồi, tỷ lệ chết cá từ 50% đến 60%, gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi cá hồi trên thế giới Đồng thời với tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn này mà các nghiên cứu về phage nhằm kiểm soát bệnh do vi khuẩn F psychrophilum gây ra được thực hiện Năm 2008, Stenholm và cộng sự đã tiến hành phân lập và xác định đặc điểm về hình thái, bộ gen,… của phage xâm nhiễm vi khuẩn F psychrophilum [64] Sau đó,
Castillo và cộng sự (2012), đã tiến hành phân lập phage xâm nhiễm vi khuẩn F psychrophilum và thử nghiệm khả năng bảo vệ của phage đối với cá hồi bằng cách tiêm đồng thời vi khuẩn và phage (MOI = 10) qua màng bụng của cá, kết quả cho thấy phage có khả năng làm giảm tỷ lệ tử vong của cá là 13%, với tỷ lệ chết cao nhất là 67% so với nghiệm thức đối chứng tỷ lệ chết cao nhất là 80% [65] Năm 2013, Madsen và cộng sự đã thực hiện khảo sát sự phát tán và tồn tại của phage F psychrophilum trong cá và trong môi trường Thí nghiệm này chỉ ra rằng những con cá tiêm đồng thời phage và vi khuẩn thì phage tồn tại lâu hơn so với cá chỉ được tiêm phage; bên cạnh đó, trong môi trường nước, các nhà nghiên cứu nhận thấy pH có ảnh hưởng đến sự tồn tại của phage, phage tồn tại ở pH 4.5 - 7.5 và sau 55 ngày thì mật độ phage giảm 10 4 lần so với ban đầu [66]
Phage xâm nhiễm vi khuẩn Flavobacterium columnare lần đầu được phân lập và xác định đặc điểm từ các ao nuôi cá nước ngọt ở Phần Lan bởi Laanto và cộng sự (2011) [67] Cũng trong năm 2011, Prasad và cộng sự đã phân lập phage xâm nhiễm
F columnare từ nước ao và bùn lắng của các vùng khác nhau ở miền Bắc Ấn Độ, tiếp đó là khảo sát khả năng bảo vệ của phage bằng cách tiêm phage vào cá, cho cá ăn thức ăn tẩm phage và bổ sung phage vào nước ao nuôi (MOI = 100), tất cả các cách này đều làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn trong huyết thanh, mang, gan và thận của cá (thấp hơn 10 3 CFU/mL) sau 6 giờ thử nghiệm [68]
Vi khuẩn Vibrio anguillarum gây ra bệnh nhiễm trùng máu ở cá hồi Đại Tây Dương Higuera và cộng sự (2013) đã phân lập phage xâm nhiễm vi khuẩn trên; đồng thời, nhóm nghiên cứu này đã khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn, kết quả cho thấy phage có khả năng tăng tỷ lệ sống của cá lên 100% (MOI: 1 và 20) so với cá không bổ sung phage tỷ lệ sống chưa đến 10% [69], và đây là báo cáo đầu tiên về phage trong việc bảo vệ cá chống lại sự lây nhiễm của vi khuẩn V anguillarum
Walakira và cộng sự (2008) là nhóm nghiên cứu đầu tiên trên thế giới công bố phân lập và xác định đặc điểm cả phage xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, đây là vi khuẩn gây ra bệnh gan thận mủ trên cá nheo (Ictalurus punctatus
Rafinesque) tại Mỹ Các báo cáo sau đó do Carrias và cộng sự (2011), Yasuike và cộng sự (2014) tiến hành phân tích bộ gen của phage xâm nhiễm E ictaluri đã chứng minh tiềm năng của chúng như một liệu pháp sinh học chống lại bệnh do vi khuẩn gây ra [70, 71]
2.6.2 Tình hình nghiên c ứ u ở Vi ệ t Nam
Hiện nay các nghiên cứu về phage ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá còn rất hạn chế Nhóm nghiên cứu của Hoàng Anh Hoàng cùng cộng sự năm 2018 đã phân lập, khảo sát hoạt tính và giải mã bộ gen của phage MK7 [72] Phage MK7 được phân lập từ gan, thận của cá tra thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, có chu kì xâm nhiễm là 45 phút với hệ số nhân là 50, đồng thời MK7 cho kết quả thử nghiệm ức chế vi khuẩn E icrtaluri trong môi trường tổng hợp là 15 giờ và trong nước ao là 51 giờ
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện thí nghiệm: từ tháng 2 năm 2021 đến tháng 06 năm 2022
- Thí nghiệm in – vitro (Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo, bảo quản chế phẩm phage PVN06 và khả năng ức chế vi khuẩn E ictaluri của chế phẩm phage PVN06): Phòng thí nghiệm Sinh học P107B2 – Trường đại học Bách Khoa, địa chỉ 268 Lý Thường Kiệt, Phường 14, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh
- Thí nghiệm in – vivo (Đánh giá hiệu quả của chế phẩm phage PVN06 trong phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra giống): kết hợp với GS TS Đặng Thị Hoàng Oanh, khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ.
