Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phối trộn thực khuẩn thể nhằm kiểm soát vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi

PHẠM ĐỖ TRÀ MY

NGHIÊN CỨU PHỐI TRỘN THỰC KHUẨN THỂ NHẰM

KIỂM SOÁT VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI

GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Hoàng Anh Hoàng

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

Cán bộ chấm nhận xét 2 : PGS.TS Lê Phi Nga

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 14 tháng 01 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

2 TS Phan Thị Huyền

3 TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 4 PGS.TS Lê Phi Nga

5 TS Hoàng Anh Hoàng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 01/09/1993 Nơi sinh: TPHCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu phối trộn thực khuẩn thể nhằm kiểm soát

vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Phân lập thực khuẩn thể có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

từ gan cá tra

- Xác định đặc tính của các thực khuẩn thể phân lập được, bao gồm hoạt tính xâm nhiễm (chu kỳ xâm nhiễm, hệ số nhân) và hình thái

- Nghiên cứu khả năng ức chế của dòng thực khuẩn thể đơn lẻ đối với vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường dinh dưỡng chuẩn

- Phối trộn và nghiên cứu khả năng ức chế của các hỗn hợp thực khuẩn thể đối với

vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong môi trường dinh dưỡng chuẩn

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 11/02/2019

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2019 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Hoàng Anh Hoàng

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Tp.HCM, ngày… tháng… năm 20…

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô Trường Đại học Bách Khoa TPHCM, quý thầy cô Khoa Kỹ thuật Hóa học và đặc biệt là quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết và nhiệt tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy hướng dẫn, TS Hoàng Anh Hoàng Cảm ơn thầy vì đã giúp tôi định hướng, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ tôi với tất cả tâm huyết của một người thầy trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin cảm ơn các chị em, bạn bè tại phòng thí nghiệm 107B2, đặc biệt là chị Trần Thị Thanh Xuân, đã luôn bên cạnh, chia sẻ và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình tôi vì đã tin tưởng và ủng hộ tôi phát triển con đường học vấn của mình

Xin chân thành cảm ơn!

TPHCM, ngày….tháng….năm 20…

PHẠM ĐỖ TRÀ MY

năng ức chế vi khuẩn E ictaluri của các thực khuẩn thể cho thấy hầu hết đều có thời

gian ức chế ổn định trong khoảng 18 – 20 giờ, ngoại trừ thực khuẩn thể G9.2 do hoạt tính xâm nhiễm không ổn định Sau các mốc thời gian trên đã có sự hiện diện và sinh trưởng của các chủng vi khuẩn kháng thực khuẩn thể Đây là một thách thức lớn với liệu pháp thực khuẩn thể Một trong những giải pháp được đưa ra là sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể (phage cocktail) Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của các phage cocktail G1 + G7, G7 + G8 và G1 + G8 cho thấy không phải tất cả các phage cocktail đều làm tăng hiệu quả ức chế vi khuẩn Chỉ có phage cocktail G7 + G8 cho thời gian ức chế lên đến 28 giờ, lâu hơn so với từng thực khuẩn thể riêng lẻ

ABSTRACT

White spots in the internal organs, caused by the bacterium Edwardsiella ictaluri, is one of the most common diseases in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) farmed in the Mekong Delta, Vietnam In this study, bacteriophage

G1, G7, G8 and G9.2 were isolated from striped catfish livers According to results of one-step growth curve experiments, burst size of phage G1 and phage G7 were 160.52 ± 3.12 and 71.70 ± 3.77, respectively Lysis time of phage G1 and phage G7 were 70 min and 55 min, respectively Phage G8 had burst size of 28.22 ± 6.0 after

60 min Burst size of phage G9 was 41.72 ± 13.01 after 70 min In vitro E ictaluri

inactivation experiments were also conducted in broth culture medium with single phage Most of results show that inactivation remained in 18-20h, except G9.2 due to unstable lytic activity After 20h, the turbidity of bacterium-phage solutions increased due to phage-resistant bacteria This is a major challenge in phage therapy The

application of phage cocktail may address this problem According to in vitro E ictaluri inactivation experiments using phage coctail G1 + G7, G7 + G8, G1 + G8, it

is not true that all of phage cocktails could increase the inactivation time on bacteria Only phage cocktail G7 + G8 prolonged the inactivaion time rather than single bacteriophage The inactivation time of phage cocktail G7 + G8 was 28h

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả mà tôi đưa ra trong luận văn này là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây

Tác giả

PHẠM ĐỖ TRÀ MY

1.1 Giá trị kinh tế ngành nuôi cá tra tại Việt Nam 2

1.2 Tình hình dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra và bất cập khi sử dụng kháng sinh 2

1.2.1 Tình hình dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra 2

1.2.2 Bất cập khi sử dụng kháng sinh trong điều trị dịch bệnh thủy sản 3

1.3 Liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản 5

1.3.1 Tổng quan về thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể 5

1.3.2 Các tiêu chí chọn lọc dòng thực khuẩn thể cho liệu pháp thực khuẩn thể 14

1.3.3 Nghiên cứu phối trộn thực khuẩn thể 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu 17

2.5.4 Tinh sạch và tạo stock thực khuẩn thể 21

2.5.5 Quan sát hình thái thực khuẩn thể 23

2.5.6 Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm của các thực khuẩn thể đã phân lập 232.5.7 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của dòng thực khuẩn thể đơn lẻ trong môi trường TSB 25

2.5.8 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của hỗn hợp thực khuẩn thể trong môi trường TSB 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28

3.1 Kết quả phân lập thực khuẩn thể 28

3.2 Kết quả tạo stock thực khuẩn thể 30

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính xâm nhiễm của các thực khuẩn thể 30

3.4. Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của dòng thực khuẩn thể đơn lẻ trong môi trường TSB 34

3.5 Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của hỗn hợp thực khuẩn thể trong môi trường TSB 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 43TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

