Nghiên cứu đa hình snp trên một số gen thuộc hệ thống igf liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở cá tra nuôi

1 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa LỜICAMĐOAN i LỜICẢMƠN ii MỤCLỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮVIẾTTẮT vii DANH MỤCCÁCBẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ,ĐỒTHỊ xi MỞĐẦU CHƯƠNG TỔNGQUAN 1.1 Giới thiệu chung cá tra nuôiPangasianodonhypophthalmus 1.1.1 Vịtrí phân loại đặc điểmsinhhọc 1.1.2 Tình hình ni trồng giá trịkinhtế 1.1.3 Các nghiên cứu liên quan đến chọn giốngcá tra 1.2 Tăng trưởng (phát triển cơ) cávàcác genliên quan 1.2.1 Quá trình tăng trưởngởcá 1.2.2 Điều hòa tăng trưởngởcá 1.2.3 Một số gen liên quan đến tính trạng tăng trưởng nghiên cứu ởcá xương 11 1.3 Vai trò, chức năngvàđặc điểm cấu trúc số gen /protein thuộc hệ thống IGF 13 1.3.1 Vai trò, chức số protein thuộc hệ thống IGF tăngtrưởng củasinhvật .13 1.3.2 Đặc điểm cấu trúc số gen protein tương ứng thuộc hệ thống IGFcủacá xương 16 1.4 Cơ sở tiến hành xác định đa hình đơn nucleotide (SNP) số gen thuộc hệ thống IGF liên quan đến tính trạng tăng trưởng cátrani .23 1.4.1 Vai trị quan trọng SNP việc xác định thị phân tử liênquan đến tính trạngquan tâm .23 1.4.2 Một số phương pháp xác định SNP (SNP genotyping) trêngen đích 24 1.4.3 Các nghiên cứu SNP số gen thuộc hệ thống IGF liên quan đếntính trạng tăng trưởng ởcá xương 29 1.4.4 Các gen thuộc hệ thống IGF xác định dựa thông tin hệ gen cátra nuôi 31 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀPHƯƠNGPHÁP 34 2.1 Nguyênvậtliệu 34 2.2 Phươngpháp .36 2.2.1 Phân tích cấu trúc cácgenđích 36 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 37 2.2.3 Khuếch đại gen phảnứngPCR 37 2.2.4 Giải trình tự gen IGF1, IGF2, IGF1R, IGFBP-1, -2, -3, -5, -6, -7 bằngphươngphápSanger 47 2.2.5 Kiểm tra tính xác thực kết giải mã Sanger so với trình tựthamchiếu 48 2.2.6 Phát sàng lọc SNP gen đích mẫukhởitạo .48 2.2.7 Xác định SNP sàng lọc mẫu kiểm nghiệm phươngpháp kéo dài mộtnucleotide(SBE) 50 2.2.8 Phân tíchdữliệu 53 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ .55 3.1 Phân tích cấu trúc số gen/protein thuộc hệ thống IGF cá tra nuôi.55 3.1.1 Các gen mã hóa IGF (IGF1 IGF2) proteintươngứng .55 3.1.2 Gen mã hóa thụ thể IGF1 (IGF1R) proteintươngứng 58 3.1.3 Một số gen mã hóa IGFBPvàcác proteintươngứng 60 3.2 Xác định tính xác thực trình tự giải mã Sanger so với trình tự tham chiếu 63 3.3 Phát hiện, sàng lọc SNP gen đích thuộc hệ thống IGF mẫu khởi tạo .64 3.3.1 Phát sàng lọc SNP trêngenIGF1 64 3.3.2 Phát sàng lọc SNP trêngenIGF2 66 3.3.3 Phát sàng lọc SNP trêngenIGF1R .68 3.3.4 Phát sàng lọc SNP trêngen IGFBP-1 70 3.3.5 Phát sàng lọc SNP trêngen IGFBP-2 71 3.3.6 Phát sàng lọc SNP trêngen IGFBP-3 72 3.3.7 Phát sàng lọc SNP trêngen IGFBP-5 74 3.3.8 Phát sàng lọc SNP trêngen IGFBP-6 75 