Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sự thay đổi hàm lượng các chất liên quan đến một số yếu tố sinh thái của loài thiên lý hương (embelia parviflora wall ex a dc ) tại vườn quốc gia tam đảo

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VILASACK PHANTHALATH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT LIÊN QUAN ĐẾN MỘT SỐ YẾU TỐ SINH THÁI CỦA LOÀI THI

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VILASACK PHANTHALATH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT LIÊN QUAN ĐẾN MỘT SỐ YẾU TỐ SINH THÁI CỦA LOÀI THIÊN LÝ HƯƠNG

(Embelia parviflora Wall.ex A.DC.)

TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, tháng 12/2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VILASACK PHANTHALATH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT LIÊN QUAN ĐẾN MỘT SỐ YẾU TỐ SINH THÁI CỦA LOÀI THIÊN LÝ HƯƠNG

(Embelia parviflora Wall.ex A.DC.)

TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

Ngành: Sinh thái học

Mã số: 8.42.01.20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS SỸ DANH THƯỜNG

Thái Nguyên, tháng 12/2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã thực hiện việc kiểm tra mức độ tương đồng luận văn qua phần mềm Turnitin một cách trung thực và đạt kết quả mức độ tương đồng 27% Bản luận văn kiểm tra qua phần mềm là bản cứng đã nộp để bảo vệ trước hội đồng Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nghiệm

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2023

Học viên

(Ký, ghi rõ họ tên)

VILASACK PHANTHALATH

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Sỹ Danh Thường người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Hồng và nhóm nghiên cứu, cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa học

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Bộ Giáo dục

và Đào tạo, mã số B2023-TNA-25

Tôi cũng xin cảm ơn lãnh đạo Trường Trung học phổ thông Viêng Thong, Tỉnh Bolikhamxay, Lào đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học tại Việt Nam

Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2023

Tác giả luận văn

VILASACK PHANTHALATH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Thời gian, phạm vi nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Những nghiên cứu về loài Thiên lý hương ở trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 4

1.2 Những nghiên cứu về đặc điểm cấu tạo hiển vi của các loài cây thuốc ở Việt Nam 6

1.3 Những nghiên cứu về mật độ và khả năng tái sinh của các loài cây thuốc ở Việt Nam 8

1.4 Những nghiên cứu về sự biến đổi hàm lượng các nhóm chất lớn có liên quan đến các yếu tố sinh thái của môi trường 10

1.5 Khái quát điều kiện tự nhiên và kinh tế xã hội của Vườn quốc gia Tam Đảo 11

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Phương pháp điều tra theo tuyến và ô tiêu chuẩn (OTC) 14

2.2 Phương pháp thu mẫu thực vật 14

2.3 Phương pháp phân tích mẫu vật 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái ngoài và cấu tạo hiển vi 15

2.5 Phương pháp nghiên cứu mật độ, chất lượng, nguồn gốc cây tái sinh 15

2.6 Phương pháp đánh giá sự thay đổi hàm lượng các chất liên quan đến các điều kiện sinh thái 17

2.6.1 Đánh giá và xác định các điều kiện sinh thái 17

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu 17

2.7 Phương pháp chiết mẫu nghiên cứu hoạt tính sinh học 18

2.8 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào 18

2.8.1 Phương pháp xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp 19

2.8.2 Phương pháp MTT để xác định hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào đối với tế bào nuôi cấy dạng hỗn dịch (HL-60) 21

2.9 Phương pháp xử lý số liệu 22

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đặc điểm hình thái của loài Thiên lý hương 23

3.1.1 Đặc điểm hình thái ngoài 23

3.1.2 Đặc điểm hình thái hiển vi 25

3.2 Mật độ, chất lượng, nguồn gốc cây tái sinh của loài Thiên lý hương 29

3.2.1 Mật độ 29

3.2.2 Chất lượng và nguồn gốc cây tái sinh 30

3.3 Sự thay đổi hàm lượng các chất lớn có liên quan đến các điều kiện sinh thái 31

3.4 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

1 Kết luận 39

2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Mật độ loài cây Thiên lý hương 29

Bảng 3.2 Nguồn gốc và chất lượng cây tái sinh của Thiên lý hương 30

Bảng 3.3 Các nhân tố sinh thái tại thị trấn Tam Đảo 32

Bảng 3.4 Thành phần và hàm lượng tinh dầu 32

Bảng 3.5 Khả năng gây độc tế bào của mẫu nghiên cứu 35

Bảng 3.6 Hình ảnh gây độc tế bào của mẫu nghiên cứu 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh hình thái ngoài cây Thiên lý hương 24

Hình 3.2 Cấu tạo của rễ 25

Hình 3.3 Cấu tạo thân cây 26

Hình 3.4 Cấu tạo phiến lá 27

Hình 3.5 Cấu tạo gân lá 28

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thiên lý hương (Embelia parviflora Wall ex A DC.) còn có tên khác là

Cẩm xà lặc, Chua ngút hoa thưa, Rè đẹp, Sâm, Xà là pẹt Đây là một loài thực vật làm thuốc quý được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian Rễ và toàn bộ dây leo già dùng làm thuốc trị vô sinh, thông kinh, khí hư, đau lưng, đau gối, gãy xương, việm ruột mãn tính Loài này phân bố ở Cao Bằng, Lạng Sơn (Văn Lãng), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hòa Bình (Đà Bắc), Ninh Bình, Nghệ An (Quỳ Châu), Kon Tum (Ngọc Linh), Gia Lai (Măng Giang), Lâm Đồng (Đà Lạt) Ngoài ra, còn phân bố ở

Ấn Độ, Trung Quốc (Hải Nam, Vân Nam, Quảng Tây, Quảng Đông), Mianma, Thái Lan, Malaixia và Inđônexia Tuy loài Thiên lý hương có khu phân bố rộng, nhưng nơi cư trú rất rải rác và bị chia cắt, số lượng cá thể ít do nạn phá rừng và khai thác (chặt cả cây làm thuốc), được xếp hạng ở mức sẽ nguy cấp (VU)

Vườn quốc gia Tam Đảo nằm trọn trên dãy núi Tam Đảo thuộc địa phận 3 tỉnh gồm Thái Nguyên, Vĩnh Phúc và Tuyên Quang Vườn quốc gia Tam Đảo có 1.282 loài thực vật thuộc 660 chi, 179 họ thực vật bậc cao có mạch, trong đó có các loài điển hình cho vùng cận nhiệt đới Có 42 loài đặc hữu và 64 loài quý hiếm

cần được bảo tồn và bảo vệ như Hoàng thảo tam đảo (Dendrobium daoensis), Trà hoa dài (Camellia longicaudata), Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia petelotii), Toa tiên (Asarum petelotii), Thùy hoa leo (Molas tamdaoensis), Trọng lâu kim tiền (Paris delavayi) và Thiên lý hương (Embelia parviflora)

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về loài thực vật này chủ yếu mô

tả đặc điểm hình thái hoặc liệt kê giá trị sử dụng Tuy nhiên chưa có công trình nào đi sâu điều tra nghiên cứu một cách đầy đủ về đặc điểm hình thái, sinh thái

và sự biến động hàm lượng một số chất liên quan đến các yếu tố sinh thái của

môi trường Với những lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sự thay đổi hàm lượng các chất liên quan đến một số yếu tố sinh thái của loài Thiên lý hương (Embelia parviflora Wall.ex A.DC.) tại vườn quốc gia Tam Đảo

2 Thời gian, phạm vi nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2022 đến tháng 10 năm 2023

- Phạm vi nghiên cứu: đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tại điểm có sự phân

bố của loài Thiên lý hương tại Vườn quốc gia Tam Đảo thuộc tỉnh Vĩnh Phúc

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định và mô tả chi tiết được đặc điểm hình thái ngoài và đặc điểm cấu tạo hiển vi của loài Thiên lý hương

- Xác định được mật độ, chất lượng, nguồn gốc cây tái sinh của loài Thiên lý hương tại Vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

- Xác định được sự thay đổi hàm lượng các chất có tinh dầu có liên quan đến các điều kiện sinh thái

- Xác định được hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết từ loài thiên lý hương

4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái ngoài và đặc điểm cấu tạo hiển vi của loài Thiên lý hương

- Nghiên cứu mật độ, chất lượng, nguồn gốc cây tái sinh của loài Thiên

lý hương ở Vườn quốc gia Tam Đảo

- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng các chất có tinh dầu có liên quan đến các điều kiện sinh thái

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết từ loài thiên lý hương

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài cung cấp đầy đủ các thông tin về đặc điểm hình thái ngoài, hình thái giải phẫu hiển vi, mật độ, khả năng tái sinh, phân bố và hoạt tính sinh học kháng 1 số dòng tế bào ung thư trên người của loài Thiên lý hương

- Ý nghĩa thực tiễn: Các kết quả thu được cung cấp các cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Thiên lý hương ở Việt Nam Ngoài ra, đề tài là tài liệu tham khảo cho các sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Sinh học

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nghiên cứu về loài Thiên lý hương ở trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Trên thế giới

SenHua Lu và cộng sự (2012) khi nghiên cứu thành phần hóa học của

dầu dễ bay hơi ở các bộ phận khác nhau của loài Thiên lý hương (Embelia parviflora Wall ex A DC.) bằng cách chưng cất hơi nước và sau đó được

phân tích bằng phép đo sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Kết quả chỉ ra rằng, 11 hợp chất đã được xác định từ rễ, chiếm 77,67% tổng lượng dầu dễ bay hơi; 36 hợp chất đã được xác định từ thân, chiếm 92,88% tổng lượng dầu dễ bay hơi;

74 hợp chất được xác định từ lá, chiếm 85,11% tổng lượng dầu dễ bay hơi [32]

Năm 2020, Wenjun Liu và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bổ máu và khám phá cơ chế của nó của cao chiết được chiết xuất từ các dung môi khác

nhau từ loài Embelia parviflora và thử nghiệm trên chuột thiếu máu Kết quả chỉ

ra rằng, các thành phần chiết xuất bằng ethyl acetate, n-butanol và nước từ loài Thiên lý hương có thể cải thiện chức năng miễn dịch và biểu hiện các yếu tố tạo máu ở chuột thiếu máu và cho thấy một số tác dụng bổ máu nhất định [40]

Shi-Yong Wang đã chỉ ra rằng, các loài thực vật thuộc chi Embelia như E parviflora và E laeta là những loại thuốc được sử dụng phổ biến và tác dụng

chữa bệnh của chúng đã được xác nhận trong y học của dân tộc Choang Trung

Quốc Những nghiên cứu hiện nay cho thấy, các loài thực vật thuộc chi Embelia

có thành phần hóa học và tác dụng dược lý tương tự nhau Do đó các loài thực vật này đều có giá trị sử dụng và tiềm năng phát triển trong tương lai [38]

Lee HwaJin và Ryu JaeHa đã chỉ ra rằng, các chất hòa tan trong hexan từ

rễ của loài Thiên lý hương có khả năng chống viêm và các bệnh truyền nhiễm liên quan đến nhóm Leukotriene B4 (LTB4 - nhóm các chất trung gian gây viêm ở người) ở liều lượng trung bình là 25 µg/ml Các chất AA-4 và ES-4 được phân tách bằng sắc ký cột có mức độ ức chế liên kết LTB4 với bạch cầu trung tính ở người lần lượt là 78 và 62% ở liều 30 µg/ml [31]

Chen X và cộng sự (1992) khi điều tra khảo sát chợ thảo dược truyền thống tại huyện Jingx, Khu tự trị dân tộc Choang Quảng Tây đã thống kê được