E ictaluri Edwardsiella ictaluri

MOI Tỷ lệ giữa số lượng thực khuẩn thể và số lượng vi khuẩn (Multiplicity Of Infection)

SM Đệm lưu trữ thực khuẩn thể có chứa NaCl (Sodium cloride) và MgSO4 (Magnesium sulphate)

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nhiều đốm trắng có kích cỡ 1-3mm trên gan, thận cá tra mắc bệnh 3Hình 1.2 Chu trình sinh tan (Lytic cycle) và chu trình tiềm tan (Lysogenic cycle) của thực khuẩn thể 7Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm 9Hình 1.4 Cơ chế ngăn chặn sự xâm nhập của DNA thực khuẩn thể T4 trên

Escherichia coli 11

Hình 2.1 Biến động số lượng thực khuẩn thể trong quá trình xâm nhiễm 24

Hình 3.1 Biến động số lượng thực khuẩn thể G1 theo thời gian trong thí nghiệm khảo

sát hoạt tính xâm nhiễm E ictaluri 31

Hình 3.2 Biến động số lượng thực khuẩn thể G7 theo thời gian trong thí nghiệm khảo

sát hoạt tính xâm nhiễm E ictaluri 31

Hình 3.3 Biến động số lượng thực khuẩn thể G8 theo thời gian trong thí nghiệm khảo

sát hoạt tính xâm nhiễm E ictaluri 32

Hình 3.4 Biến động số lượng thực khuẩn thể G9.2 theo thời gian trong thí nghiệm

khảo sát hoạt tính xâm nhiễm E ictaluri 33

Hình 3.5 Biến động OD600 của dịch vi khuẩn E ictaluri theo thời gian khi bổ sung

thực khuẩn thể G1 với MOI = 2 35Hình 3.6 Biến động OD600 của dịch vi khuẩn E ictaluri theo thời gian khi bổ sung

thực khuẩn thể G7 với MOI = 2 35Hình 3.7 Biến động OD600 của dịch vi khuẩn E ictaluri theo thời gian khi bổ sung

thực khuẩn thể G8 với MOI = 2 36Hình 3.8 Biến động OD600 của dịch vi khuẩn E ictaluri theo thời gian khi bổ sung

thực khuẩn thể G9.2 với MOI = 2 37

Hình 3.9 Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn E ictaluri của các hỗn hợp thực

khuẩn thể 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Những nghiên cứu về liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản 13

Bảng 2.1 Địa điểm và thời gian lấy mẫu gan cá tra 17

Bảng 3.1 Vòng sinh tan và hình thái của thực khuẩn thể G1, G7, G8, G9.2 29Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hệ số nhân và chu kỳ xâm nhiễm của thực khuẩn thể G1, G7, G8 và G9.2 34

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu 19

Sơ đồ 2.2 Quy trình phân lập thực khuẩn thể 20

Sơ đồ 2 3 Quy trình tinh sạch thực khuẩn thể 21

Sơ đồ 2.4 Quy trình tạo stock thực khuẩn thể 22

Sơ đồ 2.5 Quy trình khảo sát hoạt tính xâm nhiễm của thực khuẩn thể 24

Sơ đồ 2.6 Quy trình khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của thực khuẩn thể 26

MỞ ĐẦU

Với điều kiện địa lý - tự nhiên thích hợp, nuôi trồng thủy sản là một nền văn hóa truyền thống lâu đời, mang lại giá trị kinh tế cao cho Việt Nam Đặc biệt, cá tra được coi là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực, đem lại nguồn lợi lớn cho đất nước Tuy nhiên, tình hình dịch bệnh do vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản đang ngày càng tăng với những diễn biến phức tạp, gây tổn thất về sản lượng và chất lượng thủy sản nói chung cũng như cá tra nói riêng Trong đó, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri là một trong những bệnh phổ biến trên cá tra tại Đồng bằng

Sông Cửu Long Trong bối cảnh này, kháng sinh là một biện pháp truyền thống và phổ biến để kiểm soát các bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên, liệu pháp kháng sinh còn nhiều bất cập, cũng như hiện trạng sử dụng kháng sinh không hợp lý tiềm ẩn nhiều nguy cơ đến nền kinh tế, con người và môi trường Đặc biệt là có sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh

Tại Việt Nam, một trong những tác hại rõ rệt nhất của việc thiếu kiểm soát trong khâu quản lý và sử dụng kháng sinh là tình trạng nhiễm dư lượng kháng sinh trong các mặt hàng thủy sản Dẫn đến, nhiều lô hàng xuất khẩu của nước ta bị trả về từ những thị trường xuất khẩu chính, gây thiệt hại đến nền kinh tế cũng như gây mất lòng tin ở thị trường thế giới Vì vậy, cần nhanh chóng tìm ra giải pháp hữu hiệu để hạn chế ảnh hưởng bởi kháng sinh Nhiều nhà nghiên cứu mong muốn tìm kiếm các liệu pháp mới thay thế kháng sinh Một trong những hướng đi đó là liệu pháp thực khuẩn thể

Với những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu phối trộn thực

khuẩn thể nhằm kiểm soát vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên

cá tra nuôi”, với mong muốn phối trộn và chọn lọc hỗn hợp thực khuẩn thể thích hợp, có thể sử dụng trong việc kiểm soát dịch bệnh gan thận mủ với hiệu quả cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giá trị kinh tế ngành nuôi cá tra tại Việt Nam

Khai thác và nuôi trồng thủy sản đã tồn tại và phát triển từ lâu đời, là một trong những nét đặc trưng của quốc gia ven biển Việt Nam bên cạnh nền nông nghiệp lúa nước Không những là mặt hàng ưa chuộng với thị trường trong nước, thủy sản còn là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Theo báo cáo của Cục Chế biến và Phát triển thị trường nông sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), giá trị xuất khẩu thủy sản tháng 10 năm 2018 ước đạt 873 triệu USD, đưa giá trị xuất khẩu thủy sản 10 tháng đầu năm 2018 ước đạt 7.24 tỷ USD, tăng 6.2% so với cùng kỳ năm 2017 Trong đó, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là 4 thị trường xuất khẩu của thủy sản Việt Nam trong 9 tháng đầu năm 2018, chiếm 54.5% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản [1]

