BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Phí Thị Cẩm Miện XÂY DỰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ NHẬN DẠNG VÀ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẢO TỒN LOÀI XÁO TAM PHÂN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phí Thị Cẩm Miện XÂY DỰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ NHẬN DẠNG VÀ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẢO TỒN LOÀI XÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phí Thị Cẩm Miện Xây dựng thị phân tử nhận dạng nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Chu Hoàng Hà Các kết thu luận án Hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phí Thị Cẩm Miện ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận án, xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Chu Hoàng Hà, người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt trình thực Luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Các Thầy Cô giáo, anh chị bạn đồng nghiệp Viện Công nghệ sinh học; Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, sinh hoạt chuyên môn thực Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn đến Học Viện Khoa học Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình dự án Việt Bỉ (AI Programe-VNUA, 2014-2019) hỗ trợ kinh phí cho đề tài “A study of phylogenetics and biopharmaceutical properties of the Vietnamese traditional medicinal plants belonging to the genus Paramignya for the development of hepatoprotective nutraceuticals” giai đoạn 2018-2019 để giúp tơi có nguồn kinh phí thực nội dung nghiên cứu Luận án Sau cùng, từ tận đáy lịng, tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành Luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn ! Phí Thị Cẩm Miện iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu .2 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học .2 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu 4.2 Phạm vi nghiên cứu Những đóng góp luận án CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Paramignya .5 1.1.1 Đặc điểm sinh học chi Paramignya 1.1.2 Một số thành phần hóa học hoạtt tính sinh học chi Paramignya 1.2 Cây Xáo tam phân (P trimera), phân loại, đặc điểm sinh học hoạt chất sinh học 11 1.2.1 Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân 11 1.2.2 Đặc điểm thực vật học Xáo tam phân Việt Nam 11 1.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh dược học Xáo tam phân .16 1.3 Các phương pháp nghiên cứu phân loại thực vật 20 1.3.1 Các thị đặc điểm thực vật 20 iv 1.3.2 DNA barcode ứng dụng DNA barcode để nhận dạng phân biệt loài 25 1.3.3 Ứng dụng thị phân tử xác định quan hệ tiến hóa 31 1.3.4 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể thực vật 34 1.3.5 Các nghiên cứu hệ thống học, DNA barcodes loài thuộc chi Paramignya loài P trimera 36 1.4 Nhân giống loài Xáo tam phân 37 1.4.2 Nhân giống Xáo tam phân tự nhiên 49 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.1 Vật liệu nghiên cứu 52 2.1.1 Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại quan hệ phát sinh mẫu thu thập 52 2.1.2 Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân 52 2.1.3 Các thị phân tử DNA 53 2.2 Nội dung nghiên cứu 57 2.3 Phương pháp nghiên cứu 57 2.3.