380 loài thực vật làm thuốc, thuộc 129 họ và 322 chi Các loài làm thuốc phổ

biến là Embelia parviflora, Malus doumeri, Panax notoginseng, Polygala fallax, Nghiên cứu này là nguồn tài liệu tham khảo tốt cho việc khai thác, sử

dụng tài nguyên dược liệu của đồng bào dân tộc Choang [25]

Năm 2019, Jean Marc Dubost và cộng sự đã nghiên cứu tri thức sử dụng thảo dược của đồng bào dân tộc Mông ở nước Cộng hòa dân chủ nhân dân Lào Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, 333 loài thực vật đã được sử dụng làm thuốc chữa các bệnh về đường tiêu hóa, các bệnh phụ khoa và bệnh lây truyền qua đường tình dục, các bệnh về da, các bệnh thận và bàng quang, chấn thương và làm thuốc bổ Việc lưu truyền kiến thức sử dụng cây thuốc chủ yếu là truyền miệng, theo hệ thống mẫu hệ và được lưu giữ nghiêm ngặt trong dòng họ

Trong nghiên cứu này, loài Thiên lý hương (Embelia parviflora) cùng với loài

E sessiliflora được đồng bào các dân tộc Mông ở Lào sử dụng để chữa các

bệnh liên quan đến rối loạn tiêu hóa [27]

Nhận xét chung: Loài Thiên lý hương chủ yếu được nghiên cứu bởi các

tác giả người Trung Quốc, nơi loài này đã được sử dụng phổ biến trong tri thức bản địa của các dân tộc Các nghiên cứu đã chỉ ra các tác dụng dược lý và tác dụng làm thuốc, là cơ sở khoa học tin cậy cho các nghiên cứu sâu hơn về loài này trong tương lai

1.1.2 Ở Việt Nam

Những nghiên cứu về loài Thiên lý hương ở Việt Nam hầu như không

có, chỉ có một số công trình giới thiệu, mô tả đặc điểm hình thái, công dụng của loài này trong một số tài liệu:

Sách đỏ Việt Nam (2007) đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái ngoài, tên Việt Nam khác, tên đồng nghĩa (syonym), sinh học và sinh thái, phân bố, giá trị

sử dụng, tình trạng, phân hạng và biện pháp bảo vệ loài này ở Việt Nam Đây là tài liệu giới thiệu chi tiết nhất về loài thực vật này ở Việt Nam [18]

Phạm Hoàng Hộ (1999) trong “Cây cỏ Việt Nam, tập 1” giới thiệu vắn

tắt các đặc điểm hình thái quan trọng, phân bố, mùa hoa quả kèm theo hình vẽ

để nhận dạng loài này ở Việt Nam [13]

Lê Thị Thanh Hương và cộng sự (2013) nghiên cứu cây thuốc và kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của đồng bào dân tộc Sán Chí tại xã Phú Đình,

huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên đã chỉ ra rằng Thiên lý hương (Embelia parviflora Wall.) là loài thực vật thuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae), lá nhỏ, hoa

màu trắng mọc ở nách lá Loài này được người Sán Chí gọi là Quế dây vì cây

có mùi thơm rất đặc trưng giống mùi cây Quế Theo kinh nghiệm của người Sán Chí, thân và rễ cây Thiên lý hương được dùng để ngâm rượu xoa bóp giúp giảm đau mỏi xương khớp [11]

Năm 2015, Lê Thị Thanh Hương và cộng sự đã điều tra nghiên cứu cây thuốc và kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của đồng bào dân tộc Tày ở xã Văn

An, huyện Văn Quan, tỉnh Lạng Sơn Kết quả chỉ ra rằng, có 115 loài cây thuốc thuộc 103 chi, 63 họ của 2 ngành thực vật bậc cao có mạch được người Tày ở

xã Văn An sử dụng làm thuốc Trong số đó, loài Embelia parviflora Wall ex

A DC (Thiên lý hương - Co nam coi) được dùng chữa bệnh dập nát, gãy xương, và dùng làm thuốc bổ [12]

Lưu Đàm Ngọc Anh và cộng sự khi nghiên cứu tri thức bản địa các loài thực vật tạo màu của cộng đồng các dân tộc ở vùng núi phía bắc Việt Nam đã kết luận rằng, cộng đồng các dân tộc có kiến thức phong phú trong việc sử dụng các loại cây để nhuộm thực phẩm và tạo màu Các tác giả đã thống kê được 43 loài thuộc 24 họ được đồng bào các dân tộc thiểu số sử dụng để tạo màu Trong đó loài Thiên lý hương (tên gọi phổ biến khác là Tà là vẹt) được các dân tộc sử dụng bộ phận thân cây để ngâm rượu uống làm thuốc bổ, vị thuốc khi ngâm rượu có màu đỏ [36]

Vũ Thị Thu Hiền, Lại Thị Thanh (2020) khi nghiên cứu về đa dạng của cây thuốc tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Hu, tỉnh Thanh Hóa bước đầu đã ghi nhận

được 187 loài, thuộc 155 chi, 70 họ thuộc 4 ngành thực vật bậc cao có mạch (Magnoliophyta, Polypodiophyta, Pinophyta và Lycopodiophyta) Đồng thời cũng xác định được 13 loài cây thuốc quý cần được bảo vệ, trong đó loài Thiên lý hương được xếp ở mức VU (sẽ nguy cấp) theo sách đỏ Việt Nam 2007 [9]

Năm 2023, Nguyễn Thị Lương cùng cộng sự sử dụng phương pháp điều tra thực vật dân tộc học tìm hiểu các loài thực vật có khả năng sử dụng làm màu thực phẩm của 11 dân tộc từ bắc vào nam Kết quả đã thống kê được 110 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc 54 họ Trong đó, loài Thiên lý hương sử dụng phần gỗ (rễ và thân) để nhuộm xôi cho màu đỏ [35]