Riêng với mặt hàng cá tra, tính đến tháng 9 năm 2018, Việt Nam đã xuất khẩu 1.6 tỷ USD cá tra, tăng trưởng mạnh 23% so với cùng kỳ Hầu hết các thị trường nhập khẩu cá tra nhiều hơn trong 9 tháng, với kim ngạch nhập khẩu từ Mỹ đạt gần 370 triệu USD, tăng 23% so với cùng kỳ [2] Trong 9 tháng đầu năm 2018, tổng diện tích nuôi cá tra tại ĐBSCL đạt 5480 ha, tăng 5% và sản lượng đạt 992.6 nghìn tấn, tăng 6% so với cùng kỳ năm trước Trong đó, Đồng Tháp, Bến Tre và Cần Thơ là 3 tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi cao nhất của khu vực Tính riêng Đồng Tháp, diện tích nuôi cá tra chiếm 37% và sản lượng chiếm 32% tổng diện tích của toàn vùng [3]

1.2 Tình hình dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra và bất cập khi sử dụng kháng sinh

1.2.1 Tình hình dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra

Dịch bệnh động vật thủy sinh là một nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm sản lượng và chất lượng sản phẩm ngành nuôi trồng thủy sản Trong đó, bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết là những bệnh phổ biến trên cá tra [4] Bệnh gan thận mủ

trên cá tra do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1998 Theo các quan sát trước đây, bệnh thường xuất hiện vào các tháng mưa từ tháng 8 đến tháng 11 Tại thời điểm này, lượng mưa nhiều kết hợp với nước lũ từ thượng nguồn đổ về làm thay đổi thành phần và tính chất hóa lý như nhiệt độ và pH của nước

ao nuôi Cá tra nuôi khó thích nghi sự thay đổi đột ngột, dẫn đến suy yếu và dễ dàng bị tác động bởi các tác nhân gây bệnh Nhiệt độ môi trường xuống thấp là điều kiện

thuận lợi cho vi khuẩn Edwardsiella ictaluri tấn công cá qua mang, da hoặc theo

đường thức ăn [5]

Tuy nhiên, sự biến đổi khí hậu toàn cầu khiến tình hình dịch bệnh trên cá tra tại ĐBSCL diễn biến ngày càng phức tạp Hiện nay, bệnh gan thận mủ trên cá tra có thể xuất hiện quanh năm làm tăng chi phí điều trị cũng như chi phí thức ăn, gây tổn thất lớn cho người nông dân Đối với ao nuôi cá tra thịt, khi ao bị tấn công bởi vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri, chi phí điều trị bệnh tăng từ 3,000 - 4,000 đồng/kg Lượng thức

ăn cũng tăng cao, thay vì 1.55 kg thức ăn cho ra 1kg cá tăng trọng thì nay, tỷ lệ này có thể tăng lên 2 - 2.5 kg thức ăn Nhiều hộ nuôi cá tra xuất khẩu thua lỗ nặng, nguyên nhân một phần do thời tiết bất lợi và cá giống không sạch bệnh [5] Tính đến cuối tháng 10 năm 2018, giá trung bình cá tra nguyên liệu tại ĐBSCL đã lên mức kỷ lục 35,000 – 36,500 đồng/kg Giá cá nguyên liệu tăng quá nhanh đẩy giá xuất khẩu tăng theo Tại một số thị trường, trong đó có thị trường Mỹ, yếu tố giá cũng đang là một bất lợi [3]

1.2.2 Bất cập khi sử dụng kháng sinh trong điều trị dịch bệnh thủy sản

Hiện nay, sử dụng kháng sinh là phương pháp phổ biến để đối phó với bệnh thủy sản nói chung và bệnh gan thận mủ trên cá tra nói riêng Tuy nhiên, phương pháp này gây nhiều bất cập, đặc biệt là ảnh hưởng rõ rệt đến nền kinh tế nước ta Xuất

Hình 1.1 Nhiều đốm trắng có kích cỡ 1-3mm trên gan, thận cá tra mắc bệnh [4]

khẩu phi lê cá tra đông lạnh từng được xem là thế mạnh của nền kinh tế Việt Nam Sau khi xảy ra hàng loạt vụ việc trả hàng do không vượt qua khâu kiểm tra chất lượng tại các thị trường nhập khẩu, trong đó bao gồm kiểm tra dư lượng kháng sinh, mặt hàng này đang đứng trước nguy cơ mất dần vị thế, bởi ngoài việc cạnh tranh với các nước khác còn cho thấy sự không đảm bảo về chất lượng cũng như vệ sinh an toàn thực phẩm [6] Nguyên nhân chủ yếu do tình trạng sử dụng kháng sinh bất hợp lý của người nông dân cùng với sự kiểm soát chất lượng nguồn cung thiếu chặt chẽ của các doanh nghiệp xuất khẩu cá tra

Tháng 10 năm 2014, Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản (NAFIQAD), thông qua hệ thống cảnh báo nhanh (RASFF) của Tổng vụ Sức khỏe và Người tiêu dùng - Ủy ban Châu Âu, NAFIQAD đã nhận được thông tin về 11 lô hàng cá tra Việt Nam bị cơ quan thẩm quyền EU phát hiện có dư lượng kháng sinh cấm sử dụng Nitrofurazone (dẫn xuất của Nitrofuran) Ngay sau đó, tại thị trường Hàn Quốc, Cơ quan quản lý chất lượng thủy sản Hàn Quốc (NFQS) cũng kiểm tra tăng cường các chỉ tiêu trong nhóm Nitrofuran đối với các lô hàng cá tra nhập khẩu từ Việt Nam Đây là lần đầu tiên sản phẩm cá tra đông lạnh xuất khẩu của Việt Nam bị vướng vào chất kháng sinh cấm Các vụ việc trả hàng do không đạt các chỉ tiêu chất lượng, bao gồm dư lượng kháng sinh, gây mất uy tín và trở ngại cho ngành xuất khẩu thủy sản nói chung và xuất khẩu cá tra nói riêng Từ ngày 02/08/2017, Mỹ công bố tiến hành kiểm tra 100% lô hàng cá da trơn nhập khẩu từ Việt Nam trước khi lưu thông tại thị trường Mỹ Trong đó, riêng nhóm hóa chất, đối với các lô cá tra, Mỹ kiểm nghiệm đa dư lượng 108 chất nhóm thuốc bảo vệ thực vật, 89 chất kháng sinh, 17 kim loại và 4 chất nhóm thuốc nhuộm Những rào cản trên đã khiến xuất khẩu cá tra sang Mỹ trong năm 2017 giảm gần 11%, xuống còn 387 triệu USD [7]

Không những gây ra hiện tượng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, việc sử dụng thuốc và hoá chất không đúng qui định, lặp đi lặp lại trong thời gian dài đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của nhiều tác nhân gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản Hậu quả là làm giảm hiệu quả sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh ở cá tra nói riêng và thủy sản nói chung tại Việt Nam

Báo cáo “Xác định tình trạng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Việt Nam”(2005) của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs đã đưa ra những dẫn chứng thiết thực về hiện trạng vi khuẩn gây bệnh thủy sản kháng thuốc kháng sinh Kết quả cho thấy hiện tượng đa kháng thuốc ở các dòng thử nghiệm là khá cao Phần lớn (94%) là kháng từ 3 loại kháng sinh trở lên trong đó có cả thuốc kháng sinh dùng trong y khoa như chloramphenicol, ampicillin và tetracyline Kết quả giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của chloramphenicol lên các chủng thí nghiệm ở mức rất cao (1024 ppm) và có đến 91% các dòng vi khuẩn thử nghiệm có giá trị MIC dao động từ 512 đến 1024 ppm [8]

Ngoài ra, theo báo cáo “Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh trên hai loài vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long” (2014) đánh giá tính kháng thuốc của 60 chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila đối với 15 loại kháng sinh Trong đó, vi khuẩn E ictaluri chỉ còn nhạy với các kháng sinh nhóm

penicillin và tỷ lệ kháng cao với các kháng sinh tetracyclin, enrofloxacin,

streptomycin và kháng sinh nhóm fennicol Đặc biệt, các vi khuẩn E ictaluri phân

lập được kháng hoàn toàn với trimethoprim/ sunfamethoxazol [9]

Một nghiên cứu khác vào năm 2017 đã cho thấy sự hiện diện của các gene có kiểu hình đa kháng thuốc kháng sinh và phát tán gene kháng thuốc cho các chủng

khác cùng loài, thậm chí loài vi khuẩn khác, trên genome của chủng E ictaluri phân

lập từ gan, thận, tỳ tạng của cá tra bệnh tại Đồng bằng sông Cửu Long [10]

Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đang nỗ lực tìm ra giải pháp để khắc phục các bất cập của việc sử dụng kháng sinh Trong bối cảnh các loại kháng sinh được sản xuất đến thời điểm này đang dần mất hiệu lực, nhiều nhà nghiên cứu xem xét các biện pháp thay thế kháng sinh trong tương lai, trong đó có liệu pháp thực khuẩn thể

1.3 Liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản

1.3.1 Tổng quan về thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể

A Thực khuẩn thể và các quá trình nhân lên của thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể (bacteriophage hay phage) là những virus chỉ xâm nhập và làm tan rã vi khuẩn Đặc biệt, chúng không gây hại đối với con người Hơn thế, thực

khuẩn thể tấn công vi khuẩn với tính đặc hiệu cao, ít ảnh hưởng đến những vi khuẩn có lợi như những vi khuẩn sống trong hệ tiêu hóa người Chúng được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1915 bởi một nhà vi khuẩn học người Anh là Frederick Twort Hai năm sau (1917), nhà vi sinh vật học Pháp Félix d'Hérelle lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ “thực khuẩn thể” cho nhóm virus là nguyên nhân chính tiêu diệt vi khuẩn trong các phát hiện trước đó

Tương tự các loại virus khác, thực khuẩn thể rất đa dạng về cấu trúc cũng như bộ máy di truyền Chúng có thể cấu tạo bởi sợi đơn hay sợi đôi RNA hoặc DNA với vỏ capsid hình xoắn hay khối 20 mặt; có thể có hoặc không có màng bao Tuy nhiên, phần lớn trong số các thực khuẩn thể đã được biết đến giờ sở hữu bộ gene DNA sợi kép Đây cũng được xem là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên [11] Ngoài hình thái và vật liệu di truyền, thực khuẩn thể còn được phân loại dựa trên khu vực xuất hiện phổ biến, vi khuẩn mục tiêu và thông thường nhất là dựa trên hình thức nhân lên của chúng thông qua tế bào chủ [12]

Thực khuẩn thể nhân lên trong hệ thống tế bào chủ theo chu trình sinh tan (lytic cycle) và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) Đây là cơ sở để chia thực khuẩn thể làm 2 nhóm là thực khuẩn thể độc (virulent phage) và thực khuẩn thể ôn hòa (temperate phage)

Chu trình tan xảy ra với thực khuẩn thể độc, diễn ra qua các bước:

Hấp phụ (adsorption): Thực khuẩn thể bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn qua

các thụ thể (receptor) đặc hiệu Người ta nhận thấy trên bề mặt vi khuẩn có khoảng 300 thụ thể, và các thực khuẩn thể khác nhau có các vị trí điểm hấp phụ khác nhau [13] Một số thực khuẩn thể có thể bám trên tiêm mao hay lông của vi khuẩn [11]

Xâm nhập (penetration): Sau khi hấp phụ, thực khuẩn thể co phần đuôi lại còn

một nửa chiều dài và đâm ống đuôi qua thành tế bào và màng tế bào chất Enzyme lysozyme tiết ra từ đuôi phá hủy thành tế bào vi khuẩn DNA của thực khuẩn thể được bơm vào nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn, bỏ lại vỏ capsid ngoài thành tế bào Nếu có từ 2 thực khuẩn thể khác nhau trở lên xâm nhập vào cùng một tế bào vi khuẩn thì chỉ có một thực khuẩn thể được nhân lên [13]

Tổng hợp (synthesis): Bộ máy di truyền thực khuẩn thể rất nhỏ để chúng có

thể tự tổng hợp Vì vậy, khi đã xâm nhập vào tế bào chủ, bằng nhiều cách khác nhau, chúng kiểm soát bộ máy trao đổi chất của tế bào chủ nhằm sản xuất các vật liệu để tổng hợp thực khuẩn thể mới

Trưởng thành (maturation): Các phần tử của thực khuẩn thể hợp nhất, tạo

thành thực khuẩn thể hoàn chỉnh

Phóng thích (release): Enzyme lysozome mã hóa bởi DNA thực khuẩn thể phá

hủy thành tế bào giúp giải phóng các thực khuẩn thể Tế bào vi khuẩn lúc này bị phá vỡ

Khoảng thời gian từ giai đoạn hấp phụ đến phóng thích (chu kỳ xâm nhiễm) tùy thuộc vào thực khuẩn thể khác nhau Số lượng thực khuẩn thể mới tạo thành từ mỗi tế bào vi khuẩn (hệ số nhân) khoảng 50 đến 200 thực khuẩn thể [11]

Chu trình tiềm tan xảy ra với các thực khuẩn thể ôn hòa Không phải lúc nào chúng cũng nhân lên theo chu trình sinh tan, phần lớn thời gian chúng ở trạng thái tiềm tan Khi đó, bộ máy di truyền thực khuẩn thể hợp nhất với bộ máy di truyền của Hình 1.2 Chu trình sinh tan (Lytic cycle) và chu trình tiềm tan (Lysogenic cycle)

của thực khuẩn thể [11]

tế bào chủ gọi là prophage Trong giai đoạn này, chúng gần như vô hại với tế bào chủ Các prophage nhân lên cùng bộ máy di truyền của tế bào vi khuẩn; vì vậy tất cả tế bào con hình thành sau quá trình phân bào đều mang bộ gene của cả tế bào mẹ và prophage Chu trình tan có thể xảy ra ngẫu nhiên hoặc khi có tác động từ bên ngoài như sự thiếu hụt chất dinh dưỡng, sự tích lũy các chất độc đối với tế bào [11] Khi chu trình tan xảy ra, các thực khuẩn thể mới sinh ra có thể chứa cả đoạn DNA của vi khuẩn chủ, gây ra mối nguy phát tán gene gây độc và gene kháng kháng sinh từ tế

bào chủ Báo cáo của Yang và cs (2018) cho thấy có sự hiện diện của gene sul2 kháng sulfonamide, gene aac-(6')-lb-cr kháng ciprofloxacin, gene ermF kháng erythromycin và gene aph(3')-IIIa kháng aminoglycosides trên DNA của thực khuẩn

thể phân lập từ nước sông [14] Nhóm tác giả Calero-Cáceres và cs (2019) cũng đã chứng minh thực khuẩn thể trong môi trường biển mang gene kháng kháng sinh như

kháng aminocoumarin, bacitracin, thậm chí đa kháng kháng sinh (cụ thể gene mexB)

[15]

Như vậy, nếu lợi dụng quá trình nhân lên của thực khuẩn thể để tiêu diệt các tế bào vi khuẩn có hại thì sử dụng thực khuẩn thể độc là lựa chọn hợp lý Chúng sẽ phá vỡ các tế bào vi khuẩn ở giai đoạn phóng thích trong chu trình tan Mặt khác, sử dụng thực khuẩn thể ôn hòa không những gặp nhiều trở ngại trong việc bất hoạt và tiêu diệt tế bào vi khuẩn mà còn tiềm ẩn nguy cơ phát tán các gene độc, gene kháng thuốc từ tế bào chủ một cách ngẫu nhiên, khó kiểm soát

B Tính kháng thực khuẩn thể của vi khuẩn

Thực khuẩn thể có khả năng nhận diện và tương tác đặc hiệu với các thụ thể nằm trên bề mặt ngoài tế bào vi khuẩn Các thành phần tham gia cấu tạo bề mặt ngoài tế bào vi khuẩn đồng thời là thụ thể cho thực khuẩn thể khá đa dạng, tùy thuộc vào nhóm vi khuẩn Gram âm hay vi khuẩn Gram dương Vì vậy, một trong những cơ chế kháng thực khuẩn thể của vi khuẩn là ẩn, thay đổi hoặc loại bỏ các điểm thụ thể [16]

Với nhóm vi khuẩn Gram âm, cấu trúc thành tế bào gồm lớp màng ngoài lipid và lớp mỏng peptidoglycan Ngoài ra, so với vi khuẩn Gram dương, chúng còn có các Lipopolysaccharide (LSP) trên lớp màng ngoài LPS là phức hợp polymer của monosaccharide và acid béo, gồm 3 phần là lipid A, lõi và kháng nguyên O Có 2 loại LPS là loại nhẵn (S) - dạng cấu trúc thông thường - và loại nhám (R) - dạng không có kháng nguyên O Một vài thực khuẩn thể sẽ hấp phụ lên cả 2 loại LPS Thực khuẩn thể nhận diện LPS nhẵn có phổ xâm nhiễm hẹp, với tính đặc hiệu được xác định bởi cấu trúc đa dạng của kháng nguyên O của từng nhóm vi khuẩn Ngược lại, thực khuẩn thể nhận diện LPS nhám có phổ xâm nhiễm rộng hơn do cấu trúc lõi LPS được bảo tồn ở nhiều loài vi khuẩn Gram âm Ngoài ra, các protein trên màng cũng có thể là các thụ thể cho thực khuẩn thể [17] Báo cáo của Seed và cs (2012) chứng minh rằng

vi khuẩn Vibrio cholerae có khả năng thay đổi kháng nguyên O1 của chúng để ngăn chặn quá trình hấp phụ của thực khuẩn thể Ở Vibrio cholerae, gene wbeL và manA

đóng vai trò quan trọng trong sự tổng hợp kháng nguyên O1 Đột biến ở đuôi poly-A

của wbeL tạo nên sự thay đổi kháng nguyên O1, ngăn chặn sự tấn công của thực

khuẩn thể ICP1 [18]

Với nhóm vi khuẩn Gram dương, điểm khác biệt chính là lớp peptidoglycan của vi khuẩn Gram dương chiếm 40 – 90 % trọng lượng khô tế bào Peptidoglycan là một polymer gồm các monomer là N-acetyl-glucosamine và N-acetylmuramic acid Ngoài ra, teichoic acid cũng là một thành phần quan trọng, và đóng vai trò là kháng

Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm

nguyên bề mặt của vi khuẩn Theo nghiên cứu của Linberg năm 1973, sự tham gia của N-acetyl-glucosamine trong công thức của teichoic acid và nhóm O-acetyl trong muramic acid đóng vai trò quan trọng đến sự hấp phụ của thực khuẩn thể lên

Staphylococcus aureus [17] Báo cáo của Azam và cs (2018) cho thấy có sự xuất hiện

của các chủng kháng thực khuẩn thể ɸSA039 khi cho chúng xâm nhiễm

Staphylococcus aureus SA003 Chủng kháng SA003R2 bị đột biến mất gene S156,

mã hóa enzyme TarS cho quá trình glycosyl hóa β-N-acetyl-glucosamine trên teichoic acid Điều này đã làm giảm rõ rệt khả năng hấp phụ của ɸSA039 [19]

Bên cạnh đó, nhiều thực khuẩn thể có thụ thể là lông, tiêm mao, polysaccharide trên vỏ nhầy như thực khuẩn thể χ xâm nhiễm các vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriacae, thực khuẩn thể PBS7 xâm nhiễm B subtilis, B pumilus, B licheniformis, hay thực khuẩn thể PBP7 đặc hiệu với B pumilis Thụ thể trên vỏ nhầy của vi khuẩn gram âm cũng có thể là kháng nguyên Vi thường có trên Salmonella, Citrobacter và E coli [17] Các thụ thể này cũng có thể bị biến đổi để kháng lại sự

xâm nhiễm của thực khuẩn thể

Ngoài những thay đổi trên bề mặt ngoài, vi khuẩn còn có các chơ chế khác để kháng lại sự tấn công của thực khuẩn thể như ngăn chặn quá trình xâm nhập của thực khuẩn thể, phân giải vật liệu di truyền của thực khuẩn thể… Với cơ chế ngăn chặn sự xâm nhập của DNA thực khuẩn thể, vi khuẩn sử dụng hệ thống loại trừ bội nhiễm (Superinfection exclusion, gọi tắt là Sie), gồm các protein nằm trong cấu trúc màng vi khuẩn để chống lại sự tấn công trở lại của các thực khuẩn thể đặc hiệu Ví dụ hệ

thống Sie của Escherichia coli gồm protein Imm và protein Sp Sau khi lớp

peptidoglycan trên màng tế bào bị phá vỡ, protein Imm ngăn chặn không cho DNA

của T4 xâm nhập tiếp qua lớp màng trong để vào tế bào chất Ở các chủng Escherichia coli khác còn có sự hỗ trợ của protein Sp ngăn cản quá trình phân giải lớp

peptidoglycan DNA của T4 sẽ bị nhốt giữa lớp peptidoglycan và lớp màng ngoài [20]

Hình 1.4 Cơ chế ngăn chặn sự xâm nhập của DNA thực khuẩn thể T4 trên

Escherichia coli [20]

Trường hợp DNA thực khuẩn thể đã xâm nhập được vào tế bào chất, đa số vi khuẩn có thể sử dụng hệ thống R-M (Restriction-modification systems) để phân cắt các DNA lạ Hệ thống R-M gồm enzyme cắt giới hạn có chức năng cắt đặc hiệu các đoạn DNA không bị methyl hóa và enzyme methylase có chức năng methyl hóa, bảo vệ DNA Thông thường, enzyme cắt giới hạn có hoạt tính cao hơn enzyme methylase vì vậy DNA thực khuẩn thể sẽ bị phân giải Trường hợp DNA thực khuẩn thể được methyl hóa, các thực khuẩn thể mới sẽ sinh ra và tiếp tục xâm nhiễm các tế bào lân cận có cùng hệ thống R-M [20]

Ngoài hệ thống R-M, vi khuẩn còn sử dụng hệ thống CRISPR–Cas để phân cắt DNA thực khuẩn thể Trên bộ gene của vi khuẩn có chứa gene mã hóa enzyme cas, đóng vai trò phân cắt DNA và vùng CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) có chức năng như bộ nhớ, định hướng hoạt tính xúc tác chống lại các DNA ngoại lai CRISPR thường bao gồm nhiều trình tự lặp lại không nối tiếp, xen giữa bằng các trình tự DNA ngắn, gọi là spacer, lấy từ các nhân tố di truyền bên ngoài bộ gene vi khuẩn Hệ thống này khi được biểu hiện sẽ tạo ra các phức hợp chứa protein cas với crRNA, bắt cặp và phân cắt đặc hiệu các DNA ngoại lai Vì vậy hệ thống CRISPR–Cas được xem như hệ miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn [21]

C Liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản

Liệu pháp thực khuẩn thể là phương pháp trị liệu sử dụng thực khuẩn thể độc để phòng và điều trị các bệnh do vi khuẩn So với việc sử dụng kháng sinh, ưu điểm của liệu pháp thực khuẩn thể là tính đặc hiệu cao Điều này giúp làm giảm ảnh hưởng của việc điều trị với hệ vi sinh vật trong ruột cá cũng như các vi khuẩn tự nhiên không phải chủng đích Mặt khác, thực khuẩn thể có nguồn gốc tự nhiên, rất đa dạng và phong phú nên hạn chế đáng kể khó khăn trong việc phê chuẩn và cấp giấy phép sử dụng so với kháng sinh Cũng chính vì chúng xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, việc phân lập một thực khuẩn thể mới nhanh hơn phát hiện một kháng sinh mới Ngoài ra, thực khuẩn thể được nhân lên thông qua quá trình lây nhiễm vào các tế bào vi khuẩn đặc hiệu chỉ trong vài giờ, vì vậy công nghệ sản xuất thực khuẩn thể sẽ ít sử dụng các hóa chất đắt tiền và tiết kiệm chi phí hơn so với kháng sinh [22]

Thông thường một quy trình nghiên cứu chọn lọc chủng thực khuẩn thể đặc hiệu với vi khuẩn đích và đánh giá tính hiệu quả của chúng bao gồm các bước sau: (1) Phân lập các chủng thực khuẩn thể độc từ môi trường nuôi trồng; (2) Nuôi cấy; (3) Nghiên cứu đặc điểm kiểu gene và kiểu hình của thực khuẩn thể; (4) Lây nhiễm chúng với chủng vi khuẩn đích; (5) Chọn lọc chủng thực khuẩn thể độc thích hợp cho điều trị Tiếp theo, cần xây dựng một mô hình thực tế ứng dụng thực khuẩn thể vào nuôi trồng thủy sản (6) Đánh giá tính hiệu quả của thực khuẩn thể chống lại sự xâm nhiễm trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong khu vực khảo nghiệm; (7) Xác định các gene độc hay yếu tố gây độc trong thực khuẩn thể Và cuối cùng, (8) đánh giá tính thương mại khi sử dụng thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản như là một biện pháp bảo vệ lâu dài [23]

Kể từ những công bố đầu tiên vào thập niên 1980, đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản

Bảng 1.1 Những nghiên cứu về liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản [22]

Vi khuẩn Tên bệnh thủy sản Đối tượng nghiên cứu

Tài liệu tham khảo

Aeromonas hydrophila

Bệnh xuất huyết

(Hemorrhagicsepticemia) Thối đuôi-thối vảy (tail and fin rot) Bệnh đỏ vảy (red-fin disease)

Cá chạch

(Misgurnus anguillicaudatus)

Wu và cs (1981) Jun và cs (2013)

Aeromonas salmonicida

Bệnh nhọt (Furnunculosis)

Cá hồi chấm hồng

(Salvelinus fontinalis)

Cá hồi cầu vồng

(Oncorhynchus mykiss)

Cá hồi Đại Tây Dương

(Salmo salar)

Imbeault và cs (2006)

Edwardsiella tarda

Bệnh đốm trắng (Edwardsiellosis)

Cá chạch

(Misgurnus anguillicaudatus)

Wu và cs(1981)Wu và Chao

Flavobacterium columnare

Bệnh Columnaris (Columnaris disease)

Cá trê trắng

(Clarias batrachus)

Prasad và cs (2011)

Flavobacterium psychrophilum

Bệnh lở loét trên cá hồi vân (Rainbow trout fry syndrome)

Cá hồi cầu vồng và

Cá hồi Đại Tây Dương

Madsen và cs (2013) Castillo và cs (2012)

Lactococcus spp

(Seriola

quinqueradiata)

Nakai và cs (1999)

Vi khuẩn Tên bệnh thủy sản Đối tượng nghiên cứu

Tài liệu tham khảo

Pseudomonas aeruginosa

Bệnh tổn thương-loét da (Ulcerative lesions on skin)

Cá trê nước ngọt

(Clarias gariepinus)

Khairnar và cs (2013)

Streptococcus iniae

Bệnh Streptococcosis Cá bơn Nhật Bản

(Paralichthys olivaceus)

Matsuoka và cs (2007)

(Luminous vibriosis)

Tôm hùm

(Penaeus monodon)

Vinod và cs (2006) Karunasagar và cs (2007)

Trên thế giới đã có các công bố phân lập được thực khuẩn thể xâm nhiễm E ictaluri Năm 2008, Walakira và cs đã phân lập và khảo sát hoạt tính của 2 dòng thực khuẩn thể ΦeiDWF and ΦeiAU xâm nhiễm E ictaluri từ mẫu nước hồ nuôi cá da

trơn tại Mỹ [24, 25] Năm 2014, Motoshige Yasuike và cs đã giải mã hoàn chỉnh bộ

gene của thực khuẩn thể PEi21 xâm nhiễm E ictaluri phân lập từ nước sông ở Nhật

Bản [26] Năm 2018, Hoàng và cs đã phân lập một dòng thực khuẩn thể độc MK7

xâm nhiễm đặc hiệu E ictaluri từ gan, thận cá tra thuộc Đồng bằng Sông Cửu Long

MK7 có chu kỳ xâm nhiễm là 45 phút và hệ số nhân là 50 Bên cạnh đó, MK7 cho

kết quả thử nghiệm khả năng bất hoạt E ictaluri trong môi trường tổng hợp là 15 giờ

và trong môi trường nước ao là 51 giờ [27]

1.3.2 Các tiêu chí chọn lọc dòng thực khuẩn thể cho liệu pháp thực khuẩn thể

Tính chất cơ bản cần xác định đối với thực khuẩn thể để đánh giá tính hiệu quả của chúng trong liệu pháp thực khuẩn thể là hoạt tính làm tan rã vi khuẩn (dựa trên chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân) Thực khuẩn thể có chu kỳ ngắn và/hoặc hệ số nhân cao được xem là có hoạt tính làm tan mạnh Ngoài ra, khi thử nghiệm một liệu pháp mới, bên cạnh việc đánh giá tính hiệu quả thì tính an toàn và sự ổn định của liệu pháp cũng là những điểm đáng quan tâm Vì vậy, lựa chọn thực khuẩn thể thích hợp cho một liệu pháp mới cũng phải dựa trên nhiều tiêu chí, nhằm đáp ứng các mục tiêu trên

Như ta đã biết, liệu pháp thực khuẩn thể sử dụng các thực khuẩn thể độc, bắt buộc chỉ thông qua chu trình tan để nhân số lượng Tuy nhiên còn rất nhiều trở ngại trên con đường đưa liệu pháp này ra thực tiễn Cụ thể, cần xem xét khả năng chống

chịu, sự ổn định của thực khuẩn thể trong môi trường in vivo Mặt khác, cần khảo sát

phổ xâm nhiễm Thực khuẩn thể thường có phổ xâm nhiễm hẹp, tùy trường hợp để khắc phục đặc điểm này, các nhà nghiên cứu sử dụng phage cocktail – hỗn hợp nhiều thực khuẩn thể - để mở rộng phổ xâm nhiễm một cách thích hợp Bên cạnh đó, cần khảo sát khả năng sản xuất thực khuẩn thể trong thực tiễn như chủng vi khuẩn sử dụng, khả năng tinh sạch hay điều kiện bảo quản thực khuẩn thể [28]

1.3.3 Nghiên cứu phối trộn thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể có phổ xâm nhiễm khá hẹp Đây được xem là ưu điểm, tuy nhiên cũng mang đến nhiều hạn chế Để được sử dụng như một tác nhân diệt khuẩn, các chế phẩm thực khuẩn thể cần có phổ xâm nhiễm thích hợp, có thể xâm nhiễm và tiêu diệt được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật tự nhiên có lợi hoặc vô hại trong môi trường nuôi trồng thủy sản Ngoài ra, trong quá trình điều trị bệnh bằng liệu pháp thực khuẩn thể, điều đáng lo ngại là sự bùng phát trở lại của vi khuẩn do sự xuất hiện của các chủng kháng thực khuẩn thể

Phối trộn thực khuẩn thể nhằm mục đích mở rộng phổ xâm nhiễm, tăng khả năng điều trị bệnh gây ra bởi nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, và giảm thiểu sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thực khuẩn thể Thuật ngữ “phage cocktail” được sử dụng cho hỗn hợp từ hai thực khuẩn thể riêng biệt trở lên Nhiều báo cáo cho thấy việc sử dụng phage cocktail mang lại hiệu quả hơn thực khuẩn thể riêng lẻ trong việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Kết quả của Carla và cs (2016) đối với thực khuẩn thể

phSE-1, phSE-2 và phSE-5 xâm nhiễm Salmonella Typhimurium cho thấy, ở trường

hợp này khả năng ức chế vi khuẩn đích của phage cocktail không cho hiệu quả rõ rệt hơn so với thực khuẩn thể riêng lẻ, tuy nhiên tỷ lệ vi khuẩn kháng thực khuẩn thể lại thấp hơn [29] Năm 2018, João Duarte và cs báo cáo phage cocktail làm giảm nồng

độ vi khuẩn A salmonicida nhanh hơn thực khuẩn thể đơn, đồng thời làm giảm các

chủng kháng thực khuẩn thể [30]

Tiêu chí lựa chọn thực khuẩn thể tạo phage cocktail dựa trên hoạt tính xâm nhiễm của từng thực khuẩn thể được thể hiện qua chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân Ngoài ra, giả thuyết đặt ra là vi khuẩn kháng thực khuẩn thể này vẫn có thể bị xâm nhiễm bởi các thực khuẩn thể khác trong hỗn hợp nếu ta phối trộn nhiều loại thực khuẩn thể khác nhau, với hình thức xâm nhiễm đa dạng (ví dụ chúng nhận diện các thụ thể khác nhau) Tuy nhiên, cần chú ý đến số loại thực khuẩn thể được phối trộn Càng nhiều thực khuẩn thể thì phổ xâm nhiễm càng lớn Nếu quá nhiều sẽ có khả năng ảnh hưởng lớn đến các vi khuẩn không mục tiêu, sản xuất phức tạp hơn và chi phí sản xuất cao hơn [31]

Hướng ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam còn rất mới Mặc dù đã có báo cáo về phân lập và khảo sát hoạt tính thực khuẩn

thể xâm nhiễm Edwardsiella ictaluri tại Việt Nam, vẫn cần phải thiết lập bộ sưu tập

các thực khuẩn thể để làm cơ sở cho việc lựa chọn dòng thực khuẩn thể thích hợp Bên cạnh đó, việc sử dụng thực khuẩn thể làm công cụ ức chế sự phát triển của vi khuẩn còn nhiều khó khăn, như sự phát sinh của các chủng vi khuẩn kháng thực khuẩn thể trong quá trình điều trị Phối trộn thực khuẩn thể được xem là chiến lược giúp tăng hiệu quả của liệu pháp thực khuẩn thể dựa trên cơ sở mở rộng phổ xâm nhiễm, có thể khắc phục tình trạng kháng thực khuẩn thể so với việc sử dụng một thực khuẩn thể đơn lẻ Bên cạnh đó, một hỗn hợp chứa nhiều dòng thực khuẩn thể xâm nhiễm được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau giúp làm tăng giá trị thực tiễn của liệu pháp Vì vậy, mục tiêu chính của đề tài là nghiên cứu phối trộn và chọn lọc hỗn hợp thực khuẩn thể thích hợp trong phòng và điều trị bệnh gan thận mủ do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri ở cá tra

Các bước nghiên cứu của đề tài: (1) phân lập và khảo sát đặc tính của các thực khuẩn thể từ mẫu gan cá tra bao gồm hoạt tính xâm nhiễm chủng vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri (chu kỳ xâm nhiễm, hệ số nhân) và hình thái, (2) nghiên cứu khả năng ức chế của từng thực khuẩn thể đơn lẻ đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

trong môi trường dinh dưỡng chuẩn, (3) phối trộn và nghiên cứu khả năng ức chế của

các hỗn hợp thực khuẩn thể đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong môi trường

dinh dưỡng chuẩn