Vật liệu
- Chủng vi khuẩn được sử dụng trong các thí nghiệm: E ictaluri E1 nhận từ Đại học Cần Thơ, Tp Cần Thơ
- Phage PVN06 từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học (do tôi phân lập, năm 2020), khoa kỹ thuật hóa học, trường ĐH Bách Khoa, Tp HCM
- Tủ ủ ổn nhiệt (MMM Group)
- Tủ cấy vô trùng (HUY
- Máy lắc tròn GFL 3005, máy lắc ổn nhiệt (JISICO)
- Máy quang phổ UV-Vis
- Màng lọc vụ trựng 0.22 àm (Membrane Solution)
- Bếp khuấy từ gia nhiệt (Stuart)
- Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB)
- Môi trường Brain heart infusion (BHI)
- Môi trường Edwardsiella ictaluri medium (EIM)
- Môi trường Luria Bertani (LB)
- Đệm Phosphate Buffered Saline (PBS)
Thành phần môi trường và hóa chất được trình bày cụ thể ở phụ lục A
3.2.4 Phương pháp đĩa thạ ch 2 l ớ p (plaque assay)
Phương pháp đĩa thạch 2 lớp (plaque assay) nhằm xác định trực tiếp số lượng phage xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn chủ qua đêm (18-20 giờ) trong mụi trường TSB Tiến hành bổ sung 200 àL dịch tăng sinh vi khuẩn vào ống mụi trường TSA đó làm tan (giữ ở nhiệt độ 40-45℃) Tiếp theo bổ sung 100 àL dịch phage đã pha loãng để định lượng theo nồng độ pha loãng Đổ hỗn hợp trên vào đĩa thạch LB và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng, ghi nhận và tính toán lượng phage theo công thức:
Mật độ phage (PFU mL) = Số vòng sinh tan × 1
Hệ số pha loãng× 10 Trong đó: Số vòng sinh tan là số lượng vòng sinh tan đếm được trên đĩa thạch.
Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với 3 nội dung chính như được mô tả ở Hình 3.1:
- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến bảo quản chế phẩm phage PVN06
- Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm phage PVN06 trên cá tra
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu
Chế tạo chế phẩm phage
Bảo quản chế phẩm phage PVN06
Hiệu quả của chế phẩm phage PVN09 trong phòng bệnh gan thận mủ ( in vitro & in vivo )
MOI, pH, nhi ệ t độ , cation: Mg 2+
& Ca 2+ Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng: Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng: pH, nhi ệt độ , môi trường dinh dưỡ ng:
3.3.5 Các y ế u t ố ảnh hưởng đế n quá trình ch ế t ạ o ch ế ph ẩ m phage PVN06
- Mật độ phage trong chế phẩm của quá trình chế tạo (PFU/mL)
- Yếu tố khảo sát gồm: giá trị MOI, nhiệt độ, pH và cation (Mg 2+ và Ca 2+ )
3.3.5.1 Chuẩn bị vi khuẩn E ictaluri E1 và phage PVN06
Vi khuẩn E ictaluri E1 được tăng sinh qua đêm (trong vòng 18 giờ) trong ống falcon 50mL Sau đó, dịch nuôi cấy sẽ được đo giá trị OD600 và bổ sung vào bình nuôi cấy (erlen 250mL chứa 40mL môi trường TSB) sao cho OD600 đạt 0.5 (~10 9 CFU/mL) nhằm đảm bảo sự đồng nhất trong tất cả các thí nghiệm
Phage PVN06 được tạo stock và sau đó, stock phage được kiểm tra lại mật độ (PFU/mL) trước khi thực hiện các thí nghiệm bằng phương pháp thạch hai lớp (Mục 3.2.4)
3.3.5.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo phage
Các yếu tố cần khảo sát bao gồm: giá trị MOI, pH, nhiệt độ và cation (Mg 2+ và
Tiến hành tăng sinh vi khuẩn E ictaluri E1 (đã hoạt hóa qua đêm) trong môi trường dinh dưỡng TSB ở điều kiện (như trong bảng 3.1) cho tới OD600 ~ 0.1 Tiếp theo, bổ sung phage PVN06 với giá trị MOI cần thiết (theo bảng 3.1) Đồng nuôi cấy vi khuẩn và phage trong 5 giờ và thu dịch nổi, ly tâm 10 000 rpm ở 4℃ và khảo sát mật độ phage tạo thành (PFU/mL) bằng phương pháp thạch hai lớp (Mục 3.2.4) Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và kết quả được phân tích bằng phần mềm Excel và SPSS 20
Bảng 3.1 Các yếu tố và bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06
3.3.6 Các y ế u t ố ảnh hưởng đế n b ả o qu ả n ch ế ph ẩ m phage
- Phần trăm phage sống sót dưới tác động của môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ trong 98 ngày khảo sát
