Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tạo chủng trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Thơm NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CÓ HOẠT TÍNH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ LUẬN V[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thơm NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CĨ HOẠT TÍNH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ LUẬN VĂN THẠC SĨ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thơm NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CĨ HOẠT TÍNH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: PGS TS Đỗ Thị Huyền Hƣớng dẫn 2: ThS Trần Băng Diệp Hà Nội, 2020 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần đƣợc công bố hội nghị khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Thơm ii Lời cảm ơn Với tất lịng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới hai ngƣời thầy: PGS TS Đỗ Thị Huyền, Trƣởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cho kiến thức q báu, chia sẻ kinh nghiệm giúp đỡ tơi q trình hồn thiện luận văn; ThS Trần Băng Diệp, Trƣởng phịng Cơng nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện lƣợng Nguyên tử Việt Nam - ngƣời thầy bên cạnh tôi, truyền cho cảm hứng nghiên cứu khoa học, cho ý tƣởng định hƣớng đắn, bảo kỹ cần thiết ln tận tình, gần gũi, tạo điều kiện tốt suốt trình tơi thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới anh chị Phòng Công nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện lƣợng Nguyên tử Việt Nam giúp đỡ nhiệt tình đóng góp ý kiến q báu nhƣ tận tình dạy, tạo điều kiện giúp đỡ thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện lƣợng Nguyên tử Việt Nam tạo điều kiện cho tơi có thời gian để học tập thời gian công tác Viện Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học Công nghệ với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu suốt thời gian thực luận văn Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Đề tài KHCN cấp bộ, mã số ĐTCB 01/18/TTCX: “Ứng dụng xạ gamma gây đột biến Trichoderma để tạo chế phẩm phân giải nhanh rơm rạ đồng ruộng” ThS Trần Băng Diệp làm chủ nhiệm Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ngƣời thân gia đình ngƣời bạn thân thiết bên cạnh, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Thơm iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng việt ADN Axit deoxyribonucleic ADN ARN Axit ribonucleic ARN CBD Cellulose binding domain Vùng liên kết cellulose CMC Carboxyl methyl cellulose Cơ chất CMC DNS Axit 3,5- dinitrosalicylic Thuốc thử DNS FPase Filter paper activity Hoạt độ thủy phân giấy lọc Gy Gray Gy HC Hydrolysis capacity Khả thủy phân kDa Kilo Dalton kDa LET Linear Energy Transfer Hệ số truyền lƣợng tuyến tính MT Mơi trƣờng Mơi trƣờng PDA Potato destrose agar Môi trƣờng khoai tây TB Tế bào Tế bào VSV Vi sinh vật Vi sinh vật iv Danh mục bảng Bảng 1.1 Giá trị LET MT nƣớc (nguồn: ICRU 1995) 17 Bảng 2.1 Các chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp cellulase 21 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng Trichoderma sau ngày nuôi cấy MT PDA 28 Bảng 3.2 Khả sinh cellulase chủng Trichoderma 32 Bảng 3.3 Giá trị HC chủng T koningiopsis VTCC 31435 sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 34 Bảng 3.4 Khả thủy phân cellulose khuẩn lạc T koningiopsis xử lý chiếu xạ liều khác 40 Bảng 3.5 Giá trị HC 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả sinh cellulase cao tạo đƣợc chiếu xạ 43 Bảng 3.6 Hoạt độ CMCase chủng sau chiếu xạ VTCC I-1 VTCC I-3 sau lần cấy truyền 50 v Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian loại cellulase Hình 1.2 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose phức hệ cellulosome Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc Trichoderma mơi trƣờng PDA 11 Hình 1.4 Bào tử Trichoderma 13 Hình 1.5 Tác dụng trực tiếp gián tiếp xạ ion hóa tới ADN 16 Hình 3.1 Vịng phân giải CMC số chủng Trichoderma sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 34 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng T koningiopsis VTCC 31435 MT PDA sau ngày nuôi cấy 35 Hình 3.3 Hình thái quan sinh sản chủng T koningiopsis VTCC 31435 36 Hình 3.4 Mối tƣơng quan số lƣợng bào tử T koningiopsis VTCC 31435 sống sót dịch bào tử liều xạ 37 Hình 3.5 Mối tƣơng quan số lƣợng lƣợng bào tử T koningiopsis VTCC 31435 sống sót liều xạ 38 Hình 3.6 Sàng lọc khuẩn lạc sinh cellulase cao từ dung dịch bào tử T koningiopsis VTCC 31435 chiếu xạ liều 700 1500 Gy 42 Hình 3.7 Vịng phân giải CMC số khuẩn lạc T koningiopsis sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 43 Hình 3.8 Hoạt độ CMCase FPase 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả sinh cellulase cao tạo đƣợc chiếu xạ 44 Hình 3.9 Chủng T koningiopsis 02 thể đột biến nuôi cấy MT PDA 28oC 48 vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 CELLULASE 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại .4 1.1.3 Cơ chế tác động cellulase 1.1.4 Nguồn thu nhận cellulase 1.1.4.1 Vi khuẩn 1.1.4.2 Xạ khuẩn 1.1.4.3 Nấm 1.1.5 Các ứng dụng nhóm cellulase 1.1.5.1 Ứng dụng công nghiệp 1.1.5.2 Ứng dụng xử lí mơi trường 1.1.5.3 Ứng dụng sản xuất phân bón .10 1.1.5.4 Ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học .10 1.1.5.5 Ứng dụng kĩ thuật di truyền 10 1.2 SƠ LƢỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE CỦA Trichoderma 10 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Trichoderma .10 1.2.2 Hình thức sinh sản Trichoderma 12 1.2.3 Khả thủy phân cellulose Trichoderma 13 1.3 BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VSV - TĂNG CƢỜNG KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA Trichoderma 14 1.3.1 Đột biến ngẫu nhiên tăng hoạt độ cellulase chi nấm Trichoderma .14 1.3.1 Bức xạ gamma 15 1.3.2 Ứng dụng xạ ion hóa gây tạo đột biến VSV 17 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT TƢ, THIẾT BỊ 21 2.1.1 Nguyên vật liệu 21 vii 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Bảo quản giữ giống .23 2.2.2 Xử lý chiếu xạ 23 2.2.2.1 Thu dung dịch bào tử nấm 23 2.2.2.2 Chiếu xạ dung dịch bào tử 23 2.2.2.3 Chiếu xạ thạch đĩa 24 2.2.3 Xác định số lƣợng tế bào 24 2.2.4 Định tính định lƣợng cellulase 24 2.2.4.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch .24 2.2.4.2 Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) .25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1.TUYỂN CHỌN CHỦNG Trichoderma CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN 28 3.1.1 Tốc độ phát triền hình thái khuẩn lạc chủng Trichoderma 28 3.1.2 Tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt tính cellulase cao ổn định 31 3.1.2.1 Khả sinh cellulase chủng Trichoderma .31 3.1.2.2 Một số đặc điểm chủng T koningiopsis VTCC 31435 .34 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG NẤM T koningiopsis VTCC 31435 36 3.2.1 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả sống sót chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 36 3.2.2 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả sinh cellulase chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 39 3.3 CÁC CHỦNG Trichoderma ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO 42 3.3.1 Sàng lọc khuẩn lạc Trichoderma kháng xạ có khả sinh cellulase cao 42 3.3.2 Hoạt độ cellulase khuẩn lạc tiềm 44 3.3.2.1 Hoạt độ CMCase 44 viii 3.3.2.2 Hoạt độ FPase 46 3.3.2.3 Hình thái chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao 47 3.3.2.3 Tính ổn định chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao .49 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC PHỤ LỤC 59 PHỤ LỤC 60 MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc nơng nghiệp có sản lƣợng lúa gạo đứng hàng đầu giới với hàng triệu rơm rạ để lại sau thu hoạch năm Đốt rơm rạ trở thành thói quen từ lâu nông dân nhiều nƣớc Đông Nam Á có Việt Nam Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đốt rơm rạ đồng ruộng làm chất dinh dƣỡng đất Đốt đồng nhiều lần lâu dài làm cho đất biến chất trở nên chai cứng, dẫn đến phát sinh nhiều bệnh dịch hại lúa [1] Ngồi ra, khói đốt rơm rạ gây nguy hại tới sức khỏe ô nhiễm bụi mịn - loại bụi độc hại chui sâu vào phổi gây bệnh hô hấp, chí ung thƣ [2] Khơng thế, việc đốt rơm rạ khiến Việt Nam phải đối mặt với tƣợng sƣơng mù quang hóa - loại ô nhiễm không khí đặc biệt tƣơng tác xạ tia cực tím mặt trời với khí thải từ động xe máy, khí thải cơng nghiệp, khói từ cháy rừng, đốt nƣơng rẫy, rơm rạ theo mùa vụ… [2] Để giải vấn đề này, đồng thời giảm đƣợc lƣợng phân bón sử dụng nơng nghiệp thủy phân rơm rạ đồng ruộng theo cách tự nhiên lựa chọn Việc bổ sung thêm lồi vi sinh vật (VSV) có khả thủy phân cellulose mạnh nhƣ số loài nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn… vào nguyên liệu chứa cellulose hay rơm rạ đồng sau thu hoạch giúp việc thủy phân đƣợc nhanh chóng, triệt để, mang lại hiệu lâu dài không gây ô nhiễm cho mơi trƣờng mà thuốc hóa học khơng thể sánh kịp Trichoderma spp loại nấm sợi diện gần nhƣ tất loại đất nhiều môi trƣờng sống khác Nhờ việc nuôi cấy dễ dàng, không tốn với khả tiết enzyme cellulase hoạt độ cao gấp vài trăm lần so với vi khuẩn [3], Trichoderma thu hút đƣợc quan tâm đặc biệt Cellulase ngoại bào từ số chủng Trichoderma thƣờng tồn dƣới dạng phức hệ enzyme (cellulosome) nhờ mà chúng thủy phân hiệu vùng vơ định hình vùng tinh thể cellulose [4] Các tia X, , tia notron có bƣớc sóng ngắn nên có khả ion hóa khả xuyên sâu cao Các tia phóng xạ gây đột biến cách làm đứt gãy ADN, thay đổi cấu trúc ADN hình thành hợp chất có hoạt tính khơng ổn định làm biến đổi ADN Bức xạ ion hóa tạo đột biến vị trí xác định nhờ hoạt tính VSV đƣợc cải thiện [5] Ngồi ra, gây đột biến xạ có nhiều ƣu điểm nhƣ phổ đột biến rộng, tần suất đột biến cao… làm tăng khả chọn đƣợc đột biến mong muốn rút ngắn thời gian sàng lọc [6] Để cải thiện khả sinh cellulase Trichoderma nhiều nghiên cứu gây đột biến chủng nấm xạ tia gamma đƣợc thực Trong nghiên cứu Shahbazi cộng sự, hoạt tính cellulase T reesei đƣợc cải thiện tăng 1,5-1,99 lần nhờ tác nhân đột biến tia gamma [4] Khả tiết cellulase T reesei tăng lên 1,8 lần xử lý chiếu xạ gamma liều kGy khảo sát Tamada cộng [7] Trên chất bã mía, chủng T viride đƣợc xử lý chiếu xạ liều 20 krad lần liên tiếp có hoạt tính sinh cellulase tăng 253,5% thay tăng 134,5% xử lý lần liều chiếu [8] Với mục đích sử dụng xạ gamma tạo chủng Trichoderma đột biến có khả sinh cellulase cao dùng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phân giải nhanh rơm rạ đồng ruộng, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao xử lý chiếu xạ” với nội dung sau: Tuyển chọn số chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao (từ chủng giống phịng thí nghiệm ngân hàng giống nƣớc); Đánh giá mối tƣơng quan liều chiếu xạ tới tỷ lệ sống sót chủng nấm Trichoderma tiềm dung dịch bào tử thạch đĩa; Khảo sát ảnh hƣởng liều chiếu xạ tới tỷ lệ đột biến sinh cellulase cao chủng nấm Trichoderma; Sàng lọc chủng Trichoderma sau chiếu xạ có hoạt tính sinh cellulase cao; Đánh giá tính ổn định chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao Trichoderma 3 CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 CELLULASE 1.1.1 Giới thiệu chung Cellulase phức hệ enzyme có khối lƣợng phân tử khoảng 30 đến 110 kDa [9], có khả phân cắt cellulose số loại polysaccharide tƣơng tự thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucoside thành oligosaccharide đƣờng đơn [3, 10] Cellulase có chất protein, đƣợc cấu tạo từ đơn vị axit amin đƣợc nối với liên kết peptide CO-NH- Ngồi ra, cấu trúc cịn có thành phần phụ khác tùy thuộc vào vị trí phân bố chức loại cellulase Cellulase từ nguồn khác có khối lƣợng phân tử, thành phần cấu tạo, cấu trúc trật tự xếp axit amin khác dẫn đến khác tính đặc hiệu chất, nhiệt độ pH tối ƣu Nhiệt độ pH ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác enzyme, enzyme có nhiệt độ pH thích hợp riêng Nhiệt độ pH tối ƣu cho hoạt động cellulase chủng Trichoderma IS-5 nghiên cứu Nascimento cộng 60oC 3,0 [11], giá trị chủng T reesei lần lƣợt 30oC 4,5 nghiên cứu Silas cộng [12] Cùng hƣớng nghiên cứu, Vân cộng đánh giá hoạt tính CMCase chủng T asperellum nhận thấy nhiệt độ pH tối thích lần lƣợt 55 oC 4,0, enzyme bền nhiệt độ thấp 10-30oC hoạt động vùng pH axit 3,5-4,5 [13] pH tối ƣu số chủng Trichoderma nghiên cứu Singh cộng nằm khoảng 5,5-7,5, nhiệt độ tối ƣu 25-30oC Môi trƣờng pH axit đƣợc chứng minh tối ƣu cho sinh trƣởng phát triển hầu hết chủng Trichoderma [14] Ngoài ra, hoạt độ CMCase đƣợc đánh giá xác mơi trƣờng pH axit, điều đƣợc chứng minh Singh cộng chủng số chủng Trichoderma điển hình [14] Trong giới hạn nhiệt độ chƣa làm biến tính enzyme, hoạt tính chúng tăng nhiệt độ tăng Tuy nhiên, nhiệt độ tăng giới hạn hoạt tính enzyme lại giảm Ngun nhân nhiệt độ tăng cao, số liên kết yếu phân tử protein enzyme bị đứt gãy làm thay đổi cấu trúc phân tử này, đặc biệt trung tâm hoạt động enzyme, từ ảnh hƣởng tới hoạt tính xúc tác chúng [12] Các ion kim loại đóng vai trị quan trọng việc định hình cấu trúc khơng gian phân tử enzyme nhân tố cần thiết trung tâm hoạt động enzyme Các ion kim loại Cu2+, Fe2+, EDTA làm tăng hoạt tính β-glucanase A niger từ 12% lên 52% Trong đó, ion kim loại khác nhƣ Mn2+, Co+, Ni2+ lại làm giảm hoạt tính endoglucanase nồng độ thấp Hiệu ứng đƣợc Tao cộng lý giải ion kim loại bám vào vị trí hoạt động enzyme (ví dụ nhóm thiol) làm enzyme giảm hoạt tính [15] 1.1.2 Phân loại Dựa vào tính đặc hiệu chất chế phân cắt, cellulase đƣợc chia thành loại: β-1,4- D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-1,4- D-glucan4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [10] β-1,4-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) có nhiều tên gọi khác nhƣ exoglucanase, exoβ-glucanase cellobiohydrolase, exocellobiohydrolase, exo-β-1,4- glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, cellobiohydrolase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase Chúng thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose β-1,4-D-Glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) có tên gọi khác nhƣ endoglucanase, endo-β-1,4-D-glucanase, endo-1,4-endoglucan hydrolase, carboxymethyl cellulase, celludextrinase, cellulase A, cellulosin AP, alka cellulase, cellulase A3, 9,5 cellulase, avicelase, pancellase SS Enzyme thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside mạch chuỗi cellulose, chenin β-D-glucan ngũ cốc β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tên gọi khác nhƣ βglucosidase, β-D-glucosidase, β-1,6glucosidase, βglucoside glucohydrolase, p-nitrophenyl, aryl-β-glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsion, elaterase, arbutinase, amygdanase, primeeverosidase, amygdalase, marase, sacinase Enzyme thủy phân gốc β-D-glucoside khơng khử đầu tận để giải phóng β-D-glucose Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian loại cellulase [10] Các loại enzyme phân bố rộng rãi tự nhiên, thu nhận từ nhiều nguồn nhƣ động vật, thực vật vi sinh vật (VSV) [16] Tuy nhiên enzyme từ động vật thực vật thƣờng khơng đƣợc sử dụng nhiều q trình thu nhận bảo quản phức tạp Nguồn thu cellulase phong phú hiệu từ VSV nhƣ Bacillus, Trichoderma, Aspergillus… 1.1.3 Cơ chế tác động cellulase Để trình thủy phân cellulose nhanh triệt để phải có tham gia ba loại enzyme cellulase (endoglucanases, exoglucanases βglucosidases) Nếu thiếu ba enzyme trên, q trình thủy phân khơng thể đến Từ nghiên cứu riêng rẽ loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp ba loại enzyme này, nhiều nhà khoa học đƣa kết luận chung loại enzyme thay phiên thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối glucose Có nhiều cách giải thích khác chế tác động cellulase, cách giải thích Singh cộng đƣợc nhiều ngƣời cơng nhận Theo tác giả, chế tác động hiệp đồng loại cellulase nhƣ sau: endoglucanases tác động vào vùng vơ định hình bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucoside tạo đầu tự Tiếp đó, exoglucanases cơng cắt đoạn cellobiose từ đầu mạch đƣợc tạo thành Kết tác động endoglucanases exoglucanases tạo celloligosaccharide mạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidases thủy phân tiếp tạo thành glucose [14] Hình 1.2 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose phức hệ cellulosome (A Cơ chế tác động riêng rẽ loại enzyme; B Cơ chế tác động hiệp đồng cellulosome [16] Cellulase từ số chủng Trichoderma thƣờng tồn dƣới dạng phức hệ đa enzyme (cellulosome) Các cellulosome phân cắt đồng thời triệt để vùng vơ định hình vùng tinh thể cellulose tạo sản phẩm cuối khoảng thời gian ngắn so với tác động riêng rẽ loại enzyme 1.1.4 Nguồn thu nhận cellulase Cellulase loại enzyme phân bố rộng rãi nhiều đối tƣợng, từ động vật, thực vật, tới VSV Ở động vật, cellulase thƣờng có dịch tiết dày bị, động vật thân mềm [19] Ở thực vật, cellulase tìm thấy hạt ngũ cốc nảy mầm nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen [9] Nhờ ƣu điểm bật tốc độ sinh trƣởng phát triển VSV mà nguồn enzyme chúng đƣợc quan tâm đặc biệt Mặt khác, VSV, việc giới tự động hóa q trình ni cấy, điều kiện ni cấy kiểm sốt mà khơng phụ thuộc vào yếu tố bên ngồi [20] nên hầu hết cellulase thƣơng mại có nguồn gốc VSV Khơng chủng VSV sinh cellulase đƣợc phân lập khả phân giải cellulose chúng đƣợc nghiên cứu đánh giá Các VSV phân giải cellulose chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ nhƣ bò, cừu, dê hay từ trùng nhƣ bọ cánh cứng, mối Ngồi chúng cịn đƣợc tìm phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải… [21] 1.1.4.1 Vi khuẩn Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm nhiều loài khác nhau, điển hình nhƣ Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens Các loài phần lớn thuộc nhóm VSV kị khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ ruột loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn [22] Các dịng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí sinh cellulase nhƣ Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus Geobacillus thƣờng đƣợc phân lập từ lịng đất Đối với dịng ƣa ấm pH nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase (CMCase) chúng hoạt động 5,5 55oC, với dịng ƣa nhiệt giá trị 5,0 75oC [23] 1.1.4.2 Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) vi khuẩn Gram (+) dạng sợi nhƣ nấm Chúng VSV hiếu khí có mặt khắp nơi tự nhiên ADN xạ khuẩn giàu G+C chiếm 57-75 %, chúng chiếm ƣu đất phèn khô [24] Streptomyces giống chủ đạo xạ khuẩn, VSV sinh cellulase đƣợc đặc biệt quan tâm Một số loài đáng ý thuộc giống nhƣ Streptomyces reticu, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces vidans [25] Xạ khuẩn Thermoactimnomyces đƣợc tìm thấy trầm tích đại dƣơng, hay Streptosporangium có quặng apatit loài thủy phân cellulose mạnh [26] 1.1.4.3 Nấm Nấm sinh vật có chế sinh hóa độc đáo phân giải chất tạo sản phẩm bậc hai đặc biệt, nhóm đƣợc nghiên cứu nhiều lĩnh vực thủy phân cellulose [27] Sản phẩm cellulase từ nấm thƣờng có hoạt lực cao dƣờng nhƣ khơng có dạng vật lý phức tạp nhƣ enzyme thu nhận từ vi khuẩn Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicilum pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus Rhizopus oryzae có vai trị quan trọng quy trình thủy phân cellulose nhiều môi trƣờng khác [27] Cellulase đƣợc sản xuất từ chủng nấm thƣờng có sản lƣợng cao so với vi khuẩn [13] Hầu hết sản phẩm cellulase thƣơng mại đƣợc sản xuất loài nấm thuộc chi Trichoderma Aspergillus Điều cho thấy nấm mốc nguồn VSV tiết enzyme mạnh nghiên cứu ứng dụng để sản xuất enzyme quy mô công nghiệp [8, 21] Việc phân lập, xác định tính chất lý - hóa loại cellulase từ nấm Trichoderma đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu chẳng hạn CMCase từ T reesei [4, 7, 17], từ T viride [3, 8] hay từ T asperellum [28] Ở Việt Nam, enzyme thủy phân cellulose hoạt tính cao thu đƣợc từ nhiều nguồn khác nhƣ loại nấm Trichoderma, A awamori, Penicilum hay từ loại xạ khuẩn… [1, 13] 1.1.5 Các ứng dụng nhóm cellulase 1.1.5.1 Ứng dụng cơng nghiệp Trong công nghiệp sản xuất giấy, loại enzyme đƣợc bổ sung khâu nghiền bột tẩy trắng Enzyme endoglucanase làm thay đổi nhẹ cấu hình sợi cellulose, tăng khả nghiền tiết kiệm khoảng 20% lƣợng cho q trình nghiền học Ngồi ra, ngƣời ta sử dụng endoglucanase hemicellulase để tẩy trắng mực in giấy thay sử dụng axit HCl Nhiều nghiên cứu chứng minh phƣơng pháp giữ cho sợi giấy khơng bị ăn mịn nhiều, khơng ảnh hƣởng đến môi trƣờng gây hại sức khỏe ngƣời thải môi trƣờng q trình sản xuất [28] Trong cơng nghiệp dệt, cellulase đƣợc sử dụng để giữ màu vải sáng, bền không bị sờn cũ Đối với vải jean, cellulase đƣợc sử dụng thay cho việc sử dụng đá bọt chà lên vải tạo vệt “stone washed” Độ đậm nhạt vệt “stone washed” đƣợc thay đổi cách tăng hay giảm lƣợng cellulase sử dụng giai đoạn giặt [29] Cellulase đƣợc bổ sung vào bột giặt chất tẩy rửa để làm mềm vải cotton; đồng thời, tẩy số vết bẩn khó giặt nhƣ vết mực, vết bẩn có nguồn gốc protein, vết loang dầu mỡ,… [30] Phế phụ phẩm nông lâm nghiệp có chất lignocellulose nguồn nguyên liệu dồi cho sản xuất ethanol sinh học cách phối trộn chúng với enzyme nhƣ: cellulase, hemicellulase,… có đƣợc từ q trình ni cấy chủng nấm mốc A niger, T reesei, A tereus… [31] Cellulase đƣợc ứng dụng nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm nhƣ công nghệ sản xuất bia, nƣớc hoa quả, agar agar, cà phê…Nghiên cứu Thuần cộng sự, sử dụng lên men vỏ cà phê T.viride A niger cho thấy hệ enzyme pectinase cellulase từ hai chủng nấm mốc có khả thủy phân cao pectin cellulose vỏ cà phê Nghiên cứu mở hƣớng ứng dụng lên men phế phụ phẩm chủng nấm giúp tận dụng nguồn phụ phế phẩm nông nghiệp, giảm khả ô nhiễm môi trƣờng chất thải gây nhƣ vỏ cà phê, hèm bia sau lên men bia, mật rỉ đƣờng, loại trấu nhà máy xay xát,… [32] 1.1.5.2 Ứng dụng xử lí mơi trường Các chất thải hữu chiếm khối lƣợng lớn tổng số chất thải đô thị khu công nghiệp; cellulose chiếm khoảng 50% chất thải hữu có nguồn gốc thực vật Các chất thải khó thủy phân điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, bổ sung VSV giàu cellulase vào phân giải rác rút ngắn thời gian thủy phân khoảng tháng so với khoảng tháng điều kiện tự nhiên [33] 10 VSV đƣợc sử dụng phổ biến xử lí mơi trƣờng ví dụ nhƣ xử lí nƣớc thải từ nhà máy giấy, xí nghiệp xay xát,… Các chế phẩm vi sinh có chứa VSV sinh cellulase đƣợc nghiên cứu, phát triển sản xuất đại trà nhƣ chế phẩm sinh học cellulase (Cơng ty Cổ phần Xử lí Mơi trƣờng Việt Nam), chế phẩm Emuniv (Công ty Cổ phần Vi sinh Ứng dụng)… [31] 1.1.5.3 Ứng dụng sản xuất phân bón Việc sử dụng chế phẩm enzyme cellulase xử lý rơm rạ tạo thành phân bón hữu đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi chuyển giao cơng nghệ cho nhiều địa phƣơng nhƣ; Hịa Bình, Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Thái Bình, Nam Ðịnh, Bạc Liêu [31] 1.1.5.4 Ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học Nhiên liệu sinh học loại nhiên liệu tái tạo, đƣợc tạo từ sản phẩm ngành nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm hay trình tái chế sản phẩm dầu ăn dầu thực vật Bioethanol biodiesel hai loại nhiên liệu sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi cho ngành giao thơng vận tải; đó, biodiesel ester axit béo ankyl, đƣợc tạo từ dầu mỡ thực vật, động vật mỡ tái chế, bioethanol đƣợc sản xuất nhờ cellulase thủy phân sinh khối cellulose 1.1.5.5 Ứng dụng kĩ thuật di truyền Việc sử dụng chế phẩm cellulase tinh khiết kĩ thuật di truyền có xu hƣớng ngày tăng thay phƣơng pháp học hóa học enzyme phá vỡ thành tế bào thực vật mà không gây tổn thƣơng tới quan bên tế bào, nhờ nguyên vẹn nhân tố di truyền đƣợc đảm bảo [34] 1.2 SƠ LƢỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE CỦA Trichoderma 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Trichoderma Trichoderma spp thuộc giới nấm, ngành Euascormycete, Hypocreales, họ Hyporealease Ascomycota, lớp ... hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao xử lý chiếu xạ? ?? với nội dung sau: Tuyển chọn số chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao (từ chủng. .. ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thơm NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CĨ HOẠT TÍNH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ... lọc chủng Trichoderma sau chiếu xạ có hoạt tính sinh cellulase cao; Đánh giá tính ổn định chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao Trichoderma 3 CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 CELLULASE