Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG R[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Hoàng Nghĩa Sơn Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong lĩnh vực sinh học trọng lực, nghiên cứu vi trọng lực khơng gian tìm nhiều tác động điều kiện trọng lực lên trình sinh học, chế nhạy cảm với trọng lực, hay định hướng dựa vào trọng lực sinh vật Tuy nhiên, việc nghiên cứu không gian gặp phải số khó khăn định, bao gồm chi phí đắt đỏ cho phương tiện nghiên cứu ảnh hưởng tiêu cực từ môi trường vi trọng lực lên thể phi hành gia Để khắc phục khó khăn trên, nhà khoa học cố gắng tạo mơ hình hệ thống sinh học mô điều kiện tương tự trạng thái vi trọng lực mặt đất nhằm nghiên cứu sâu tác động điều kiện vi trọng lực hay siêu trọng lực sinh vật sống hay đối tượng sống Trái Đất Nhiều nghiên cứu loại tế bào sinh vật khác hoạt động khác khơng gian so với Trái đất Do có đa dạng lớn loại tế bào tự nhiên, ảnh hưởng vi trọng lực lên tế bào vơ đa dạng thường phức tạp Một số nghiên cứu vai trò vi trọng lực tăng sinh biệt hóa tế bào chứng minh tế bào phát triển môi trường vi trọng lực phát triển khác với điều kiện bình thường dẫn đến thay đổi trình phân chia tế bào Khung xương tế bào đối tượng chịu ảnh hưởng lớn tác động vi trọng lực Bộ khung xương tế bào hình thành cấu trúc tế bào bao gồm tương tác vi ống, vi sợi actin, vi sợi trung gian protein liên quan Do đó, khung xương tế bào có liên quan lớn đến hình dạng tế bào Sự bất thường hoạt động vi ống vi sợi khung xương tế bào có ảnh hưởng bất lợi lên thân tế bào, chí gây hậu lớn tế bào giai đoạn phôi Các chế thay đổi tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào tác động vi trọng lực chưa chứng minh rõ ràng Tế bào gốc trung mơ cuống rốn dịng tế bào tiềm việc thu nhận chúng không vấp phải nhiều vấn đề đạo đức dòng tế bào gốc trung mơ từ nguồn khác Hiện nay, chưa có nhiều báo cáo tác động vi trọng lực lên tế bào gốc trung mơ cuống rốn, nghiên cứu sử dụng dòng tế bào làm đối tượng để đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực Từ lý trên, nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D để tạo môi trường vi trọng lực mô nhằm mục tiêu đánh giá tác động điều kiện vi trọng lực mô lên tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cells, viết tắt hucMSC Mục tiêu nghiên cứu luận án Mục tiêu nghiên cứu tìm phương thức tác động điều kiện vi trọng lực mô lên phát triển hucMSC, thông qua việc xác định thay đổi hình thái tế bào, tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào hucMSC điều kiện in vitro Các nội dung nghiên cứu luận án ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên tăng sinh tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mơ lên q trình apoptosis tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên thay đổi hình thái nhân tế bào chất tế bào hucMSC 3 ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên khung xương tế bào tế bào hucMSC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vai trò nghiên cứu sinh học không gian Phần nêu tầm quan trọng liệt kê hướng nghiên cứu sinh học không gian 1.2 Giới thiệu vi trọng lực vi trọng lực mô Phần giới thiệu tổng quan nêu khái niệm vi trọng lực vi trọng lực mô 1.3 Các hệ thống mô vi trọng lực Phần giới thiệu số hệ thống vi trọng lực mô nghiên cứu thực hệ thống 1.4 Tế bào gốc trung mô cuống rốn Phần trình bày đặc tính sinh học tế bào gốc trung mô cuống rốn lợi ích chúng nghiên cứu 1.5 Sự tăng sinh tế bào Trình bày khái niệm tăng sinh tế bào, chu kỳ tế bào yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên tăng sinh tế bào 1.6 Quá trình apoptosis Phần trình bày khái niệm, yếu tố ảnh hưởng đến trình apoptosis phương pháp đánh giá apoptosis 1.7 Nhân tế bào chất Phần trình bày khái niệm yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân tế bào chất tế bào 1.8 Bộ khung xương tế bào Phần trình bày thành phần cấu trúc nên khung xương tế bào nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên khung xương tế bào CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu ‒ Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) cung cấp Viện Sinh học Nhiệt đới ‒ Hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô thiết kế chế tạo đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thay đổi cấu trúc khung tế bào thể sống điều kiện mô trạng thái vi trọng lực (simulated microgravity)”, thuộc Chương trình Khoa học cơng nghệ vũ trụ, mã số: VTCB.15/18-20 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 2.2.1.1 Phương pháp giải đông hucMSC huyền phù hóa mơi trường ni cấy DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) bổ sung 15% FBS (FBS-HI-22B, Capricorn Scientific, Đức) 1% Pen/Strep (15140-122, Gibco, Mỹ), sau ly tâm 1500 vịng/phút phút nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào Tủa tế bào tái huyền phù môi trường nuôi cấy nuôi điều kiện 37°C, 5% CO2 2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền Tế bào hucMSC xử lý với Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific, Đức) ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút phút nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào Tủa tế bào tái huyền phù hóa ni nhiệt độ 37°C, 5% CO2 5 2.2.1.3 Phương pháp đông lạnh Tủa hucMSC sau thu hoạch huyền phù hóa với 500 μl DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) 500 μl môi trường đông lạnh HyCryo-STEM (SR30002.02, GE Healthcare Life Sciences, Mỹ) Huyền phù tế bào chuyển vào ống đông lạnh (430663, Corning, Mỹ) trữ 20°C giờ, sau trữ -80°C qua đêm cuối chuyển vào nitơ lỏng để lưu trữ 2.2.2 Đánh giá thị marker tế bào gốc trung mô hucMSC sau giải đông cấy chuyền thu hoạch đánh giá tính gốc phương pháp Flow cytometry sử dụng kit Human MSC analysis kit (562245, BD Biosciences, Mỹ) Mẫu tế bào phân tích hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) 2.2.3 Thử nghiệm vi trọng lực hucMSC ni bình ni T-25 (160430, Thermo Scientific, Mỹ) đĩa 96 giếng (161093, Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ 105 tế bào/bình ni × 103 tế bào/giếng Đĩa bình ni tế bào đổ đầy môi trường nuôi cấy Tế bào sau chia làm nhóm: nhóm vi trọng lực (SMG-Clinostat) nhóm đối chứng (Control) Đối với nhóm vi trọng lực, tế bào nuôi hệ thống máy 3D-Clinostat quay chế độ 1,3×10-3G Tế bào nhóm đối chứng ni điều kiện trọng lực bình thường (1G) Thử nghiệm vi trọng lực tiến hành vòng 72 2.2.4 Đánh giá tăng sinh tế bào 2.2.4.1 Đánh giá mật độ tế bào hucMSC xử lý với dung dịch WST-1 (11644807001, Roche, Thụy Sĩ) 3,5 37ºC, 5% CO2 Giá trị OD giếng đo máy quang phổ GloMax® Explorer Multimode Microplate Reader (Promega, Mỹ) bước sóng 450 nm 2.2.4.2 Đánh giá chu kỳ tế bào Đánh giá tỉ lệ tế bào vào pha chu kỳ: Hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) sử dụng để phân tích thay đổi chu kỳ hucMSC Đánh giá biểu mức phiên mã gene điều hòa chu kỳ tế bào: RNA tổng hucMSC tách kit ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Z6011, Promega, Mỹ) Biểu mức độ phiên mã gene CDK2, CDK6, Cyclin A đánh giá phương pháp Realtime qRT-PCR sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1Step Go Hi-ROX kit (PB25.32.03, PCRBiosystem, Anh) Chu trình nhiệt tiến hành sau: 45°C 15 phút, 95°C phút, 40 chu kỳ gồm 95°C 10 giây 62°C 15 giây, 71 chu kỳ 60°C 30 giây, 4°C 30 phút Trình tự mồi bao gồm: CDK2 F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’, TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’; CDK6 GCCATTAGTTTACCTGGACCCAGA-3’, CACTGACATGGAAGACAGGAACCT-3’; CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, 5’- F: 5’- R: TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’, TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’; R: Cyclin A 5’F: R: GAPDH 5’5’- F: R: 5’5’- AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ Phương pháp 2-∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biorads) áp dụng để đánh giá mức độ biểu tương đối biểu gene Đánh giá biểu mức dịch mã gene điều hòa chu kỳ tế bào: Mức độ biểu protein Cyclin A1+A2, CDK4, CDK6 đánh giá phương pháp Western Blot Protein GAPDH sử dụng làm đối chứng Các kháng thể sử dụng bao gồm: Anti-Cyclin A1 + Cyclin A2 antibody (ab185619, Abcam, Mỹ), Anti-CDK4 antibody (ab137675, Abcam, Mỹ), Anti-CDK6 antibody (ab124821, Abcam, Mỹ), Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ) Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) dùng để đo cường độ vạch protein kết phim 2.2.5 Đánh giá trình apoptosis 2.2.5.1 Thu hoạch tế bào Tủa tế bào hucMSC thu hoạch Mục 2.2.1.2 2.2.5.2 Đánh giá tỉ lệ apoptosis hucMSC sau thu hoạch xử lý với FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) phân tích hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ) 2.2.5.3 Đánh giá biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis Các gene Bax Bcl-2 đánh giá biểu mức phiên mã phương pháp Realtime qRT-PCR Quy trình thu nhận RNA tổng phản ứng Realtime qRT-PCR thực Mục 2.2.4.2 Chu trình nhiệt tiến hành sau: 45°C 15 phút, 95°C phút, 40 chu kỳ gồm 95°C 10 giây 52,2°C 15 giây, 71 chu kỳ 60°C 15 giây, 4°C 30 phút Các cặp mồi đặc trưng cho gene khảo sát bao gồm: Bax F: 5’R: CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’, TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’; 5’F: Bcl-2 TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’, R: TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’; GAPDH 5’5’- F: 5’- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’, 5’- R: AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ 2.2.6 Đánh giá thay đổi hình thái nhân tế bào chất hucMSC nhuộm nhân Hoechst 33342 (14533, SigmaAldrich, Mỹ) quan sát hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ) Ứng dụng Cell Cycle App sử dụng để đánh giá hình thái nhân, bao gồm diện tích, cường độ giá trị hình dạng nhân (nuclear shape value) Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) dùng để đánh giá diện tích tế bào Kích thước hucMSC đánh giá phương pháp flow cytometry thông qua kết đo số FSC (Forward Scatter) 2.2.7 Đánh giá thay đổi cấu trúc khung xương tế bào 2.2.7.1 Thu hoạch tế bào Tủa tế bào hucMSC thu hoạch Mục 2.2.1.2 2.2.7.2 Đánh giá biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi Các gene gồm α-tubulin β-actin đánh giá biểu mức phiên mã phương pháp Realtime qRT-PCR Mục 2.2.4.2 Chu trình nhiệt tiến hành sau: 45°C 15 phút, 95°C phút, 40 chu kỳ gồm 95°C 10 giây 60°C 15 giây, 71 chu kỳ 60°C 15 giây, 4°C 30 phút Các cặp mồi đặc trưng cho gene khảo sát bao gồm: α-tubulin F: 5’R: CATTGAAAAGTTGTGGTCTGATCA-3’, GCTTGGGTCTGTAACAAAGCAT-3’; GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’, AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’; β-actin 5’F: R: GAPDH 5’5’- F: 5’- ... vi trọng lực mô nhằm mục tiêu đánh giá tác động điều kiện vi trọng lực mô lên tăng sinh cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cells, vi? ??t tắt hucMSC... điều kiện in vitro Các nội dung nghiên cứu luận án ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên tăng sinh tế bào hucMSC ‒ Đánh giá ảnh hưởng vi trọng lực mô lên trình apoptosis tế bào hucMSC ‒ Đánh. .. đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học vi? ??n, họp Học vi? ??n Khoa học Công nghệ - Vi? ??n Hàn lâm Khoa học Công nghệ Vi? ??t Nam vào hồi … …, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư vi? ??n