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu xây dựng đồ phân bố 57 2.3.2 Phương pháp mơ tả hình thái 58 2.3.3 Tách chiết tinh DNA tổng số 58 2.3.4 PCR nhân vùng microsatellite thị SSR .58 2.3.5 PCR nhân vùng thị phân tử 59 2.3.6 Giải trình tự đăng ký trình tự 59 2.3.7 Phương pháp phân tích liệu trình tự 60 2.4 Phương pháp nhân giống in vitro Xáo tam phân .66 2.4.1 Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân 66 2.4.2 Ảnh hưởng môi trường tới khả sinh trưởng Xáo tam phân điều kiện in vitro 67 2.4.3 Nghiên cứu khả tạo mô sẹo Xáo tam phân 67 2.4.4 Ảnh hưởng nhóm cytokinins auxin tới khả nhân nhanh Xáo tam phân 68 2.4.5 Ảnh hưởng nhóm auxin tới khả hình thành rễ Xáo tam phân 68 2.4.6 Phương pháp bố trí xử lý thí nghiệm 69 v CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 70 3.1 Khảo sát phân bố đặc điểm hình thái mẫu thuộc chi Paramignya Khánh Hòa Lâm Đồng 70 3.1.1 Khảo sát thành phần loài phân bố mẫu nghiên cứu 70 3.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu thuộc chi Paramignya 75 3.2 Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng lồi thơng qua thị barcode .81 3.3 Xác định đa dạng di truyền mẫu Xáo tam phân dựa vào thị SSR .81 3.4 Nghiên cứu thị DNA nhận dạng loài 86 3.4.1 PCR xác định trình tự vùng thị DNA .86 3.4.2 Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST 88 3.5 Xây dựng thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P trimera 95 3.5.1 Khảo sát liệu DNA mã vạch loài thuộc chi Paramignya .95 3.5.2 Xây dựng sở liệu trình tự thuộc chi Paramignya 95 3.5.3 So sánh trình tự để nhận dạng phân biệt Xáo tam phân .97 3.5.4 Xây dựng tiến hóa lồi 97 3.5.5 Xây dựng thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân 103 3.5.6 Đánh giá thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch 108 3.6 Nhân giống in vitro Xáo tam phân .112 3.6.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân 112 3.6.2 Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp với nhân nhanh in vitro Xáo tam phân .115 3.6.3 Nghiên cứu khả tạo mô sẹo Xáo tam phân 116 3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm cytokinins tới khả nhân nhanh Xáo tam phân .119 KẾT LUẬN .129 KIẾN NGHỊ 131 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .133 PHỤ LỤC 141 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABDG : Automatic Barcode Gap Discovery AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BAP : 6-benzylaminopurine benzyladenine BI : Bayesia interference CSDL : Cơ sở liệu CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Acid indoleacetic IBA : 3-Indolebutyric acid ITS : Internal transcribed spacer ITS : Internal transcribed spacer KC : Knudson C medium LSD : Least significant differential LSD0.05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0.05 matK : Maturase K MS : Murashige & Skoog medium MSA : Multiple sequence alignment NCBI : National Center for Biotechnology Information P trimera : Paramignya trimera PCR : Polemerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic rbcL : Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSR : Simple sequence Repeat STS : Silver thiosulfate TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980 α - NAA : Axit α-naphtyl axetic 2.4 D : 2.4-Dichlorophenoxyacetic vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp thị phân tử sử dụng genome lục lạp .30 Bảng 2.1 Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh 52 Bảng 2.2 Trình tự mồi