3.3.9 Phát sàng lọc SNP trêngen IGFBP-7 78 3.4 Phân tích liên quan đến tính trạng tăng trưởng SNP sàng lọc.82 3.4.1 SNP genotyping cá thể thuộc mẫukiểmnghiệm 82 3.4.2 Phân tích mối liên quan SNP sàng lọc tính trạng tăng trưởngcủa cátra nuôi 84 CHƯƠNG THẢOLUẬN 98 4.1 Trình tựvàcấu trúc hồn chỉnh gen thuộc hệ thống IGF cá tra nuôi phân tích tương đồng với lồi cáxươngkhác 98 4.2 Sự đa dạng di truyền gen thuộc hệ thống IGF cátra nuôi .100 4.3 Sự liên quan đa dạng di truyền gen thuộc hệ thống IGF với tính trạng tăng trưởng cátrani .105 4.4 Phát triển thị phân tử SNP nhằm ứng dụng chọn giống cá tra theo hướng tăng trưởng 108 KẾTLUẬN .110 KIẾNNGHỊ 111 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦATÁCGIẢ 112 TÀI LIỆUTHAMKHẢO 113 PHỤLỤC 127 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên Tên đầy đủ viết tắt AFLP Nghĩa tiếng Việt dùng luận án ALS Amplified fragment length polymorphism Acid labile subunit Đa hình chiều dài đoạn khuếch đại Tiểu đơn vị axit không bền Alt Alternative Thay ATP Adenosine triphosphate BLAST Basic Local Alignment Search Tool Coding sequence CDS CpG Công cụ tìm kiểm so sánh trình tự Vùng mã hóa Đảo CpG Cys Cysteine EBV Estimated breeding value Giá trị chọn giống ước đoán FRET GF Fluorescence resonance energy transfer Growth factor Chuyển đổi lượng cộng hưởng huỳnh quang Nhân tố tăng trưởng GH Growth hormone Hormone tăng trưởng GHIH H Growth hormone-inhibiting hormone Growth hormone-releasing hormone Haplotype Hormone ức chế hormone tăng trưởng Hormone giải phóng hormone tăng trưởng Kiểu gen đơn bội IGF Insulin like growth factor Nhân tố tăng trưởng tương tự insulin GHRH IGFBP Insulin like growth factor binding protein IGFBP-rP IGFBP-related protein Protein bám với IGF IGFR Thụ thể IGF LD Insulin like growth factor receptor Linkage disequilibrium LOH Loss of heterozygousity Mất tính dị hợp tử MAF Minor allele frequency Tần số alen thiểu số Protein liên quan đến IGFBP Mất cân liên kết MAS Marker‐assisted selection Chọn giống nhờ thị MRFs Myogenic regulatory factors Các nhân tố điều hòa NCBI NGS National Center for Biotechnology Information Next generation sequencing Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Giải trình tự gen hệ NN Non-identified Không xác định NST Chromosome Nhiễm sắc thể PIC Polymorphism information content Quantitative trait loci Thơng tin đa hình Vị trí cắt enzym giới hạn DNA Nhân ngẫu nhiên DNA đa hình Ref Restriction site associated DNA Random amplified polymorphism DNA Reference RNA-seq RNA sequencing Giải trình tự RNA SAP Shrimp alkaline phosphatase SBE Single base extension Kéo dài nucleotide SNP Đa hình đơn nucleotide SP Single nucleotide polymorphism Signal peptide MAP Simple sequence repeat Đoạn lặp trình tự đơn giản QTL RAD RAPD Locus quy định tính trạng số lượng Tham chiếu Peptit tín hiệu TTC Tăng trưởng chậm TTN Tăng trưởng nhanh UTR Untranslated region Vùng không dịch mã WGS Whole genome sequencing Giải trình tự tồn hệ gen DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Các gen thuộc hệ thống IGF cátra nuôi 32 Bảng 1.2.Sốđịnh danh trình tự gen, mRNA, protein NCBI số gen hệ thống IGF cá tra nuôi lựa chọn để phân tíchcấutrúc 33 Bảng 2.1.Thông tin 20 cá thể cá tra nuôi mẫukhởi tạo 35 Bảng 2.2.