- Mật độ phage (PFU/mL) theo thời gian trong các điều kiện bảo quản khác nhau
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng đến quá trình bảo quản phage
Chuẩn bị chế phẩm phage: Vi khuẩn E ictaluri được tăng sinh trong 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau gồm TSB, BHI, EIM (nuôi lắc 150 rpm, 30℃) cho đến khi OD600=0.1 Sau đó, thực hiện bổ sung phage với MOI = 0.1 Sau 5 giờ xâm nhiễm, tiến hành thu chế phẩm bằng cỏch ly tõm và lọc qua màng lọc 0.45 àm để loại bỏ hết vi khuẩn Chế phẩm phage sẽ được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (khoảng 4℃) và nhiệt độ phòng (khoảng 25-30℃) Chế phẩm sẽ được khảo sát hàng tuần bằng phương pháp đĩa thạch 2 lớp (Mục 3.2.4) trong 3 tháng và lặp lại 3 lần, được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và SPSS 20
3.3.7 Th ử nghi ệ m ch ế ph ẩ m phage trong phòng b ệ nh trên cá tra gi ố ng
- Quãng thời gian phage kiểm soát sự tăng sinh của vi khuẩn
- Số lượng phage được giải phóng theo thời gian
Vi khuẩn E ictaluri được nuôi cấy trong môi trường TSB ở 150 rpm, 30℃ đến
OD600=0.1 thì tiến hành bổ sung phage với các MOI khác nhau (0.01, 0.1, 1.0) Thí nghiệm thực hiện trong 10 giờ, mỗi giờ thu 1 mL dịch khuẩn và phage được đo mật độ quang OD600 và xác định mật độ phage tự do bằng phương pháp đĩa thạch hai lớp (Mục 3.2.4)
Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần và xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và SPSS 20
3.3.7.2 Thử nghiệm sử dụng chế phẩm phage PVN06 trong phòng bệnh ở cá tra (In vivo)
- Khảo sát sự tương quan giữa mật độ thực khuẩn thể và vi khuẩn lên hiệu quả phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra giống thông qua tỷ lệ cá chết tích lũy
- Giải phẫu cá và tái phân lập vi khuẩn để xác nhận nguyên nhân gây bệnh bằng phản ứng PCR
1 Chuẩn bị phage hoạt tính:
Chế phẩm phage được chuẩn bị như sau: Nuôi vi khuẩn E ictaluri E1 trong môi trường TSB ở nhiệt độ phòng với tốc độ lắc là 150 rpm cho đến khi OD600 khoảng 0.1, sau đó bổ sung một thể tích phage thỏa MOI = 0.1 và tiếp tục nuôi lắc trong khoảng 3 giờ Dịch nuôi cấy sau 3 giờ đem ly tâm ở 4℃, 5 phút, 10 000 rpm và dịch sau li tõm được lọc qua màng lọc 0.45 àm để thu lấy chế phẩm phage
2 Chuẩn bị phage bất hoạt:
Sau khi có được chế phẩm phage, một phần chế phẩm sẽ được bất hoạt bằng cách đun cách thủy chế phẩm phage ở nhiệt độ 95-100℃ trong 10 phút
3 Xây dựng mô hình cá nhiễm khuẩn E ictaluri từ môi trường nước (Thực hiện tại Đại học Cần Thơ)
Bảng 3.2 Mô hình thử nghiệm chế phẩm phage trong phòng bệnh ở cá tra
Mục tiêu để đánh giá độc lực của vi khuẩn, xác định giá trị LC50 cho thí nghiệm bảo vệ cá bằng chế phẩm phage Cá tra khỏe mạnh (đạt chỉ tiêu khoảng 10g) được chọn và được chia đều vào các bể nhựa hình trụ 50L chứa 20L nước, mỗi bể gồm 20 con cá Tổng cộng có 21 bể được thực hiện theo ma trận thể hiện ở bảng 3.2
4 Thử nghiệm hiệu quả sử dụng chế phẩm phage để phòng bệnh cho cá tra
Thí nghiệm 1: Xác định lượng phage từ thức ăn đi vào đệm SM:
Tiến hành bổ sung 12mL chế phẩm phage (10 8 PFU/g) vào 600g thức ăn (hàm lượng 20 mL/kg thức ăn) Đưa 1g thức ăn đã trộn chế phẩm phage vào 0.5L SM (40g/20L - đối với bể có tổng khối lượng cá là 20 con - thể tích nước trong bể 20 L) Thu 1 mL mẫu nước theo thời gian (5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 phút - kể từ lúc cho thức ăn vào nước), ly tõm 10 000 rpm, 4℃, 5 phỳt, thu 500 àL dịch nổi để xỏc định mật độ phage xuất hiện trong nước nuôi cá bằng phương pháp đĩa thạch hai lớp (Mục 3.2.4) nhằm xác định phage từ thức ăn đi vào SM và tính toán các giá trị sau
1 Tỷ lệ phage từ thức ăn đi vào đệm SM (%) sau 60 phút thử nghiệm:
- PSM: Mật độ phage từ thức ăn giải phóng vào đệm SM sau 60 phút (PFU/mL)
- PT: Mật độ phage bổ sung vào thức ăn cá (PFU/mL)
2 Tỷ lệ phage bám vào thức ăn cá (%):
Lặp lại thí nghiệm 3 lần và được xử lý thống kê bằng Excel và SPSS20