1.2 Những nghiên cứu về đặc điểm cấu tạo hiển vi của các loài cây thuốc ở Việt Nam

Lê Thị Mi Chi và cộng sự (2016) đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học,

đặc điểm vi phẫu và hình thái của cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Delile)

thuộc họ Cúc (Asteraceae) thu thập tại thành phố Đà Nẵng Loài này có nguồn gốc từ Châu Phi và được nhập trồng ở Việt Nam Cây có tác dụng trị đái tháo đường, chống oxy hóa và điều hòa miễn dịch, trị xơ vữa động mạch, chống béo phì, kháng viêm, chống ung thư, trị sốt rét, chống dị ứng Kết quả nghiên cứu

đã bổ sung đặc điểm hình thái ngoài; đặc điểm hiển vi rễ, thân và lá; tiêu chuẩn hóa bột dược liệu và khảo sát sơ bộ thành phần hóa học Kết quả này là cơ sở cho việc tiêu chuẩn hóa dược liệu về loài thực vật này ở Việt Nam [4]

Dịch Thị Phương Anh và cộng sự (2017) đã mô tả chi tiết đặc điểm cấu

tạo hiển vi (rễ, thân, lá) của loài Màn màn tím (Cleome rutidosperma DC.) thu

thập tại tỉnh Thái Nguyên Kết quả nghiên cứu cấu tạo giải phẫu (rễ, thân, lá)

đã chỉ ra rằng, cấu tạo loài này mang đặc điểm cấu tạo chung của cây 2 lá mầm Cấu tạo rễ đặc trưng bởi cấu tạo thứ cấp Cấu tạo của thân có mô mềm ruột rất phát triển, mô dày xốp phân bố chủ yếu ở các góc của thân Cấu tạo phiến lá phân biệt mô giậu và mô xốp, phần gân chính có 4-5 bó libe gỗ xen kẽ trong khối tế bào mô mềm [1]

Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự (2018) đã mô tả chi tiết được đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu cơ quan sinh dưỡng (rễ, thân, lá) của cây Ba kích

(Morinda officinalis) trồng tại vườn thực nghiệm của Khoa Sinh học - Trường

Đại học Sư phạm Thái Nguyên Kết quả nghiên cứu đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái hiển vi cơ quan sinh dưỡng từ ngoài vào trong, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về loài thực vật làm thuốc này [7]

Lò Mai Thu (2021) khi nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài

Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) ở khu bảo tồn Copia (Sơn La)

đã đưa ra một số kết luận rằng Loài Anoectochilus setaceus có thân rễ dài từ 5

- 12 cm, đường kính thân rễ từ 2,5 - 3,5 mm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, có lông bảo vệ, màu hồng nhạt hoặc xanh trắng Rễ có chiều dài thay đổi

từ 1 - 9 cm Kích thước của lá thay đổi, dài 3 - 5 cm, rộng 2 - 4 cm Phiến lá hình trứng, mép nguyên, đầu lá tù, đuôi lá hình tim Lá có màu nâu đỏ hoặc xanh thẫm ở mặt trên [21]

Trương Minh Nhựt và cộng sự (2022) đã xác định sơ bộ thành phần cấu

tạo và tác dụng của loài Trà hoa vàng (Camellia flava) trồng tại Tây Nguyên

Kết quả nghiên cứu đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái hiển vi Cụ thể vi phẫu thân gần tròn, bao gồm bần, nhu bì, mô cứng, libe 1, libe 2, mạch gỗ 1, mạch

gỗ 2, mô mềm gỗ 1, mô mềm gỗ 2, tia tủy, mô mềm tủy và tinh bột Vi phẫu cuống lá có hai tai nhỏ và mặt dưới lồi tròn, bao gồm biểu bì, mô dày góc, mô mềm khuyết, hệ thống dẫn hình cung với gỗ ở trên và libe ở dưới, mạch gỗ, mô mềm gỗ, thể cứng và tinh thể calci oxalat Vi phẫu thịt lá có biểu bì trên, biểu

bì dưới, lỗ khí tập trung nhiều ở biểu bì dưới, mô mềm giậu, mô mềm xốp và tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình khối rải rác trong mô mềm Ngoài ra, nhóm tác giả cũng nêu rõ đặc điểm bột dược liệu, kết quả giải trình tự gen rbcL, định lượng hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần, đánh giá tác dụng chống oxi hóa, ức chế hoạt tính enzyme α amylase, tác dụng kháng khuẩn

và kháng viêm của loài này [16]

1.3 Những nghiên cứu về mật độ và khả năng tái sinh của các loài cây thuốc ở Việt Nam

Võ Đại Hải (2008) khi nghiên cứu đặc điểm tái sinh tự nhiên loài Vối

thuốc (Schima wallichii Choisy) tại vùng vùng Tây Bắc đã kết luận rằng Vối

thuốc là loài tái sinh rất mạnh với giá trị tổ thành có nơi lên tới 5,1 với trường hợp tái sinh dưới tán rừng và 2,4 - 9,7 với trường hợp tái sinh sau nương rẫy

Đa số cây tái sinh Vối thuốc đều có chất lượng trung bình và tốt (27 - 100%), tỷ

lệ cây tái sinh có triển vọng sau nương rẫy bỏ hóa là khá cao 73-100% Phần lớn cây tái sinh Vối thuốc dưới tán rừng có chiều cao thấp hơn 1m (chiếm 33-100%) Nghiên cứu cũng đã đưa ra một số đề xuất nhằm xúc tiến quá trình tái sinh Vối thuốc cho các đối tượng này [8]

