Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo mô hình chuột mang thai hộ nhằm ứng dụng tạo chuột chuyển gen

PHAN NGỌC UYÊN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO MÔ HÌNH CHUỘT MANG THAI HỘ NHẰM ỨNG DỤNG TẠO CHUỘT CHUYỂN GEN

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

Cán bộ chấm nhận xét 2 :

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày 14 tháng 01 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 PGS TS Nguyễn Đức Lượng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phan Ngọc Uyên Phương MSHV: 1570770 Ngày, tháng, năm sinh: 26/03/1991 Nơi sinh: Quảng Trị Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo mô hình chuột mang thai hộ nhằm tạo chuột

chuyển gen

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Xác định giai đoạn động dục ở chuột cái bằng phương pháp quan sát trực quan âm đạo thông qua phương pháp vết phết tế bào âm đạo

 Tạo chuột mẹ mang thai hộ thành công bằng phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng và theo dõi chuột mẹ mang thai sau khi chuyển phôi

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/08/2019

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2019 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình

Tp HCM, ngày tháng năm 20

TRƯỞNG KHOAKỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn đến quý Thầy, Cô đã giảng dạy trong chương trình Cao học Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM đã hết lòng truyền nhiệt huyết cũng như kiến thức quý giá giúp tôi hoàn thành tốt luận văn cũng như trong cuộc sống

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ khoa học

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Giáo sư Fumihiro Sugiyama, Phó giáo sư Seiya Mizuno, Tiến sĩ Đinh Thị Hương Trà, chị Tanimoto, chị Kato, Chị Daitoku, chị Okano, nghiên cứu sinh Suziki và toàn thể anh, chị, em, bạn bè tại Khu nuôi động vật thử nghiệm ở Trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn

Cám ơn tập thể lớp cao học và tất cả các anh, chị, em các khóa học, đặc biệt là chị Nguyễn Thị Anh Thư đã động viên tinh thần giúp tôi vượt qua nhiều khó khăn trong suốt thời gian học tại trường

Cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học đã tài trợ nguồn kinh phí để tôi thực hiện luận văn thạc sĩ này Đồng thời, gửi lời cảm ơn đến các anh, chị, em, bạn bè thuộc Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Động vật – Trung tâm Công nghệ Sinh học

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã tạo nguồn động viên để tôi hoàn thành khóa học này

Xin chân thành cảm ơn!

Phan Ngọc Uyên Phương

TÓM TẮT

Việc tạo chuột mẹ mang thai hộ đóng vai trò quan trọng trong việc tạo chuột biến đổi gen phục vụ các nghiên cứu khoa học đặc biệt là các lĩnh vực liên quan đến y sinh học Mặc dù việc tạo chuột mẹ mang thai hộ đã được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nào được công bố liên quan đến việc chuyển phôi mang gen ngoại lai vào chuột mẹ mang thai hộ Các nghiên cứu liên quan đến tạo phôi chuột chuyển gen đã được nghiên cứu ở Việt Nam, tuy nhiên để có thể tạo được sinh vật chuyển gen, các phôi này phải được chuyển vào chuột mẹ mang thai hộ để sinh chuột con mang gen Vì vậy nghiên cứu của chúng tôi có tiềm năng rất lớn trong việc ứng dụng tạo chuột biến đổi di truyền Trong nghiên cứu này, phương pháp tạo mô hình chuột mẹ mang thai hộ được thực hiện như sau: Đầu tiên, chuột đực hữu thụ được phẫu thuật cắt ống dẫn tinh và giao phối với chuột cái hữu thụ nhằm kiểm tra kết quả bất thụ Chuột cái cho phôi được gây siêu bài noãn bằng 5 IU PMSG và 5 IU hCG, giao phối với chuột đực hữu thụ và thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho quá trình vi tiêm

gen egfp vào tiền nhân đực Các phôi giai đoạn 1-2 tế bào này sau đó được chuyển

vào ống dẫn trứng của chuột mẹ mang thai hộ nhằm kiểm tra hiệu quả của việc tạo chuột mẹ mang thai hộ Mặt khác, chuột cái hữu thụ khác sẽ được xác định giai đoạn động dục bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo làm đối chứng với phương pháp quan sát trực quan âm đạo Các con chuột ở giai đoạn động dục được sàng lọc và ghép đôi với chuột đực bất thụ, sau đó kiểm tra dấu hiệu giao phối ở nút nhầy âm đạo Đối với những chuột có dấu hiệu giao phối thành công sẽ được phẫu thuật mở lưng kiểm tra vị trí chuyển phôi với sự hiện diện của sự trương phồng ở ống dẫn trứng và cuối cùng là chuyển phôi vào ống dẫn trứng, theo dõi quá trình mang thai sau 7 ngày đến 19±3 ngày Kết quả cho thấy chuột đực bất thụ đạt tỉ lệ 80% Đối với chuột cái, nhóm nghiên cứu đã xác định được giai đoạn động dục với sự hiện diện của tế bào đặc trưng là tế bào biểu mô sừng hóa không nhân đồng thời đó là trực quan âm đạo sưng, mở rộng, màu hồng, ít ẩm ướt Các chuột ở giai đoạn động dục được quan sát bằng mắt thường này sau đó được giao phối với chuột đực bất thụ và cho tỉ lệ giao phối thành công của việc tạo chuột mang thai giả là 81,67%

Toàn bộ chuột mang thai giả với sự xuất hiện của đoạn bóng cho quá trình chuyển phôi giai đoạn 1-2 tế bào đạt tỉ lệ 100% chuột nhận phôi mang thai Trong đó có 2/134 chuột phát sáng huỳnh quang chiếm tỉ lệ 1,49% Mặc dù tỉ lệ chuột phát sáng huỳnh quang là chưa cao, tuy nhiên các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy tiềm năng to lớn của việc tạo mô hình chuột mang thai hộ bằng phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng nhằm hướng đến tạo chuột chuyển gen

ABSTRACT

The creation of surrogate mothers plays an important role in creating genetically modified mice for scientific researches, especially in biomedical fields Although surrogate mother mice have been studied and widely applied in the world, but in Viet Nam has not been any published related to transfer of embryos carrying DNA into recipient foster mice So our research has great potential for the application of genetically engineered mice In this study, the method of creating a model of surrogate mother was performed as follows: at first, the male mice were surgically cut vasa deferens and mate with the female mice in order to check the results Females were superovulated, first by 5 IU PMSG injection, then 46 – 48 h later by 5 IU hCG injection After that, Females were placed with males for

collecting Pronuclear-stage embryos and microinjection egfp into these embryos

These 1-2 stage embryos were then transferred to the oviducts of surrogate mothers On the other hand, other female mice will be identified as the estrus (estrous) stage by vaginal cytology as a control against visual observation Estrus females were screened and paired with vasectomized ICR males and were checked copulation plug and collect ICR females with vaginal plug to check position of embryo transfer is ampulla and then reimplantation of injected embryos Pregnancy female mice after 7 days to 19-21 days The results showed that male infertility was 80% For female mice, the team identified the estrus stage with the presence of cornified epithelial cell and visual, pink, less wet vaginal were paired with together infertility male mice and the success rate of mating mice was 81.67% The whole of pseudo pregnant mice were used for transferring of 1 – 2 stage embryo, reached the rate of 100% of mice receiving pregnant embryos In which 2/134 fluorescing mice accounted for 1.49% Although the ratio of mice with fluorescent fluorescence is not high, the results of this study show the great potential of creating surrogate mice model by surgical transfer of embryos into the fallopian tubes to guide to create transgenic mice

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực và được thực hiện bởi chính nhóm nghiên cứu của chúng tôi

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Học viên

Phan Ngọc Uyên Phương

2.3.4 Các loại tế bào ở các giai đoạn của chu kì động dục của chuột 10

2.4 Công nghệ cấy truyền phôi 11

2.5 GFP – EGFP và tầm quan trọng trong nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Vật liệu 14

3.1.1 Thiết bị, dụng cụ 14

3.1.2 Hóa chất, môi trường sử dụng cho nghiên cứu 14

3.1.3 Động vật sử dụng cho nghiên cứu 15

3.2 Phương pháp 15

3.2.1 Tạo mô hình chuột đực bất thụ 16

3.2.2 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 17

3.2.3 Xác định giai đoạn động dục ở chuột nhắt trắng ICR 18

3.2.3.1 Các phương pháp xác định chu kì động dục 18

3.2.3.2 Phương pháp quan sát trực quan âm hộ 18

3.2.3.3 Xác định chu kì động dục ở chuột cái bằng vết phết tế bào âm đạo 19

3.2.4 Thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 23

3.2.4.1 Chuẩn bị đĩa vi giọt môi trường cho quá trình thu nhận hợp tử giai đoạn 2 tiền nhân 23

3.2.4.2 Gây siêu bài noãn chuột cái và thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân

24

3.2.5 Kiểm tra sự hoạt động của plasmid mang gen egfp 25

3.2.6 Chuẩn bị egfp cho quá trình vi tiêm 25

3.2.7 Vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 27

3.2.8 Kiểm tra sự phát triển của hợp tử và biểu hiện huỳnh quang của phôi giai đoạn 2 tế bào 27

3.2.9 Nuôi phôi và chọn lọc các phôi được chuyển 28

3.2.10 Phương pháp kiểm tra huyết thống chuột mẹ mang thai hộ và chuột con sinh ra 33

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34

4.1 Tạo chuột đực bất thụ 34

4.2 Biểu hiện của âm hộ chuột cái ở giai đoạn động dục 35

4.3 Sự hiện diện của các loại tế bào trên vết phết tế bào âm đạo (vaginal smear) chuột ở giai đoạn động dục 37

4.4 Kiểm tra sự hoạt động của egfp 39

4.5 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân cho quá trình vi tiêm 40

4.6 Tạo chuột cái mang thai hộ 41

4.7 Kiểm tra huyết thống của chuột mẹ mang thai hộ và chuột con sinh ra 45

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Quá trình tạo chuột biến đổi gen áp dụng mô hình chuột mang thai hộ 5

Hình 2.2 Quy trình tạo chuột chuyển gen 5

Hình 2.3 Cơ quan sinh sản ở chuột 7

Hình 2.4 Cơ quan sinh sản của chuột đực; bao gồm ống dẫn tinh, mào tinh hoàn và tinh hoàn 7

Hình 2.5 Sự thay đổi hàm lượng progesterone và estradiol trong suốt quá trình động dục ở chuột 9

Hình 2.6 Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột 10

Hình 2.7 Các loại tế bào đặc trưng ở giai đoạn động dục và nghỉ động dục ở chuột 10

Hình 2.8 Vị trí diễn ra sự thụ tinh tạo thành hợp tử ở chuột 12

Hình 2.9 Chuyển phôi bằng phương pháp phẫu thuật tiếp cận ống dẫn trứng 13

Hình 3.1 Đoạn ống dẫn tinh bị loại bỏ nhằm tạo chuột đực bất thụ 16

Hình 3.2 Các bước cắt ống dẫn tinh ở chuột đực 16

Hình 3.3 Quá trình thu nhận đoạn buồng trứng - ống dẫn trứng – tử cung chuột được mô tả sơ lược như sau 18

Hình 3.4 Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột BALB/cByJ thuộc chủng albino 19

Hình 3.5 Quá trình thu nhận dịch âm đạo ở chuột 21

Hình 3.6 Nhỏ 1 giọt dung dịch có chứa dịch âm đạo chuột lên lam kính được đánh số thứ tự 21

Hình 3.7 Sự hiện diện của các tế bào qua các giai đoạn của chu kì động dục được xác định bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo và quan sát ở mẫu tươi 22

Hình 3.8 Sự hiện diện của các tế bào qua các giai đoạn của chu kì động dục được xác định bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo và nhuộm H&E 22

Hình 3.10 Vị trí ống dẫn trứng với sự hiện diện của ampulla chứa trứng trưởng thành hoặc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 25

Hình 3.11 Bản đồ plasmid PCX-EGFP 26

Hình 3.12 Cấu trúc đoạn egfp-Promotor sau khi cắt bởi SalI và BamHI từ plasmid

PCX-EGFP 26

Hình 3.13 Phôi giai đoạn 2 tế bào phát triển sau quá trình vi tiêm DNA vào tiền nhân đực 28

Hình 3.14 Vị trí của phôi các giai đoạn trong ống dẫn trứng ở chuột 30

Hình 4.1 Ống dẫn tinh được cắt thành công bằng kẹp nhiệt 34

Hình 4.2 Sau 7 ngày, vết mổ hoàn toàn khép kín cùng với sự hoạt động bình thường trở lại của chuột đực sau khi cắt ống dẫn tinh 34

Hình 4.3 Âm hộ chuột qua các giai đoạn của chu kì động dục 36

Hình 4.4 Bốn giai đoạn của chu kỳ động dục được xác định qua các loại tế bào có trong mẫu phết âm đạo 37

Hình 4.5 tế bào HEK293T dưới kính hiển vi huỳnh quang 40

Hình 4.6 Hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 41

Hình 4.7 Vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho quá trình chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ 41

Hình 4.8 Âm hộ chuột cái 42

Hình 4.9 Ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ 43

Hình 4.10 Lồng chuột nuôi các chuột nhận phôi sau quá trình chuyển phôi 44

Hình 4.11 Theo dõi quá trình mang thai của chuột mang thai hộ sau khi chuyển phôi 44

Hình 4.12 Hệ thống kính hiển vi soi nổi có gắn huỳnh quang được sử dụng cho việc kiểm tra sự biểu hiện phát sáng huỳnh quang của chuột con 45

Hình 4.13 Chuột phát sáng huỳnh quang của protein egfp 46

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Sự thay đổi của progesterol và estradiol trong quá trình động dục ở chuột 8Bảng 2.2 Biểu hiện của âm hộ chuột cái được quan sát bằng mắt thường qua các giai đoạn của chu kì động dục 9Bảng 3.1 Xác định các giai đoạn của phôi chuột tiền làm tổ 30Bảng 4.1 Tỉ lệ chuột đực bất thụ được tạo nên bằng phương pháp cắt ống dẫn tinh 35Bảng 4.2 Tỉ lệ chuột cái động dục thu được bằng quan sát trực quan âm hộ 36Bảng 4.3 Sự tương quan của phương pháp quan sát trực quan âm đạo và vết phết tế bào âm đạo 39Bảng 4.4 Số hợp tử thu nhận cho quá trình vi tiêm egfp 40Bảng 4.5 Tỉ lệ thành công của việc tạo chuột cái mang thai giả 42Bảng 4.6 Tỉ lệ thành công của sự hình thành chuột mẹ mang thai hộ qua quá trình chuyển phôi 43

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc sử dụng chuột như một mô hình động vật bệnh lý được xem như là công cụ phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh học Năm 2009, chỉ riêng các bài báo nghiên cứu về chuột thí nghiệm gấp 3 lần so với cá ngựa vằn, ruồi giấm và giun đất gộp lại Những nghiên cứu dựa trên loài gặm nhấm đã giải quyết mọi thứ từ thần kinh học và tâm lý học, cho đến thử thuốc với các loại bệnh tật Loài gặm nhấm ở phòng thí nghiệm đã được sử dụng trên các thử nghiệm động vật trong suốt hơn 150 năm qua, và số lượng những thí nghiệm dạng này vẫn đang đà tăng theo cấp số nhân tính đến năm 2019.

Vì vậy, có thể nói việc tạo ra mô hình động vật bệnh lý đặc biệt là trên đối tượng chuột là việc hết sức cần thiết, có vai trò to lớn nhằm đáp ứng nhu cầu rất lớn trong các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến y sinh học Bằng chứng là kỹ thuật này đã được thực hiện từ những năm thập niên 70 và vẫn được áp dụng cho đến thời điểm này [1]

Ngày nay, đi cùng với sự phát triển của việc chỉnh sửa gen sử dụng phương pháp Crispr/ Cas 9 thì việc tạo ra các mô hình động vật bệnh lý, đặc biệt là trên đối tượng chuột thí nghiệm ngày càng được chú trọng Việc kết hợp giữa kỹ thuật này và phương pháp tạo ra mô hình động vật là một sự kết hợp hoàn hảo trong việc tạo mô hình động vật bệnh lý, đặc biệt là trên đối tượng chuột nghiên cứu Để tạo ra được mô hình động vật mang gen ngoại lai, thì ngoài việc sàng lọc các phôi mang gen để chuẩn bị cho quá trình chuyển phôi thì việc chuyển phôi mang gen vào chuột mẹ mang thai hộ là một trong các bước cực kì quan trọng Đây có thể là bước quan trọng nhất bởi nếu bước này không thành công thì sẽ không bao giờ có được sinh vật (chuột) biến đổi gen nào được sinh ra Năm 2018, việc tạo chuột con sinh ra từ các tế bào không phải tế bào trứng (non-egg) được công bố, nghiên cứu này cho thấy việc sử dụng chuột mang thai hộ đóng vai trò hết sức quan trọng

Vì tầm quan trọng đó, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo mô hình chuột mẹ mang thai hộ nhằm tạo chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang” nhằm tạo được 1

quy trình ổn định, có tỉ lệ thành công cao để có thể làm chủ được công nghệ tạo sinh vật biến đổi gen đáp ứng nhu cầu cho các nghiên cứu liên quan đến mô hình chuột

Mục tiêu chung của đề tài: Tạo được chuột mẹ mang thai hộ nhằm ứng dụng tạo chuột chuyển gen phục vụ các nghiên cứu liên quan đến chuột thí nghiệm và mở ra một hướng đi mới cho việc tạo chuột biến đổi di truyền cho các nghiên cứu tiếp theo của các nhà khoa học ở Việt Nam

Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung cụ thể cần thực hiện như sau:

- Xác định giai đoạn động dục ở chuột cái bằng phương pháp quan sát trực quan âm đạo thông qua phương pháp vết phết tế bào âm đạo

Chỉ tiêu đánh giá: (1) Sự hiện diện rõ rang của các tế bào đại diện cho giai

đoạn của chu kì động dục đặc biệt là giai đoạn động dục (estrous); (2) Sự tương quan cao giữa hai phương pháp trực quan âm đạo và vết phết tế bào âm đạo nhằm

thực hiện việc quan sát trực quan âm đạo và xác định được giai đoạn động dục mà

không cần kiểm tra lại bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo

- Sàng lọc được hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho quá trình vi tiêm DNA chuẩn bị quá trình chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ

Tiêu chí đánh giá: (1) Thu nhận được các hợp tử giai đoạn 2 tiền nhân (2)

Phôi sau khi vi tiêm DNA có sự sinh trưởng và phát triển thành các giai đoạn 2 tế bào nhằm đảm bảo sự khỏe mạnh của phôi

- Tạo chuột mẹ mang thai hộ thành công bằng phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng và theo dõi chuột mẹ mang thai sau khi chuyển phôi

Chỉ tiêu đánh giá: (1) Chuột đực không có khả năng sinh sản sau khi cắt

ống dẫn tinh; (2) Ghi nhận được dấu hiệu giao phối thành công của các chuột được ghép đôi nhằm tiến hành kiểm tra ống dẫn trứng (3) ống dẫn trứng chuột cái có dấu hiệu tiếp nhận phôi (xuất hiện ampulla) (4) Chuột nhận phôi có dấu hiệu mang thai

ít nhất sau 1 tuần chuyển phôi

Nghiên cứu của Masaru Okabe và cộng sự năm 1997 trong việc tạo ra chuột

chuyển gen phát sáng huỳnh quang nhằm tạo ra nguồn tế bào mang gen egfp dồi

dào phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến cấy ghép tế bào đã báo cáo rằng, có 272 hợp tử đã vi tiêm DNA đã được cấy chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và kết quả đạt được 52 chuột con sinh ra [2]

Daniel D Carson và cộng sự năm 2000 đã báo cáo rằng, việc chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ là một bước thiết yếu trong quá trình tạo chuột biến đổi gen [3] Do đó, việc tạo mô hình chuột mang thai hộ là cần thiết

Lars M Ittner và cộng sự năm 2007 nghiên cứu việc sản xuất chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm DNA vào phôi đã mô tả việc chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ, trong đó để tạo chuột mẹ mang thai hộ cần sử dụng chuột cái ở giai đoạn động dục [4] Trong nghiên cứu của Satoshi Kishigami và cộng sự năm 2006 về nghiên cứu sản xuất chuột nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân tế bào sinh dưỡng cũng mô tả việc chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và chuột mang thai hộ được tạo ra từ việc sử dụng chuột cái giai đoạn động dục

Năm 1972 Arthur K Champlin và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp xác định các giai đoạn của động dục ở chuột bằng việc quan sát trực quan âm hộ Giai đoạn động dục được ghi nhận âm hộ có màu hồng, ít ẩm ướt Tuy nhiên đây là một phương pháp đòi hỏi kĩ năng cũng như nhiều kinh nghiệm của người thực hiện, do đó cần có các phương pháp khác đối chiếu

Shannon L Byers và cộng sự năm 2012 đã đưa ra phương pháp xác định các giai đoạn của chu kì động dục ở chuột bằng quan sát trực quan âm hộ ở các chủng chuột khác nhau, đồng thời đối chiếu là phương pháp vết phết tế bào âm đạo với sự xuất hiện của tế bào đặc trưng như tế bào biểu mô sừng hóa không nhân, tế bào biểu mô có nhân, tế bào bạch cầu Các tế bào này xuất hiện với tỉ lệ khác nhau ở các giai

đoạn khác nhau, nhóm nghiên cứu của Shannon L Byers cũng đã được ra công cụ nhằm ước tính tỉ lệ tế bào và đưa ra giai đoạn động dục chính xác Tuy nhiên, phương pháp của Shannon L Byers và cộng sự là quan sát dưới kính hiển vi với mẫu tươi dịch âm đạo Điều này có ưu điểm là dễ dàng thực hiện, tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, các thị trường bên trong tiêu bản chứa dịch âm đạo không chỉ có tế bào, do đó rất khó phân biệt sự khác nhau của các loại tế bào ở các giai đoạn khác nhau

Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 đã báo cáo về việc áp dụng mô hình chuột mang thai hộ trong đó sử dụng chuột ICR làm chuột mẹ mang thai hộ phục vụ nghiên cứu về các điều kiện nuôi khác nhau ở các hệ thống khác nhau và sinh con non bình thường [5]

Kết quả nghiên cứu của Ayako Isotani và cộng sự năm 2016 trong việc thiết lập dòng tế bào gốc phôi của chuột đã vi tiêm gen ngoại lai vào phôi và chuyển phôi vào chuột cái mang thai hộ nhằm sinh con non [6]

Trong nghiên cứu về hiệu quả của việc chỉnh sửa gen bằng kỹ thuật EZ được báo cáo bởi Andrew J Modzelewski và cộng sự năm 2018 trên tạp chí Nature cũng mô tả việc tạo chuột biến đổi gen bằng việc vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ nhằm sinh chuột con được chỉnh sửa gen [7]

Crispr-Yi Wu và cộng sự năm 2019 nghiên cứu về việc tạo ra chuột biến đổi gen được đăng trên tạp chí Nature đã mô tả việc vi tiêm hỗ hợp sgRNA và Cas9 mRNA hoặc protein vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và giai đoạn 2 tế bào Hợp tử sau vi tiêm được nuôi đến giai đoạn hai tế bào và các phôi hai tế bào sau vi tiêm được chuyển vào ống dẫn trứng của chuột mang thai hộ (hình 2.1) [8]

Hình 2.1 Quá trình tạo chuột biến đổi gen áp dụng mô hình chuột mang thai hộ [8]

U Lampreht Tratar và cộng sự năm 2018 trong nghiên cứu mô hình chuột trong các nghiên cứu liên quan đến ung thư đã chỉ ra rằng, trong tất cả ba phương pháp tạo chuột chuyển gen mà họ đã sử dụng, điều quan trọng và chung nhất là đều phải chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ để tạo ra mô hình chuột nghiên cứu theo mô tả hình bên dưới [9]

Hình 2.2 Quy trình tạo chuột chuyển gen [9]

Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một công trình nào ở Việt Nam được công bố về nghiên cứu tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm tạo chuột phát sáng huỳnh quang tiếp cận bằng việc phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng Điều này có

thể thấy nghiên cứu của chúng tôi đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc phục vụ cho nghiên cứu khoa học Sự đang dạng về mặt ứng dụng của mô hình chuột mẹ mang thai hộ cũng cho thấy tiềm năng ứng dụng của mô hình chuột mẹ mang thai hộ là rất lớn, đồng thời việc làm chủ công nghệ này là một lợi thế to lớn trong việc thực hiện các nghiên cứu khoa học tiếp theo

2.2 Vai trò của chuột trong nghiên cứu

Thông qua tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước được thực hiện trên đối tượng chuột, có thể thấy chuột đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nghiên cứu cơ bản và cả các nghiên cứu ứng dụng, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh học Các nghiên cứu này càng thể hiện vai trò của nó khi ngày nay, tỉ lệ con người mang bệnh tật ngày càng nhiều, như vậy việc tạo ra các mô hình chuột là ngày càng quan trọng

Chuột được xem là một mô hình cho các nghiên cứu và đã được chứng minh là cực kì hữu ích bởi tính tương đồng về bộ gen của nó với con người lên đến 80% [10] Do đó, chuột mang thai hộ là một công cụ hỗ trợ mạnh mẽ trong các nghiên cứu cơ bản liên quan đến y sinh học cũng như các ứng dụng điều trị trong việc phát triển một loại thuốc mới bất kì [11]

2.3 Tổng quan về chuột nhắt trắng 2.3.1 Sinh lý sinh sản

Tùy thuộc vào từng chủng chuột mà có độ tuổi trưởng thành về mặt sinh dục khác nhau Trong đó, chuột được sử dụng cho nghiên cứu về sinh sản thường thấy dao động khoảng 45 – 50 ngày đối với chuột cái và lên đến 60 ngày đối với chuột đực [12] Ngoài ra còn có một số chủng chuột với các độ tuổi sinh sản khác nhau như FVB/N (4 – 5 tuần tuổi) [13], C57BL/6 x BalBc (8 tuần tuổi) [14] bởi vì chúng cung cấp các loại tế bào (trứng và tinh trùng) thích hợp cho việc sản xuất các dòng chuột nhân bản [15] Ngoài ra cũng có một số chủng chuột như B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2) [4], B6C3F1 (C57BL/6 x C3H/He) với độ tuổi sinh sản là 8 – 10 tuần tuổi Đồng thời, chủng chuột thích hợp làm chuột mang thai hộ và chuột bất thụ là ICR (CD – 1) [8], [15], [16], [17]

2.3.2 Cơ quan sinh sản chuột nhắt trắng

Hình 2.3 Cơ quan sinh sản ở chuột (bên trái: chuột cái, bên phải: chuột đực) [18]

Hình 2.4 Cơ quan sinh sản của chuột đực; bao gồm ống dẫn tinh, mào tinh hoàn và tinh hoàn [19]

2.3.3 Chu kì động dục ở chuột

Chu kì động dục ở chuột hay còn gọi là chu kì sinh sản của chuột Chu kì động dục được tính từ lúc bắt đầu động dục cho đến lúc bắt đầu lại 1 chu kì động dục mới Chu kì động dục bao gồm bốn giai đoạn chính: Tiền động dục (proestrous), động dục (Estrous), sau động dục (metestrous), giai đoạn nghỉ động dục (diestrous) và được xác định dựa vào việc quan sát các loại tế bào hiện diện trong dịch âm đạo của chuột, đồng thời với sự biểu hiện của hành vi tình dục, có thể quan sát và xác định được giai đoạn động dục của chuột Sự thay đổi này có thể phản ánh đối với sự thay đổi nội tiết bên trong cơ thể chuột, các thay đổi xảy ra trong chu kì động dục của chuột là điều hiển nhiên [20] Ta có thể xác định chu kì động dục của chuột bằng việc quan sát vết phết tế bào âm đạo ở các giai đoạn khác

nhau [21], [22] Trong suốt chu kì động dục ở chuột, các giai đoạn tiền động dục, động dục, sau động dục thường kéo dài 12 giờ và giai đoạn dài nhất là nghỉ động dục kéo dài khoảng 65 giờ

Bảng 2.1 Sự thay đổi của progesterol và estradiol trong quá trình động dục ở chuột

Sau động dục Duy trì ở mức thấp Duy trì ở mức thấp

Nghỉ động dục Tăng cao Tăng nhẹ sau đó giảm và duy trì ở mức thấp

Trong quá trình động dục, hàm lượng progesterone và estradiol có sự thay đổi rõ rệt Đối với giai đoạn tiền động dục, hàm lượng progesterone và estradiol tăng cao nhưng sẽ giảm dần cho đến khi vào giai đoạn động dục và duy trì ổn định cho đến cuối giai đoạn sau động dục, Đến giai đoạn nghỉ động dục, hàm lượng progesterone sẽ tăng đột ngột và duy trì ở ngưỡng cao này cho đến cuối giai đoạn nghỉ động dục, hàm lượng progesterone sẽ giảm dần khi bắt đầu lại chu kì động dục mới Ngược lại với progesterone thì estradiol có sự biến thiên trong giai đoạn này Cụ thể, estradiol sẽ tăng lên đáng kể, tuy nhiên thấp hơn nhiều so với progesterone và điều đáng nói là estradiol không duy trì ở mức cao mà sẽ giảm dần ngay sau đó và duy trì ở mức thấp như ở giai đoạn động dục và sau động dục [23] Đối với người, chu kì sinh sản hay còn gọi là chu kì kinh nguyệt và thường kéo dài từ 28 – 32 ngày Chu kì động dục khác nhau ở các loài; đối với chuột, chu kì động dục thường kéo dài 4 - 5 ngày [12], [20], [23]; tuy nhiên sự động dục ở các thời điểm rất đa dạng và tùy thuộc vào từng loài Giai đoạn động dục của chuột được xác định trong khoảng thời gian từ lúc chuột cái có dấu hiệu chấp nhận giao phối bằng biểu hiện hành vi và quan sát âm hộ [12]

Xác định chu kì động dục của chuột là công cụ rất hữu ích cho việc lựa chọn chuột để chuẩn bị ghép đôi [20] Trong nghiên cứu này của chúng tôi, xác định giai

đoạn động dục của chu kì động dục được thực hiện nhằm nâng cao tỉ lệ ghép đôi của chuột, do đó chúng tôi chọn giai đoạn động dục là giai đoạn thích hợp nhất [24]

Hình 2.5 Sự thay đổi hàm lượng progesterone và estradiol trong suốt quá trình động dục ở chuột [23]

 Sự thay đổi về âm hộ ở các giai đoạn khác nhau của chu kì động dục của chuột:

Theo Byers và cộng sự năm 2012, có sự khác biệt rõ ràng của âm hộ chuột cái được quan sắt bằng mắt thường được thể hiện qua bảng 1.2 và hình 2.6 như sau:

Bảng 2.2 Biểu hiện của âm hộ chuột cái được quan sát bằng mắt thường qua các giai đoạn của chu kì động dục

Giai đoạn của chu kỳ

Tiền động dục Kích thước âm đạo mở nhưng nhỏ, màu sắc âm hộ đỏ hồng, khô, sưng nhiều và có nếp nhăn (hình A).

Động dục Âm đạo lúc này mở rộng, màu sắc âm hộ hồng nhạt, khô, sưng, bóng, có nếp nhăn (hình B).

Sau động dục Kích thước âm đạo thu nhỏ lại, ít sưng hơn và có màu tái nhạt, khô và không sưng (hình C).

Nghỉ động dục

Kích thước âm đạo rất nhỏ, điều này cho thấy chuột ngưng tiếp nhận các hoạt động tình dục Âm hộ không sưng, khô và màu sắc tái nhạt hơn nhiều so với các giai đoạn khác (hình D).Nguồn: Byers và cộng sự, 2012 [20], [24]

Sự thay đổi về âm hộ ở các giai đoạn khác nhau của chu kì động dục của chuột được biểu thị như hình sau:

Hình 2.6 Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột [20], [24]

CbyB6F1/J (bên trái); C57BL/6J (bên phải) [20] A: Proestrous – tiền động dục B: Estrous – động dục C: Metestrous – sau động dục D: Diestrous – nghỉ động dục

Tử cung chuột có sự thay đổi lớn ở giai đoạn tiền động dục và giai đoạn động dục Ở hai giai đoạn này, tử cung trương phồng, có sự tập trung của mạch máu một cách rõ rệt do sự tuần hoàn của estrogen tăng cao Đồng thời, tử cung ướt và khô có trọng lượng nặng nhất Ở hai giai đoạn còn lại là sau động dục và nghỉ động dục hình dạng tử cung trở lại bình thường, trọng lượng ướt và khô của tử cung chuột thấp nhất ở giai đoạn nghỉ động dục - diestrous [12]

2.3.4 Các loại tế bào ở các giai đoạn của chu kì động dục của chuột

Hình 2.7 Các loại tế bào đặc trưng ở giai đoạn động dục và nghỉ động dục ở chuột [25]

 Sự thay đổi về biểu hiện hành vi tình dục của chuột ở giai đoạn động dục của chu kì động dục ở chuột

Trong giai đoạn động dục, chuột cái có thể ngửi thấy mùi Pheromones của chuột đực, do đó dễ dàng bị hấp dẫn bởi chuột đực và tiếp nhận giao phối Ngược lại ở giai đoạn diestrus, chuột cái không thể ngửi thấy mùi của chuột đực, do đó không những không tiếp nhận giao phối mà thậm chí có thể trở nên hung dữ và tấn công ngược lại với chuột đực được ghép cặp

2.4 Công nghệ cấy truyền phôi

Chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ bằng cách tiếp cận âm đạo mà không xâm lấn [17] Ngoài ra có thể chuyển phôi vào ống dẫn trứng, sừng tử cung hoặc tử cung bằng việc phẫu thuật Nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về việc ứng dụng hệ thống CRISPR – Cas9 trong việc chỉnh sửa gen, hỗn hợp này được vi tiêm vào phôi giai đoạn 2 tế bào và chuyển phôi vào ống dẫn trứng [4], [5], [7], [8], [26], [27], [28]

Nguyên tắc:

Tùy theo phôi được chuyển mà chúng ta có vị trí chuyển phôi khác nhau Thông thường, khi tinh dịch được phóng thích vào âm đạo chuột, tinh trùng sẽ tách khỏi tinh tương và di chuyển qua cổ tử cung để vào tử cung Tinh trùng khỏe mạnh tiếp tục di chuyển đến 1/3 ngoài của ống dẫn trứng và thụ tinh tại đây Quá trình thụ tinh diễn ra sẽ tạo ra hợp tử và phát triển thành phôi hai tế bào Phôi hai tế bào tiếp tục phát triển đến các giai đoạn 4-8 tế bào trong đoạn ống dẫn trứng Đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang thì sẽ ở vị trí gần sừng tử cung, sau khi phôi thoát nang sẽ vào tử cung để làm tổ Nghiên cứu của R Carballada và cộng sự năm 2000 [29] cho thấy trong tổng số 111 hợp tử, có 93 hợp tử phát triển đến giai đoạn 2 tế bào chiếm tỉ lệ 83,8%, số hợp tử phát triển đến giai đoạn blastocyst là 27 chiếm tỉ lệ 24% giảm 59,8% Nghiên cứu của Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 cho thấy việc nuôi phôi đến giai đoạn 2 tế bào đạt 100%, trong khi đó nuôi phôi đến giai đoạn blastocyst đạt 93%, giảm 7% so với ban đầu Đồng thời, nghiên cứu của Lifang Cui và cộng sự năm 2014 [5] cho thấy việc phẫu thuật chuyển phôi giai đoạn blastocyst được nuôi

từ 1 tế bào đạt 63,3% và phôi blastocyst tự nhiên đạt 75,3% Một nghiên cứu gần đây nhất của Nguyen Van Thuan và cộng sự năm 2019 [30] trong việc thiết lập dòng phôi chuột phát sáng huỳnh quang bằng phương pháp tiêm tinh trùng trữ lạnh -80oC vào bào tương trứng, trong đó kết quả của việc tạo phôi giai đoạn hai tế bào đạt 100% và nuôi đến được nuôi đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) thì giảm còn 83,11% ở nhóm đối chứng, nhóm sử dụng tinh trùng tươi đạt 100% ở giai đoạn hai tế bào và nuôi đến giai đoạn phôi nang thì tỉ lệ này còn 57,5%, đối với nhóm sử

dụng tinh trùng gfp đạt 85,7% ở giai đoạn hai tế bào và nuôi đến giai đoạn phôi nang còn 21,2% Điều này cho thấy việc nuôi phôi trong điều kiện invitro có bất lợi

cho việc phát triển của phôi Do đó, việc chuyển phôi vào cơ thể chuột mẹ nhận phôi là càng sớm càng tốt cho sự bám dính và làm tổ của phôi Vì vậy, tùy vào mục đích thí nghiệm để cân nhắc việc nuôi phôi đến giai đoạn hai tế bào hay đến giai đoạn phôi nang Ngày nay, việc chuyển phôi sử dụng phương pháp tiếp cận tử cung bằng phương pháp phẫu thuật được sử dụng ngày càng nhiều trên thế giới [28] Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành chuyển phôi giai đoạn phôi 2 tế bào, do đó chúng tôi tiếp cận chuyển phôi từ vị trí ống dẫn trứng Phôi được chuyển là phôi giai đoạn 1- 2 tế bào, do đó vị trí chuyển sẽ ở gần ampulla hoặc

thông qua vòi ống dẫn trứng (infundibulum)

Bên cạnh đó, phương pháp chuyển phôi vào ống dẫn trứng là phương pháp mang lại hiệu quả cao và được các nhà nghiên cứu sử dụng rộng rãi do đó, để nghiên cứu của chúng tôi mang tính ứng dụng cao là có thể phù hợp với các nghiên cứu mới nhất, chúng tôi tiến hành tiếp cận phương pháp chuyển phôi vào ống dẫn trứng

Hình 2.8 Vị trí diễn ra sự thụ tinh tạo thành hợp tử ở chuột [31]

Hình 2.9 Chuyển phôi bằng phương pháp phẫu thuật tiếp cận ống dẫn trứng [32]

2.5 GFP – EGFP và tầm quan trọng trong nghiên cứu

GFP (Green Fluorescent Protein) một loại protein bao gồm 238 axit amin,

lần đầu tiên được phân lập từ loài sứa Aequorea victoria sống ở ven biển Tây Bắc

Thái Bình Dương Ở phía dưới chiếc dù xòe rộng có những mấu cơ phát sáng xanh mờ Đó là một loại protein có khả năng phát sáng màu xanh lục khi chiếu ánh sáng

cực tím GFP của Aequorea victoria có đỉnh phát sáng ở bước sóng 509 nm, tương

ứng với vùng ánh sáng xanh trong phổ ánh sáng nhìn thấy Người ta đã lợi dụng

tính chất phát quang của gfp để dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng Gen mã hóa cho gfp được sử dụng như một gen chỉ thị trong công nghệ biến đổi di truyền

Tuy nhiên gfp phát sáng không mạnh và tính bền vững chưa cao Vì vậy, vào năm 1995 Robert Y Tsien tại đại học California đã nâng cao được đặc trưng quang phổ

của gfp, với cường độ phát quang cao và bền vững hơn hàng chục lần, đó chính là egfp Thay vì 238 axit amin của gfp thì egfp có 265 axit amin Hai axit amin ở vị trí 64 và 65 của gfp đã được thay thế thành Leucine và Threonine ở egfp [33] Ngày nay, việc sử dụng egfp ngày càng phổ biến trong các nghiên cứu khoa học

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu

3.1.1 Thiết bị, dụng cụ

3 Kính hiển vi soi ngược ECLIPSE NIKON Nhật

4 Kính hiển vi soi nổi Stemi 305 Carl Zeiss Đức

5 Kính hiển vi vi thao tác VMI 0510 Carl Zeiss Đức

6 Incell analyzer MH02024 GE healthcare Mỹ

8 Máy cắt và uốn kim 16019 Narishige Nhật Bản

3.1.2 Hóa chất, môi trường sử dụng cho nghiên cứu

3.1.3 Động vật sử dụng cho nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 nguồn động vật:

- Chuột Mus musculus var albino (ICR) khỏe mạnh, trưởng thành về mặt

sinh dục 6 – 8 tuần tuổi có trọng lượng 25 - 28 g đối với chuột cái, 25-32 g đối với chuột đực được cung cấp bởi Viện Pasteur TP HCM và được nuôi dưỡng ở phòng nuôi động vật của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Điều kiện nuôi dưỡng 22oC - 25oC, độ ẩm khoảng 50 – 60%, chu kì chiếu sáng là 12h sáng : 12h tối, thức ăn tự do [14], [17], [21], [34], [32] Chuột được nuôi trong lồng từ 4-5 con [35]

- Chuột ICR được nuôi dưỡng tại phòng nuôi động vật ở Khu nuôi động vật thử nghiệm của trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản Trọng lượng của chuột được sử dụng và điều kiện nuôi dưỡng như trên

3.2 Phương pháp

Việc nghiên cứu tạo mô hình chuột mẹ mang thai hộ sẽ được thực hiện thông qua các phương pháp tạo chuột đực bất thụ, gây siêu bài noãn ở chuột cái cho phôi và sàng lọc được chuột cái ở giai đoạn động dục nhằm phối với chuột đực bất thụ chuẩn bị cho quá trình nhận phôi, đồng thời để kiểm tra kết quả của việc tạo thành công chuột mang thai hộ thì phương pháp cấy chuyển phôi sẽ được thực hiện Nghiên cứu được mô tả tóm tắt theo sơ đồ sau:

3.2.1 Tạo mô hình chuột đực bất thụ

Chuột đực bất thụ được phối với chuột cái khỏe mạnh, trưởng thành về mặt sinh dục để tạo ra chuột cái mang thai giả phục vụ cho quá trình chuyển phôi từ vị trí ống dẫn trứng đến tử cung tùy theo giai đoạn phôi được chuyển

Quy trình tạo chuột đực bất thụ được thể hiện như sau:

Chuột được gây mê sau 1 - 3 phút đối với chuột đực và 1 phút đối với chuột cái, chuột mê hoàn toàn Tiến hành phẫu thuật chuột và cắt đoạn ống dẫn tinh theo nguyên tắc sau (hình 3.1 và 3.2):

Hình 3.1 Đoạn ống dẫn tinh bị loại bỏ nhằm tạo chuột đực bất thụ [4]

Quy trình phẫu thuật chuột đực cắt ống dẫn tinh được mô tả như sau:

Hình 3.2 Các bước cắt ống dẫn tinh ở chuột đực [32]

chứa mào tinh, tinh hoàn và ống dẫn tinh Làm sạch vùng lông tại vị trí phẫu thuật, dùng kẹp nhỏ tách phần da và cơ ra khỏi nhau theo đường kẻ màu đen

trên hình A, dùng dao nhỏ tạo một vết rạch nhỏ, thẳng đứng và vuông góc với hướng của đuôi, đồng thời dùng kẹp và kéo nhỏ khác kéo phần da này ra, dùng dao nhỏ khác tạo một vết rạch ở phần cơ tương ứng với vết rạch ở phần da ban đầu sao cho để lộ ống dẫn tinh ra B: Dùng kéo nhỏ kéo phần ống dẫn tinh ra ngoài C: Dùng kẹp và kéo nhỏ để cắt 1 đoạn ống dẫn tinh dài 5mm tương ứng

như hình C và D E: Dùng chỉ khâu tự tiêu loại 4O để khâu miệng vết mổ lần lượt từ da đến cơ, tẩm povidine để tránh nhiễm trùng, sau đó đưa chuột trở lại

buồng nuôi và theo dõi sự hồi phục của chuột

3.2.2 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân

Gây siêu bài noãn ở chuột cái được sử dụng như là một phương pháp để thu nhận trứng ở chuột cho phôi và chuột nhận phôi Trong nghiên cứu này, quá trình gây siêu bài noãn được thực hiện với PMSG và hCG

Chuột cái sau khi được gây siêu bài noãn bằng việc tiêm phúc mạc bụng với PMSG 5IU và hCG 5IU sau 46 – 48 h kể từ mũi tiêm đầu tiên với PMSG được chọn để ghép đôi với chuột đực hữu thụ theo tỉ lệ 1:1 và thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân Chuột đực sau khi giao phối sẽ được tách riêng và nghỉ ngơi một vài ngày, trong trường hợp có sự thiếu hụt chuột đực cho nghiên cứu, thì chuột đực sau giao phối phải được nghỉ ngơi ít nhất 1 ngày cho lần giao phối tiếp theo

Chuột sau khi được hy sinh nhân đạo (sacrificed) bằng kéo dãn đốt sống cổ, chuột sẽ được thu nhận buồng trứng - ống dẫn trứng – tử cung được thể hiện qua hình sau:

Hình 3.3 Quá trình thu nhận đoạn buồng trứng - ống dẫn trứng – tử cung chuột được mô tả sơ lược như sau [4]

a Dùng kéo và kẹp tách phần da ở ổ bụng chuột b Chuột sau khi được tách phần cơ và đẩy nội quan ra khỏi ổ bụng, sao cho có thể quan sát thấy tử cung Tử cung – ống dẫn trứng - buồng trứng được kéo ra ngoài bằng kéo và kẹp c: Dùng kéo và kẹp xác định vùng cần cắt d: Dùng kéo và kẹp cắt 1 đầu của tử cung, đoạn nối với ống dẫn trứng và buồng trứng, sau đó cắt phần còn lại, đoạn

nối với âm đạo

3.2.3 Xác định giai đoạn động dục ở chuột nhắt trắng ICR 3.2.3.1 Các phương pháp xác định chu kì động dục

Có rất nhiều phương pháp dùng để xác định chu kì động dục ở chuột như đo trở kháng điện [36], phân tích sinh hóa nước tiểu [37], quan sát trực quan âm hộ [35], vết phết tế bào âm đạo [20] Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phương pháp quan sát trực quan âm hộ và vết phết tế bào âm đạo Đây là hai phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có tính chính xác cao [20] Ngoài ra, hai phương pháp này phù hợp cho việc tiến hành nghiên cứu tiếp theo

3.2.3.2 Phương pháp quan sát trực quan âm hộ

Phương pháp quan sát trực quan âm hộ là phương pháp dễ thực hiện, ít tốn kém và ít gây tổn hại đến động vật nghiên cứu nhất, vì âm hộ là bộ phận bên ngoài cơ thể Đây cũng là phương pháp thuận lợi nhất cho việc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo mà không làm động vật nghiên cứu trở nên căng thẳng hay hoảng sợ

Quan sát trực quan âm hộ được tiến hành như sau:

1 Cố định chuột bằng tay trái Ngón tay trỏ và ngón tay cái của bàn tay trái giữ lấy phần tai và cổ chuột, đồng thời ngón tay út và áp út kẹp lấy đuôi chuột sao cho chuột không quay đầu hay có các cử động mạnh khác

2 Hướng phần phía bụng và cơ quan sinh dục của chuột về phía người thực hiện Quan sát và ghi nhận âm hộ chuột theo các chỉ tiêu: màu sắc, hình thái, sự xuất hiện của nếp nhăn, mức độ sưng, độ ẩm ướt và kích thước của âm hộ hay trạng thái đóng hay mở của âm hộ [20], [24], [35]

3 Thả chuột nhẹ nhàng và đưa trở lại buồng nuôi

Sự thay đổi của âm hộ chuột qua các giai đoạn được thể hiện như hình sau:

Hình 3.4 Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột BALB/cByJ thuộc chủng albino [20], [24]

A: Proestrous – tiền động dục B: Estrous – động dục C: metestrous – sau động dục D: Diestrous – nghỉ động dục

3.2.3.3 Xác định chu kì động dục ở chuột cái bằng vết phết tế bào âm đạo

Phương pháp vết tế bào âm đạo có thể tiến hành theo hai cách Dịch tế bào âm đạo sau khi được cố định trên lam kính, có hai cách để xác định sự hiện diện của các tế bào Cách thứ nhất là quan sát trực tiếp lam kính [20], [38]; cách thứ hai là nhuộm với các loại thuốc nhuộm trong phương pháp Papanicolaou [38], Crystal violet [22] hoặc thuốc nhuộm xanh methylen [20], [35], [38] Trong nghiên cứu này của chúng tôi, phương pháp nhuộm xanh methylen 1% trong vòng 45 giây được thực hiện để quan sát sự hiện diện của các loại tế bào âm đạo chuột mang thai và chuột mang thai hộ đồng thời xác định giai đoạn tiền động dục và động dục của chuột Quá trình xác định các giai đoạn của chu kì động dục bằng vết phết tế bào âm đạo được thực hiện vào lúc 8 – 9 h sáng [39] như sau:

1 Bắt chuột và giữ cố định chuột bằng tay trái sao cho âm hộ chuột hướng về phía người thực hiện để dễ dàng thao tác

2 Dùng pipet man hút 10 µl dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.9%) , sau đó đưa nhẹ nhàng dung dịch này vào âm đạo chuột không quá 0,5 cm [25] sao cho đầu tuýp của pipet không đụng thành âm đạo chuột Tiến hành hút, nhả dung

dịch nước muối này trong âm đạo chuột 5-7 lần, sau đó hút ngược trở lại vào pipet man và rút pipet man ra khỏi âm đạo chuột một cách nhẹ nhàng Trong trường hợp đầu tuýp của pipet man chạm vào thành âm đạo chuột thì phải nhanh chóng thả chuột ra và đưa trở lại buồng nuôi để tránh làm chuột trở nên hoảng sợ và căng thẳng thêm vì khả năng rách âm đạo là rất cao hoặc gây rối loạn sinh lý chuột bởi việc mang thai giả không mong muốn ở chuột

3 Thu nhận dung dịch nước muối sinh lý chứa dịch âm đạo chuột vào eppendorf 0,2 ml

4 Dung dịch này được nhuộm với xanh methylen 1% với tỉ lệ 1:1 trong vòng 45 giây [20] Nhỏ 1 giọt dung dịch này lên lam kính với thể tích cố định là 10 µl, đậy lammel lên giọt dung dịch sao cho không có bọt khí, để khô tự nhiên và quan sát dưới kính hiển vi quang học

5 Đối với trường hợp quan sát mẫu tươi mà không nhuộm với thuốc nhuộm đặc trưng, thì sau khi nhỏ giọt lên lam kính, đậy lam kính, để khô tự nhiên hoặc quan sát ngay

6 Đánh giá sự xuất hiện của các loại tế bào trên tiêu bản và xác định các giai đoạn trong chu kì động dục theo biểu đồ tròn bên dưới

Sơ đồ 1: Biểu thị cho sự xuất hiện các loại tế bào trong chu kì động dục ở chuột