Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định trình tự bộ gene thực khuẩn thể tấn công đặc hiệu vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới

HCM C ӜNG HÒA XÃ HӜI CHӪ 1*+Ƭ$9,ӊT NAM 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA Ĉӝc lұp-Tӵ do-Hҥnh phúc ;iFÿӏnh trình tӵ bӝ gene thӵc khuҭn thӇ tҩQF{QJÿһc hiӋu vi khuҭn Aeromonas hydrophila bҵng kӻ thuұ

ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP HCM

75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA

7Ӯ48$1*9,1+

;È&ĈӎNH TRÌNH TӴ BӜ GENE THӴC KHUҬN THӆ

Aeromonas hydrophila B ҴNG KӺ THUҰT

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60420201

LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ

THÀNH PHӔ HӖ CHÍ MINH, tháng 09 QăP

&{QJWUuQKÿѭӧc hoàn thành tҥi: 7UѭӡQJĈҥi Hӑc Bách Khoa – Ĉ+4*-HCM

Cán bӝ Kѭӟng dүn khoa hӑc 1: TS Phan Thӏ HuyӅn

Cán bӝ Kѭӟng dүn khoa hӑc 2: TS Hoàng Anh Hoàng

ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP HCM C ӜNG HÒA XÃ HӜI CHӪ 1*+Ƭ$9,ӊT NAM 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA Ĉӝc lұp-Tӵ do-Hҥnh phúc

;iFÿӏnh trình tӵ bӝ gene thӵc khuҭn thӇ tҩQF{QJÿһc hiӋu vi khuҭn Aeromonas

hydrophila bҵng kӻ thuұt giҧi trình tӵ gene thӃ hӋ mӟi

II.NHI ӊM VӨ VÀ NӜI DUNG:

ĈӅ tài gӗm các nӝi dung sau:

III.NGÀY GIAO NHI ӊM VӨ: 19/08/2019

IV.NGÀY HOÀN THÀNH NHI ӊM VӨ: 24/07/2020

V.CÁN B Ӝ +ѬӞNG DҮN:

1 TS Phan Thӏ HuyӅn

2 TS Hoàng Anh Hoàng

CÁN B Ӝ +ѬӞNG DҮN

TS Phan Thӏ HuyӅn TS Hoàng Anh Hoàng

CH Ӫ NHIӊM BӜ 0Ð1Ĉ¬27Ҥ275ѬӢNG KHOA KӺ THUҰT HÓA HӐC

PGS.TS Lê Thӏ Thӫy Tiên *6763KDQ7KDQK6ѫQ1DP

i

L ӠI CҦ0Ѫ1

Em xin gӱi lӡi cҧPѫQFKkQWKjQKQKҩWÿӃn:

TiӃQVƭ3KDQ7Kӏ HuyӅQÿmFKRHPFѫKӝi, nhӳQJWUDRÿәLKѭӟng dүn nhiӋt tình Luôn tҥo không khí gҫQJNJLYjÿӝng viên em nhӳng lúc cҫn thiӃt nhҩt trong suӕt quá trình thӵc hiӋQÿӅ tài

TiӃQVƭ+RjQJ$QK+RjQJÿmWҥo mӑLÿLӅu kiӋn tӕt nhҩt cùng vӟi sӵ Kѭӟng dүn tұn tình, chi tiӃt giúp em hoàn thành luұQYăQQj\

Quý Thҫ\&{WUѭӡQJĈҥi hӑc Bách Khoa Thành phӕ Hӗ &Kt0LQKÿmWUX\Ӆn ÿҥt kiӃn thӭc cho em trong suӕt thӡi gian hӑc tұp tҥLWUѭӡng

CҧPѫQFiFFKӏ, các em sinh viên tҥLSKzQJ%ÿһc biӋt là chӏ Trҫn Thӏ 7KDQK;XkQÿmOX{QErQFҥnh, chia sҿ YjJL~Sÿӥ tôi nhӳng lúc khó khăn

*LDÿuQKYjQKӳQJQJѭӡi bҥn thân thiӃWÿmOX{QTXDQWkm, lҳng nghe, chia sҿ YjWLQWѭӣng

Xin chân thành cҧPѫQ

Thành phӕ Hӗ Chí Minh, 08/2020

Tӯ Quang Vinh

ii

7Ï07Ҳ7

Thӵc khuҭn thӇ PVN02 lây nhiӉm vi khuҭn Aeromonas hydrophila ÿmÿѭӧc phân WtFKFiFÿһFÿLӇm vi sinh và giҧi trình tӵ bӝ gene Thӵc khuҭn thӇ có hoҥWÿӝng ly giҧi cao vӟi thӡi gian xâm nhiӉm và hӋ sӕ QKkQWѭѫQJӭng là khoҧng 20 phút và 105 PFU/tӃ bào Quan sát thӵc khuҭn thӇ PVN02 bҵng kính hiӇQYLÿLӋn tӱ cho thҩy PVN02 thuӝc hӑ Myoviridae Bӝ gene cӫa PVN02 là DNA sӧi kép vӟi chiӅu dài 51.668 bp, hàm GC là 52% Trong sӕ 64 gene, 13 gene có thӇ ÿѭӧc dӵ ÿRiQÿӇ mã hóa protein vӟi chӭFQăQJGӵ ÿRiQ.K{QJFyJHQHÿӝc lӵc hoһc kháng kháng sinh ÿѭӧc tìm thҩy trong bӝ gene, cho thҩy PVN02 có tiӅPQăQJOjPӝt tác nhân kiӇm soát vi khuҭn Aeromonas hydrophila Thӵc khuҭn thӇ ÿѭӧc phân loҥi sӱ dөng cây

phát sinh loài và mҥQJOѭӟi chia sҿ gene Thӵc khuҭn thӇ 391Ojÿҥi diӋQÿҫu tiên cӫa mӝt loài mӟi trong mӝW FKL FKѭD ÿѭӧF [iF ÿӏQK WUѭӟF ÿy Whuӝc hӑ

Myoviridae Nghiên cӭu này xác nhұn rҵng PVN02 là mӝt thӵc khuҭn thӇ ly giҧi

mӟi và có thӇ phөc vө QKѭPӝt tác nhân kiӇm soát vi khuҭn Aeromonas hydrophila tiӅPQăQJ

iii

ABSTRACT

The bacteriophage PVN02 infecting Aeromonas hydrophila was morphologically

characterized and its whole genome was sequenced The phage had high lytic activity with its latent period and burst size were approximately 20 min and 105 CFU/cell, respectively Phage observation using transmission electron microscope

indicated that PVN02 belonged to Myoviridae family The genome of PVN02 was

a double-stranded DNA molecule, which was 51,668 bp in length, and its GC content was of 52% Among its 64 genes, 13 of them could be predicted to encode proteins with 8 predicted protein No virulence or antibiotic resistance genes were found in the genome, suggesting that it could be used as a useful biocontrol agent Classification of the phage using average nucleotide identity, phylogenetic analysis and gene-sharing networks was carried out Phage PVN02 is the first representative of a new species within a previously undefined genus within the

Myoviridae family This study confirms that PVN02 is a novel lytic phage and can

be served as a potentially biocontrol agent

iv

/Ӡ,&$0Ĉ2$1

7{L[LQ FDP ÿRDQÿk\ Oj F{QJ WUuQKQJKLrQ Fӭu cӫa riêng tôi, các sӕ liӋu trong nghiên cӭu là khách quan và trung thӵc NӃXFyVDLVyWOLrQTXDQÿӃQÿӅ tài, tôi xin hoàn toàn chӏu trách nhiӋm

Tӯ Quang Vinh

v

M ӨC LӨC

LӠI CҦ0Ѫ1 i

TÓM T ҲT ii

ABSTRACT iii

LӠ,&$0Ĉ2$1 iv

M ӨC LӨC v

DANH M ӨC CHӲ VIӂT TҲT vii

DANH M ӨC HÌNH viii

DANH M ӨC BҦNG ix

DANH M Ө&6ѪĈӖ x

M Ӣ ĈҪU 1

&+ѬѪ1*7ӘNG QUAN 3

1.1 6ѫOѭӧFYӅAeromonas hydrophila 3

1.2 6ѫOѭӧFYӅWKӵFNKXҭQWKӇYjOLӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇ 4

7KӵFNKXҭQWKӇ 4

/LӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇ 5

1.3 &{QJQJKӋJLҧLWUuQKJHQHWKӃKӋPӟL 6

1.3.1 Công nghӋJLҧLWUuQKWӵJHQHWKӃKӋPӟL 6

1.3.2 Công nghӋ giҧi trình tӵ gene thӃ hӋ mӟi cӫa Illumina 7

1.4 7uQKKuQKQJKLrQFӭXWURQJYjQJRjLQѭӟF 12

7URQJQѭӟF 12

1JRjLQѭӟc 12

1.5 0өFWLrXYjQӝLGXQJQJKLrQFӭXFӫDÿӅWjL 13

1.5.1. 0өFWLrXQJKLrQFӭX 13

1.5.2 Nӝi dung nghiên cӭu cӫDÿӅ tài 14

&+ѬѪ1* VҰT LIӊ89¬3+ѬѪ1*3+È31*+,Ç1&ӬU 15

9ұWOLӋX 15

7KLӃWEӏYjGөQJFө 15

+yDFKҩW 16

6ѫÿӗQJKLrQFӭXWәQJTXiW 17

vi

3KѭѫQJSKiS 18

7ҥRVWRFNWKӵFNKXҭQWKӇ 18

;iFÿӏQKKuQKWKiLWKӵFNKXҭQWKӇ 19

.KҧRViWÿѭӡQJFRQJPӝWFKXNǤOk\QKLӉPWKӵFNKXҭQWKӇ 19

;iFÿӏQKSKәOk\QKLӉPFӫDWKӵFNKXҭQWKӇ 21

7KXQKұQYjNLӇPWUDJHQRPHFӫDWKӵFNKXҭQWKӇ 21

&+ѬѪ1*.ӂT QUҦ VÀ THҦO LUҰN 32

.ӃWTXҧWҥRVWRFNYj[iFÿӏQKKuQKWKiLWKӵFNKXҭQWKӇ 32

.ӃWTXҧWҥRVWRFN 32

;iFÿӏQKKuQKWKiLWKӵFNKXҭQWKӇ 32

ĈѭӡQJFRQJPӝWFKXNǤOk\QKLӉPWKӵFNKXҭQWKӇ 32

.ӃWTXҧ[iFÿӏQKSKә[kPQKLӉP 33

.ӃWTXҧWKXQKұQYjNLӇPWUDJHQRPHFӫDWKӵFNKXҭQWKӇ 34

3.5 Nhân bҧn genome cӫa thӵc khuҭn thӇ 34

.LӇPWUDYj[ӱOêGӳOLӋXWK{ 35

/ҳSUiSKӋJHQH 37

&K~JLҧLFҩXWU~F 40

&K~JLҧLFKӭFQăQJ 41

3KkQWtFKSKҧKӋ 47

3.11 Tính an toàn cӫa thӵc khuҭn thӇ PVN02 49

&+ѬѪ1*.ӂT LUҰN VÀ KIӂN NGHӎ 50

.ӃWOXұQ 50

.LӃQQJKӏ 50

'$1+0Ө&&È&&Ð1*75Î1+.+2$+Ӑ& 51

7¬,/,ӊ87+$0.+Ҧ2 52

PH Ө LӨC 1: BҦNG KӂT QUҦ 7,Ç1 Ĉ2È1 25) %ҴNG PHҪN MӄM PROKKA 59

PHӨ LӨC 2: KӂT QUҦ PHӘ XÂM NHIӈM CӪA THӴC KHUҬN PVN02 62

LÝ L ӎCH TRÍCH NGANG 63

vii

DANH M ӨC CÁC TӮ VIӂT TҲT CFU: Colony Forming Unit

CWA: Cell Wall Amidase

EBI: European Bioinformatics Institute

ENA: European Nucleotide Archive

FDA: Food and Drug Administration

gDNA: Genomic DNA

MCP: Major Capsid Protein

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NGS: Next Generation Sequencing

ORF: Open Reading Frame

PFU: Plaque Forming Unit

RCA: Rolling Circle Amplification

TerL: Terminase Large Subunit

WGS: Whole Genome Sequencing

WGA: Whole Genome Amplification

viii

DANH M ӨC HÌNH

&+ѬѪ1*7ӘNG QUAN

Hình 1.1: Hình thái khuҭn lҥc cӫa Aeromonas hydrophila 3

Hình 1.2: Quá trình xâm nhiӉm và phân giҧi cӫa thӵc khuҭn thӇ trên vi khuҭn 5

+uQK&iFEѭӟFFѫEҧn trong giҧi trình tӵ thӃ hӋ mӟi cӫa hӋ thӕng Illumina 7

Hình 1.4: Cҩu trúc Adapter cӫa hӋ thӕng Illumina 9

+uQK&iFJLDLÿRҥn trong phҧn ӭng nhân bҧn bҳc cҫu 10

Hình 1.6: Illumina HiSeq flowcell 11

Hình 1.7: Quá trình thu nhұn dӳ liӋu trình tӵ trên hӋ thӕng Illumina 11

&+ѬѪ1*9ҰT LIӊ89¬3+ѬѪ1*3+È3 Hình 2.1: Mô tҧ kӃt quҧ ÿLӋn di gDNA 22

&+ѬѪ1*.ӂT QUҦ VÀ THҦO LUҰN Hình 3.1: Hình thái cӫa thӵc khuҭn thӇ PVN02 32

+uQKĈѭӡng cong mӝt chu kǤ xâm nhiӉm cӫa thӵc khuҭn thӇ PVN02 33

Hình 3.3: KӃt quҧ ÿLӋn di bӝ gene thӵc khuҭn thӇ PVN02 34

Hình 3.4: KӃt quҧ ÿLӋn di sҧn phҭm nhân bҧn bӝ gene PVN02 sau tinh sҥch 35

Hình 3.5: KӃt quҧ kiӇm tra dӳ liӋu thô 36

Hình 3.6: KӃt quҧ kiӇm tra chҩWOѭӧng dӳ liӋu thô sau khi xӱ lý 36

Hình 3.7: KӃt quҧ ÿiQKgiá lҳp ráp genome thӵc khuҭn thӇ PVN02 37

+uQK.ӃWTXҧ%/$671FӫDJHQRPHWKӵFNKXҭQWKӇ391 38

+uQK.ӃWTXҧSKkQWtFKÿӝEDRSKӫFӫDWKӵFNKXҭQWKӇ391 39

+uQK.ӃWTXҧVRViQKÿӝEDRSKӫFӫD391WUѭӟFYjVDXNKLOҩ\PүXFRQ 40 Hình 3.%ҧQÿӗJHQRPHFӫDWKӵFNKXҭQWKӇ391 46

Hình 3.12: Phân tích cây phát sinh loài cӫa thӵc khuҭn thӇ PVN02 và các thӵc khuҭn thӇ WѭѫQJÿӗng 47

Hình 3.13: MҥQJOѭӟLSURWHLQÿѭӧc xây dӵng bҵng phҫn mӅPY&RQWDFWYjÿѭӧc xây dӵng trӵc quan dùng phҫn mӅm Cytoscape 3.8.9 48

+uQK.ӃWTXҧNLӇPWUDYӟL5$67N 49

Bҧng 2.1: Mӕi quan hӋ giӳDÿLӇm chҩWOѭӧng Q và xác xuҩt lӛi 25

&+ѬѪ1*.ӂT QUҦ VÀ THҦO LUҰN

Bҧng 3.1: KӃt quҧ phә xâm nhiӉm cӫa PVN02 33

%ҧQJ.ӃWTXҧFiFGRPDLQFӫDWKӵFNKXҭQWKӇ391 41

%ҧQJ.ӃWTXҧFK~JLҧLFҩXWU~FYjFKӭFQăQJWKӵFNKXҭQWKӇ391 42

x

DANH M Ө&6ѪĈӖ

&+ѬѪ1*9ҰT LIӊ89¬3+ѬѪ1*3+È31*+,Ç1&ӬU

6ѫÿӗ6ѫÿӗQJKLrQFӭXWәQJTXiW 17 6ѫÿӗ6ѫÿӗWKӵFKLӋQWҥRWKӵFNKXҭQWKӇ 18 6ѫÿӗ6ѫÿӗWKӵFKLӋQWKtQJKLӋPÿѭӡQJFRQJPӝWFKXNǤOk\QKLӉP 20

1

M Ӣ ĈҪU

HiӋn nay, viӋc sӱ dөng kháng sinh không kiӇm soát trong viӋFSKzQJYjÿLӅu trӏ bӋnh trên thuӹ sҧn ÿmGүQÿӃn sӵ kháng kháng sinh cӫa các loҥi vi khuҭn gây hҥi

QKѭ Aeromonas hydrophila Bên cҥQK ÿy, quá trình hӝi nhұp quӕc tӃ buӝc chҩt

Oѭӧng thӫy hҧi sҧn tҥLQѭӟc ta phҧi tuân thӫ các TX\ÿӏnh ngày càng khҳt khe trong viӋc sӱ dөng kháng sinh trên thuӹ sҧn, QKѭ TX\ÿӏnh cӫa Cөc Quҧn lý Thӵc Phҭm Yj 'ѭӧc Phҭm Hoa KǤ )'$  QăP  FKӍ chҩp nhұn các kháng sinh oxytetracycline, florfenicol và sulfadimethoxine/ormetoprim dùng trong thuӹ sҧn 'Rÿy, ÿӇ SKzQJYjÿLӅu trӏ bӋnh thuӹ sҧn mӝt cách hiӋu quҧ, phù hӧp vӟLTX\ÿӏnh quӕc tӃ, cҫn phҧi tìm kiӃP FiF SKѭѫQJ SKiS NKiF QKѭ probiotic, prebiotic, synbiotics, enzyme, bioremediations, bacteriocine và liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ ÿӇ ÿLӅu trӏ và kiӇm soát dӏch bӋnh trong nuôi trӗng thuӹ sҧn

Aeromonas hydrophila là vi khuҭn gây bӋnh xuҩt huyӃt trên hҫu hӃt các loài

FiQѭӟc ngӑt trên thӃ giӟi Ӣ ViӋW1DPÿһc biӋWOjĈӗng Bҵng sông Cӱu Long, vi khuҭn gây bӋnh xuҩt huyӃt và có tҫn sӕ xuҩt hiӋn cao nhҩt trên cá tra nuôi, bӋnh xuҩt hiӋQTXDQKQăPSKә biӃn nhҩt vào mùa khô HiӋn nay, SKѭѫQJSKiSFKtQKÿӇ phòng và trӏ bӋnh xuҩt huyӃt do Aeromonas hydrophila vүn dӵa chӫ yӃu vào kháng sinh Tuy nhiên, viӋc sӱ dөng kháng sinh thiӃu kiӇm soát dүQÿӃQNKyNKăQWURQJTXiWUuQKÿLӅu trӏ

LiӋu pháp thӵc khuҭn thӇ là mӝWSKѭѫQJSKiSÿmUDÿӡi tӯ rҩt sӟPQKѭQJGR

sӵ phát triӇn mҥnh mӁ cӫa kháng sinh trong thӃ kӹ 20, liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ ÿm

bӏ OmQJTXrQFKRÿӃn khi viӋc sӱ dөng kháng sinh không kiӇm soát, dүQÿӃn sӵ xuҩt hiӋn cӫa các vi khuҭQNKiQJNKiQJVLQKÿmlàm liӋu pháp thӵc khuҭn thӇ ÿѭӧc chú ý trӣ lҥi, trӣ WKjQKSKѭѫQJSKiSÿҫy tiӅPQăQJWURQJÿLӅu trӏ các bӋnh do vi khuҭn gây ra trong thuӹ sҧn hiӋn nay MһFGFyWtQKÿһc hiӋu cao, hiӋu quҧ kiӇm soát tӕt vӟi vi khuҭn chӫ WѭѫQJӭQJQKѭQJYLӋc ӭng dөng thӵc khuҭn thӇ YjRÿLӅu kiӋnthӵc

tӃ vүn còn nhiӅu hҥn chӃ HiӋn nay, vүQFKѭDFyFyPӝWSKѭѫQJSKiSKD\TX\WUuQK

cө thӇ ÿӇ ÿiQKJLiPӝt cách toàn diӋn vӅ tính an toàn cӫa thӵc khuҭn thӇ trong viӋc ӭng dөng làm chӃ phҭm kiӇm soát vi khuҭn do tiӅm ҭn các tính chҩt kháng kháng VLQK FiF JHQH Jk\ ÿӝc trong bӝ gene thӵc khuҭn thӇ Bên cҥQK ÿy FiF SKѭѫQJ

2

pháp thӵc nghiӋm truyӅn thӕng có thӇ bӓ sót các yӃu tӕ QJX\FѫGRSKpSWKӱ không phù hӧp nên viӋc tiӃp cұQÿiQKJLiWtQKDQWRjQGӵa vào hӋ gene thӵc khuҭn thӇ nhҵP[iFÿӏQKFiFJHQHNKiQJNKiQJVLQKJHQHJk\ÿӝFYjÿһFÿLӇm các gene cӫa thӵc khuҭn thӇ có vai trò quan trӑng trong viӋF[iFÿӏnh tiӅPQăQJӭng dөng cӫa thӵc khuҭn thӇ

ViӋc phân tích hӋ gene thӵc khuҭn thӇ dùng kӻ thuұt giҧi trình tӵ Sanger rҩt tӕn kém và hiӋu quҧ không cao, cùng vӟi sӵ phát triӇn mҥnh mӁ cӫa kӻ thuұt giҧi trình tӵ gene thӃ hӋ mӟi (Next Generation Sequencing - 1*6 ÿһc biӋt là giҧi trình

tӵ toàn bӝ gene (Whole genome sequencing - :*6  ÿm JL~S WăQJ ÿӝ chính xác FNJQJQKѭNKiPSKiYj[iFÿӏQKÿѭӧFFiFÿһFÿLӇm phân tӱ cӫa genome thӵc khuҭn thӇ tӯ ÿyÿiQKJLiÿѭӧc tính an toàn cӫa hӋ gene, tiӅPQăQJӭng dөng cӫa thӵc khuҭn thӇ Chính vì vұy, tôi quyӃWÿӏnh thӵc hiӋQÿӅ tài³;iFÿӏnh trình tӵ bӝ

gene thӵc khuҭn thӇ tҩQF{QJÿһc hiӋu vi khuҭn Aeromonas hydrophila bҵng

k ӻ thuұt giҧi trình tӵ gene thӃ hӋ mӟi”

khí không bҳt buӝc, khӱ QLWUDWHR[LGDVHGѭѫQJWtQK>@

Hình 1.1: Hình thái khu̱n l̩c cͯa Aeromonas hydrophila A-B: Hình thái khu̱n l̩Fÿ˯QC-D: Hình ̫nh nhu͡n gram vi khu̱QTXDQViWG˱ͣi kính hi͋n vi [4] Aeromonas hydrophila là vi khuҭn gây bӋnh nhiӉm trùng huyӃt trên cá và

ÿѭӧc báo cáo là bӋnh có tӹ lӋ tӱ vong cao, gây ҧQKKѭӣng nghiêm trӑQJÿӃn kinh tӃ cӫa ngành nuôi trӗng thӫy sҧn [2] Ӣ ViӋt Nam, Aeromonas hydrophila gây bӋnh xuҩt huyӃt trên cá tra và có thӇ xҧy ra ӣ tҩt cҧ FiFJLDLÿRҥn nuôi vӟi tӹ lӋ hao hөt có thӇ OrQÿӃQ>@.KiQJVLQKOjSKѭѫQJSKiSSKә biӃn hiӋQQD\ÿӇ kiӇm soát và phòng ngӯa bӋnh xuҩt huyӃt do Aeromonas hydrophila Jk\QrQQKѭQJYLӋc sӱ dөng vӟi liӅXFDRÿmGүQÿӃn tình trҥng kháng kháng sinh xҧy ra Các chӫng Aeromonas

hydrophila nhҥy cҧm vӟi doxycyclin, cefotaxim và ciprofloxacin; kháng cao vӟi các

4

kháng sinh tetracyclin, florfenicol và kháng hoàn toàn vӟi kháng sinh nhóm penicillin, cefalexin và trimethoprim/sunfamethoxazol [3]

'RÿyFҫn phҧi sӱ dөQJFiFSKѭѫQJSKiSNKiFNӃt hӧp vӟLNKiQJVLQKÿӇ

WăQJNKҧ QăQJNLӇm soát vi khuҭn Aeromonas hydrophila trong nuôi trӗng thӫy sҧn

1.2 6ѫOѭӧFYӅWKӵFNKXҭQWKӇYjOLӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇ

7KӵFNKXҭQWKӇ

7KӵFNKXҭQWKӇEDFWHULRSKDJHKRһFSKDJH OjVLQKYұWNêVLQK[kPQKLӉPYjSKiKӫ\YLNKXҭQ7URQJWӵQKLrQWKӵFNKXҭQWKӇWӗQWҥLYӟLVӕOѭӧQJOӟQWURQJP{LWUѭӡQJQѭӟFÿҩW« EҩWFӭQѫLQjRFyVӵWӗQWҥLFӫDWӃEjRFKӫ>@

7KӵFNKXҭQWKӇFyFKXWUuQKVӕQJGӵDWUrQÿһFWtQKVӕQJÿyOjO\JLҧL{Qhòa và tiӅm tan giҧ [6] Thӵc khuҭn thӇ sinh tan sau khi xâm nhiӉm sӁ phá hӫy genome cӫa tӃ bào chӫOjPQJѭQJPӑi hoҥWÿӝng tәng hӧp phөc vө tӃ bào chӫ, WKD\YjRÿyOjWәng hӧp các thành phҫn khác nhau cӫa thӵc khuҭn thӇ (protein và QXFOHLFDFLG ÿӇ tҥo ra thӃ hӋ thӵc khuҭn thӇ mӟi Sau quá trình tҥo thӵc khuҭn thӇ mӟi, tӃ bào chӫ bӏ phân giҧi và các hҥt thӵc khuҭn thӇ VDXNKLÿѭӧc giҧi phóng tiӃp tөc tìm kiӃm và xâm nhiӉm tӃ bào vi khuҭn lân cұn khác 1Jѭӧc lҥi, thӵc khuҭn thӇ tiӅm tan sau khi xâm nhiӉm sӁ hӧp nhҩt genome cӫa nó vӟi genome tӃ bào chӫ Genome cӫa thӵc khuҭn thӇ O~FQj\ÿѭӧc gӑi là “prophage” TӃ bào chӫ bӏ xâm nhiӉm có thӇ nhұQÿѭӧc mӝt sӕ lӧi thӃ tӯ SURSKDJHQKѭWăQJFѭӡng khҧ QăQJWUDo ÿәi chҩWNKiQJNKiQJVLQKVLQKÿӝc tӕ và kháng lҥi sӵ xâm nhiӉm cӫa các thӵc khuҭn thӇ khác thuӝc cùng loài hoһc chӫng Prophage có thӇ bҳWÿҫu chu kǤ sinh tan khi chӏXWiFÿӝng cӫa 1 sӕ yӃu tӕ KyDOêQKѭWLDEӭc xҥ, hóa chҩt, các chҩt gây ung WKѭQKiӋWÿӝÿӝ mһQKjPOѭӧQJGLQKGѭӥng«ӢGҥQJtiӅm tan giҧ, thӵc khuҭn thӇ tӗn tҥi ӣ dҥng bҩt hoҥt trong tӃ bào chӫ, dҥng này xҧ\UDNKLÿLӅu kiӋQP{LWUѭӡng ӣ trҥng thái cҥn kiӋt và khi chҩWGLQKGѭӥQJÿѭӧc bә sung trӣ lҥi, thӵc khuҭn thӇ sӁ chuyӇn thành dҥng ly giҧi hoһc ôn hòa [7]

5

Khi genome cӫa thӵc khuҭn thӇ tách khӓi genome tӃ bào chӫ, mӝt sӕ gene cӫa tӃ bào chӫ có thӇ liên kӃt vӟi genome cӫa thӵc khuҭn thӇ, các gene này sӁ ÿѭӧc thӵc khuҭn thӇ PDQJÿӃn các tӃ bào khác, tҥo ra sӵ chuyӇn gene theo chiӅu ngang trong quҫn xã vi khuҭQGRÿyFyWKӇ OjPWăQJWtQKÿӝc cӫa các vi khuҭn nhұn gene

/LӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇ

/LӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇVӱGөQJWKӵFNKXҭQWKӇÿӇ[kPQKLӉPYjWLrXGLӋWYLNKXҭQJk\EӋQKQKҵPWLrXGLӋWYjNKӕQJFKӃVӕOѭӧQJYLNKXҭQӣPӭFFKRSKpSQKӡÿyJL~SSKzQJYjÿLӅXWUӏFiFEӋQKGRQKLӉPNKXҭQ7KXӝFYjRQKӳQJSKѭѫQJSKiSWKD\WKӃNKiQJVLQKOLӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇOjPӝWWURQJ³QKӳQJӭQJFӱYLrQViQJJLi´FKRYLӋFiSGөQJQKҵPPөFÿtFKSKzQJWUӏEӋQKWUrQWKӫ\KҧLVҧQ

ĈӇWKӵFKLӋQWKjQKF{QJOLӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇWKӵFNKXҭQWKӇÿѭӧFFKӑQFҫQÿiSӭQJPӝWVӕWLrXFKtĈҫXWLrQWKӵFNKXҭQWKӇSKҧLFyNKҧQăQJQKLӉPWUrQNKRҧQJUӝQJYLNKXҭQFKӫPRQJPXӕQ7KӭKDLWKӵFNKXҭQWKӇQrQFyKӋVӕQKkQOӟQYjWKӡLJLDQ[kPQKLӉPQJҳQÿӇWӕLÿDKyDKLӋXTXҧFӫDOLӋXSKiS7KӭEDWKӵFNKXҭQWKӇNK{QJÿѭӧFPDQJJHQHPmKyDFiFQKkQWӕÿӝFOӵFFӫDYLNKXҭQFNJQJQKѭFiFJHQHNKiQJNKiQJVLQKYjJHQHÿӝFWӕGRÿyQKӳQJWKӵFNKXҭQWKӇ ôn hòa NK{QJÿѭӧFVӱGөQJWURQJOLӋXSKiSWKӵFNKXҭQWKӇ>@

6

1.3 &{QJQJKӋJLҧLWUuQKJHQHWKӃKӋPӟL

1.3.1 &iFF{QJQJKӋJLҧLWUuQKWӵJHQHWKӃKӋPӟL

7URQJQKӳQJQăPWUӣOҥLÿk\NӻWKXұWJLҧLWUuQKWӵJHQHWKӃKӋPӟL hay còn ÿѭӧFJӑLOjJLҧLWUuQKWӵJHQHWKӃKӋWKӭKDLÿmFyQKLӅXEѭӟFSKiWWULӇQPҥQKPӁ+LӋQÿmFyQӅQWҧQJF{QJQJKӋWURQJJLҧLWUuQKWӵWKӃKӋPӟLÿѭӧFSKiWWULӇQ

ĈҫXWLrQOjQӅQWҧQJGR/LIH6FLHQFHVSKiWWULӇQWKѭѫQJPҥLYjRQăP

VӱGөQJNӻJLҧLWUuQKWӵpyrosequencing kӃt hӧp vӟL3&5QKNJWѭѫQJQӅn tҧng Qj\ÿѭӧc ROCHE mua lҥLYjÿmQJѭQJSKiWWULӇQYjRQăPGRNK{QJWKӇ cҥnh tranh vӅ GXQJOѭӧng giҧi và giá thành vӟi nӅn tҧng cӫa Illumina [10]

7KӭKDLOjQӅQWҧQJGRSolexa phát triӇQQăP Yjÿѭӧc Illumina mua lҥi QăPFiFKӋ thӕng trên nӅn tҧng cӫa Illumina sӱ dөng SKѭѫQJSKiSWәng hӧp mҥch kӃt hӧp vӟLUHYHUVLEOHWHUPLQDWRUVÿӇ giҧi trình tӵ Ĉk\OjQӅn tҧng giҧi trình

tӵ thӃ hӋ mӟi dүQÿҫu hiӋn nay, VDXQKLӅXFҧLWLӃQYjSKiWWULӇQKLӋQÿDQJOjF{QJQJKӋSKәELӃQQKҩWFKLӃPÿӃQGӳOLӋXJLҧLWUuQKWӵJHQHWKӃKӋPӟL[11]

NӅn tҧng thӭ 3 là Sequencing by Oligo Ligation Detection (SOLiD) do Applied Biosystems phát triӇQYjRQăP1Ӆn tҧng này giҧi trình tӵ bҵng phҧn ӭng gҳn sӱ dөQJHQ]\PH$'1OLJDVHÿӇ [iFÿӏnh trình tӵ ÿtFK'RJLӟi hҥn vӅ kích WKѭӟc chӍ có thӇ giҧi tӕLÿDESYjWKӡi gian chҥy tӯ ÿӃn 14 ngày nên nӅn tҧng này hiӋQNK{QJFzQÿѭӧc ӭng dөng rӝng rãi [12]

1ӅQ WҧQJ WKӭ  Oj '1$ QDQREDOO VHTXHQFLQJ GR &RPSOHWH *HQRPLFV SKiWWULӇQ YjR QăP  Yj ÿѭӧF %HLMLQJ *HQRPLFV ,QVWLWXWH %*,  PXD OҥL YjR QăP

  1ӅQ WҧQJ Qj\ Vӱ GөQJ FiF '1$ QDQREDOOV NӃW KӧS YӟL SKҧQ ӭQJ 5ROOLQJFLUFOHUHSOLFDWLRQÿӇJLҧLWUuQKWӵ'1$ [12]

Và cuӕi cùng là nӅn tҧng Ion Torrent do /LIH6FLHQFHVSKiWWULӇQQăP1ӅQWҧQJQj\VӱGөQJFKLSEiQGүQÿӇÿRJLiWUӏSURWRQVJLҧLSKyQJUDWURQJTXiWUuQKEDVHPӟLÿѭӧFJҳQYjRNKLWәQJKӧSPҥFKPӟL0һFGNtFKWKѭӟFÿRҥQJLҧLFyWKӇOrQÿӃQESQKѭQJKӋWKӕQJQj\GӉVDLVyWNKLJLҧLQKӳQJKRPRSRO\PHU[12]

7

1.3.2 Công ngh Ӌ giҧi trình tӵ gene thӃ hӋ mӟi cӫa Illumia

7URQJ ÿӅ tài này, tôi sӱ dөng nӅn tҧng cӫD ,OOXPLQD ÿӇ giҧi trình tӵ thӵc khuҭn thӇ PVN02 Nguyên lý cӫa hӋ thӕng Illumina là sӱ dөQJSKѭѫQJSKiSWәng hӧp mҥFK GQJ FiF GHR[\QXFORVLGH WULSKRVSKDWH ÿiQK Gҩu huǤnh quang (dNTP) Trong mӛi chu kǤ tәng hӧp mҥch, khi các deoxynucloside triphosphate ÿtQKNqPphân tӱ huǤnh quang gҳn vào mҥch mӟi sӁ phát ra tín hiӋu quang và tҥm dӯng quá trình tәng hӧp mҥch Trong mӛi chu trình giҧi trình tӵ, mӝt deoxynucloside WULSKRVSKDWH ÿiQK Gҩu huǤQK TXDQJ G173  ÿѭӧc thêm vào phҧn ӭng tәng hӧp chuӛi acid nucleic Phân tӱ huǤnh quang cӫDQXFOHRWLGHÿyQJYDLWUzQKѭPӝt khóa dӯng phҧn ӭQJSRO\PHUKyDGRÿy, sau khi mӛLG173ÿѭӧc tích hӧp, màu huǤnh TXDQJ ÿѭӧc ghi lҥL ÿӇ [iF ÿӏQK QXFOHRWLGH Yj VDX ÿy Eӏ cҳt bӓ ÿӇ tәng hӧp nucleotide tiӃp theo Vì cҧ 4 loҥi dNTP gҳn khóa dӯng tәng hӧp thuұn nghӏch có mһWÿӗng thӡLGѭӟi dҥQJÿѫQSKkQWӱ, sӵ cҥnh tranh ngүu nhiên giúp giҧm thiӇu viӋc tәng hӧp mҩWFkQÿӕi ViӋF[iFÿӏnh các base dӵDYjRFѭӡQJÿӝ tín hiӋXÿRÿѭӧc trong mӛi chu trình, giúp giҧm thiӇu các sai sӕ thô so vӟi công nghӋ khác KӃt quҧ cuӕi cùng là trình tӵ ÿѭӧFÿӑc tӯng base mӝt vӟLÿӝ chính xác cao, loҥi bӓ ÿѭӧc các lӛLGRÿһc thù trình tӵ, cho phép quá trình giҧi trình tӵ mҥnh mӁ trên toàn

bӝ genome, bao gӗm các trình tӵ lһp lҥi Ӣ chu kǤ tiӃp theo, enzyme sӁ phân cҳt các phân tӱ huǤnh quang cho phép các nucleotide tiӃS WKHR ÿѭӧc gҳn vào, các deoxynucloside triphosphate gҳn huǤQK TXDQJ Qj\ ÿѭӧc gӑi là các reversible terminator [13]

Khác biӋt lӟn nhҩt vӟi kӻ thuұt giҧi trình tӵ Sanger là thay vì giҧi trình tӵ mӝWÿRҥQÿѫQOҿ, kӻ thuұt này cho phép giҧi trình tӵ vӟi mӝWOѭӧng lӟQFiFÿRҥn DNA khác nhau song song tҥi cùng mӝt thӡLÿLӇPGRÿyWҥo ra mӝWOѭӧng lӟn thông tin dӳ liӋX Ĉһc biӋt, các hӋ thӕng giҧi trình tӵ cӫa Illumina sӱ dөng các deoxynucleotide triphosphate gҳn huǤnh quang có khҧ QăQJWKXұn nghӏch, tӯ ÿyWLӃt kiӋm thӡLJLDQYjFKROѭӧng dӳ liӋXÿҫu ra vô cùng lӟn so vӟLSKѭѫQJSKiS6DQJHU

9

Chu ҭn bӏ WKѭYLӋn: gDNA (genomic DNA) mүu sӁ ÿѭӧc phân cách thành

FiFÿRҥn DNA mҥch ÿѫQVDXÿyFKӑn lӑFFiFÿRҥQFyNtFKWKѭӟc phù hӧp, xӱ lý gҳn vӟLFiFDGDSWHUÿһc biӋt ӣ cҧ KDLÿҫu và có thӇ nhân bҧn hoһc không nhân bҧn W\WKHRSKѭѫQJSKiSWҥRWKѭYLӋn sӱ dөQJÿӇ tҥRWKjQKWKѭYLӋn cho viӋc giҧi trình

x Trình tӵ primer nhân bҧn: trình tӵ giúp cho enzyme DNA polymerase bám vào nhân bҧn tròn quá trình tҥRWKѭYLӋn

x Trình tӵ phân biӋt (indexs): giúp giҧi trình tӵ ÿӗng thӡi nhiӅu mүu trong cùng lҫn giҧi, phân biӋt giӳa các mүu khác nhau Có nhiӅu kiӇu trình tӵ phân biӋt khác nhau tùy theo kit giҧi trình tӵ sӱ dөQJQKѭFKӍ sӱ dөng 1 trình tӵ phân biӋt (i7) hoһc hai trình tӵ phân biӋt (i5 và i7) hoһc sӱ dөng kӃt hӧp 3 trình tӵ phân biӋt

Hình 1.4: C̭u trúc Adapter cͯa h͏ th͙ng Illumina [14]

Nhân b ҧn theo cөm: 7KѭYLӋn sӁ ÿѭӧc nҥSYjRIORZFHOOFiFÿRҥn DNA

mҥFKÿѫQVӁ lai vӟi bӅ mһt cӫa flowcell nhӡ vào trình tӵ bә sung cӫa adapter vӟi

k͇ ti͇p [15]

Quá trình nhân bҧQWKѭӡQJÿѭӧc thӵc hiӋn khoҧng 35 chu kǤ tùy theo kit sӱ dөQJÿӇ tҥRWKѭYLӋn KӃt quҧ cӫa quá trình nhân bҧn bҳc cҫu sӁ tҥo thành các cөm trình tӵ Các cөm trình tӵ FiFÿӑan DNA mҥFKÿѫQNKiFQKDXFӫDJ'1$EDQÿҫu ÿѭӧc gӑLOjWKѭYLӋn cho phҧn ӭng giҧi trình tӵ

Mһc dù quá trình nhân bҧn bҳc cҫu tҥRWKjQKÿRҥn trình tӵ theo cҧ KDLKѭӟng (5’-3’ và 3’-¶ QKѭQJTXiWUuQKJLҧi trình tӵ chӍ có thӇ thӵc hiӋn theo mӝt chiӅu tҥi mӝt thӡLÿLӇP'RÿyPӝt mҥch sӁ ÿѭӧc loҥi bӓ (mҥch chӭD3