Hoàng Vũ Thơ (2016) kết luận rằng, Đinh đũa là loài cây bản địa có khả năng tái sinh hạt và cả tái sinh chồi khá mạnh Trong điều kiện gây trồng khả năng tái sinh tự nhiên của loài Đinh đũa diễn ra mạnh mẽ, trong khi ở rừng tự nhiên chưa phát hiện thấy tái sinh tự nhiên xuất hiện, và tái sinh tự nhiên xuất hiện hạn chế ở khu cây trồng phân tán Trong điều kiện đất ẩm mát dưới gốc cây mẹ sai quả ổn định, số lượng cây tái sinh nhiều, chất lượng cây tái sinh tốt hơn so với điều kiện dưới gốc cây mẹ lớp đất mặt khô cằn, lẫn nhiều sỏi đá Trong điều kiện gây trồng, khả năng tái sinh tự nhiên diễn ra khá mạnh mẽ dưới gốc các cây Đinh đũa sai quả, có tuổi trên 15 năm [20]

Nguyễn Công Hoan và cộng sự (2017), nghiên cứu một số đặc điểm tái

sinh tự nhiên của loài Xoan đào (Pygeum arboreum Endl.) tại tỉnh Thái Nguyên

và Bắc Kạn Kết quả cho thấy, những lâm phần có loài Xoan đào phân bố có mật độ dao động từ 284-393 cây/ha Thành phần loài cây tái sinh dao động từ 25-34 loài, trong đó có từ 4-7 loài tham gia vào công thức tổ thành rừng như

Xoan đào (Pygeum arboreum), Vạng trứng (Endospermum chinensis), Ràng ràng mít (Ormosia balansae), Dẻ xanh (Lithocarpus tubulosus),… Tại khu vực

nghiên cứu, số lượng cây tái sinh từ 2.373-3.973 cây/ha, trong đó số lượng cây

tái sinh có nguồn gốc từ hạt từ 1.893-3.384 cây/ha chiếm tỷ lệ trên 78% Số lượng cây tái sinh triển vọng dao động từ 1.093-1.681 cây/ha cho toàn khu vực nghiên cứu Số cây tái sinh có xu hướng giảm dần khi chiều cao tăng lên, khoảng 70% số cá thể thuộc cấp chiều cao từ I-IV trong đó Xoan đào cũng có

xu hướng giảm dần khi chiều cao tăng lên Điều đó cho thấy Xoan đào là loài cây bản địa khó tái sinh trong điều kiện môi trường bị tác động mạnh Đây là đặc điểm quan trọng để đề xuất giải pháp lâm sinh phù hợp nhằm xúc tiến tái sinh tự nhiên cho loài này tại khu vực nghiên cứu [10]

Võ Thị Minh Phương và cộng sự (2017) khi nghiên cứu đặc điểm sinh

học và hiện trạng phân bố cây Thiên môn (Asparagus sp.) tại xã Ayun, huyện

Mang Yang, tỉnh Gia Lai đã kết luận rằng Loài Thiên môn ở khu vực nghiên

cứu là loài Thiên môn chùm (Asparagus racemosus Willd.) Đây là loài thảo

dược quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, nổi trội nhất là tác dụng tăng tiết sữa

mẹ và tăng khả năng thụ thai, hiện đang được khai thác quá mức ngoài tự nhiên, thêm vào đó là khả năng tái sinh tự nhiên rất ít cần có biện pháp khai thác bảo tồn và phát triển hợp lý Thiên môn chùm phân bố chủ yếu nơi đất trống có cây gỗ tái sinh, địa hình tương đối bằng phẳng, độ cao từ 700 - 1.030

m, thành phần cây gỗ tái sinh không nhiều chỉ có 4 loài chính, thành phần thảm tươi đa dạng [17]

Kết quả nghiên cứu của Bùi Tuấn Anh và cộng sự về một số đặc điểm

hình thái, sinh học và sinh thái của loài Hoàng liên gai (Berberis julianae C.K

Schneid) ở vườn Quốc gia Hoàng liên, Lào Cai cho thấy Hoàng liên gai là loài cây bụi, có khả năng chống chịu sâu bệnh hại, chịu nhiệt tốt, mật độ loài Hoàng liên gai là 365 - 380 cá thể/ha, sinh trưởng tốt ngoài tự nhiên ở độ cao 1.400 - 1.700m với giới hạn sinh thái (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng,…) rất rộng [2]

Phạm Cường và cộng sự (2023) khi nghiên cứu về một số đặc điểm lâm

học của loài Tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) mọc tự nhiên tại Trung tâm

Thực hành và nghiên cứu lâm nghiệp cơ sở Hương Vân, thị xã Hương trà, tỉnh

Thừa Thiên Huế cho thấy Trầm gió có thể phân bố và sinh trưởng trên đất phèn, nghèo dinh dưỡng và bị úng nước nhưng không có khả năng sinh trưởng trên vùng đất ngập nước Rừng tràm gió có độ tàn che chỉ đạt 0,1 và có 11 loài cây bụi, thảm tươi chủ yếu sống dưới tán rừng Mật độ rừng tràm gió rất thấp

và chỉ đạt 2.500 cây/ha Hình thức tái sinh rừng tràm gió phổ biến là tái sinh sinh dưỡng chiếm tỷ lệ đến 85,0% tổng số cây con tái sinh trong lâm phần và mật độ cây tái sinh chỉ đạt 744,4 cây/ha Thời gian úng nước trong năm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng, phát triển và tái sinh của cây Tràm gió Trong đó, trên các vùng đất phèn có thời gian úng nước dưới 4 tháng cho sinh trưởng tốt nhất về chiều cao (8,71 m), đường kính (6,5 cm), đường kính tán (0,81 m) cũng như mật độ cây tái sinh (1.067 cây/ha) và sinh khối của rừng

Một số nghiên cứu của các tác giả về ảnh hưởng của các nhân tố môi

trường đến các hoạt chất của các cây thuốc như: ở loài Eucommia ulmoides

Oliv, độ cao và nhiệt độ trung bình năm có mối tương quan đáng kể và tỷ lệ thuận với hàm lượng axit chlorogen và flavonoid; số giờ nắng hàng năm (annual sunshine) tương quan đáng kể và tỷ lệ thuận với hàm lượng axit geniposidic, trong khi nhiệt độ trung bình năm tương quan đáng kể và tỷ lệ

nghịch với hàm lượng axit geniposidic [30] Trong khi ở loài Betula pendula

Roth., độ cao có mối tương quan thuận với hàm lượng flavonoids [24]

Ở các quần thể của loài Sinopodophyllum hexandrum (Royle) T.S Ying,

thành phần các dẫn xuất của podophyllotoxin đã được chứng minh là phù hợp với độ cao và các điều kiện sinh thái địa phương (nhiệt độ, lượng mưa, độ ẩm,

pH đất, v.v.) nhưng không liên quan với cơ sở di truyền [22], [33]

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các cây thuốc mọc trong các môi trường khác nhau tạo ra các thành phần hoạt chất khác nhau do sự phân

bố rộng của chúng ở các vùng địa lý khác nhau Điều này sẽ dẫn đến sự khác biệt về phẩm chất bên trong của chúng trong cùng một loài từ các vùng trồng khác nhau [30]

1.5 Khái quát điều kiện tự nhiên và kinh tế xã hội của Vườn quốc gia Tam Đảo

Vườn Quốc gia Tam Đảo nằm trên địa phận của 3 tỉnh: Thái Nguyên, Vĩnh Phúc và Tuyên Quang Vườn được thành lập năm 1996, với tổng diện tích

là 36.883 ha ranh giới từ độ cao 100m trở lên vòng quanh núi Tam Đảo Vườn quốc gia có chức năng, nhiệm vụ: 1) Bảo vệ nguyên vẹn hệ sinh thái rừng trên núi Tam Đảo; 2) Bảo vệ nguồn gen các loài động thực vật qúy hiếm, đặc biệt bảo vệ các loài động thực vật đặc hữu và cảnh quan thiên nhiên của Tam Đảo; 3) Phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, thăm quan học tập của các nhà khoa học và sinh viên trong nước và quốc tế; 4) Tổ chức công tác tuyên truyền, giáo dục phổ cập cho nhân dân lòng yêu thiên nhiên và ý thức bảo vệ rừng; 5) Thực hiện vai trò điều tiết nước của khu vực đầu nguồn, góp phần cải thiện môi sinh cho vừng đồng bằng Trung du Bắc Bộ và thủ đô Hà Nội; 6) Tham gia tổ chức việc tham quan du lịch và nghỉ mát; 7) Góp phần ổn định và nâng cao đời sống nhân dân trong vùng đệm

Vườn Quốc gia có 03 phân khu chính là:

1) Phân khu bảo vệ nghiêm ngặt có tổng diện tích là 17.295 ha nằm ở độ cao từ 400 m trở lên Đây là khu vực còn rừng tự nhiên và là nơi cư chú của các loài chim thú trong khu vực

2) Phân khu phục hồi Sinh thái: Có diện tích là 15.398ha, nằm bao quanh phân khu bảo vệ nghiêm ngặt Do trước kia khu vực này nằm ngoài khu rừng cấm Tam Đảo nên rừng tự nhiên ở khu vực này bị khai thác nhiều lần và nhiều diện tích đã bị mất rừng Đến nay phân khu này được khoanh nuôi phục hồi và trồng lại rừng

3) Phân khu hành chính và dịch vụ du lịch: Có diện tích 2.302 ha nằm ở sườn Tây Bắc Tam Đảo (thuộc địa phận tỉnh Vĩnh Phúc) bao quanh thị trấn Tam Đảo và hệ thủy của 2 suối Thác Bạc và Đồng Bùa Trong phân khu có cả rừng tự nhiên và rừng trồng để tạo cảnh quan đẹp và môi trường sinh thái cho khu du lịch

Địa hình: Vườn quốc gia Tam Đảo là vùng núi cao nằm trọn trong dãy

núi Tam Đảo Đây là dãy núi có trên 20 đỉnh cao từ 1.000m trở lên so với mặt nước biển, cao nhất là đỉnh Tam Đảo 1.597m Địa hình ở đây có đặc điểm là đỉnh nhọn, sườn rất dốc, độ chia cắt sâu

Thổ nhưỡng: Vườn quốc gia Tam Đảo có bốn loại đất chính gồm đất

feralit mùn vàng phát triển trên đá macma axít, xuất hiện ở độ cao từ 700 m trở lên, có diện tích 8.968 ha; đất feralit mùn vàng đỏ phân bố trên núi thấp từ độ cao 400-700 m, phát triển trên đá macma kết tinh có diện tích 9.292 ha; đất feralit đỏ vàng phát triển trên nhiều loại đá khác nhau ở độ cao 100-400 m, có diện tích 1.7606 ha; đất đất dốc tụ và phù sa ở độ cao từ 100 m trở xuống có diện tích 1.017 ha

Khí hậu: Dãy núi Tam Đảo tạo ra 2 sườn Đông và Tây rõ rệt, lượng

mưa hàng năm khác nhau đã góp phần tạo nên các tiểu vùng khí hậu khác biệt Đây cũng là yếu tố tạo ra 2 đai khí hậu nóng ẩm, nhiệt đới mưa mùa từ độ cao 700-800 m trở xuống và đai khí hậu á nhiệt đới mưa mùa, cũng như một số khu vực có nhiệt độ, lượng mưa rất khác nhau của Tam Đảo Tất cả tạo nên một Vườn quốc gia Tam Đảo được che phủ bởi một lớp thảm thực vật dày đặc, nhiều tầng và đa dạng về loài, đa dạng về quần xã sinh học và hệ sinh thái

Kiểu rừng: Vườn quốc gia Tam Đảo có 26.163 ha rừng, chủ yếu là dạng

rừng tự nhiên mưa ẩm thường xanh với độ che phủ chiếm 70% diện tích toàn vườn Ngoài ra, trong Vườn cũng tồn tại một số kiểu rừng khác như rừng kín thường xanh mưa ẩm á nhiệt đới núi thấp, rừng lùn trên đỉnh núi, rừng tre nứa, rừng phục hồi sau khai thác, rừng trồng, trảng cây bụi, trảng cỏ

Hệ thực vật: Vườn quốc gia Tam Đảo có 1.282 loài thực vật thuộc 660

chi thuộc 179 họ thực vật bậc cao có mạch, trong đó có các loài điển hình cho vùng cận nhiệt đới Có 42 loài đặc hữu và 64 loài quý hiếm cần được bảo tồn

và bảo vệ

Hệ thực vật Tam Đảo chịu ảnh hưởng của hệ thực vật Nam Trung Hoa với một số loài đặc trong thuộc các họ như: họ Re (Lauraceae), họ Mộc lan (Magnoliaceae), họ Thích (Aceraceae), họ Dẻ (Fagaceae) đặc biệt ở đây có

nhiều đại diện của ngành Hạt trần: Sam bông (Amentotaxus argotaenia), Pơ mu (Fokienia hodginsii), Thông lá ngắn (Podocarpus pilgeri), Thông tre (P neriifolius) và Kim giao (Podocapus fleuryi) Các loài thực vật đặc trưng cho

vùng nhiệt đới Ấn Độ, Mã Lai, Thái Lan thường phần bố ở đai dưới 1000 m gồm các cây họ Bàng (Combretaceae), họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Bằng lăng (Lythraceae)

Hệ động vật: Vườn quốc gia này cũng có 163 loài động vật thuộc 158

họ của 39 bộ, trong 5 lớp là: thú, chim, bò sát, ếch nhái và côn trùng Vườn có tới 239 loài chim với nhiều loài có màu lông đẹp như Vàng anh, Sơn tiêu trắng, Sơn tiêu hồng, Sơn tiêu đỏ, có những loài quý hiếm như Gà tiền, Gà lôi trắng;

có 64 loài thú với những loài có giá trị như Sóc bay, Gấu ngựa, Cầy mực, Vượn, Voọc đen, v.v Có 39 loài động vật đặc hữu, trong đó có 11 loài loài đặc

hữu hẹp chỉ có ở Vườn quốc gia Tam Đảo như Rắn sãi angen (Amphiesma angeli); Rắn ráo thái dương (Boiga multitempolaris); Cá cóc Tam Đảo (Paramerotriton deloustali) [41]

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp điều tra theo tuyến và ô tiêu chuẩn (OTC)

Phương pháp điều tra theo tuyến và ô tiêu chuẩn được sử dụng dựa theo phương pháp của Hoàng Chung (2008) [5] Tuyến điều tra: căn cứ vào địa hình

cụ thể của khu vực nghiên cứu lập các tuyến điều tra Tuyến điều tra có hướng vuông góc hoặc song song với đường đồng mức, khoảng cách giữa các tuyến điều tra là 50-100 m tùy vào loại hình cụ thể của từng quần xã Dọc tuyến điều tra bố trí các ô tiêu chuẩn (OTC) và các ô dạng bản để thu thập số liệu

- Ô tiêu chuẩn (OTC): áp dụng ô tiêu chuẩn có diện tích 16m2 (4m x 4m)

để thu thập số liệu về loài Thiên lý hương (số lượng cây, nguồn gốc và chất lượng cây tái sinh)

2.2 Phương pháp thu mẫu thực vật

- Phương pháp thu thập mẫu tiêu bản: cắt một đoạn cành dài 30 - 40 cm,

có hoa, quả hoặc có cả hoa và quả; ép mẫu bằng tờ báo gập đôi, buộc chặt, cho vào túi bóng (loại túi to) rồi đưa về phòng thí nghiệm, sấy khô phục vụ giám định tên khoa học

- Phương pháp thu mẫu nghiên cứu giải phẫu hiển vi: cắt các đoạn cành non, lá già hoặc lá bánh tẻ, rễ non cho vào túi bóng miết để bảo quản phục vụ nghiên cứu giải phẫu

- Phương pháp thu mẫu nghiên cứu hoạt tính: cắt nhỏ các đoạn cành (2-3 cm), lá, cho vào túi lưới mang về phòng thí nghiệm sấy khô để nghiên cứu các bước tiếp theo

2.3 Phương pháp phân tích mẫu vật

- Xác định tên khoa học của loài Thiên lý hương theo Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (1999) [13] Chỉnh sửa và cập nhật tên khoa học của loài theo tropicos.org và the plantlist.org [42], [43]

2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái ngoài và cấu tạo hiển vi

* Hình thái ngoài: Căn cứ vào đặc điểm của mẫu vật thu được, mô tả

chi tiết các đặc điểm hình thái ngoài theo mô tả quy phạm của Thực vật chí Việt Nam

* Hình thái cấu tạo hiển vi

- Dùng dao lam cắt lát thật mỏng theo mặt phẳng ngang Chú ý cắt lát thật mỏng thẳng đảm bảo góc với trục thẳng của vật mẫu, không nháy lại lát cắt

- Nhuộm lát cắt: Tiến hành nhuộm kép với thuốc nhuộm màu Xanhmetylen

và Cacmin Quy trình như sau:

+ Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dich nước Javen trong 30 phút để tẩy sạch nội chất của tế bào

+ Bước 2: Rửa sạch Javen bằng nước cất (2 - 3 lần)

+ Bước 3: Ngâm mẫu bằng axit axetic để sạch nước Javen còn dính lại (nếu không Javen sẽ làm mất màu thuốc nhuộm)

+ Bước 4: Rửa sạch axit axetic bằng nước cất (rửa 2 lần)

+ Bước 5: Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch Cacmin trong khoảng 30 phút + Bước 6: Rửa qua mẫu bằng nước cất (2 - 3 lần)

+ Bước 7: Nhuộm mẫu bằng dung dịch xanh metylen trong khoảng 30 giây + Bước 8: Rửa mẫu bằng nước cất (2 - 3)

+ Bước 9: Lên kính bằng nước cất

Chụp ảnh

- Ảnh được chụp trên kính hiển vi kết nối máy tính sử dụng phần mềm Microscope manger tại phòng thí nghiệm Thực vật học khoa Sinh học với các

độ phóng đại khác nhau và kết hợp với chụp ảnh bằng máy ảnh

- Sử dụng thuật ngữ để mô tả hình thái cấu tạo giải phẫu theo các tài liệu: Hình thái học thực vật của Nguyễn Bá [3]; Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật của Trần Công Khánh [14]

2.5 Phương pháp nghiên cứu mật độ, chất lượng, nguồn gốc cây tái sinh

- Mật độ cây tái sinh được xác định theo công thức:

Tính số cây trên 1 ha (1ha = 10000m2 )

x 10000

S

N /ha N

0

i

i 

Trong đó:

Ni/ha: Là mật độ của loài cây tái sinh i/ha;

S0: Là tổng diện tích ô điều tra (m2);

Ni: Là số lượng cá thể tái sinh loài thứ i

Dựa vào mật độ của loài để tính mật độ cây tái sinh cho cả ha (N/ha =

Ni/ha)

- Chất lượng cây tái sinh được đánh giá theo 3 cấp (Tốt, trung bình, xấu) + Cây tốt: Là những cây phát triển cân đối, không sâu bệnh, lá cây màu xanh đều

+ Cây xấu: Là những cây cong queo, sâu bệnh, tán lệch, lá rụng nhiều hoặc chuyển màu

+ Cây trung bình: Là cây trung gian của 2 cấp trên

+ Chất lượng cây tái sinh được xác định theo công thức:

100

x N

n N% 

Trong đó:

N%: Tỷ lệ phần trăm cây tốt, trung bình, xấu;

n: tổng số cây tốt, trung bình, xấu;

N: Tổng số cây tái sinh

- Nguồn gốc cây tái sinh được tính theo công thức:

100

x N

N N%  iTrong đó: N%: Là tỷ lệ % số cây nguồn gốc hạt hoặc chồi;

Ni: Là tổng số cây có nguồn gốc hạt hoặc chồi;

N: Là tổng số cây tái sinh

2.6 Phương pháp đánh giá sự thay đổi hàm lượng các chất liên quan đến các điều kiện sinh thái

2.6.1 Đánh giá và xác định các điều kiện sinh thái

- Xác định các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa theo số liệu của trạm quan trắc khí tượng thủy văn thị trấn Tam Đảo

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu

* Phương pháp tách chiết tinh dầu

Mẫu cây sau khi thu về, tách rời các bộ phận (thân và lá) Tiến hành cắt thân và lá thành các đoạn nhỏ khoảng 1 cm, rửa sạch Sau đó tiến hành chiết tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trong thời gian 4 giờ ở điều kiện áp suất bình thường, nhiệt độ khoảng 70 - 800C Thu dịch chiết Hòa tan dịch chiết trong n-Hexan và n-Butanol để thu tinh dầu hòa tan trong n-Hexan và n-Butanol Sau đó để dịch chiết đã hòa tan trong dung môi vào lọ thủy tinh, bọc túi bóng kín và đậy nắp (để hạn chế tối đa sự bay hơi của tinh dầu) Lưu giữ tinh dầu trong tủ lạnh mát nhiệt độ khoảng 40C Tiếp theo, tiến hành sử dụng tinh dầu của loài để phân tích thành phần hóa học của tinh dầu và thử hoạt tính sinh học về tinh dầu của cây thuốc với một số dòng tế bào

* Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu

Sử dụng mẫu tinh dầu tan trong n-hexan để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu

Lấy 1ml dịch chiết tinh dầu tan trong n-hexan vào lọ thủy tinh nhỏ, không đậy nắp và cho vào tủ sấy thông gió ở điều kiện nhiệt độ 400C trong 1 giờ Sau khi n-hexan đã bay hơi hết ta thu được tinh dầu khô

Thành phần hóa học của tinh dầu tiêu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí và sắc ký khí ghép khối phổ [19]

Sắc ký khí (GC): Được thực hiện trên máy Agilent Technologies HP

6890N Plus gắn vào detector FID của hãng Agilent Technologies, Mỹ Cột sắc ký HP-5MS với chiều dài 30 m, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp

phim mỏng 0,25 m đã được sử dụng Khí mang H2 Nhiệt độ buồng bơm mẫu (Kĩ thuật chương trình nhiệt độ-PTV) 2500C Nhiệt độ detector 2600C Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: 600C (2 phút), tăng 40C/phút cho đến

2200C, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút

Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS): Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS): việc

phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N Agilent Technologies HP 6890N ghép nối với Mass Selective Detector Agilent HP

5973 MSD Cột HP-5MS có kích thước 0,25 m × 30 m × 0,25 mm và HP1 có kích thước 0,25 m × 30 m × 0,32 mm Chương trình nhiệt độ với điều kiện

600C/2 phút; tăng nhiệt độ 40C/1 phút cho đến 2200C, sau đó lại tăng nhiệt độ

200/phút cho đến 2600C với He làm khí mang

Việc xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư viện Willey/ Chemstation HP [23]

2.7 Phương pháp chiết mẫu nghiên cứu hoạt tính sinh học

Mẫu được chiết theo phương pháp chiết Soxhlet gồm các bước sau:

Bước 1: Mẫu được cắt nhỏ, sau đó cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 500 - 600C cho đến khi cây khô giòn

Bước 2: Cân mẫu, bọc vào giấy và cho vào bình chiết Sau đó chiết hồi lưu với ethanol 90% ở nhiệt độ 70oC cho đến khi nhạt màu

Bước 3: Cất thu hồi dung môi ethanol bằng máy cô quay thu được cao chiết ethanol toàn phần Làm khô cao chiết từ 3-4 ngày trong tủ sấy ở nhiệt độ 45-500C

2.8 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam