TỔNG QUAN
Tình hình nghiên cứu sử dụng chuột mẹ mang thai hộ bằng phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng
Các nhà khoa học trên thế giới đã công bố nhiều công trình khoa học trong việc sử dụng chuột mẹ mang thai hộ phục vụ cho các nghiên cứu của họ
Nghiên cứu của Masaru Okabe và cộng sự năm 1997 trong việc tạo ra chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang nhằm tạo ra nguồn tế bào mang gen egfp dồi dào phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến cấy ghép tế bào đã báo cáo rằng, có
272 hợp tử đã vi tiêm DNA đã được cấy chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và kết quả đạt được 52 chuột con sinh ra [2]
Daniel D Carson và cộng sự năm 2000 đã báo cáo rằng, việc chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ là một bước thiết yếu trong quá trình tạo chuột biến đổi gen [3] Do đó, việc tạo mô hình chuột mang thai hộ là cần thiết
Lars M Ittner và cộng sự năm 2007 nghiên cứu việc sản xuất chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm DNA vào phôi đã mô tả việc chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ, trong đó để tạo chuột mẹ mang thai hộ cần sử dụng chuột cái ở giai đoạn động dục [4] Trong nghiên cứu của Satoshi Kishigami và cộng sự năm
2006 về nghiên cứu sản xuất chuột nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân tế bào sinh dưỡng cũng mô tả việc chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và chuột mang thai hộ được tạo ra từ việc sử dụng chuột cái giai đoạn động dục
Năm 1972 Arthur K Champlin và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp xác định các giai đoạn của động dục ở chuột bằng việc quan sát trực quan âm hộ Giai đoạn động dục được ghi nhận âm hộ có màu hồng, ít ẩm ướt Tuy nhiên đây là một phương pháp đòi hỏi kĩ năng cũng như nhiều kinh nghiệm của người thực hiện, do đó cần có các phương pháp khác đối chiếu
Shannon L Byers và cộng sự năm 2012 đã đưa ra phương pháp xác định các giai đoạn của chu kì động dục ở chuột bằng quan sát trực quan âm hộ ở các chủng chuột khác nhau, đồng thời đối chiếu là phương pháp vết phết tế bào âm đạo với sự xuất hiện của tế bào đặc trưng như tế bào biểu mô sừng hóa không nhân, tế bào biểu mô có nhân, tế bào bạch cầu Các tế bào này xuất hiện với tỉ lệ khác nhau ở các giai đoạn khác nhau, nhóm nghiên cứu của Shannon L Byers cũng đã được ra công cụ nhằm ước tính tỉ lệ tế bào và đưa ra giai đoạn động dục chính xác Tuy nhiên, phương pháp của Shannon L Byers và cộng sự là quan sát dưới kính hiển vi với mẫu tươi dịch âm đạo Điều này có ưu điểm là dễ dàng thực hiện, tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, các thị trường bên trong tiêu bản chứa dịch âm đạo không chỉ có tế bào, do đó rất khó phân biệt sự khác nhau của các loại tế bào ở các giai đoạn khác nhau
Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 đã báo cáo về việc áp dụng mô hình chuột mang thai hộ trong đó sử dụng chuột ICR làm chuột mẹ mang thai hộ phục vụ nghiên cứu về các điều kiện nuôi khác nhau ở các hệ thống khác nhau và sinh con non bình thường [5]
Kết quả nghiên cứu của Ayako Isotani và cộng sự năm 2016 trong việc thiết lập dòng tế bào gốc phôi của chuột đã vi tiêm gen ngoại lai vào phôi và chuyển phôi vào chuột cái mang thai hộ nhằm sinh con non [6]
Trong nghiên cứu về hiệu quả của việc chỉnh sửa gen bằng kỹ thuật Crispr-
EZ được báo cáo bởi Andrew J Modzelewski và cộng sự năm 2018 trên tạp chí Nature cũng mô tả việc tạo chuột biến đổi gen bằng việc vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ nhằm sinh chuột con được chỉnh sửa gen [7]
Yi Wu và cộng sự năm 2019 nghiên cứu về việc tạo ra chuột biến đổi gen được đăng trên tạp chí Nature đã mô tả việc vi tiêm hỗ hợp sgRNA và Cas9 mRNA hoặc protein vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và giai đoạn 2 tế bào Hợp tử sau vi tiêm được nuôi đến giai đoạn hai tế bào và các phôi hai tế bào sau vi tiêm được chuyển vào ống dẫn trứng của chuột mang thai hộ (hình 2.1) [8]
Hình 2.1 Quá trình tạo chuột biến đổi gen áp dụng mô hình chuột mang thai hộ [8]
U Lampreht Tratar và cộng sự năm 2018 trong nghiên cứu mô hình chuột trong các nghiên cứu liên quan đến ung thư đã chỉ ra rằng, trong tất cả ba phương pháp tạo chuột chuyển gen mà họ đã sử dụng, điều quan trọng và chung nhất là đều phải chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ để tạo ra mô hình chuột nghiên cứu theo mô tả hình bên dưới [9]
Hình 2.2 Quy trình tạo chuột chuyển gen [9]
Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một công trình nào ở Việt Nam được công bố về nghiên cứu tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm tạo chuột phát sáng huỳnh quang tiếp cận bằng việc phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng Điều này có thể thấy nghiên cứu của chúng tôi đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc phục vụ cho nghiên cứu khoa học Sự đang dạng về mặt ứng dụng của mô hình chuột mẹ mang thai hộ cũng cho thấy tiềm năng ứng dụng của mô hình chuột mẹ mang thai hộ là rất lớn, đồng thời việc làm chủ công nghệ này là một lợi thế to lớn trong việc thực hiện các nghiên cứu khoa học tiếp theo.
Vai trò của chuột trong nghiên cứu
Thông qua tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước được thực hiện trên đối tượng chuột, có thể thấy chuột đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nghiên cứu cơ bản và cả các nghiên cứu ứng dụng, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh học Các nghiên cứu này càng thể hiện vai trò của nó khi ngày nay, tỉ lệ con người mang bệnh tật ngày càng nhiều, như vậy việc tạo ra các mô hình chuột là ngày càng quan trọng
Chuột được xem là một mô hình cho các nghiên cứu và đã được chứng minh là cực kì hữu ích bởi tính tương đồng về bộ gen của nó với con người lên đến 80% [10] Do đó, chuột mang thai hộ là một công cụ hỗ trợ mạnh mẽ trong các nghiên cứu cơ bản liên quan đến y sinh học cũng như các ứng dụng điều trị trong việc phát triển một loại thuốc mới bất kì [11].
Tổng quan về chuột nhắt trắng
Tùy thuộc vào từng chủng chuột mà có độ tuổi trưởng thành về mặt sinh dục khác nhau Trong đó, chuột được sử dụng cho nghiên cứu về sinh sản thường thấy dao động khoảng 45 – 50 ngày đối với chuột cái và lên đến 60 ngày đối với chuột đực [12] Ngoài ra còn có một số chủng chuột với các độ tuổi sinh sản khác nhau như FVB/N (4 – 5 tuần tuổi) [13], C57BL/6 x BalBc (8 tuần tuổi) [14] bởi vì chúng cung cấp các loại tế bào (trứng và tinh trùng) thích hợp cho việc sản xuất các dòng chuột nhân bản [15] Ngoài ra cũng có một số chủng chuột như B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2) [4], B6C3F1 (C57BL/6 x C3H/He) với độ tuổi sinh sản là 8 – 10 tuần tuổi Đồng thời, chủng chuột thích hợp làm chuột mang thai hộ và chuột bất thụ là ICR (CD – 1) [8], [15], [16], [17]
2.3.2 Cơ quan sinh sản chuột nhắt trắng
Hình 2.3 Cơ quan sinh sản ở chuột (bên trái: chuột cái, bên phải: chuột đực) [18]
Hình 2.4 Cơ quan sinh sản của chuột đực; bao gồm ống dẫn tinh, mào tinh hoàn và tinh hoàn [19]
2.3.3 Chu kì động dục ở chuột
Chu kì động dục ở chuột hay còn gọi là chu kì sinh sản của chuột Chu kì động dục được tính từ lúc bắt đầu động dục cho đến lúc bắt đầu lại 1 chu kì động dục mới Chu kì động dục bao gồm bốn giai đoạn chính: Tiền động dục (proestrous), động dục (Estrous), sau động dục (metestrous), giai đoạn nghỉ động dục (diestrous) và được xác định dựa vào việc quan sát các loại tế bào hiện diện trong dịch âm đạo của chuột, đồng thời với sự biểu hiện của hành vi tình dục, có thể quan sát và xác định được giai đoạn động dục của chuột Sự thay đổi này có thể phản ánh đối với sự thay đổi nội tiết bên trong cơ thể chuột, các thay đổi xảy ra trong chu kì động dục của chuột là điều hiển nhiên [20] Ta có thể xác định chu kì động dục của chuột bằng việc quan sát vết phết tế bào âm đạo ở các giai đoạn khác nhau [21], [22] Trong suốt chu kì động dục ở chuột, các giai đoạn tiền động dục, động dục, sau động dục thường kéo dài 12 giờ và giai đoạn dài nhất là nghỉ động dục kéo dài khoảng 65 giờ
Bảng 2.1 Sự thay đổi của progesterol và estradiol trong quá trình động dục ở chuột
Tiền động dục Tăng cao Tăng cao Động dục Giảm dần Giảm dần
Sau động dục Duy trì ở mức thấp Duy trì ở mức thấp
Nghỉ động dục Tăng cao Tăng nhẹ sau đó giảm và duy trì ở mức thấp Trong quá trình động dục, hàm lượng progesterone và estradiol có sự thay đổi rõ rệt Đối với giai đoạn tiền động dục, hàm lượng progesterone và estradiol tăng cao nhưng sẽ giảm dần cho đến khi vào giai đoạn động dục và duy trì ổn định cho đến cuối giai đoạn sau động dục, Đến giai đoạn nghỉ động dục, hàm lượng progesterone sẽ tăng đột ngột và duy trì ở ngưỡng cao này cho đến cuối giai đoạn nghỉ động dục, hàm lượng progesterone sẽ giảm dần khi bắt đầu lại chu kì động dục mới Ngược lại với progesterone thì estradiol có sự biến thiên trong giai đoạn này Cụ thể, estradiol sẽ tăng lên đáng kể, tuy nhiên thấp hơn nhiều so với progesterone và điều đáng nói là estradiol không duy trì ở mức cao mà sẽ giảm dần ngay sau đó và duy trì ở mức thấp như ở giai đoạn động dục và sau động dục [23] Đối với người, chu kì sinh sản hay còn gọi là chu kì kinh nguyệt và thường kéo dài từ 28 – 32 ngày Chu kì động dục khác nhau ở các loài; đối với chuột, chu kì động dục thường kéo dài 4 - 5 ngày [12], [20], [23]; tuy nhiên sự động dục ở các thời điểm rất đa dạng và tùy thuộc vào từng loài Giai đoạn động dục của chuột được xác định trong khoảng thời gian từ lúc chuột cái có dấu hiệu chấp nhận giao phối bằng biểu hiện hành vi và quan sát âm hộ [12]
Xác định chu kì động dục của chuột là công cụ rất hữu ích cho việc lựa chọn chuột để chuẩn bị ghép đôi [20] Trong nghiên cứu này của chúng tôi, xác định giai đoạn động dục của chu kì động dục được thực hiện nhằm nâng cao tỉ lệ ghép đôi của chuột, do đó chúng tôi chọn giai đoạn động dục là giai đoạn thích hợp nhất [24]
Hình 2.5 Sự thay đổi hàm lượng progesterone và estradiol trong suốt quá trình động dục ở chuột [23]
Sự thay đổi về âm hộ ở các giai đoạn khác nhau của chu kì động dục của chuột:
Theo Byers và cộng sự năm 2012, có sự khác biệt rõ ràng của âm hộ chuột cái được quan sắt bằng mắt thường được thể hiện qua bảng 1.2 và hình 2.6 như sau:
Bảng 2.2 Biểu hiện của âm hộ chuột cái được quan sát bằng mắt thường qua các giai đoạn của chu kì động dục
Giai đoạn của chu kỳ động dục Biểu hiện âm hộ
Tiền động dục Kích thước âm đạo mở nhưng nhỏ, màu sắc âm hộ đỏ hồng, khô, sưng nhiều và có nếp nhăn (hình A). Động dục Âm đạo lúc này mở rộng, màu sắc âm hộ hồng nhạt, khô, sưng, bóng, có nếp nhăn (hình B).
Sau động dục Kích thước âm đạo thu nhỏ lại, ít sưng hơn và có màu tái nhạt, khô và không sưng (hình C).
Kích thước âm đạo rất nhỏ, điều này cho thấy chuột ngưng tiếp nhận các hoạt động tình dục Âm hộ không sưng, khô và màu sắc tái nhạt hơn nhiều so với các giai đoạn khác (hình D).
Nguồn: Byers và cộng sự, 2012 [20], [24]
Sự thay đổi về âm hộ ở các giai đoạn khác nhau của chu kì động dục của chuột được biểu thị như hình sau:
Hình 2.6 Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột [20], [24]
CbyB6F1/J (bên trái); C57BL/6J (bên phải) [20] A: Proestrous – tiền động dục B: Estrous – động dục C: Metestrous – sau động dục D: Diestrous – nghỉ động dục
Sự thay đổi về tử cung của chuột trong chu kì động dục
Tử cung chuột có sự thay đổi lớn ở giai đoạn tiền động dục và giai đoạn động dục Ở hai giai đoạn này, tử cung trương phồng, có sự tập trung của mạch máu một cách rõ rệt do sự tuần hoàn của estrogen tăng cao Đồng thời, tử cung ướt và khô có trọng lượng nặng nhất Ở hai giai đoạn còn lại là sau động dục và nghỉ động dục hình dạng tử cung trở lại bình thường, trọng lượng ướt và khô của tử cung chuột thấp nhất ở giai đoạn nghỉ động dục - diestrous [12]
2.3.4 Các loại tế bào ở các giai đoạn của chu kì động dục của chuột
Hình 2.7 Các loại tế bào đặc trưng ở giai đoạn động dục và nghỉ động dục ở chuột [25]
Sự thay đổi về biểu hiện hành vi tình dục của chuột ở giai đoạn động dục của chu kì động dục ở chuột
Trong giai đoạn động dục, chuột cái có thể ngửi thấy mùi Pheromones của chuột đực, do đó dễ dàng bị hấp dẫn bởi chuột đực và tiếp nhận giao phối Ngược lại ở giai đoạn diestrus, chuột cái không thể ngửi thấy mùi của chuột đực, do đó không những không tiếp nhận giao phối mà thậm chí có thể trở nên hung dữ và tấn công ngược lại với chuột đực được ghép cặp.
Công nghệ cấy truyền phôi
Chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ bằng cách tiếp cận âm đạo mà không xâm lấn [17] Ngoài ra có thể chuyển phôi vào ống dẫn trứng, sừng tử cung hoặc tử cung bằng việc phẫu thuật Nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về việc ứng dụng hệ thống CRISPR – Cas9 trong việc chỉnh sửa gen, hỗn hợp này được vi tiêm vào phôi giai đoạn 2 tế bào và chuyển phôi vào ống dẫn trứng [4], [5], [7], [8], [26], [27], [28]
Tùy theo phôi được chuyển mà chúng ta có vị trí chuyển phôi khác nhau Thông thường, khi tinh dịch được phóng thích vào âm đạo chuột, tinh trùng sẽ tách khỏi tinh tương và di chuyển qua cổ tử cung để vào tử cung Tinh trùng khỏe mạnh tiếp tục di chuyển đến 1/3 ngoài của ống dẫn trứng và thụ tinh tại đây Quá trình thụ tinh diễn ra sẽ tạo ra hợp tử và phát triển thành phôi hai tế bào Phôi hai tế bào tiếp tục phát triển đến các giai đoạn 4-8 tế bào trong đoạn ống dẫn trứng Đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang thì sẽ ở vị trí gần sừng tử cung, sau khi phôi thoát nang sẽ vào tử cung để làm tổ Nghiên cứu của R Carballada và cộng sự năm 2000 [29] cho thấy trong tổng số 111 hợp tử, có 93 hợp tử phát triển đến giai đoạn 2 tế bào chiếm tỉ lệ 83,8%, số hợp tử phát triển đến giai đoạn blastocyst là 27 chiếm tỉ lệ 24% giảm 59,8% Nghiên cứu của Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 cho thấy việc nuôi phôi đến giai đoạn 2 tế bào đạt 100%, trong khi đó nuôi phôi đến giai đoạn blastocyst đạt 93%, giảm 7% so với ban đầu Đồng thời, nghiên cứu của Lifang Cui và cộng sự năm 2014 [5] cho thấy việc phẫu thuật chuyển phôi giai đoạn blastocyst được nuôi từ 1 tế bào đạt 63,3% và phôi blastocyst tự nhiên đạt 75,3% Một nghiên cứu gần đây nhất của Nguyen Van Thuan và cộng sự năm 2019 [30] trong việc thiết lập dòng phôi chuột phát sáng huỳnh quang bằng phương pháp tiêm tinh trùng trữ lạnh -80 o C vào bào tương trứng, trong đó kết quả của việc tạo phôi giai đoạn hai tế bào đạt 100% và nuôi đến được nuôi đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) thì giảm còn 83,11% ở nhóm đối chứng, nhóm sử dụng tinh trùng tươi đạt 100% ở giai đoạn hai tế bào và nuôi đến giai đoạn phôi nang thì tỉ lệ này còn 57,5%, đối với nhóm sử dụng tinh trùng gfp đạt 85,7% ở giai đoạn hai tế bào và nuôi đến giai đoạn phôi nang còn 21,2% Điều này cho thấy việc nuôi phôi trong điều kiện invitro có bất lợi cho việc phát triển của phôi Do đó, việc chuyển phôi vào cơ thể chuột mẹ nhận phôi là càng sớm càng tốt cho sự bám dính và làm tổ của phôi Vì vậy, tùy vào mục đích thí nghiệm để cân nhắc việc nuôi phôi đến giai đoạn hai tế bào hay đến giai đoạn phôi nang Ngày nay, việc chuyển phôi sử dụng phương pháp tiếp cận tử cung bằng phương pháp phẫu thuật được sử dụng ngày càng nhiều trên thế giới [28] Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành chuyển phôi giai đoạn phôi
2 tế bào, do đó chúng tôi tiếp cận chuyển phôi từ vị trí ống dẫn trứng Phôi được chuyển là phôi giai đoạn 1- 2 tế bào, do đó vị trí chuyển sẽ ở gần ampulla hoặc thông qua vòi ống dẫn trứng (infundibulum)
Bên cạnh đó, phương pháp chuyển phôi vào ống dẫn trứng là phương pháp mang lại hiệu quả cao và được các nhà nghiên cứu sử dụng rộng rãi do đó, để nghiên cứu của chúng tôi mang tính ứng dụng cao là có thể phù hợp với các nghiên cứu mới nhất, chúng tôi tiến hành tiếp cận phương pháp chuyển phôi vào ống dẫn trứng
Hình 2.8 Vị trí diễn ra sự thụ tinh tạo thành hợp tử ở chuột [31]
Hình 2.9 Chuyển phôi bằng phương pháp phẫu thuật tiếp cận ống dẫn trứng [32]
GFP – EGFP và tầm quan trọng trong nghiên cứu
GFP (Green Fluorescent Protein) một loại protein bao gồm 238 axit amin, lần đầu tiên được phân lập từ loài sứa Aequorea victoria sống ở ven biển Tây Bắc Thái Bình Dương Ở phía dưới chiếc dù xòe rộng có những mấu cơ phát sáng xanh mờ Đó là một loại protein có khả năng phát sáng màu xanh lục khi chiếu ánh sáng cực tím GFP của Aequorea victoria có đỉnh phát sáng ở bước sóng 509 nm, tương ứng với vùng ánh sáng xanh trong phổ ánh sáng nhìn thấy Người ta đã lợi dụng tính chất phát quang của gfp để dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng Gen mã hóa cho gfp được sử dụng như một gen chỉ thị trong công nghệ biến đổi di truyền Tuy nhiên gfp phát sáng không mạnh và tính bền vững chưa cao Vì vậy, vào năm
1995 Robert Y Tsien tại đại học California đã nâng cao được đặc trưng quang phổ của gfp, với cường độ phát quang cao và bền vững hơn hàng chục lần, đó chính là egfp Thay vì 238 axit amin của gfp thì egfp có 265 axit amin Hai axit amin ở vị trí
64 và 65 của gfp đã được thay thế thành Leucine và Threonine ở egfp [33] Ngày nay, việc sử dụng egfp ngày càng phổ biến trong các nghiên cứu khoa học.
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
STT Tên thiết bị Model/số seri Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Tủ vô trùng AC2-4E8 ESCO Singapore
2 Tủ ấm MCO-18AC Panasonic Nhật bản
3 Kính hiển vi soi ngược ECLIPSE NIKON Nhật
4 Kính hiển vi soi nổi Stemi 305 Carl Zeiss Đức
5 Kính hiển vi vi thao tác VMI 0510 Carl Zeiss Đức
6 Incell analyzer MH02024 GE healthcare Mỹ
7 Máy kéo kim PC-10 Narishige Nhật Bản
8 Máy cắt và uốn kim 16019 Narishige Nhật Bản
9 Máy mài kim 15050 Narishige Nhật Bản
3.1.2 Hóa chất, môi trường sử dụng cho nghiên cứu
STT Tên hóa chất, môi trường
Code Hãng sản suất Nước sản xuất
3.1.3 Động vật sử dụng cho nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 nguồn động vật:
- Chuột Mus musculus var albino (ICR) khỏe mạnh, trưởng thành về mặt sinh dục 6 – 8 tuần tuổi có trọng lượng 25 - 28 g đối với chuột cái, 25-32 g đối với chuột đực được cung cấp bởi Viện Pasteur TP HCM và được nuôi dưỡng ở phòng nuôi động vật của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Điều kiện nuôi dưỡng
22 o C - 25 o C, độ ẩm khoảng 50 – 60%, chu kì chiếu sáng là 12h sáng : 12h tối, thức ăn tự do [14], [17], [21], [34], [32] Chuột được nuôi trong lồng từ 4-5 con [35]
- Chuột ICR được nuôi dưỡng tại phòng nuôi động vật ở Khu nuôi động vật thử nghiệm của trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản Trọng lượng của chuột được sử dụng và điều kiện nuôi dưỡng như trên.
Phương pháp
Việc nghiên cứu tạo mô hình chuột mẹ mang thai hộ sẽ được thực hiện thông qua các phương pháp tạo chuột đực bất thụ, gây siêu bài noãn ở chuột cái cho phôi và sàng lọc được chuột cái ở giai đoạn động dục nhằm phối với chuột đực bất thụ chuẩn bị cho quá trình nhận phôi, đồng thời để kiểm tra kết quả của việc tạo thành công chuột mang thai hộ thì phương pháp cấy chuyển phôi sẽ được thực hiện Nghiên cứu được mô tả tóm tắt theo sơ đồ sau:
3.2.1 Tạo mô hình chuột đực bất thụ
Chuột đực bất thụ được phối với chuột cái khỏe mạnh, trưởng thành về mặt sinh dục để tạo ra chuột cái mang thai giả phục vụ cho quá trình chuyển phôi từ vị trí ống dẫn trứng đến tử cung tùy theo giai đoạn phôi được chuyển
Quy trình tạo chuột đực bất thụ được thể hiện như sau:
Chuột được gây mê sau 1 - 3 phút đối với chuột đực và 1 phút đối với chuột cái, chuột mê hoàn toàn Tiến hành phẫu thuật chuột và cắt đoạn ống dẫn tinh theo nguyên tắc sau (hình 3.1 và 3.2):
Hình 3.1 Đoạn ống dẫn tinh bị loại bỏ nhằm tạo chuột đực bất thụ [4]
Quy trình phẫu thuật chuột đực cắt ống dẫn tinh được mô tả như sau:
Hình 3.2 Các bước cắt ống dẫn tinh ở chuột đực [32]
A: Chuột đực được gây mê hoàn toàn và xử lí với cồn 70 o ở xung quanh khu vực chứa mào tinh, tinh hoàn và ống dẫn tinh Làm sạch vùng lông tại vị trí phẫu thuật, dùng kẹp nhỏ tách phần da và cơ ra khỏi nhau theo đường kẻ màu đen trên hình A, dùng dao nhỏ tạo một vết rạch nhỏ, thẳng đứng và vuông góc với hướng của đuôi, đồng thời dùng kẹp và kéo nhỏ khác kéo phần da này ra, dùng dao nhỏ khác tạo một vết rạch ở phần cơ tương ứng với vết rạch ở phần da ban đầu sao cho để lộ ống dẫn tinh ra B: Dùng kéo nhỏ kéo phần ống dẫn tinh ra ngoài C: Dùng kẹp và kéo nhỏ để cắt 1 đoạn ống dẫn tinh dài 5mm tương ứng như hình C và D E: Dùng chỉ khâu tự tiêu loại 4O để khâu miệng vết mổ lần lượt từ da đến cơ, tẩm povidine để tránh nhiễm trùng, sau đó đưa chuột trở lại buồng nuôi và theo dõi sự hồi phục của chuột
3.2.2 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân
Gây siêu bài noãn ở chuột cái được sử dụng như là một phương pháp để thu nhận trứng ở chuột cho phôi và chuột nhận phôi Trong nghiên cứu này, quá trình gây siêu bài noãn được thực hiện với PMSG và hCG
Chuột cái sau khi được gây siêu bài noãn bằng việc tiêm phúc mạc bụng với PMSG 5IU và hCG 5IU sau 46 – 48 h kể từ mũi tiêm đầu tiên với PMSG được chọn để ghép đôi với chuột đực hữu thụ theo tỉ lệ 1:1 và thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân Chuột đực sau khi giao phối sẽ được tách riêng và nghỉ ngơi một vài ngày, trong trường hợp có sự thiếu hụt chuột đực cho nghiên cứu, thì chuột đực sau giao phối phải được nghỉ ngơi ít nhất 1 ngày cho lần giao phối tiếp theo
Chuột sau khi được hy sinh nhân đạo (sacrificed) bằng kéo dãn đốt sống cổ, chuột sẽ được thu nhận buồng trứng - ống dẫn trứng – tử cung được thể hiện qua hình sau:
Hình 3.3 Quá trình thu nhận đoạn buồng trứng - ống dẫn trứng – tử cung chuột được mô tả sơ lược như sau [4] a Dùng kéo và kẹp tách phần da ở ổ bụng chuột b Chuột sau khi được tách phần cơ và đẩy nội quan ra khỏi ổ bụng, sao cho có thể quan sát thấy tử cung
Tử cung – ống dẫn trứng - buồng trứng được kéo ra ngoài bằng kéo và kẹp c: Dùng kéo và kẹp xác định vùng cần cắt d: Dùng kéo và kẹp cắt 1 đầu của tử cung, đoạn nối với ống dẫn trứng và buồng trứng, sau đó cắt phần còn lại, đoạn nối với âm đạo
3.2.3 Xác định giai đoạn động dục ở chuột nhắt trắng ICR
3.2.3.1 Các phương pháp xác định chu kì động dục
Có rất nhiều phương pháp dùng để xác định chu kì động dục ở chuột như đo trở kháng điện [36], phân tích sinh hóa nước tiểu [37], quan sát trực quan âm hộ [35], vết phết tế bào âm đạo [20] Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phương pháp quan sát trực quan âm hộ và vết phết tế bào âm đạo Đây là hai phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có tính chính xác cao [20] Ngoài ra, hai phương pháp này phù hợp cho việc tiến hành nghiên cứu tiếp theo
3.2.3.2 Phương pháp quan sát trực quan âm hộ
Phương pháp quan sát trực quan âm hộ là phương pháp dễ thực hiện, ít tốn kém và ít gây tổn hại đến động vật nghiên cứu nhất, vì âm hộ là bộ phận bên ngoài cơ thể Đây cũng là phương pháp thuận lợi nhất cho việc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo mà không làm động vật nghiên cứu trở nên căng thẳng hay hoảng sợ
Quan sát trực quan âm hộ được tiến hành như sau:
1 Cố định chuột bằng tay trái Ngón tay trỏ và ngón tay cái của bàn tay trái giữ lấy phần tai và cổ chuột, đồng thời ngón tay út và áp út kẹp lấy đuôi chuột sao cho chuột không quay đầu hay có các cử động mạnh khác
2 Hướng phần phía bụng và cơ quan sinh dục của chuột về phía người thực hiện Quan sát và ghi nhận âm hộ chuột theo các chỉ tiêu: màu sắc, hình thái, sự xuất hiện của nếp nhăn, mức độ sưng, độ ẩm ướt và kích thước của âm hộ hay trạng thái đóng hay mở của âm hộ [20], [24], [35]
3 Thả chuột nhẹ nhàng và đưa trở lại buồng nuôi
Sự thay đổi của âm hộ chuột qua các giai đoạn được thể hiện như hình sau:
Hình 3.4 Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột BALB/cByJ thuộc chủng albino [20] , [24]
A: Proestrous – tiền động dục B: Estrous – động dục C: metestrous – sau động dục D: Diestrous – nghỉ động dục
3.2.3.3 Xác định chu kì động dục ở chuột cái bằng vết phết tế bào âm đạo
Phương pháp vết tế bào âm đạo có thể tiến hành theo hai cách Dịch tế bào âm đạo sau khi được cố định trên lam kính, có hai cách để xác định sự hiện diện của các tế bào Cách thứ nhất là quan sát trực tiếp lam kính [20], [38]; cách thứ hai là nhuộm với các loại thuốc nhuộm trong phương pháp Papanicolaou [38], Crystal violet [22] hoặc thuốc nhuộm xanh methylen [20], [35], [38] Trong nghiên cứu này của chúng tôi, phương pháp nhuộm xanh methylen 1% trong vòng 45 giây được thực hiện để quan sát sự hiện diện của các loại tế bào âm đạo chuột mang thai và chuột mang thai hộ đồng thời xác định giai đoạn tiền động dục và động dục của chuột Quá trình xác định các giai đoạn của chu kì động dục bằng vết phết tế bào âm đạo được thực hiện vào lúc 8 – 9 h sáng [39] như sau:
1 Bắt chuột và giữ cố định chuột bằng tay trái sao cho âm hộ chuột hướng về phía người thực hiện để dễ dàng thao tác
2 Dựng pipet man hỳt 10 àl dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.9%) , sau đó đưa nhẹ nhàng dung dịch này vào âm đạo chuột không quá 0,5 cm [25] sao cho đầu tuýp của pipet không đụng thành âm đạo chuột Tiến hành hút, nhả dung dịch nước muối này trong âm đạo chuột 5-7 lần, sau đó hút ngược trở lại vào pipet man và rút pipet man ra khỏi âm đạo chuột một cách nhẹ nhàng Trong trường hợp đầu tuýp của pipet man chạm vào thành âm đạo chuột thì phải nhanh chóng thả chuột ra và đưa trở lại buồng nuôi để tránh làm chuột trở nên hoảng sợ và căng thẳng thêm vì khả năng rách âm đạo là rất cao hoặc gây rối loạn sinh lý chuột bởi việc mang thai giả không mong muốn ở chuột
3 Thu nhận dung dịch nước muối sinh lý chứa dịch âm đạo chuột vào eppendorf 0,2 ml
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Tạo chuột đực bất thụ
Chuột đực bất thụ được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu liên quan đến chuyển phôi vào chuột mang thai hộ [2], [4], [16], [17], [43], [47], [48] Chuột đực bất thụ có thể là do di truyền hoặc có thể được tạo ra bằng phương pháp phẫu thuật cắt hoặc thắt ống dẫn tinh Trong nghiên cứu này, nhằm có được mô hình chuột cái mang thai hộ, chúng tôi tiến hành tạo chuột đực bất thụ bằng phương pháp cắt ống dẫn tinh ở chuột đực hữu thụ
Hình 4.1 Ống dẫn tinh được cắt thành công bằng kẹp nhiệt
(mũi tên màu đen cho thấy sự tách biệt rõ ràng của ống dẫn tinh và không gây chảy máu)
Hình 4.2 Sau 7 ngày, vết mổ hoàn toàn khép kín cùng với sự hoạt động bình thường trở lại của chuột đực sau khi cắt ống dẫn tinh A: Vết may ngay sau khi phẫu thuật cắt ống dẫn tinh B: Vết may hồi phục sau 4 ngày C: Vết may hồi phục sau 8 ngày D: Vết may hồi phục hoàn toàn sau 7 ngày, miệng vết may khép kín hoàn toàn, không có dấu hiệu nhiễm trùng
Bảng 4.1 Tỉ lệ chuột đực bất thụ được tạo nên bằng phương pháp cắt ống dẫn tinh
Lô TN Số con/lô Độ tuổi (tuần) Cân nặng (g) Tỉ lệ chuột đực bất thụ (%)
3/5 4/5 5/5 Trong nghiên cứu này của chúng tôi, chuột đực sau khi phẫu thuật cắt ống dẫn tinh quan sát thấy ống dẫn tinh bị tách thành hai phần riêng biệt và không có dấu hiệu chảy máu hay xuất huyết nội mô (hình 4.1), đồng thời quá trình hồi phục diễn ra một cách tự nhiên và không có đặc điểm bất thường, cụ thể là vết mổ hoàn toàn khép kín, không nhiễm trùng (hình 4.2) và sinh hoạt bình thường sau 14 ngày kể từ ngày phẫu thuật Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy đạt tỉ lệ 80% (12/15) chuột đực bất thụ được tạo ra bằng phương pháp cắt ống dẫn tinh Các chuột này được ghép đôi với chuột cái hữu thụ Các chuột cái được ghép đôi có dấu hiệu giao phối là một lớp màu vàng nhạt hoặc trắng đục sẽ được theo dõi và không có dấu hiệu mang thai và sinh con sau 19±3 ngày Điều này cho thấy chúng tôi đã có được mô hình chuột đực bất thụ cho nghiên cứu tạo chuột mẹ mang thai hộ Chuột mang thai hộ sẽ được tạo ra khi ghép đôi chuột đực bất thụ với chuột cái ở giai đoạn động dục.
Biểu hiện của âm hộ chuột cái ở giai đoạn động dục
Âm hộ của chuột là phần nằm bên ngoài cơ thể chuột, do đó có thể dễ dàng quan sát bằng mắt thường hàng ngày Nhóm nghiên cứu quan sát 3 lô thí nghiệm, mỗi lô 3 con, thí nghiệm được lặp lại 3 lần và có kết quả như sau:
Chu kì động dục của chuột nhắt trắng Mus musculus var albino diễn ra trong vòng 4 ngày Trong đó giai đoạn động dục được xác định là có âm hộ mở, màu hồng nhạt và có nếp nhăn [20], [25] được chúng tôi chọn lọc chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo Chuột ở các giai đoạn sau động dục và nghỉ động dục có âm hộ thu nhỏ lại, đặc biệt đối với chuột ở giai đoạn nghỉ động dục có âm hộ ẩm ướt và màu tái nhạt đi so với các giai đoạn khác cho thấy chuột không đang ở giai đoạn tiếp nhận sự giao phối, do đó được đưa trở lại buồng nuôi để tiếp tục theo dõi
Sự thay đổi của âm hộ chuột được thể hiện như hình bên dưới:
Hình 4.3 Âm hộ chuột qua các giai đoạn của chu kì động dục a: Tiền động dục Âm hộ mở, có nếp nhăn, màu hồng nhạt b: Động dục Âm hộ mở rộng, có nếp nhăn, màu hồng c: Sau động dục Âm hộ thu nhỏ trở lại d: Nghỉ động dục Âm hộ có màu tái nhạt đi so với các giai đoạn khác, ẩm ướt Bảng 4.2 Tỉ lệ chuột cái động dục thu được bằng quan sát trực quan âm hộ
Số lượng chuột có các biểu hiện của giai đoạn động dục
Số lượng chuột không có biểu hiện động dục
Tỉ lệ chuột cái động dục thu được
5/9 (55,56%) 4/9 (44,44%) 6/9 (66,67%) Mặc dù việc quan sát trực quan âm hộ dựa vào kinh nghiệm của người nghiên cứu rất nhiều, tuy nhiên, bằng việc tiếp cận và học hỏi các nghiên cứu trên thế giới về việc chọn chuột cái giai đoạn động dục bởi các biểu hiện như âm hộ sưng, có nếp nhăn, hồng, ít ẩm ướt (hình 4.3b), nhóm nghiên cứu đã kế thừa các kết quả nghiên cứu của các nghiên cứu trên thế giới nhằm làm cơ sở để thực hiện nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi Và chúng tôi đã thu nhận được kết quả ở hình 4.3 và bảng 4.3, trong đó có 15 chuột cái động dục trong tổng số 27 chuột cái được sử dụng, chiếm tỉ lệ 55,56% Chu kì động dục ở chuột thông thường kéo dài 4 – 5 ngày, tùy theo từng chủng chuột khác nhau Do đó, cứ 4-5 ngày sẽ có 1 chuột động dục, hay nói cách khác sẽ có ít nhất 25% chuột động dục được lựa chọn Trong nghiên cứu này, vì đã có cơ sở là các kết quả từ các nghiên cứu trên thế giới đã được nêu ở trên, do đó nhóm nghiên cứu thu nhận được kết quả là 55,56%, đây là các kết quả dựa trên tính khoa học và là nguồn động lực lớn cho nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tiếp theo Tuy nhiên, để đảm bảo các chuột mà chúng tôi lựa chọn được chắc chắn là các chuột động dục, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng sự hiện diện của tế bào biểu mô sừng hóa không nhân trên vết phết tế bào âm đạo.
Sự hiện diện của các loại tế bào trên vết phết tế bào âm đạo (vaginal smear) chuột ở giai đoạn động dục
Nhằm xác định chính xác các giai đoạn động dục của chuột và so sánh sự tương quan với phương pháp trực quan âm đạo, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của các loại tế bào trong dịch âm đạo chuột cái
Dịch tế bào âm đạo sau khi được cố định và nhuộm với xanh methylen 1% trong 45 giây, sau đó tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học Kết quả được thể hiện như hình và bảng sau:
Hình 4.4 Bốn giai đoạn của chu kỳ động dục được xác định qua các loại tế bào có trong mẫu phết âm đạo (20X) a: Tiền động dục Mũi tên màu vàng: Tế bào biểu mô có nhân, b: Động dục Mũi tên màu đen: tế bào biểu mô sừng hóa, c: Sau động dục d: Nghỉ động dục Mũi tên màu đỏ: tế bào bạch cầu Để tạo chuột cái mang thai giả, Shatoshi Kishigami và cộng sự năm 2006 [16], Lars M Ittner & Ju¨rgen Go¨tz và cộng sự năm 2007 [4] chọn chuột giai đoạn động dục Năm 1973 Arthur K Champlin và cộng sự [35] đã đưa ra phương pháp xác định chu kì động dục đơn giản, ít chi phí bằng vết phết tế bào âm đạo với sự hiện diện của các loại tế bào đặc trưng, trong đó ở giai đoạn động dục là các tế bào biểu mô sừng hóa không nhân (hình 4.4b) Phương pháp vết phết tế bào âm đạo được xem là phương pháp chính xác nhất trong việc xác định chu kì động dục [20]
E Aliagas và cộng sự năm 2009 [49], Shanmugam Achiraman và cộng sự năm 2011 [37], C.C Paccola và cộng sự năm 2013 [50], Chun Fu và cộng sự năm 2016 [39], Hoon Jang [34], Aderbal S Aguiar Jr và cộng sự [22], Sanjida Mahjabeen và cộng sự [23] năm 2018, Gabriela Manzano Nieves và cộng sự năm 2019 [51] xác định các giai đoạn động dục ở chuột bằng việc áp dụng phương pháp vết phết tế bào âm đạo cho mục đích nghiên cứu của họ Điều này cho thấy phương pháp chu kì động dục hay giai đoạn động dục bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo là phương pháp phổ biến và chính xác, đã được áp dụng rộng rãi từ năm 1973 cho đến nay Tuy nhiên, vì mục đích nghiên cứu của chúng tôi là tiếp tục sử dụng chuột ở giai đoạn động dục cho quá trình giao phối và chuyển phôi sau đó mà không làm ảnh hưởng đến sinh lý của chuột trước khi chuyển phôi [20], vì nhiều lí do trên, chúng tôi sử dụng phương pháp không xâm lấn là phương pháp quan sát trực quan âm hộ làm phương pháp chính Trong nghiên cứu này, sau khi xác định chu kì động dục bằng phương pháp quan sát trực quan âm hộ, nhằm xác định chính xác giai đoạn động dục bằng phương pháp quan sát trực quan âm hộ vì vậy phương pháp vết phết tế bào âm đạo được xem như là một phương pháp đối chứng Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm dịch âm đạo với xanh methylene 1% và ghi nhận được kết quả với sự hiện diện của các tế bào đặc trưng là tế bào biểu mô sừng hóa không nhân ở giai đoạn động dục Cùng quan điểm với nhóm nghiên cứu, Justin D Vidal và cộng sự năm 2017 [25] cũng đã xác định chu kì động dục bằng phương pháp quan sát trực quan âm hộ và sau đó là bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo M.M El Mahady và cộng sự năm 2015 [52], Narges Bagheripour và cộng sự năm 2016 [53] cũng sử dụng phương pháp nhuộm dịch âm đạo với xanh methylene để xác định chu kì động dục và xác định giai đoạn động dục với sự hiện diện của tế bào biểu mô sừng hóa không nhân ở giai đoạn động dục
Bảng 4.3 Sự tương quan của phương pháp quan sát trực quan âm đạo và vết phết tế bào âm đạo
Số chuột được chọn lọc giai đoạn động dục bằng PP quan sát trực quan âm hộ
Số chuột có sự hiện diện của các tế bào biểu mô sừng hóa không nhân
Tỉ lệ tương quan của hai phương pháp (%)
Trong nghiên cứu này, các chuột được chúng tôi chọn lọc là chuột ở giai đoạn động dục bằng phương pháp quan sát trực quan âm hộ làm vật liệu cho quá trình nghiên cứu tiếp theo, do đó chúng tôi không xác định các giai đoạn còn lại là tiền động dục (proestrus) với sự hiện diện của tế bào đặc trưng là tế bào biểu mô có nhân (hình 4.4 a), sau động dục (metestrus) với sự hiện diện của cả ba loại tế bào (hình 4.4 c) hay giai đoạn nghỉ động dục (diestrus) với sự hiện diện của yếu là tế bào bạch cầu (hình 4.4 d)
Từ kết quả về sự tương quan mà nhóm nghiên cứu ghi nhận và làm chủ được giữa hai phương pháp trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp quan sát trực quan âm hộ làm phương pháp chính để chọn lọc chuột ở giai đoạn động dục chuẩn bị cho quá trình tạo chuột cái mang thai hộ vì đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp và đặc biệt là không làm ảnh hưởng đến tâm lý cũng như sinh lý của chuột trong quá trình thí nghiệm Song song với quá trình tạo chuột mang thai hộ nhằm thực hiện quá trình chuyển phôi bằng việc tạo chuột đực bất thụ cho ghép đôi với chuột cái thì nguồn hợp tử được vi tiêm egfp cũng được chuẩn bị.
Kiểm tra sự hoạt động của egfp
Để đảm bảo sự hoạt động của egfp, plasmid mang gen egfp được biến nạp vào tế bào HEK293T và kiểm tra sự hoạt động của egfp dưới kính hiển vi huỳnh quang với sự phát sáng màu xanh lục của tế bào HEK293T [5] Thí nghiệm lặp lại 3 lần nhằm kiểm tra sự ổn định của sự biểu hiện của egfp Kết quả cho thấy sau 24h kể từ lúc biến nạp egfp, tế bào HEK293T phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang (hình 4.5) Điều này chứng minh sự hoạt động của egfp là bình thường Vì vậy, egfp sẽ được chúng tôi sử dụng như là một dấu hiệu để vi tiêm vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân được chuyển vào chuột mẹ mang thai hộ Điều này làm cơ sở cho việc tiến hành sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho quá trình vi tiêm egfp
Hỡnh 4.5 tế bào HEK293T dưới kớnh hiển vi huỳnh quang (thang đo: 100 àm) A: Quan sát dưới ánh sáng trắng B: Quan sát dưới ánh sánh kích thích với sự phát sáng huỳnh quang xanh của egfp.
Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân cho quá trình vi tiêm
Hợp tử giai đoạn hai tiền nhân được chuẩn bị cho quá trình vi tiêm egfp vào tiền nhân đực nhằm tạo chuột phát sáng huỳnh quang như một dấu hiệu để kiểm tra sự khác nhau về mặt huyết thống với chuột mẹ nhận phôi Quá trình thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân được kế thừa và thực hiện theo các công trình đã công bố rộng rãi trên thế giới [4], [8], [27], [44], [54], [55] được mô tả sơ lược như sau: Chuột cái khỏe mạnh, trưởng thành về mặt sinh dục được gây siêu bài noãn bằng 5
IU PMSG và 5 IU hCG sau 46 – 48 giờ, sau đó được phối với chuột đực hữu thụ và kiểm tra nút nhầy âm đạo và cuối cùng là thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho quá trình vi tiêm egfp
Bảng 4.4 Số hợp tử thu nhận cho quá trình vi tiêm egfp
Lô TN Số chuột sử dụng
Số phôi thu nhận được
Số phôi được vi tiêm
Số phôi được chuyển phôi sau vi tiêm
Kết quả bảng 4.5 cho thấy với liều tiêm hormone PMSG, hCG là 5 IU thì nhóm nghiên cứu chúng tôi nhu nhận được trung bình 32,64 hợp tử giai đoạn hai tiền nhân (359/12) Đối với các chuột ở độ tuổi sinh sản bình thường sẽ cho 8-12 chuột con/ lần sinh sản Như vậy kết quả thu nhận hợp tử như trên hoàn toàn đáng ghi nhận cho việc tối thiểu hóa số động vật sử dụng Các phôi sau khi vi tiêm được đánh giá sự sinh trưởng và phát triển, sau đó chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ
Hình 4.6 Hợp tử giai đoạn hai tiền nhân
Hình 4.7 Vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho quá trình chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ
Trong nghiên cứu này, với quy trình thực hiện như trên, chúng tôi ghi nhận dấu hiệu thụ tinh được thể hiện bằng sự hiện diện của hợp tử giai đoạn hai tiền nhân hoặc có sự xuất hiện của hai thể cực Sau đó, các hợp tử quan sát thấy rõ ràng các tiền nhân sẽ được lựa chọn, các hợp tử bất thường như chỉ có một tiền nhân, có ba tiền nhân, màng bào tương không tròn đều… bị loại bỏ Như vậy, quá trình sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân (hình 4.6) của chúng tôi đã thành công Các hợp tử này được chuẩn bị cho quá trình vi tiêm egfp (hình 4.7) và chuẩn bị cho quá trình chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ.
Tạo chuột cái mang thai hộ
Chuột cái mang thai hộ 0,5 dpc (days postcoitum) được sử dụng cho chuyển phôi vào ống dẫn trứng; 2,5 dpc được sử dụng cho chuyển phôi vào tử cung
Chuột cái mang thai hộ được cho là thành công khi có dấu hiệu giao phối với sự hiện diện của một lớp màu trắng đục hoặc vàng nhạt ở nút nhầy âm đạo (hình 4.8 B) và sự hiện diện của đoạn bóng (ampulla) trên ống dẫn trứng chuẩn bị cho quá trình nhận phôi như hình 4.9 B Sau quá trình chuyển phôi, chuột nhận phôi có dấu hiệu mang thai
Bảng 4.5 Tỉ lệ thành công của việc tạo chuột cái mang thai giả
Số chuột có sự hiện diện của ampulla (%)
Số chuột được sử dụng chuyển phôi
Trong tổng số 17 con chuột được kiểm tra dấu hiệu giao phối thành công (hình 4.8) để tạo chuột cái mang thai giả, có 14 trong số 17 (81,67%) chuột cái nhận phôi (pseudopregnant recipient females) được sử dụng để chuyển phôi 3 trong số
17 (18,33%) chuột không được sử dụng để chuyển phôi mặc dù trước đó có sự hiện diện của sự giao phối thành công (hình 4.8 B) Điều này cho thấy việc kiểm tra vị trí nhận phôi là ống dẫn trứng không có đoạn bóng (hình 4.9 A) và có đoạn bóng (4.9 B) sau quá trình giao phối thành công với chuột đực bất thụ là hết sức quan trọng, là yếu tố quyết định việc chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột mẹ mang thai hộ
Hình 4.8 Âm hộ chuột cái A: Chưa giao phối hoặc giao phối không thành công B: Giao phối thành công
(một lớp màu vàng nhạt hoặc trắng đục)
Hình 4.9 Ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ A: Ống dẫn trứng chuột cái không có ampulla B: Ống dẫn trứng chuột cái với sự hiện diện của ampulla rõ rệt chuẩn bị cho quá trình chuyển phôi C: Ống dẫn trứng chuột cái sau khi được chuyển phôi với sự hiện diện của bong bóng khí bên trong D: Kim chuyển phôi (transfer pipette) được sử dụng cho quá trình chuyển phôi với sự đan xen của các đoạn môi trường – không khí – môi trường – không khí – môi trường
Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành chuyển phôi giai đoạn 1 - 2 tế bào vào đoạn ống dẫn trứng Hình 4.9 C cho thấy sự hiện diện của bong bóng khí nhằm đảm bảo các phôi bên trong kim chuyển phôi (hình 4.9 D) được đẩy vào ống dẫn trứng và để đảm bảo thêm một lần nữa, các kim chuyển phôi sau khi chuyển phôi cũng được kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi để chắc chắn không còn phôi nào còn sót lại trong kim, đồng thời bong bóng khí này giúp cho môi trường lỏng chứa phôi không bị trào ra khỏi ống dẫn trứng, làm cơ sở cho việc theo dõi dấu hiệu mang thai của chuột sau khi đưa chuột mang thai hộ trở lại buồng nuôi (hình 4.10)
Bảng 4.6 Tỉ lệ thành công của sự hình thành chuột mẹ mang thai hộ qua quá trình chuyển phôi
Số phôi được sử dụng
Số phôi được chuyển vào ống dẫn trứng
Số chuột mẹ mang thai /chuột mang thai hộ được sử dụng (%)
Số chuột con sinh ra biểu hiện huỳnh quang /chuột con được sinh ra
(đối chứng – không vi tiêm egfp)
Hình 4.10 Lồng chuột nuôi các chuột nhận phôi sau quá trình chuyển phôi
Theo dõi sự mang thai của chuột mẹ từ 7 ngày cho đến 19 ngày sau chuyển phôi Dựa vào kết quả ở bảng 4.4, chúng tôi ghi nhận được 4/4 chuột mang thai hộ mang thai ở nhóm đối chứng và 10/10 chuột mang thai sau quá trình chuyển phôi ở nhóm vi tiêm egfp Điều này cho thấy nhóm nghiên cứu đã tạo được mô hình chuột mẹ mang thai hộ với tỉ lệ thành công cao Làm chủ được quy trình nghiên cứu nhằm ứng dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Chuột con sẽ được sinh ra sau 19±3 ngày đồng thời kiểm tra huyết thống với chuột mẹ mang thai hộ
Theo dõi sự mang thai của chuột mẹ từ 7 ngày cho đến 19 ngày sau chuyển phôi Hình 4.11 cho thấy quá trình mang thai ở chuột sau chuyển phôi Cụ thể ở hình 4.11 B cho thấy có sự hồi phục vết thương ở lưng, có sự tăng kích thước của vú và tăng nhẹ về trọng lượng Hình 4.11 C cho thấy sự tăng trọng lượng một cách rõ rệt, điều này chứng minh sự quá trình tạo chuột mẹ mang thai hộ và chuyển phôi là thành công Chuột con sẽ được sinh ra sau 19±3 ngày đồng thời kiểm tra huyết thống của chuột con được sinh ra và chuột mẹ nhận phôi
Hình 4.11 Theo dõi quá trình mang thai của chuột mang thai hộ sau khi chuyển phôi
A: Chuột vừa được chuyển phôi ngày 0,5 B: Chuột nhận phôi có dấu hiệu mang thai sau 7,5 ngày C: Chuột nhận phôi mang thai sau 18,5 ngày
Kiểm tra huyết thống của chuột mẹ mang thai hộ và chuột con sinh ra
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng chuột cái khỏe mạnh giao phối với chuột đực bất thụ, điều này dẫn đến trong ống dẫn trứng của chuột cái nhận phôi không có tinh trùng, do đó không có sự hình thành phôi thai của bản thân chuột nhận phôi Từ đó nhóm nghiên cứu có thể dễ dàng kết luận toàn bộ chuột con sinh ra sẽ khác nhau về mặt huyết thống với chuột nhận phôi Bên cạnh đó, chúng tôi sử dụng các phôi được vi tiêm plasmid mang gen egfp để chuyển phôi và chuột mẹ nhận phôi là chuột không mang gen egfp, do đó chuột con sinh ra phát sáng huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích (hình 4.12 và bảng 4.4) được xem là sự thành công của quá trình tạo chuột mẹ mang thai hộ, chuyển phôi
Toàn bộ chuột con sinh ra được nhóm nghiên cứu kiểm tra biểu hiện huỳnh quang dưới kính hiển vi soi nổi có gắn huỳnh quang (hình 4.12) với bước sóng 530-
550 nm [56] và ghi nhận thấy sự phát sáng màu xanh lục với sự biểu hiện của protein egfp như hình bên dưới
Hình 4.12 Hệ thống kính hiển vi soi nổi có gắn huỳnh quang được sử dụng cho việc kiểm tra sự biểu hiện phát sáng huỳnh quang của chuột con
Hình 4.13 Chuột phát sáng huỳnh quang của protein egfp
A1, B1, C1: ánh sáng trắng A2, B2, C2: ánh sáng kích thích có bước sóng 530 –
550 nm Trong đó cặp đôi A1, A2 chuột bên trái là chuột không mang gen, chuột bên phải mang gen biểu hiện huỳnh quang egfp B1, B2: Chuột không mang gen biểu hiện huỳnh quang egfp C1, C2: Chuột mang gen biểu hiện huỳnh quang egfp
Nhằm chứng minh việc tạo thành công chuột mẹ mang thai hộ, chúng tôi đã chuyển phôi bằng phương pháp tiếp cận vị trí chuyển phôi thông qua ống dẫn trứng Dựa vào bảng 4.4 cho thấy trong 14 lần chuyển phôi đều cho 14 chuột mẹ mang thai hộ thành công với tỉ lệ 100%, trong đó ở lô đối chứng đối với phôi không vi tiêm, chúng tôi thu nhận được tỉ lệ chuyển phôi là 71,83% và ở thí nghiệm sử dụng phôi vi tiêm DNA chúng tôi thu nhận được tỉ lệ chuyển phôi là 65,69% Mặc dù rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh egfp không gây hại cho tế bào và được xem là một dấu hiệu nhận biết việc chuyển gen vào phôi hay tế bào, tuy nhiên Mohamed S Hassanane và cộng sự năm 2017 [42] chứng minh rằng việc chuyển gen ngoại lại vào tế bào làm giảm khả năng phân chia thành 2 tế bào, điều này lí giải vì sao kết quả chuyển phôi ở lô đối chứng không vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân lại có kết quả chuyển phôi và mang thai cao hơn lô thí nghiệm Về việc chuyển phôi thì Masahito Ikawa và cộng sự trong nghiên cứu của họ đã sử dụng 12 chuột mang thai hộ, và ghi nhận được 9 chuột mang thai chiếm tỉ lệ 75% Pablo Gonza´lez-Jara năm 2017 chuyển phôi giai đoạn 2 tế bào vào ống dẫn trứng trong tổng số 391 con chuột được chuyển phôi có 333 chuột mang thai đạt tỉ lệ thành công 85,2% và trong tổng số 5029 phôi được chuyển có 1824 phôi được chuyển thành công chiếm tỉ lệ thành công là 36,26% [28] Như vậy các kết quả trên của chúng tôi đã chứng minh việc tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm phục vụ các nghiên cứu tạo chuột chuyển gen và chuyển phôi từ vị trí ống dẫn trứng là điều cần thiết [57] Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận được 2/134 chuột con sinh ra phát sáng huỳnh quang, đạt tỉ lệ 1,49% là kết quả khiêm tốn so với các nghiên cứu trên thế giới Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên, để tạo ra động vật biến đổi di truyền, tùy theo mục đích sử dụng mà chuột được chọn lựa phù hợp Các nghiên cứu liên quan đến việc tạo ra chuột biến đổi gen sử dụng chuột thuần chủng, trong khi đó vì điều kiện không cho phép, ở Việt Nam chưa có chuột thuần chủng để nghiên cứu mà chủ yếu là chuột nhắt trắng có sự biến đổi về bộ gen (chuột không thuần chủng), điều này lí giải tại sao tỉ lệ tạo chuột phát sáng huỳnh quang có kết quả thấp Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu của chúng tôi trong việc tạo thành công mô hình chuột mang thai hộ góp phần cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc thực hiện các nghiên cứu liên quan đến việc tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp Crispr/cas 9 mà thế giới đang đẩy mạnh nghiên cứu nhằm đưa các nghiên cứu của Việt Nam tiến đến gần hơn với các nghiên cứu trên thế giới.