SSR sử dụng 53 Bảng 2.3 Trình tự mồi ITS, matK rbcL 56 Bảng 3.1 Tổng hợp vị trí thu thập mẫu Khánh Hòa Lâm Đồng 70 Bảng 3.2 Số allen hệ số PIC 31 cặp mồi SSR 83 Bảng 3.3 Tổng hợp thơng tin DNA barcode lồi thuộc chi Paramignya hệ thống BOLD .95 Bảng 3.4 Tổng hợp liệu trình tự lồi thuộc chi Paramignya .96 Bảng 3.5 Tổng hợp vùng trình tự ITS, matK rbcL trình tự 107 Bảng 3.6 Khoảng cách loài loài liệu trình tự .108 Bảng 3.7 Ảnh hưởng dung dịch nano bạc tới khả tạo mẫu Xáo tam phân 112 Bảng 3.8 Ảnh hưởng dung dịch Johnson tới khả tạo mẫu Xáo tam phân 113 Bảng 3.9 Ảnh hưởng kết hợp dung dịch Johnson nano bạc tới khả khử trùng tạo mẫu Xáo tam phân 114 Bảng 3.10 Ảnh hưởng môi trường tới sinh trưởng, nhân nhanh Xáo tam phân 116 Bảng 3.11 Ảnh hưởng TDZ, IBA 2.4 D tới khả tạo mô sẹo Xáo tam phân 117 Bảng 3.12 Ảnh hưởng phối hợp TDZ, IBA 2.4D tới phát sinh mô sẹo IBA Xáo tam phân 118 Bảng 3.13 Ảnh hưởng BA tới khả phát sinh chồi Xáo tam phân 119 Bảng 3.14 Ảnh hưởng TDZ tới phát sinh chồi Xáo tam phân 120 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhóm kết hợp BA TDZ tới khả phát sinh chồi Xáo tam phân .121 Bảng 3.16 Ảnh hưởng kết hợp BA α-NAA tới phát sinh chồi Xáo tam phân 122 Bảng 3.17 Ảnh hưởng kết hợp BA IBA tới phát sinh chồi Xáo tam phân 123 viii Bảng 3.18 Ảnh hưởng IBA α-NAA tới khả hình thành rễ Xáo tam phân in vitro 124 Bảng 3.19 Ảnh hưởng số loại giá thể tới khả sống in vitro 125 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hợp chất coumarin từ chi Paramignya .9 Hình 1.2 Hình ảnh Xáo tam phân trồng khu thí nghiệm Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam .12 Hình 1.3 Hình ảnh Xáo tam phân Khánh Hòa, Việt Nam 13 Hình 1.4 Hình ảnh thân, rễ Xáo tam phân Khánh Hịa, Việt Nam 14 Hình 1.5 Hình ảnh cụm hoa Xáo tam phân xã Ninh Vân, Khánh Hòa 14 Hình 1.6 Cấu tạo hình thái lá, hoa Xáo tam phân 15 Hình 1.7 Hình ảnh Xáo tam phân thu Khánh Hòa, Việt Nam .16 Hình 1.8 Các phương pháp xây dựng tiến hóa 33 Hình 2.1a Sơ đồ xây dựng thị DNA đặc thù 61 Hình 2.1b Sơ đồ xây dựng CSDL DNA barcode 62 Hình 2.2 Quy trình xác định thị phân tử DNA barcode 63 Hình 3.1 Bản đồ địa bàn nghiên cứu vị trí thu thập mẫu tình trạng phân bố loài P trimera số loài khác thuộc chi Paramignya .73 Hình 3.2 Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu phân bố loài Xáo tam phân Paramignya trimera 74 Hình 3.3 Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu phân bố loài 75 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái Paramignya trimera (Oliv.) Burkill .76 Hình 3.5 Đa dạng hình thái Xáo tam phân P trimera (Oliv.) Burkill 77 Hình 3.6 Đặc điểm cành P armata var andamanica King thu thập Khánh Hòa, Việt Nam 78 Hình 3.7 Đặc điểm hình thái P monophylla (Lour.) Tanaka 79 Hình 3.8 Đặc điểm hình thái thân, P scandens .80 Hình 3.9 Đặc điểm P rectispinosa thu thập Cát Tiên, Lâm Đồng 80 Hình 3.10 DNA tổng số mẫu P.trimera loài thuộc chi Paramignya 81 x Hình 3.11 Kết phân tích đa hình mẫu Paramignya thị SSR số cặp mồi điển hình 82 Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền lồi thuộc chi Paramignya 84 Hình 3.13 Ma trận khoảng cách mẫu phân tích .85 Hình 3.14 Kết nhân vùng ITS, matK rbcL mẫu Paramignya 87 Hình 3.15 Kết Megablast sử dụng trình tự truy vấn ITS P trimera X1 88 Hình 3.16 Cây quan hệ tiến hóa P trimera với lồi họ hàng 90 Hình 3.17 Kết Megablast sử dụng trình tự truy vấn matK P trimera X1 91 Hình 3.18 Cây quan hệ tiến hóa P trimera với lồi họ hàng phân tích trình tự matK 92 Hình 3.19 Kết Megablast với trình tự truy vấn rbcL P trimera X1 93 Hình 3.20 Cây quan hệ tiến hóa P trimera với lồi họ hàng phân tích trình tự rbcL 94 Hình 3.21a Mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng thuật tốn ML chương trình MegaX 98 Hình 3.21b Mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng chương trình BEAST .99 Hình 3.22a Mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng thuật tốn ML chương trình MegaX 100 Hình 3.22b Mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng chương trình BEAST .101 Hình 3.23a Mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình MegaX 102 Hình 3.23b Mối quan hệ tiến hóa lồi thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình BEAST 103 Hình 3.24 Phân tích vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P trimera chuỗi trình tự ITS 105 xi Hình 3.25 Phân tích vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P trimera chuỗi trình tự matK 106 Hình 3.26 Phân tích vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P trimera chuỗi trình tự rbcL 107 Hình 3.27 Biểu đồ khoảng cách Histogram ranked pairwise trình tự chương trình ABGD 109 Hình 3.28 Hình ảnh mẫu Xáo tam phân sau khử trùng 113 Hình 3.29 Kết khử trùng dung dịch nano bạc Johnson 2,5% tới khả tạo mẫu Xáo tam phân 115 Hình 3.30 Ảnh hưởng môi trường tới sinh trưởng nhân nhanh in vitro Xáo tam phân sau tuần 116 Hình 3.31 Mơ sẹo hình thành mơi trường khác sau 12 tuần nuôi cấy .118 Hình 3.32 Ảnh hưởng BA TDZ tới khả phát sinh chồi từ đoạn thân Xáo tam phân sau tuần nuôi cấy 121 Hình 3.33 Ảnh hưởng BA TDZ tới khả phát sinh chồi từ hạt Xáo tam phân sau tuần nuôi cấy 122 Hình 3.34 Ảnh hưởng BA IBA tới khả phát sinh chồi từ đoạn thân in vitro sau tuần nuôi cấy 124 Hình 3.35 Ảnh hưởng IBA tới khả hình thành rễ Xáo tam phân in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 125 Hình 3.36 Hình ảnh in vitro Xáo tam phân sau tuần giá thể đất : cát vàng 126 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Lồi Xáo tam phân có tên khoa học Paramignya trimera (oliv.) Guill., thuộc họ Cam (Rutaceae), phân bố chủ yếu tỉnh Khánh Hòa tỉnh Ninh Thuận Theo tài liệu cơng bố, Việt Nam có lồi thuộc chi Paramignya, P trimera thân gỗ nhỏ, dạng dây trườn, mọc hoang, phân bố vùng núi đá có độ cao 200 m, nơi có khí hậu khô cằn, lớp đất mặt mỏng Xáo tam phân sử dụng nhiều đông y dân gian loài thảo dược để chữa nhiều bệnh gan, huyết áp ung thư Gần nhiều nghiên cứu cho thấy rễ Xáo tam phân chứa nhiều alkaloid, saponin, courmarin triterpenoid có tác dụng ức chế viêm gan cấp, gây độc số dòng tế bào ung thư Đặc biệt, dịch chiết Xáo tam phân lại an toàn cho sử dụng thời gian dài Rễ Xáo tam phân có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, giá rễ Xáo tam phân cao, dẫn đến việc khai thác gần cạn kiệt tự nhiên Bên cạnh đó, khả giao phấn tần suất đột biến ngẫu nhiên loài cao, kết hợp với tượng sinh sản vô phối đa bội nên kiểu hình Xáo tam phân tự nhiên đa dạng, mang nhiều đặc điểm giống với loài khác chi Paramignya Sự tồn dạng lai có kiểu hình tương tự dẫn đến khó phân biệt dễ nhầm lẫn dựa vào hình thái Cũng tồn nhiều kiểu dạng lai xa lồi gần gũi thuộc chi Paramignya nên khó nhận biết cách xác để lưu giữ, bảo tồn nhân giống lồi này, nhằm mục đích phát triển khu vực trồng Xáo tam phân làm dược liệu Do đó, u cầu xác định xác lồi Xáo tam phân cần thiết, tạo sở khoa học để nhận diện lồi xác, đồng thời bảo tồn nguồn gen nhân giống Xáo tam phân Xuất phát từ vấn đề khoa học thực tiễn, nghiên cứu “Xây dựng thị phân tử nhận dạng nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)” hướng tới mục tiêu xây dựng thị phân tử để nhận dạng xác lồi Xáo tam phân nhân giống nhằm bảo tồn khai thác hiệu giá trị dược liệu loài 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định thị phân tử DNA (mã vạch DNA) phục vụ định danh loài Xáo tam phân (P trimera); Xây dựng quy trình nhân giống in vitro loài Xáo tam phân 2.2 Mục tiêu cụ thể - Đánh giá phân bố đặc điểm hình thái, xây dựng đồ phân bố quần thể Xáo tam phân số loài thuộc chi Paramignya - Xác định mối quan hệ di truyền quần thể Xáo tam phân thị SSR - Xác định thị phân tử DNA để nhận dạng loài Xáo tam phân P Trimera - Xây dựng quy trình nhân giống Xáo tam phân P trimera in vitro thu thập Khánh Hòa Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học - Xây dựng đồ phân bố tự nhiên số quần thể Xáo tam phân số loài thuộc chi Paramignya địa bàn tỉnh Khánh Hòa Lâm Đồng - Cung cấp thêm liệu trình tự nucleotide đoạn gen ITS, matK rbcL loài Xáo tam phân số loài thuộc chi Paramignya đăng ký vào ngân hàng GenBank (NCBI), qua góp phần tạo CSDL để xây dựng DNA mã vạch nhận dạng phân biệt loài Xáo tam phân với lồi có quan hệ gần gũi chi Paramignya họ cam (Rutaceae) - Kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm hình thái, đa dạng kiểu gen kiểu hình quần thể Xáo tam phân tự nhiên tỉnh Khánh Hòa Lâm Đồng - Xác định mối quan hệ di truyền loài Xáo tam phân với số loài thuộc chi Paramignya, sở xác định thị phân tử cho phép nhận dạng loài thuộc chi Paramignya, đồng thời nhận dạng loài Xáo tam phân thị matK Cung cấp thông tin khoa học nhân giống loài Xáo tam phân in vitro 3 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Thông qua việc xây dựng đồ phân bố tự nhiên loài Xáo tam phân giúp cho việc quy hoạch, định hướng, phát triển nguồn gen loài Xáo tam phân hiệu - Từ liệu mối quan hệ di truyền thị DNA barcode cho nhận dạng loài Xáo tam phân sở cho công tác chọn tạo giống loài Xáo tam phân - Đã xây dựng thành cơng quy trình nhân nhanh giống in vitro cho lồi Xáo tam phân góp phần sản xuất số lượng lớn giống Xáo tam phân chất lượng tốt phục vụ phát triển vùng dược liệu Xáo tam phân tập trung Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu - Loài Xáo tam phân thu thập xã Ninh Vân, Ninh Hịa Diên Khánh thuộc tỉnh Khánh Hịa; lồi Xáo tam phân chuẩn cung cấp viện dược liệu phối hợp trồng bảo tồn công ty TNHH Bá Ninh số loài thuộc chi Paramignya thu thập tỉnh Khánh Hòa Lâm Đồng - Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định DNA mã vạch loài thuộc chi Paramignya, đối tượng nghiên cứu tập hợp cá thể chi Paramignya phân bố tự nhiên Khánh Hòa Lâm Đồng, Việt Nam - Trong nghiên cứu nhân nhanh in vitro Xáo tam phân, đối tượng nghiên cứu loài Xáo tam phân Viện dược liệu công ty TNHH Bá Ninh, Khánh Hòa cung cấp 4.2 Phạm vi nghiên cứu Phạm vi chuyên môn: Phạm vi nghiên cứu chuyên môn luận án là: (1) Thu thập quần thể Xáo tam phân Khánh Hòa (Xã Ninh Hòa, Ninh Vân, Diên Khánh, Khánh Hịa số lồi thuộc chi Paramignya tỉnh Lâm Đồng); (2) Tiến hành phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quần thể P trimera số loài thuộc chi Paramignya (SSR); (3) Xây dựng thị DNA barcode để nhận dạng loài Xáo tam phân có giá trị dược liệu; (4) Xây dựng quy trình nhân giống in vitro phục vụ cơng tác bảo tồn lồi Xáo tam phân Khánh Hịa 4 Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu, điều tra thu thập mẫu thực địa tiến hành vùng có phân bố lồi thuộc chi Paramignya Khánh Hòa, Lâm Đồng, Việt Nam Nghiên cứu thị phân tử, xây dựng nhận dạng loài Xáo tam phân thực phịng thí nghiệm cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân thực Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành từ tháng 01/12/2017 đến hết tháng 11/2020 Những đóng góp luận án - Bổ sung liệu khoa học để nhận dạng đặc điểm hình thái phân loại lồi Xáo tam phân địa bàn tỉnh Khánh Hòa - Đã xây dựng CSDL trình tự DNA cho lồi Xáo tam phân đăng ký ngân hàng gen giới, đồng thời bước đầu phát triển thị DNA làm tảng để phát triển DNA mã vạch Góp phần tạo sở khoa học để nhận dạng bảo tồn nguồn gen loài Xáo tam phân P trimera - Xây dựng thành cơng quy trình nhân nhanh in vitro Xáo tam phân 5 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Paramignya 1.1.1 Đặc điểm sinh học chi Paramignya 1.1.1.1 Sự phân bố thành phần loài chi Paramignya giới Việt Nam Chi Paramignya thuộc họ Cam (Rutaceae) gồm khoảng 15 loài thân gỗ nhỏ, dạng dây leo có nguồn gốc từ phía Nam, đơng nam châu Á miền bắc nước Úc Theo phân loại thực vật học sở liệu thực vật học (theplantlist.org), chi Paramignya bao gồm 30 loài Trong số 30 lồi, có hai lồi chấp nhận tên khoa học P confertifolia Swingle P rectispinosa W G.Craib Cho đến nay, có bốn lồi nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh dược học (P monophylla, P griffithii, P trimera, P scandens), 22 loài khác chưa chấp nhận tên khoa học sở liệu Theo liệu thực vật học nhiều tổ chức nghiên cứu nhà thực vật vườn Thực vật Hoàng gia Kew (Anh Quốc) vườn Thực vật Missouri (Hoa Kỳ), tính đến năm 2013 có 30 lồi cho thuộc chi Paramignya đề cập đến tài liệu khác [1] gồm: Paramignya andamanica Tanaka Paramignya angulata Kurz Paramignya armata Oliv Paramignya beddomei Tanaka Paramignya blumei Hassk Paramignya brassii C.T.White Paramignya citrifolia Hook.F Paramignya citrifolia Oliv Paramignya confertifolia Swingle Paramignya cuspidata (Ridl.) Burkill Paramignya dubia Koord & Valeton ex Moll & Janssonius Paramignya glabra Tanaka Paramignya grandiflora Oliv Paramignya griffithii Hook.F 6 Paramignya hainanensis Swingle Paramignya hispida Pierre ex Guillaumin Paramignya littoralis Miq Paramignya lobata Burkill Paramignya longipedunculata Merr Paramignya longispina Hook.F Paramignya micrantha Kurz Paramignya mindanaensis Merr Paramignya missionis (Oliv.) Burkill Paramignya monophylla Wight Paramignya petelotii Guillaumin Paramignya rectispinosa Craib Paramignya ridleyi Burkill Paramignya scandens Craib Paramignya surasiana Craib Paramignya trimera (Oliv.) Burkill Thực tế, tình trạng phân loại chi Paramignya chưa thống nhà phân loại học thực vật Gần đây, Zhang D X (2008) cho chi Paramignya có khoảng 15 lồi phân bố Nam Á, Đơng Nam Á miền Bắc nước Úc [1] 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái chung lồi thuộc chi Paramignya Việt Nam Ở Việt Nam, theo tài liệu cơng bố cho thấy có lồi thuộc chi Paramignya [2], bao gồm: - Paramignya armata Oliv var andamanica King, 1874 [3] - Cựa gà, Quýt gai Mọc Đà Nẵng, Khánh Hòa trồng Nam Đây loại leo, cao khoảng - m, có nhánh vàng nhạt, có gai ngắn nách, cong phía sau, dài - 12 mm Lá dạng màng, dai, ngun, hình bầu dục hay thn trịn gốc, tận mũi nhọn hình tam giác nhọn, nhẵn, dài 7,5 - 12,5 cm, rộng 3,5 - 4,5 cm, có cuống ngắn Hoa xếp - hoa nách Quả đen hay vàng, hình cầu, mang cuống dài - 3,5 cm có thùy Mọc thành bụi gỗ leo, cao - 10 m Ra hoa tháng 8, ăn Lá đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho [4] 7 - Paramignya griffithii Hook F, 1875 [5] - Xáo Griffith, phân bố Lâm Đồng, Khánh Hòa Là dạng tiểu mộc leo, có gai cong, cành mảnh Lá có phiến bầu dục kích thước x cm, rộng nửa trên, mỏng Hai mặt nâu nhạt lúc khô, gân phụ có - cặp Cuống dài từ - 10 mm Hoa có từ - hoa nách lá, dài mm, cọng mảnh; đài 10 hình đĩa, tiểu nhụy - 10, rời ngắn bao phấn; nỗn sào có lơng Trái xanh tròn to cm, thịt nhớt - Paramignya hispida Pierre ex Guillaum [5, 6] - Cựa gà nhám, phân bố Nghệ An, Quảng Trị, Đồng Nai Là dạng tiểu mộc leo, có gai cong xuống, dài khoảng cm; nhánh mảnh, lúc non có lơng Lá có phiến to dài x rộng từ - 10 x cm, xoan trịn dài, đáy hình tim; gân phụ khơng rõ, tuyến nhỏ, nhiều; cuống có lơng, dài cm Hoa đơn, cọng dài - mm; đài 5, có lơng mặt ngồi; cánh hoa cao cm; tiểu nhụy 10, rời nhau; đĩa mật làm thành thư đài; nỗn sào trịn, khơng lơng, buồng 5, noãn [7] - Paramignya monophylla Wight, 1840 [3] - Xáo hoa, phân bố Hà Nội (Ba Vì cũ) Là tiểu mộc leo, có gai cong Lá thon, to, có kích thước dài x rộng từ - x 2,5 cm, đầu thon, đáy tù, gân mảnh, có tuyến thấy rõ mặt dưới; cuống dài cm, hoa - nách lá, cọng ngắn; đài mm, cánh hoa dài 13 mm, bầu dục hẹp [5] - Paramignya petelotii Guillaum, 1944 [3] - Xáo petelot, mọc Hịa Bình (Mai Châu) Là dạng tiểu mộc leo; cành già xám, bì nhỏ, nhiều, màu trắng; gai nhỏ, cong Lá có phiến bầu dục trịn dài, to với kích thước 10 x cm, mỏng, lục tươi lúc khô, gân phụ mảnh, vào 10 cặp, cuống - 10 mm Hoa nách lá, dài 15 mm; đài cao 5-6mm; cánh hoa hẹp; tiểu nhụy 10, dài cánh hoa; dĩa mật; nỗn sào có lơng, buồng [5] - Paramignya scandens (Griff.) Craib, 1926 [3] - Xáo leo, phân bố Hà Nam, Quảng Trị, Lâm Đồng Là dạng tiểu mộc leo; cánh non có lơng mịn, nâu; gai nhỏ cong, có lơng Lá có phiến bầu dục, vào x 3,5 cm, đầu tà hay có ngắn, đáy tròn, gân phụ từ - 11 cặp; cuống dài từ - mm, có lơng mịn Hoa thường nách lá, cọng cm; dài nhỏ, rìa lơng; cánh hoa dài mm; tiểu nhụy 10, nhau, chi có lơng; nỗn sào có lơng Trái không lông, xoan, dài đến 1,5 cm [5] - Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum., 1946 [3] - Xáo tam phân, mọc núi Gị vấp Là dạng có gai dài, cong xuống; cành khơng có lơng Lá có phiến ... khoa học thực tiễn, nghiên cứu ? ?Xây dựng thị phân tử nhận dạng nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)? ?? hướng tới mục tiêu xây dựng thị phân tử để nhận dạng xác lồi Xáo. .. sánh trình tự để nhận dạng phân biệt Xáo tam phân .97 3.5.4 Xây dựng tiến hóa loài 97 3.5.5 Xây dựng thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân 103 3.5.6 Đánh giá thị phân tử dựa vào phân. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phí Thị Cẩm Miện Xây dựng thị phân tử nhận dạng nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam