Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt cây me (tamarindus indica l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT CÂ[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT CÂY ME (Tamarindus indica L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME (Tamarindus indica L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS Nguyễn Thị Mai Phương Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Hồng Minh Hà Nội - 2021 MỞ ĐẦU Lỗng xương là bệnh phở biến toàn cầu Loãng xương làm tăng tính dòn của xương dẫn đến dễ bị gãy, vì thế ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, cuộc sống của mỗi cá nhân và cả cộng đồng xã hội Tổ chức y tế thế giới rất quan tâm và mong muốn cải thiện được tình trạng này, nhằm nâng cao sức khỏe cũng chất lượng cuộc sống của người Tỷ lệ người bị lỗng xương ngày mợt tăng lên ở cả các nước phát triển và phát triển, đặc biệt là với những người có tuổi Các số liệu thống kê cho thấy khoảng 200 triệu người toàn thế giới bị bệnh này và khoảng 2,8 triệu người Việt Nam mắc phải bệnh loãng xương Loãng xương xảy sự mất cân bằng giữa sự mất xương và sự hình thành xương, đó sự hình thành xương xảy chậm sự mất xương Vì vậy, các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính làm tăng sự hình thành xương hoặc làm giảm sự mất xương để điều trị loãng xương là hướng nghiên cứu rất được quan tâm Phần lớn các thuốc thị trường là các tác nhân làm giảm sự mất xương Trong đó, chỉ có rất ít chất có khả cảm ứng làm tăng sự tạo xương Thêm vào đó, việc sử dụng các thuốc hóa học hiện để xử lý lỗng xương có mợt sớ hạn chế hiệu quả cũng gây phản ứng phụ sử dụng lâu dài Do đó, việc phát hiện và sử dụng những chất tự nhiên có khả cảm ứng tái tạo xương mới, ít gây phản ứng phụ để xử lý bệnh lỗng xương và trì đợ bền của xương là hướng nghiên cứu mới, có nhiều tiềm ứng dụng để điều trị bệnh loãng xương cũng các bệnh liên quan khác Theo thống kê của Viện Dược liệu thì nước ta có khoảng 4000 lồi thực vật được dùng làm thuốc ở mức độ khác Các số liệu cho thấy tiềm to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú, có thể sử dụng ng̀n ngun liệu tiềm nghiên cứu sàng lọc nhằm tìm những hợp chất có hoạt tính dược học quý hiếm, đó có các chất có tác dụng cảm ứng tái tạo xương và hiệu quả 2 Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi được phân bố rộng rãi toàn thế giới ở 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam Polysaccharide từ hạt me (TSP) có nhiều hoạt tính sinh học quý và được ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực khác TSP có khả chống oxy hóa, hạ cholesterol, giảm khả xơ vữa thành mạch máu TSP cũng có thể sử dụng là một chất làm đặc và ổn định, làm tác nhân gel hóa, làm chất làm ởn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì nó có tính chất tương tự tinh bột ổn định TSP được thử nghiệm có hiệu quả điều trị bệnh tiêu hóa và được sử dụng làm chất mang thuốc chữa bệnh đại tràng Liên quan đến hướng nghiên cứu tác dụng lên bảo vệ xương, hợp chất tách chiết từ hạt me cũng được chứng minh là có tác dụng tích cực đối với mợt sớ bệnh xương khớp Ngồi ra, hợp chất polysaccharide tự nhiên từ quả me cũng được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh học scaffold ứng dụng y dược Mặc dù các công trình công bố chứng tỏ TSP và các dẫn xuất của nó có nhiều hoạt tính sinh học quý, có khả ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực khác các nghiên cứu sâu chế tác dụng của TSP và các dẫn xuất của nó đối với quá trình biệt hóa tế bào tạo xương vẫn còn thiếu vắng Cho đến nay, chưa có cơng trình nghiên cứu cách toàn diện đầy đủ ảnh hưởng TSP dẫn xuất nó, đặc biệt dẫn suất sulphate, đến trình tái tạo xương (TTX) Xuất phát từ những tồn tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, cũng để góp phần khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta, thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng hình thành xương dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.)” nhằm đánh giá đầy đủ tác dụng cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất TSP tiềm mô hình in vitro 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG 1.1.1 Lịch sử, định nghĩa, phân loại loãng xương 1.1.1.1 Lịch sử bệnh loãng xương Loãng xương được xác định xuất hiện từ thời Ai Cập cổ đại năm 990 – TCN tìm thấy các xác ướp có bướu ở người hạ cấp Thế kỷ 18, bác sĩ phẫu thuật người Anh John Hunter phát hiện rằng xương được đặt thể, xương cũ bị phân hủy hoặc được tái hấp thụ Quá trình phân hủy hay tái hấp thu này được chứng minh là đóng vai trò quan trọng bệnh loãng xương Năm 1830, nhà nghiên cứu bệnh học người Pháp Jean Lobstein nhận thấy rằng xương của một số bệnh nhân bị thủng lỗ lớn thông thường và ông đặt tḥt ngữ lỗng xương (xương xớp) để mơ tả sự thay đởi của xương người Bình thường Lỗng xương Hình 1.1 Cấu trúc mơ xương người bình thường so với người loãng xương [1] Mặc dù có lịch sử lâu đời định nghĩa bệnh loãng xương chỉ được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) chính thức đưa vào năm 1991 tại Thụy Sĩ và tiếp tục hoàn thiện cập nhật vào năm 2001[1] Loãng xương được định nghĩa là một tình trạng rối loạn chuyển hóa của bộ xương làm giảm sức mạnh của xương dẫn đến làm tăng nguy gãy xương Sức mạnh của xương được phản ánh thông qua hai yếu tố: khối lượng xương và chất lượng xương [2] Đo mật độ xương cho ta biết lượng chất khoáng đơn vị diện tích hoặc thể tích của xương Còn chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, tốc độ chuyển hóa của xương, độ khoáng hóa, mức độ tổn thương tích lũy, tính chất của các chất bản của xương 1.1.1.2 Phân loại bệnh loãng xương Dựa vào các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển hóa xương, loãng xương có thể được phân thành hai nhóm chính là loãng xương nguyên phát (type type 2) tuổi tác hoặc tình trạng mãn kinh và lỗng xương thứ phát mợt sớ bệnh mạn tính hoặc liên quan đến sử dụng một số loại thuốc… 1.1.2 Cơ chế phương pháp điều trị bệnh loãng xương 1.1.2.1 Cơ chế Loãng xương xuất phát từ sự mất cân đối giữa hai hoạt động tạo xương và hủy xương mà cụ thể là lượng xương bị đào thải nhiều lượng xương thay Ở cấp độ phân tử, mô xương được cấu thành từ tế bào tạo xương (osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast) và nhóm một số tế bào khác Những tế bào này tương tác với một số chất khoáng, protein, hormone và các phân tử khác để nuôi dưỡng xương, liên tục đục bỏ xương cũ thay bằng xương Tế bào tạo xương (osteoblast) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell – MSC) có tác động thay đổi đến cấu trúc xương, tạo những lớp xương góp phần tạo lực của xương Những tế bào này đặt điều kiện thích hợp có thể chuyển hóa thành tế bào xương điều kiện khác chúng cũng có thể trở thành tế bào cơ, mỡ hoặc sụn Tế bào hủy xương (osteoclast) là những tế bào xuất phát từ tế bào tạo máu có chức đục bỏ xương cũ hay xương bị tổn hại qua một quá trình phân hủy chất khoáng Trong điều kiện bình thương, chức của tế bào hủy xương và tế bào tạo xương hoạt động mức độ tương đương và tín hiệu của loại tế bào này ảnh hưởng đến loại tế bào Trong thể người, mô xương được cấu thành từ bụng mẹ và được làm trì sự phát triển qua hai trình modelling remodelling Hai quá trình này xảy với những chế riêng biệt để biệt hóa các nhóm tế bào xương, giúp đạt được sự tạo thành xương hoặc làm xương Hai quá trình này, phối hợp quá trình phát triển xương để định dạng xương thích hợp, trì nồng độ huyết của các ion và sửa chữa các vùng cấu trúc xương bị tổn thương Hình 1.2 Quá trình remodel [3] Quá trình remodel là quá trình chu chuyển xương từ lúc còn nhỏ đến trước trưởng thành (18-20 tuổi) Chức của quá trình là hoàn chỉnh khối xương làm cho xương thay đổi kích thước hình dạng và tăng trưởng Trong quá trình này, hai hoạt động tạo và hủy xương xảy một cách độc lập tại một vị trí, hoạt động tạo xương diễn mạnh hủy xương Quá trình remodel là quá trình diễn liên tục, suốt đời, tốc độ xảy giảm dần theo tuổi tác Chức của quá trình là trì mật độ xương, phân hủy những mảng xương cũ hay xương bị tổn hại và thay thế bằng những mảng xương Remodel là quá trình rất cần thiết để trì lực của xương Quá trình này xảy theo trình tự gồm: hoạt hóa (activation), hủy xương (resorption), trung gian (reversal), hình thành xương (bone formation) và khống hóa (mineralization) Q trình remodel được bắt đầu các tế bào hủy xương (osteoclast) được biệt hóa và hoạt động để loại bỏ xương già, xương hỏng bằng cách hấp thu các chất khoáng để lại những lỗ hổng bề mặt xương Tế bào đơn nhân (monocuclear cells) thu dọn các mảnh vụn được thải hoạt động hủy xương và chuẩn bị bề mặt được phục hồi trước tế bào tạo xương (osteoblast) sửa chữa xương bị tổn hại Tiếp theo, tế bào tạo xương tổng hợp thành phần hữu và vô của xương, thay thế phần xương bị hấp thụ thông qua quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation) Sự khoáng hóa xương (mineralization) và sự biệt hóa của một số tế bào tạo xương thành tế bào xương (osteocytes) là giai đoạn cuối để hoàn thành quá trình tái mơ hình [4] Trong q trình remodel, hai hoạt đợng tạo và hủy xương diễn bề mặt xương với tốc độ 2-10% xương hằng năm Trước bước vào giai đoạn trưởng thành hoạt động tạo xương diễn tương đương hoạt động hủy xương, đó mật độ xương đạt mức độ cao ở độ tuổi 20-30 Sau đạt mức tối đa, xương bắt đầu suy giảm với tốc độ khác theo độ tuổi Sau thời kỳ mãn kinh vài năm ở nữ và sau 50 tuổi ở nam, hoạt động hủy xương lấn át hoạt động tạo xương, tỷ lệ hủy xương và tạo xương mất cân bằng mà cụ thể là sự hình thành xương ít sự hấp thụ xương, gây mất cân bằng nội mô xương và dẫn đến tình trạng thể bắt đầu mất xương, mật độ xương, trọng lượng và độ cứng của xương giảm dẫn đến tình trạng loãng xương Trong q trình remodel, mợt sớ protein và các nhân tố osterix (OSX), COX2 và Runx2 tham gia vào quá trình làm tăng sự biểu hiện của alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OPN) và osteocalcin (OSC) Đây là những nhân tố quyết định sự tạo tế bào xương trưởng thành (mature osteoblast) (Hình 1.3) Tế bào gớc trung mơ từ tủy xương (MSC) đến thời điểm này được chứng minh là dòng tế bào gốc đa năng, với khả biệt hóa giới hạn các dòng tế bào thuộc lớp trung mô tế bào xương, sụn, và mỡ Tuy nhiên, một số thí nghiệm khác cũng cho thấy rằng dòng tế bào gốc này cũng có khả biệt hóa thành tế bào gan, tế bào tim, tế bào thần kinh quá trình biệt hóa rất nhiều giai đoạn và có tỉ lệ thành công thấp Hình 1.3 Sơ đồ trình phát triển biệt hóa tế bào gốc (MSC) thành tế bào tạo xương [5] Quá trình biệt hóa tế bào xương trưởng thành từ tế bào gốc MSC trải qua giai đoạn được chỉ hình 1.3 Bắt đầu của quá trình là từ tế bào gốc ở tủy – MSC (1), trải qua giai đoạn tăng sinh - proliferation (2) để trở thành tiền tế bào xương – pre-osteoblast (3) và qua giai đoạn khoáng hóa (mineralization) để trở thành tế bào xương trưởng thành – mature osteoblast (4) [2] 1.1.2.2 Các phương pháp điều trị loãng xương Kiểm soát lỗng xương có thể khơng dùng th́c bao gờm việc cung cấp đủ canxi và vitamin D, tập thể dục tăng cân, cai thuốc lá, hạn chế uống rượu / caffein và các kỹ thuật phòng ngừa bị ngã Trong trường hợp phải điều trị lỗng xương dùng th́c thì định hướng hiên tập trung vào hai hướng là:  Ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hủy xương (osteoclast)  Làm gia tăng các nhân tớ tái tạo xương (TTX) thơng qua biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differntiation) Hiệu quả điều trị của thuốc phụ thuộc vào tuổi tác, giới tính và sức khỏe của bệnh nhân Các chất ức chế được sử dụng là bisphosphonates, chất chủ vận/ đối kháng estrogen [EAAs], estrogen, calcitonin denosumab) Bisphosphonates vẫn là lựa chọn điều trị hàng đầu và tiết kiệm chi phí nhất cho bệnh loãng xương, ngày càng có nhiều lo ngại tính an toàn lâu dài của chúng Tuy nhiên, không phải tất cả các loại thuốc điều trị loãng xương được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) chấp thuận để điều trị loãng xương Thuốc điều trị đầu tay cho hầu hết bệnh nhân có nguy gãy xương cao bao gồm alendronate, risedronate, zoledronic acid và denosumab Đối với những người không thể sử dụng liệu pháp uống và có nguy gãy xương cao, nên sử dụng teriparatide, denosumab hoặc axit zoledronic Đới với nam giới bị lỗng xương, điều trị đầu tay dung thuốc bisphosphonates [6] 9 Hầu hết những liệu pháp điều trị loãng xương hiện tập trung vào giải pháp làm giảm sự mất xương không khôi phục lại được khối lượng xương bị mất và độ cứng của xương, liệu pháp làm gia tăng TTX còn ít được đề cập đến [6] Vì vậy, hướng nghiên cứu và ứng dụng những nhân tố (factor) kích thích TTX để phục hồi một phần khối lượng xương bị mất, sửa chữa sự mất cân bằng các đặc điểm vi cấu trúc xương xốp lỗng xương nhờ đó làm tăng đợ cứng của xương và kết hợp giữa các nhân tố kìm hãm sự mất xương với kích thích TTX là hướng nghiên cứu và đầy triển vọng cho điều trị loãng xương Sử dụng các chất có khả cảm ứng TTX, người ta có thể tạo vật liệu sinh học ở dạng “giá đỡ” ba chiều (3D scaffold) có khả điều trị bệnh [6] Vật liệu này là một khuôn ngoại bào nhân tạo với nhiều lỗ xốp và có khả phân hủy sinh học, bao gồm các tế bào nuôi cấy, các phân tử tín hiệu (các nhân tố tăng trưởng hay chất TTX) và khuôn 3D Các tế bào và phân tử tín hiệu được cấy vào khuôn 3D scaffold và sau đó được đưa vào vùng xương cần ghép để cảm ứng sự tăng trưởng và sản sinh xương Sau scaffold được đưa vào thể, tế bào bám dính, phân chia, biệt hóa, di chuyển vào các lỗ scaffold, đồng thời tiết các thành phần ngoại bào cần thiết để tạo mô và tổ chức hình thành mơ khỏe mạnh bình thường [7] 1.1.3 Tình hình nghiên cứu loãng xương giới Việt Nam 1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Trong các nghiên cứu được công bố, hợp chất berberine được nghiên cứu khá nhiều và được chứng minh là có thể làm giảm loãng xương bằng cách ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương osteoclast và kích thích biệt hóa tế bào tạo xương osteoblast Li cs., [8] chứng minh rằng berberine làm ngăn chặn sự suy giảm mật độ khoáng hóa xương in vivo in vitro bằng cách ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hấp thụ xương osteoclast Ngoài ra, berberine còn cảm ứng sự chết tế bào hấp thụ xương osteoclast theo đường apoptosis Nhóm nghiên cứu sau đó cũng chứng minh rằng berberine có thể ngăn chặn sự mất xương ở những người bị loãng xương 10 sự già hóa [9] Khi nghiên cứu ảnh hưởng của berberine đến quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation), Lee cs., [10] cho thấy berberine làm tăng sự hình thành xương (bone formation) thông qua việc hoạt hóa nhân tố phiên mã chính quá trình tạo xương (Runx2) bởi protein p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), từ đó chứng minh berberine có thể là nhân tố tiềm để điều trị các rới loạn liên quan đến bao gờm lỗng xương, xương Nghiên cứu của Han và cs., [11] chỉ hợp chất dẫn xuất của berberine (berberine bioisostere Q8) có thể cảm ứng biệt hóa tế bào tạo xương in vitro Trong một nghiên cứu khác với hợp chất từ quả me, Sundaram cs., [12] chứng tỏ hiệu quả chống viêm khớp của dịch chiết hạt me (tamarind seed extract- TSE) TSE đóng vai trò là một nhân tố ức chế sự thoái hóa sụn, phân hủy xương và kháng viêm Nghiên cứu của Sanyasi và cs., [13] mô tả và xác định một hydrogel đóng vai trò là một vật liệu cho kỹ nghệ mô xương (bone tissue engineering), đó carboxyl methyl tamarind polysaccharide là một polymer bán tổng hợp từ quả me Nhóm tác giả chứng minh rằng vật liệu này là thích hợp cho sự bám dính, sự sinh trưởng một cách hiệu quả các tế bào tiền tạo xương (bone precursor cells) Gần đây, nhóm nghiên cứu này tìm một vật liệu được tổng hợp từ polysaccharide tự nhiên có nguồn gốc từ bột quả me được gắn với acrylic acid (AA) là TKP – AA có tiềm sử dụng là vật liệu sinh học scaffold và cho kỹ nghệ mô xương với giá thành thấp Lĩnh vực thiết kế chế tạo vật liệu sinh học scaffold sử dụng kỹ thuật in 3D (3D printing) được sử dụng nhiều thế giới Kỹ thuật in 3D được sử dụng rộng rãi cho việc chế tạo "giá đỡ" ứng dụng y học và tái tạo mô hay kỹ nghệ mô tế bào (TE) TE là một công nghệ đầy triển vọng cho việc gia tăng tái tạo và sửa chữa những sai sót của mô bởi sự tương tác giữa tế bào, “giá đỡ” (scaffold) và tương thích những nhân tố tăng trưởng bề mặt “giá đỡ” Những đặc điểm này giúp cho vật liệu nhân tạo tương tự mô tự nhiên Do đó, tế bào dễ dàng bám dính và tăng sinh vật liệu 3D 11 Nguyên lý chung cho việc chế tạo vật liệu 3D scaffold để điều trị bệnh xương là tạo vật liệu giá đỡ 3D (chất nền) mang các yếu tố bổ sung để giúp cho tế bào xương có thể phát triển và biệt hóa Sau đó, chất tự nhiên có hoạt tính cảm ứng TTX được gắn chất cảm ứng tế bào xương, kích thích quá trình biệt hóa tế bào, hình thành xương Tuy nhiên, nhiều vật liệu giá đỡ 3D không có khả tự hủy thể sau hình thành tế bào xương đó bệnh nhân cần phải thực hiện lại phẫu thuật nhằm đem vật liệu đó khỏi thể Các nghiên cứu theo hướng này được tiến hành mạnh mẽ nhằm khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng chất sinh học và hướng tới ứng dụng điều trị Hàng loạt các nghiên cứu các đối tượng thực vật khác cho thấy triển vọng của việc phát hiện các chất tự nhiên có hoạt tính TTX từ thực vật [14,15,16] Tuy nhiên, các nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều và còn thiếu vắng các nghiên cứu sâu chế tác dụng ở mức phân tử cũng những đánh giá đầy đủ mô hình in vivo nhằm mục đích ứng dụng điều trị hay tạo vật liệu cho TE 1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú, chứa đựng kho tàng vô giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học và dược lý Rất nhiều loài thực vật được sử dụng là nguồn dược liệu quí nhân dân để chữa trị bệnh với tính an toàn và hiệu quả cao, đó có những loại được sử dụng lâu đời để điều trị các bệnh xương khớp Mimosa pudica L., Solanum procumbens, Piper lolot Đây chính là nguồn nguyên liệu phong phú và tiềm để cung cấp các chất có hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương Ở Việt Nam, việc nghiên cứu tìm các hoạt chất có hoạt tính cảm ứng TTX tiềm năng, có thể ứng dụng và ít tác dụng phụ cho điều trị loãng xương và các bệnh xương khớp là vấn đề còn mẻ và cũng nhận được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có khả ứng dụng điều trị loãng xương chỉ được thực hiện mô hình in vivo Trong đó, các nghiên cứu mô hình in vitro còn rất hạn chế Nhóm nghiên cứu của trường Đại học Tôn Đức Thắng tiến hành 12 khảo sát tác dụng của cao xương cá sấu hoa cà mô học xương đùi chuột nhắt trắng bị gây loãng xương cảm ứng bởi prednison (corticoid) Cḥt thí nghiệm bị lỗng xương sau đó được điều trị bằng alendronat (5 mg/kg) hay cao xương cá sấu hoa cà ở cả hai liều uống 1.89 g/kg và 3.77 g/kg tuần Kết quả cho thấy, việc sử dụng cao xương cá sấu hoa cà có tác dụng làm giảm thiểu các khuyết hỏng prednison gây cấu trúc xương, làm tăng sự hiện diện của các tế bào xương (cốt bào, hay osteocyte cells) ở khu vực bị lỗng xương, phục hời lại sự hiện diện của các nguyên bào xương (tế bào tạo xương, hay osteoblast cells) tại những vị trí mà xương bị thiếu hụt Điều này chứng tỏ quá trình khôi phục xương diễn để lặp lại sự cần bằng quá trình tái cấu trúc xương [16] Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa sâu tìm hiểu chế và đường hướng phân tử của cao xương cá sấu hoa cà đối với sự TTX Có thể thấy, phần lớn các nghiên cứu hiện sử dụng mơ hình gây lỗng xương in vivo cḥt phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam so với các mô hình in vivo các động vật khác thế giới Tuy nhiên, việc sử dụng mô hình in vivo chuột cũng còn nhiều hạn chế các nghiên cứu sàng lọc cũng nghiên cứu chế phân tử Gần đây, nhóm nghiên cứu của Tô Thanh Thúy, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội lại tập trung theo hướng phát triển, chuyển hóa xương mô hình cá medaka và zebrafish và sàng lọc các thuốc và hợp chất tự nhiên có tác dụng đến chuyển hóa xương và chớng lỗng xương [17,18] Nhóm nghiên cứu sử dụng mô hình cá chuyển gen rankl:HSE:CFP mang cấu trúc gen chuyển bao gồm một promoter cảm ứng nhiệt điều khiển hai chiều đồng thời gen rankl (receptor activator of niclear factor kappa-β ligand) và gen mã hóa cho protein chỉ thị huỳnh quang CFP (complement factor properdin) để sàng lọc các hoạt chất chớng lỗng xương Ấu trùng cá này bị sốc nhiệt biểu hiện Rankl ngoại sinh làm tế bào hấp thụ xương hình thành và hoạt động, gây sự phá hủy mô xương được khoáng hóa tạo kiểu hình giớng lỗng xương ở giai đoạn phát triển rất sớm Trong một nghiên cứu gần đây, ấu trùng cá medaka chuyển gen mô phỏng bệnh loãng xương được điều trị bằng hai loại thuốc là etidronate và alendronate (hai loại biphosphonates thông dụng để điều trị bệnh loãng xương người) Sử dụng 13 các kỹ thuật hình ảnh, các kết quả cho thấy tác dụng ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương một cách có hiệu quả và phụ thuộc nồng độ, làm trì và phục hồi độ toàn vẹn xương Nhóm tác giả kết luận mô hình cá medaka là phù hợp để nghiên cứu sàng lọc th́c chớng lỗng xương in vivo [18] Tuy vậy, chế phân tử của thuốc cần sàng lọc (chất cần nghiên cứu) đới với bệnh lỗng xương vẫn chưa được thực hiện mơ hình cá Như vậy, có thể thấy rằng các nghiên cứu nước đối với các chất có khả TTX, đặc biệt là các chất tự nhiên rất hạn chế và chưa được đầu tư nghiên cứu chuyên sâu Với tamarind seed polysaccharide (TSP) dẫn suất dạng sulfate của (TSPS), nhóm nghiên cứu của Bùi Ngọc Tân cs., [19, 20] nghiên cứu chiết tách và bước đầu xác định thành phần hóa học của TSP từ quả me Sau đó, nhóm nghiên cứu này cũng tổng hợp dẫn suất TSPS và đánh giá một số hoạt tính sinh học của dẫn suất thu được Tuy nhiên, nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học, đặc biệt hoạt tính cảm ứng TTX dẫn suất sulfate chưa thực 1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYSACCHARIDE TỪ QUẢ ME 1.2.1 Giới thiệu me Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi được phân bố rộng rãi toàn thế giới ở 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam Cây me được sử dụng một loại thảo dược tại nhiều quốc gia thế giới Ấn Độ và Châu Phi [21] 14 Hình 1.4 Cây me (Tamarindus indica L.) Các bợ phận của me được sử dụng với nhiều mục đích khác lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm Cây me cao 15 đến 30 m, tán rộng, nhiều lá Lá me có dạng kép lông chim chẵn, dài từ cm đến 10 cm, gồm 10 đến 20 đôi lá chét thuôn không cân xứng, chóp lõm, dài 20 mm, rộng 2mm Hoa trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá hay thành chùy tận Quả dài mọc thõng xuống, dẹt, dài 7-12 cm, rộng 25 mm, dày 10 mm Vỏ quả ngoài mỏng, cứng, giòn, màu đỏ, vỏ quả giữa có xơ, vị chua, sau loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu nâu nhạt hay vàng nhạt Quả chứa 3-5 hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng Mùa quả vào tháng 10-11 Các bộ phận của me quả, hạt, lá, hoa và vỏ me được sử dụng với mục đích hóa học thực vật và dược phẩm Lá và hoa me có thể được sử dụng một loại rau bữa ăn truyền thống của nhiều dân tộc Đặc biệt, quả me và hạt me được nhiều tác giả nghiên cứu thành phần và tác dụng hóa học thực vật và dược phẩm Trong quả me có chứa chủ yếu 10% acid hữu (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali bitactrat 3,25%, đường 12,5%, gồm 4,70%, pectin 6,25% Ngồi cịn có 34,35% xơ, nước 27,55% Trong hạt có glucose, xylan, protein, chất béo, muối vô Trong đời sống quả me được sử dụng theo mùa vụ, làm thực phẩm, tạo hương vị, gia vị món cà ri, súp và 15 cũng là thành phần chính một số loại nước ép và đồ uống Người ta có thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào đồ uống và cũng có thể chế biến thành mứt, kẹo Nước quả me là loại đồ uống bổ dưỡng, được nhiều nước thế giới sử dụng và có nhiều cách thức chế biến khác Tại một số quốc gia châu Phi, nước quả me được trộn với tro gỗ để trung hòa vị chua của acid tartaric Tuy nhiên phương pháp phổ biến nhất là thêm đường để tạo vị ngọt cho đồ uống Phần lớn sản phẩm đồ uống có nước me được sản xuất thương mại Đôi nước quả me được cho vào đồ uống có cồn [22] Trong y học, theo đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng Vỏ me có vị chát, có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh tiêu hóa (kiết lỵ, ỉa chảy ) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi [21] Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, lá me thường được dùng để nấu nước tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè Thịt me, lá và hoa được kết hợp với nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của me còn có tác dụng như: Quả me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị nôn mửa, đầy và khó tiêu; chữa cảm lạnh Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có tác dụng chữa rôm sảy, mẩn ngứa, vỏ me có tác dụng chữa táo, phòng và chữa viêm lợi, viêm nha chu Hạt me rang được coi là một loại gia vị đặc biệt thực phẩm [21] Theo y học phương Tây, quả me được sử dụng một phương thuốc lợi tiểu điều trị chứng rối loạn mật, vàng da và tiêu chảy, giúp hệ thần kinh hoạt động tốt (hàm lượng thiamin 29%), thiamin là một loại vitamin B có vai trò quan trọng các hoạt động của dây thần kinh và bắp Me là một nguồn cung cấp vi chất cho thể Mg2+, Ca2+ Quả me là một những nguồn cung cấp chất xơ cao nhất các loại trái cây, giúp ngăn ngừa táo bón (hàm lượng chất xơ 20%) Chất xơ có tác dụng điều hòa nhu động ruột và được coi một loại thuốc nhuận tràng tự nhiên và không gây tác dụng phụ Quả me có thành phần kali cao gấp hai lần lượng kali chuối Do đó, quả me có tác dụng kiểm soát huyết áp tốt không gì chuối 16 Nước me giúp ổn định huyết áp bằng cách kiểm soát các tác động của natri thể, tránh để tình trạng lượng natri tăng cao làm cho huyết áp tăng [22] Quả me cũng được biết đến một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu (hàm lượng sắt 2,8%) Vì vậy, cũng là loại trái rất tốt cho phụ nữ mang thai Giúp kiểm soát mức cholesterol (hàm lượng niacin 1,2%) Me chứa khá nhiều chất niacin, một loại vitamin B rất quan trọng với sức khỏe Chất này có thể giúp giảm cholesterol xấu và tăng lượng cholesterol tốt thể Thành phần của me bao gồm chất riboflavin giúp chuyển hóa carbohydrate thể thành lượng có thể cung cấp lượng mà không gây béo (hàm lượng riboflavin 9%) Quả me có tác dụng hỗ trợ chế đông máu (hàm lượng calcium 7%) Quả me là một những loại trái giàu canxi Canxi (với sự giúp đỡ của vitamin K) đóng một vai trò rất quan trọng quá trình đông máu Vì vậy, quả me được coi là loại quả có tác dụng ổn định chế đông máu Quả me cũng có tác dụng giảm sốt và bảo vệ chống lại cảm lạnh (dùng thịt quả me đun với nước dùng để uống) Quả me giúp thể tiêu hóa thức ăn, vỏ của hạt me là một phương thuốc hiệu quả chống tiêu chảy và bệnh lỵ Mặc dù có nhiều tác giả công bố các ứng dụng đa dạng của me và được đưa vào sử dụng cuộc sống Tuy nhiên me vẫn còn có rất nhiều tiềm giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu giá trị của me đặc biệt là lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm [22] 1.2.2 Cấu trúc hóa học TSP Theo Joseph cs [22] polysaccharide phân lập được từ quả me thuộc lớp chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí C6 là liên kết với -D-xylopyranose và liên kết với -D-galactopyranose-(12)--Dxylopyranose Chuỗi này đƣợc lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG, bao gồm ba nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và được phân cách bằng một glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose được liên kết với galactopyranose (L) theo Hình 1.5 17 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học xyloglucan tamarind seed polysaccharide (TSP) Gần đây, cấu trúc của TSP được mô tả có dạng heptasaccharide (Glc4Xyl3, theo kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu XXLG), monosaccharide (Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) được đề cập Nhiều tính chất của xyloglucan (khả tạo gel, độ tan…) phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, một số polysaccharide có trọng lượng phân tử nhỏ có các hoạt tính sinh học quý giá và được sử dụng y học TSP chiết nước có dạng gel và kết tủa dung môi hữu cơ, TSP có trọng lượng phân tử từ 700–2500 kDa TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me phụ thuộc vào nguồn gốc TSP được sử dụng để kiểm soát liều lượng thuốc và không gây bất kỳ phản ứng phụ nào, có thể tạo khuôn với natri alginate để làm bao cho viên thuốc Người ta tạo dẫn chất sulfate hóa và cetyl hóa của polysaccharide để làm tăng khả chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định Gần đây, TSP được xác định là chất không gây ung thư, là chất kết dính có nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả giữ thuốc cao [22] 18 1.2.3 Phân lập TSP từ hạt me TSP có thể được phân lập bằng các kỹ thuật khác thông qua phương pháp hóa học, phương pháp enzyme sử dụng protease và kết hợp của protease với siêu âm cường độ cao Trong phương pháp hóa học, bột hạt ngâm nước được đun sôi nước Sau đó, chất nhầy được lọc và thêm vào một lượng acetone bằng để kết tủa polysaccharide, sau đó được cô đặc và sấy khô Trong phương pháp enzyme, bột nhân trộn với ethanol được xử lý bằng protease Sau đó, dung dịch được ly tâm và phần nổi phía được thêm vào ethanol để kết tủa, sau đó được tách và làm khô Độ tinh khiết của TSP có thể được xác định bởi sự vắng mặt của protein TSP có thể biến tính tạo thành kết tủa không hòa tan, đó làm cho việc tách TSP trở nên khó khăn Vì thế, loại bỏ các protein là mục tiêu chính tất cả các phương pháp phân lập TSP [22] 1.2.4 Ứng dụng polysaccharide từ me Polysaccharide chiết xuất từ hạt me được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, có thể ứng dụng dược phẩm Ví dụ, hoạt tính kháng u kích thích miễn dịch của polysaccharide PST001 được phân lập từ hạt me (T indica) được Aravind cs., công bố [23] Kết quả thu được chỉ rằng PST001 ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác Hơn nữa, độc tính của PST001, khả làm giảm khối u và điều hòa miễn dịch cũng được đánh giá các nghiên cứu in vivo Các tác giả cho thấy PST001 làm giảm đáng kể khối u và cải thiện mạnh mẽ hoạt động điều hòa miễn dịch [23] Hơn nữa, TSP này cũng được đánh giá các đặc tính hóa học, bao gồm độ ẩm, độ tro, pH, hàm lượng khoáng chất, khả giữ nước, tính chất vi lượng, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng sulphate, protein axit uronic [23] Ngoài ra, gần TSP cũng được đánh giá ảnh hưởng của nó lên q trình tiêu hóa lên men in vitro, ảnh hưởng đến thành phần hệ vi sinh vật đường ruột [24] Do TSP là một polymerđa chức năng, có nhiều đặc tính lý hóa đặc biệt đóng vai trò của chất ổn định, chất làm đặc, chất kết dính, chất làm chậm giải phóng, chất điều chỉnh chất tạo huyền phù, chất tăng độ nhớt, chất tạo ... HÀN L? ?M KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME (Tamarindus. .. nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta, thực hiện đề tài luận văn: ? ?Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng hình thành xương dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L. )? ?? nhằm... (Tamarindus indica L. ) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS Nguyễn Thị Mai Phương Hướng dẫn 2: TS