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGF1 .38 Bảng 2.3.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGF2 .39 Bảng 2.4.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGF1R 41 Bảng 2.5.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGFBP-1 .42 Bảng 2.6.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGFBP-2 .43 Bảng 2.7.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGFBP-3 .45 Bảng 2.8.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGFBP-5 .45 Bảng 2.9.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGFBP-6 .46 Bảng 2.10.Danh sách cặp mồi thiếtkếnhằm nhân đoạngenIGFBP-7 .47 Bảng 2.11.Trình tự mồi nhân đoạn chứa SNP sàng lọcvàmồi SBE cho phản ứng kéo dài mộtnucleotide(SBE) 51 Bảng 3.1.Danh sách SNP phát trêngenIGF1 66 Bảng 3.2.Danh sách SNP phát trêngenIGF2 67 Bảng 3.3.Danh sách SNP phát trêngenIGF1R 69 Bảng 3.4.Danh sách SNP phát trêngenIGFBP-1 70 Bảng 3.5.Danh sách SNP phát trêngenIGFBP-2 71 Bảng 3.6.Danh sách SNP phát trêngenIGFBP-3 73 Bảng 3.7.Danh sách SNP phát trêngenIGFBP-5 75 Bảng 3.8.Danh sách SNP phát trêngenIGFBP-6 77 Bảng 3.9.Danh sách SNP phát trêngenIGFBP-7 80 Bảng 3.10.Danh sách SNP sàng lọc mẫukhởitạo .82 Bảng 3.11.Phân tích mối liên quan SNP 13680 A>T genIGF1với tính trạng tăng trưởng cátrani 85 Bảng 3.12.Phân tích mối liên quan SNP genIGF1Rvới tính trạng tăng trưởng cátra ni 86 Bảng 3.13.Phân tích cân liên kết (linkage disequilibrium (LD)) SNP genIGF1Rthông qua giá trị D’vàR2 .87 Bảng 3.14.Phân tích mối liên quan haplotype phát sinh từ SNP genIGF1R lên tính trạng tăng trưởng cátranuôi .88 Bảng 3.15.Phân tích mối liên quan SNP 704 C>G (p.Leu8Val) genIGFBP-3 với tính trạng tăng trưởng cátranuôi .89 Bảng 3.16.Phân tích mối liên quan SNP 525 T>A (p.Val16Glu) genIGFBP5với tính trạng tăng trưởng cátranuôi 90 Bảng 3.17.Phân tích mối liên quan SNP 2278 C>A genIGFBP-6với tính trạng tăng trưởng cátrani 91 Bảng 3.18.Phân tích mối liên quan SNP genIGFBP-7với tính trạng tăng trưởng cátra ni 92 Bảng 3.19.Phân tích cân liên kết (linkage disequilibrium (LD)) SNP genIGFBP-7thông qua giá trị D’vàR2 93 Bảng 3.20.Phân tích mối liên quan haplotype phát sinh từ SNP genIGFBP7lên tính trạng tăngtrưởng 94 Bảng 3.21.Phân tích tác động haplotype phát sinh từ thị SNP lựa chọn lên tính trạng tăng trưởng cátrani .95 Bảng 3.22 Phân tích tác động tổ hợp kiểu gen phát sinh từ thị SNP lựa chọn lên tính trạng tăng trưởng cátranuôi .97 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1.Cá tra nuôiPangasianodon hypophthalmus Hình 1.2.Sựphát triển sau giai đoạn phơi ởcáxương Hình 1.3.Mơ hình điều hòa phát triển cơởcá 10 Hình 1.4.Hệ thống IGF động vậtcóvú 13 Hình 1.5.Cấu trúc tiền thân IGFvàcấu trúc bậc ba protein IGF ởcáxương 17 Hình 1.6.Cấu trúc tetramer IGF1R gồm chuỗi dịdimer alphabeta 19 Hình 1.7.Cấu trúc gen, protein IGF1Ra (A)vàIGF1Rb (B) cácloàicá 21 Hình 1.8.Cấu trúc genvàprotein củacác IGFBP 22 Hình 1.9.Nguyên lýkỹthuật PCR đặc hiệu alen dựatrên FRET 26 Hình 1.10.Hình ảnh minh họa q trình thực thí nghiệm SBE sử dụng SNapShot 27 Hình 2.1.Nội dung nghiên cứuvàcác nhóm phương pháp nghiên cứutươngứng 36 Hình 2.2 Vị trí cặp mồi thiếtkếtrên trình tựgenIGF1 38 Hình 2.3 Vị trí cặp mồi thiếtkếtrên trình tựgenIGF2 39 Hình 2.4.Vị trí cặp mồi thiếtkếtrên trình tựgenIGF1R 40 Hình 2.5.Vị trí cặp mồi thiếtkếtrên trình tựgenIGFBP-1 .42 Hình 2.6.Vị trí cặp mồi thiếtkếtrên trình tựgenIGFBP-2 .43 Hình 2.7.Vị trí cặp mồi thiết kế trình tự genIGFBP-3,IGFBP-5và IGFBP-6 .44 Hình 2.8.Vị trí cặp mồi thiếtkếtrên trình tựgenIGFBP-7 .46 Hình 2.9.Tiêu chí sàng lọc SNP phát mẫukhởitạo 49 Hình 3.1.Kết phân tích cấu trúc genvàprotein IGF1 cátrani 55 Hình 3.2.Kết phân tích cấu trúc genvàprotein IGF2 cátrani 57 Hình 3.3.Kết phân tích cấu trúc genvàprotein IGF1R cátra nuôi 59 Hình 3.4.Kết phân tích cấu trúc gen, protein IGFBP-1vàIGFBP-2 60 Hình 3.5.Kết phân tích cấu trúc gen, protein IGFBP-3 (A), IGFBP-5 (B)vàIGFBP6(C) 61 Hình 3.6.Kết phân tích cấu trúc genvàproteinIGFBP-7 63 Hình 3.7.Kết phát hiệnIGF1.13680A>Ttrên genIGF1thơng qua so sánh trình tự tương ứng giảimãbằng phương pháp Sanger với trình tự tham chiếu 65Hình 3.8.Kết phát hiệnIGF1R.83894 A>G genIGF1Rthơng qua so sánh trình tự tương ứng giảimãbằng phương pháp Sanger với trình tự tham chiếu 68Hình 3.9.Kết phát hiệnIGFBP-3.704 C>G genIGFBP-3thơng qua so sánh trình tự tương ứng giảimãbằng phương pháp Sanger với trình tự thamchiếu .72 Hình 3.10.Kết phát hiệnIGFBP-5.525 T>A genIGFBP-5thông qua so sánh trình tự tương ứng giảimãbằng phương pháp Sanger với trình tự thamchiếu .74 Hình 3.11.Kết phát hiệnIGFBP-6 2278 C>A genIGFBP-6thơng qua so sánh trình tự tương ứng giảimãbằng phương pháp Sanger với trình tự tham chiếu 76 Hình 3.12.Kết phát hiệnIGFBP-7.4559C>Atrên genIGFBP-7thơng qua sosánh trình tự tương ứng giảimãbằng phương pháp Sanger với trình tự thamchiếu 79 Hình 3.13.Kết điện di mao quản sản phẩm SNaPshot mẫu đại diện nhóm mồi SBE thứ sau phân tích phầnmềmGeneMapper 83 Hình 3.14.Kết điện di mao quản SNaPshot mẫu đại diện nhóm mồi SBE thứ hai sau phân tích phầnmềmGeneMapper 84 Hình 4.1.Kết phân tích vị trí SNP phát trêncácgen .100 Hình 4.2.Tỉ lệ SNP sàng lọc tổng số SNP phát gen 102 Hình 4.3.Kết so sánh trình tự protein IGFBP-7 cá tra ni (Pangasianodon hypophthalmus)vàcác lồi cáxươngkhác .103