Thí nghiệm 3: Cho cá ăn thức ăn có phun phage:
Nghiệm thức bổ sung phage hoạt tính: Thức ăn được trộn theo các mức phage là 10 5 , 10 6 và 10 7 PFU/g, mỗi mức phage cho 15 bể cá thí nghiệm (5 mức mật độ khuẩn × 3 lần lặp lại) (Bảng 3.1) Lượng thức ăn cho 15 bể cá được tính là: 40g × 15 bể = 0.6 kg Tổng thể tích chế phẩm phage là 12mL (20mL/kg × 0.6 kg = 12 mL) được phun đều vào thức ăn bằng bình xịt và cho cá ăn ngay sau khi phối trộn phage
Nghiệm thức bổ sung phage bất hoạt: Thức ăn được trộn chung cho 6 nghiệm thức (5 nghiệm thức tương ứng với 5 mật độ khuẩn và 1 nghiệm thức không cảm nhiễm khuẩn), gồm 18 bể cá Lượng thức ăn cho 18 bể cá (5 mức mật độ khuẩn × 3 lần lặp lại): 40g × 18 bể = 720g
Cá được cho ăn thức ăn có trộn phage 1 ngày trước khi gây cảm nhiễm (1 lần/ngày) và tiếp tục cho ăn thức ăn có trộn phage 1 giờ trước khi gây cảm nhiễm
- Tiến hành ghi nhận số lượng cá chết mỗi ngày (từ ngày bắt đầu thí nghiệm – ngày 0 cho đến khi kết thúc thí nghiệm – ngày 14) và tính toán tỷ lệ cá chết tích lũy mỗi ngày (%) theo công thức sau:
- Kiểm tra mật độ phage trong nước của bể cá: 24 giờ sau cảm nhiễm và trước khi cho ăn 1 giờ, mẫu nước trong các bể (mỗi bể lấy 1 mẫu) được thu để kiểm tra mật độ phage bằng phương pháp đĩa thạch 2 lớp (Mục 3.2.4)
- Giải phẫu cá, tái phân lập vi khuẩn và tái định danh bằng phương pháp PCR: Để xác định vi khuẩn E icrtaluri hiện diện ở cá nhiễm trong thử nghiệm phòng bệnh, tiến hành giải phẫu quan sát và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý bên ngoài, bên trong và tái phân lập thận trước những cá vừa chết và hấp hối trên môi trường EIM 1.5% agar Ủ đĩa đã cấy ở 28℃ sau 36 – 48 giờ Quan sát và chọn những khuẩn lạc nhỏ, tròn, trắng đục và không nhân kích thước từ 1 - 1.5 mm để PCR với cặp mồi đặc hiệu
(GAACGCTATTAACGCTCACACC) cho sản phẩm PCR có chiều dài 407bp [79, 80]
Ngoài ra, hiệu quả phòng bệnh (%) được tính toán theo công thức sau:
- %BiP9: Tỉ lệ cá chết ở nghiệm thức bổ sung phage BiP9 (%)
- %BiP0: Tỉ lệ cá chết ở nghiệm thức không bổ sung phage BiP0 (%)
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế tạo chế phẩm phage PVN06 34 1 Ảnh hưởng của giá trị MOI đến quá trình chế tạo chế phẩm phage
4.1.1 Ảnh hưở ng c ủ a giá tr ị MOI đế n quá trình ch ế t ạ o ch ế ph ẩ m phage
Hình 4.1 Ảnh hưởng của MOI đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06
MOI là tỷ lệ của số lượng phage và số lượng vi khuẩn tại thời điểm bổ sung phage Giá trị MOI có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc có thể chế tạo phage ở quy mô lớn và cần một lượng phage ban đầu như thế nào trong quá trình chế tạo Theo Ward và cộng sự (2020), với MOI nhỏ hơn 10 có thể đảm bảo rằng lượng phage ban đầu sử dụng không quá lớn, cũng như lượng phage mới sinh ra đạt chất lượng và số lượng tốt [82] Hình 4.1 thể hiện ảnh hưởng của MOI đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06 Từ hình 4.1 ta dễ dàng thấy ở tất cả các giá trị MOI thì mật độ phage đều tăng đều Ở 3 giờ đầu tiên lượng phage ở MOI=1.0 cao nhất, tuy nhiên sau
3 giờ không có sự khác biệt quá nhiều giữa MOI=1.0 và MOI=0.1 Sau 5 giờ khảo sát, ở hai giá trị MOI 1.0 và 0.1 có mật độ phage trong chế phẩm lần lượt là 10.32 logPFU/mL và 10.39 logPFU/mL, hai giá trị này không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng B.1) Từ kết quả này, ta thấy giá trị MOI=0.1 là phù hợp, đáp ứng được hai yếu tố: lượng phage ban đầu nhỏ và hiệu quả tạo ra phage tự do tốt
4.1.2 Ảnh hưở ng c ủa pH đế n quá trình ch ế t ạ o ch ế t ạ o ch ế ph ẩ m phage
Hình 4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage
Hình 4.2 thể hiện tác động của các giá trị pH khác nhau đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06 Sau 5 giờ khảo sát, với giá trị pH 6.0 lượng phage sinh ra đạt khoảng 10.47 ± 0.20 logPFU/mL và giảm dần khi pH tăng dần, ở pH 9.0 lượng phage tạo ra là 9.68 ± 0.06 logPFU/mL Tuy vậy, sau khi phân tích thống kê thấy được rằng không có sự khác biệt ý nghĩa về mật độ phage tạo ra ở 5 giờ của 4 giá trị pH (6.0, 7.0, 8.0, 9.0) (Bảng B.2) pH ảnh hưởng đến sự ổn định và hoạt động của màng tế bào vi khuẩn E ictaluri và vi khuẩn này phát triển tốt ở khoảng pH 6.5-7 nên ở pH 6.0 có thể xem là pH tốt cho quá trình tăng sinh của phage Cùng với sự ổn định của màng tế bào vi khuẩn sẽ ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm và quá trình nhân lên của phage trong tế bào chủ Ngoài ra, pH còn tác động đến khả năng hoạt động và tính ổn định của phage, điều này cũng ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm thành công vào tế bào chủ của chúng Phần kết quả về độ ổn định pH dưới đây khá tương đồng với kết luận này, đó là phage PVN06 khá ổn định trong một khoảng pH rộng (4.0-11) Tuy nhiên để chế tạo phage còn phụ thuộc vi khuẩn chủ, do đó, ở mức pH 6.0 đã đáp ứng được song song hai yếu tố, đầu tiên mang lại môi trường thích hợp cho vi khuẩn chủ tăng trưởng ổn định và thứ 2 duy trì môi trường thích hợp cho phage hoạt động từ đó tạo ra năng suất cao trong quá trình tạo chế phẩm Vì vậy, pH 6.0 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo
4.1.3 Ảnh hưở ng c ủ a nhi ệt độ đế n quá trình ch ế t ạ o ch ế ph ẩ m phage
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chế tạo phage PVN06
Nhiệt độ chi phối đến quá trình sinh lý cũng như sinh trưởng của vi khuẩn E ictaluri Ở ngưỡng nhiệt độ thích hợp, E ictaluri tăng sinh tốt và các đặc điểm sinh lý của nó cũng ổn định, điều này giúp cho phage có thể dễ dàng xâm nhiễm và sản sinh phage mới Hiệu quả của quá trình chế tạo phage dưới tác động của nhiệt độ được thể hiện ở hình 4.3 Ta có thể thấy rõ trong 3 giờ đầu tiên kể từ lúc bắt đầu bổ sung phage, ở mức nhiệt độ 28℃ và 30℃, cho thấy sự gia tăng đáng kể về số lượng phage (lần lượt là 10.50 ± 0.05 và 10.73 ± 0.05 logPFU/mL) so với hai mốc nhiệt độ còn lại (khoảng 7.3 logPFU/mL) và không có sự khác biệt đáng kể giữa chúng Tuy nhiên, sau 5 giờ khảo sát, số lượng phage có trong chế phẩm ở 4 mốc nhiệt độ đều đạt gần 11 logPFU/mL và không có sự khác biệt ý nghĩa (Bảng B.3) Theo nghiên cứu trước đó, vi khuẩn E ictaluri sinh trưởng tối ưu khi nhiệt độ dưới 26-30℃ [7, 13], đồng thời theo Shan và công sự (2014) thì hoạt động xâm nhiễm và ly giải của phage phụ thuộc vào nhiệt độ mà ở đó vi khuẩn phát triển và sinh trưởng tốt [83] Do đó, nhiệt độ từ 28-30℃ là phù hợp cho sự phát triển tối ưu của vi khuẩn và hiệu quả cho quá trình chế tạo phage
4.1.4 Ảnh hưở ng c ủa cation đế n quá trình ch ế t ạ o ch ế ph ẩ m phage
Hình 4.4 Ảnh hưởng của ion Mg 2+ và Ca 2+ đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage
Hình 4.4 đề cập đến sự ảnh hưởng của hai ion Mg 2+ và Ca 2+ đến hiệu quả chế tạo chế phẩm phage PVN06 Cation Mg 2+ và Ca 2+ có tác động tích cực đến quá trình chế tạo chế phẩm PVN09 [84] Tác động tích cực này là do vi khuẩn E ictaluri là vi khuẩn gram âm khi có mặt của các cation sẽ làm tăng tính thẩm thấu của màng tế bào do đó giúp phage dễ dàng và tiếp cận với vi khuẩn chủ [84] Tuy nhiên, trong nghiên cứu của này, sự có mặt của các cation với nồng độ 0.2 – 1.0 mM không có sự khác biệt nào trong hiệu quả chế tạo phage so với mẫu đối chứng (không bổ sung bất kỳ cation nào) (Bảng B.4) Sự khác biệt giữa phage PVN09 và PVN06 có thể do hai phage này thuộc 2 họ phage khác nhau và từ hai nguồn phân lập khác nhau (PVN06 phân lập từ bùn ao và PVN09 phân lập từ nội tạng cá), do đó lớp vỏ capsid của chúng có các thành phần khác nhau và sẽ chịu ảnh hưởng của các cation trong quá trình xâm nhiễm vi khuẩn theo chiều hướng riêng biệt Tóm lại, cation Mg 2+ và Ca 2+ không phải là yếu tố chi phối hiệu suất chế tạo chế phẩm phage PVN06.
Ảnh hưởng của nhiệt độ và các loại môi trường dinh dưỡng đến quá trình bảo quản phage PVN06
Nhiệt độ bảo quản phage là yếu tố quan trọng nhất quyết định đến khả năng hoạt động của phage Trong báo cáo của Ackermann và cộng sự (2004), phage được bảo quản ở 4℃, -20℃, -80℃ cùng với một số chất bảo quản (như nito lỏng, glycerol) [85] Tuy nhiên, điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp thường áp dụng trong quy mô phòng thí nghiệm và các điều kiện này thường có chi phí cao và rất khó sử dụng khi chế tạo ở quy mô lớn Ở nhiệt độ cao hay thậm chí ở nhiệt độ phòng, các phage rất khó để bảo quản trong thời gian dài vì chúng thường giảm mật độ sau vài ngày bảo quản [41], thậm chí sau 1 giờ tỷ lệ phage còn tồn tại chưa đến 60% [74] Do đó, quá trình khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và canh trường lên hoạt tính của phage là cần thiết để có thể ứng dụng vào quá trình chế tạo phage trong tương lai nhằm thiết lập quy trình bảo quản đơn giản cũng như tiết kiệm chi phí
Sau 98 ngày khảo sát, mật độ phage trong chế phẩm giảm không đáng kể so với mật độ phage ban đầu kể cả ở 4℃ hay ở nhiệt độ phòng (30℃) được thể hiện thông qua hình 4.7 Không có khác biệt đáng kể nào khi bảo quản phage trong môi trường TSB hay BHI, mật độ phage sau khảo sát khoảng 10 10 PFU/mL Tuy nhiên khi bảo quản phage ở môi trường EIM, mật độ phage giảm không đáng kể khi bảo quản ở 4℃, nhưng ở nhiệt độ phòng giảm từ 1 - 3 giá trị log PFU/mL so với ban đầu
Từ đó cho thấy rằng, chế phẩm PVN06 ổn định ngay cả ở nhiệt độ phòng và 4℃ khi được lưu trữ trong môi trường TSB và BHI Đặc biệt ở chế phẩm phage PVN06 khi bảo quản ở nhiệt độ phòng trong môi trường TSB chỉ giảm khoảng 0.39 log từ 10.06 ± 0.09 xuống còn 9.67 ± 0.15 (log10PFU/mL) trong 98 ngày khảo sát
(hơn 3 tháng) mà không cần bất kì chất bảo quản nào khác Bên cạnh đó, trong điều kiện chế tạo thì môi trường TSB rẻ hơn nhiều lần so với môi trường BHI nên chế tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm phage trong môi trường TSB trở nên đơn giản và tiện lợi hơn nhiều
Hình 4.5 Hoạt tính của chế phẩm phage PVN06 trong môi trường TSB, BHI và
EIM bảo quản ở 4℃ và nhiệt độ phòng (30℃)
Theo nghiên cứu của Duyên và cộng sự năm 2022 cũng đã theo dõi ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ đến quá trình bảo quản phage PVN09 là một phage được phân lập từ nội tạng cá tra [84] Ở 4℃, chế phẩm phage ổn định trong cả 3 loại môi trường (TSB, EIM, BHI) sau 100 ngày Tuy nhiên, ở nhiệt độ phòng chế phẩm phage không được hiệu quả như ở 4℃, sau 100 ngày, mật độ phage giảm lần lượt là khoảng 1 logPFU/mL (môi trường TSB), 2 logPFU/mL (môi trường BHI và EIM) Như vậy, phage PVN06 có độ ổn định tốt hơn phage PVN09 trong quá trình bảo quản ngay cả ở nhiệt độ phòng Điều này có thể được lý giải do sự khác nhau từ các nguồn phân lập phage, cấu tạo của phage dẫn đến sự khác biệt về độ bền của hai phage.
Thử nghiệm chế phẩm phage trong phòng bệnh
Thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát sự tăng sinh của vi khuẩn trong môi trường TSB được thực hiện ở cả 3 giá trị MOI: 0.01, 0.1, 1.0 và mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung phage (Hình 4.8) Nhìn vào hình 4.7 ta thấy được ở nghiệm thức MOI = 0.01, OD600 theo thời gian từ 0 - 6.5 giờ tăng (nhưng thấp hơn so với đối chứng), ở mốc 7 giờ và 10 giờ OD600 giảm nhẹ (mốc 10 giờ OD600 = 0.316), sau 24 giờ OD600 = 2.03 ± 0.02 tăng cao và cao hơn so với đối chứng (OD600 = 0.92 ± 0.01) Ở nghiệm thức MOI = 0.1, OD600 tăng nhẹ từ 0-3.5 giờ, từ mốc 4-10 giờ, OD600 giảm dần (OD600 duy trì ổn định quanh giá trị 0.08-0.09 từ mốc 5-10 giờ), đến 24 giờ OD600 tăng trở lại (OD600 = 0.293±0.04) nhưng vẫn thấp hơn mẫu đối chứng Tương tự với nghiệm thức MOI = 0.1, ở nghiệm thức MOI = 1.0, OD600 tăng nhẹ từ 0-3 giờ, từ mốc 3.5-10 giờ, OD600 giảm dần (OD600 duy trì ổn định quanh giá trị 0.08-0.09 từ mốc 5-
10 giờ), đến 24 giờ OD600 tăng (OD600 = 0.222±0.002) Từ kết quả này ta có thể thấy khả năng kiểm soát tăng sinh vi khuẩn ở nghiệm thức MOI = 0.01 kém hơn hẳn so với nghiệm thức MOI = 0.1 và 1.0
Hình 4.6 Khả năng kiểm soát sự tăng sinh của vi khuẩn của phage PVN06
Các thử nghiệm kiểm soát vi khuẩn E ictaluri của phage cũng đã được thực hiện trong một số nghiên cứu Trong nghiên cứu của Hoàng và cộng sự, phage MK7 có khả năng kiểm soát vi khuẩn trong 15 giờ với MOI = 2.0 [86] Nghiên cứu của tác giả Hoàng Anh Hoàng và Đ.T My Phạm, kết quả khảo sát với 3 phage khác nhau gồm G1, G7 và G8 duy trì độ đục của môi trường (OD600 < 0.1) trong khoảng 18 – 20 giờ với MOI = 2.0 [77] Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu này đều thực hiện với MOI
= 2.0 với đơn phage hoặc phage cocktail nên khả năng kiểm soát phage có thể tốt hơn so với báo cáo này, nhưng với kết quả kiểm soát của phage PVN06 ở MOI = 0.1 và 1.0 cũng đã có thể lên đến hơn 10 giờ Bên cạnh đó, trong thực tế, thí nghiệm được tiến hành khảo sát cho đến khi OD600 tăng trở lại, tại thời điểm 24 giờ giá trị OD600 của tất cả các nghiệm thức đều trên 0.2 Vì vậy một lần nữa khẳng định phage PVN06 có thể kiểm soát vi khuẩn tăng sinh trong 10 giờ hoặc hơn nhưng không quá 24 giờ Điều này cho thấy khả năng có thể ứng dụng phage vào trong thực tế
4.3.2 K ế t qu ả th ử nghi ệ m ch ế ph ẩ m phage PVN06 trong phòng b ệ nh ở cá tra gi ố ng
4.3.2.1 Kết quả quá trình giải phóng phage từ thức ăn cá
Hình 4.7 Phage PVN06 thôi giải từ thức ăn đi vào đệm SM
Quá trình phage giải phóng từ thức ăn đi ra đệm SM trong 1 giờ được thể hiện ở hình 4.9 Sau 1 giờ, lượng phage giải phóng tối đa là 3.72 ± 0.11 log PFU/mL (Bảng E.9), trong khi lượng phage ban đầu 7.95 PFU/g, điều này cho thấy lượng phage từ thức ăn ra môi trường nước là khoảng 3% Do đó hiệu quả phủ phage trên bề mặt thức ăn cá là xấp xỉ 97% Khi so sánh với nghiên cứu về hiệu quả sử dụng chế phẩm trong phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophyla gây ra trên cá tra của T.H.O Dang và cộng sự năm 2021 phage thôi giải vào đệm SM tối đa là 3.99 ± 0.02 log PFU/ml [74], thấp hơn so với kết quả của báo cáo này Tuy nhiên trong nghiên cứu đã sử dụng mật độ phage PVN02 đầu vào thấp hơn khoảng 8 lần với 6.68 ± 0.01 logPFU/g Sự khác biệt về khả năng phủ phage lên bề mặt của thức ăn cá còn phụ thuộc vào từng loại phage do sự khác nhau về cấu trúc lớp vỏ capsid
4.3.2.2 Kết quả thử nghiệm chế phẩm phage trong phòng bệnh ở cá
Trong quá trình thử nghiệm, nhiệt độ nước và pH của nước trong tất cả các bể (63 bể) và luôn được theo dõi mỗi ngày cho đến khi kết thúc thử nghiệm, giá trị trung bình của hai thông số này lần lượt là 27.2 ± 0.4℃ và 7.3 ± 0.1, cho thấy điều kiện giống nhau và ổn định ở tất cả các bể
Lượng phage từ thức ăn đi vào nước bể nuôi cá được thể hiện ở hình 4.10 Ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung phage, lượng phage từ thức ăn vào nước nhỏ hơn 4 logPFU/mL và lượng phage từ thức ăn đi vào nước cao chủ yếu ở các nghiệm thức bổ sung phage với mật độ cao Tuy vậy, lượng phage đầu vào ở các nghiệm thức lần lượt là 7.2 ± 0.08, 8.2 ± 0.08, 9.2 ± 0.08 log PFU/g thì tỉ lệ phage bám vào thức ăn vẫn còn cao Bên cạnh đó, lượng phage thoát ra ngoài vẫn có thể kiểm soát và nhân lên khi có sự xuất hiện của vi khuẩn bên ngoài môi trường
Hình 4.8 Mật độ phage PVN06 từ thức ăn đi vào nước nuôi cá thay đổi theo thời gian trong 15 ngày khảo sát với mật độ (A) 17 PFU/g, (B) 8.17 PFU/g và (C) 9.17
Hình 4.9 Tỷ lệ cá chết tích lũy trong thử nghiệm phòng bệnh
Hình 4.11 cho thấy tỷ lệ cá chết tích lũy (%) theo thời gian Cá được cho ăn thức ăn có trộn phage từ ngày 0 và được cảm nhiễm vi khuẩn vào ngày 1 trong quá trình thử nghiệm Cá bắt đầu chết từ ngày thứ 2 sau cảm nhiễm vi khuẩn ở tất cả các nghiệm thức (trừ nghiệm thức đối chứng B0P0) không bổ sung phage (hình 4.12A) trong khi đó ở các nghiệm thức có bổ sung phage, ngày thứ 3 của thử nghiệm cá mới bắt đầu chết và ngày này cũng ghi nhận số lượng cá chết nhiều nhất
Hình 4.11A cho thấy tỷ lệ cá chết tích lũy trong ở nghiệm thức bổ sung phage bất hoạt, ở nghiệm thức BiP0 (không cảm nhiễm vi khuẩn và bổ sung phage bất hoạt) tỷ lệ cá chết rất thấp 1.67% ± 2.89 và gần như là không có, các con cá còn lại sống khỏe mạnh cho thấy thành phần trong chế phẩm không ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cá Ở các nghiệm thức bổ sung phage bất hoạt tỷ lệ cá chết tích lũy tăng theo mật độ khuẩn cảm nhiễm và cao hơn so với các nghiệm thức có bổ sung phage với cùng mật độ vi khuẩn (Hình 4.11) với tỷ lệ cá chết thấp nhất và cao nhất lần lượt là 36.7 ± 2.9% (ở nghiệm thức B3P0) và 75.0 ± 5.0% (ở nghiệm thức B7P0)
Hình 4.11B cho biết, cá được cho ăn thức ăn có bổ sung phage ở mật độ 7.17 ± 0.09 logPFU/g có tỷ lệ cá chết tích lũy khá cao từ 33.36 ± 2.89% đến 71.67 ± 2.89%
(Bảng B.7) và gần bằng với lô thí nghiệm bổ sung phage bất hoạt Sau khi phân tích thống kê cho thấy rằng tỷ lệ cá chết ở lô bổ sung phage bất hoạt và bổ sung phage với mật độ thấp nhất là không có sự khác biệt ý nghĩa (p>0.05) Điều này cho thấy với mật độ phage này chưa đủ để có thể phòng ngừa bệnh gan thận mủ
Hình 4.11C là các nghiệm thức có bổ sung phage với mật độ là 8.17 ± 0.09 logPFU/g sẽ giúp cho tỷ lệ cá chết giảm so với các nghiệm thức bổ sung phage bất hoạt, tỷ lệ cá chết từ 31.67 ± 2.89% đến 65.00 ± 5.00% (Bảng B.7) Tuy nhiên, sau khi xử lý số liệu với mức ý nghĩa p