Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện Escherichia coli ứng dụng trong giám sát môi trường

TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện Escherichia coli ứng dụng trong giám sát môi trường A study on formulating biosensors in detecting Escherichia coli for en

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN HỒNG YẾN NHI

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC NHẰM PHÁT HIỆN Escherichia coli ỨNG DỤNG TRONG

GIÁM SÁT MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học:

PGS.TS ĐẶNG VŨ BÍCH HẠNH

PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán bộ chấm nhận xét 1:

TS VŨ THỊ QUYỀN Cán bộ chấm nhận xét 2:

TS ĐÀO PHÚ QUỐC Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 06 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Lê Phi Nga 2 Thư ký hội đồng: TS Hoàng Mỹ Dung 3 Ủy viên hội đồng: PGS.TS Đặng Vũ Bích Hạnh 4 Phản biện 1: TS Vũ Thị Quyền

5 Phản biện 2: TS Đào Phú Quốc Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS LÊ PHI NGA

i NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Hồng Yến Nhi MSHV: 2070076 Ngày, tháng, năm sinh: 14/06/1995 Nơi sinh: TP HCM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện Escherichia coli ứng dụng trong giám sát môi trường (A study on formulating biosensors in detecting Escherichia coli for environmental monitoring)

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm vụ: Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học phát hiện DNA của vi khuẩn Escheriachia coli bằng cách tạo đế cảm biến kết hợp vật liệu nano và phương pháp đánh giá quang học Raman

Nội dung:  Tổng hợp nano kim loại, bao gồm bạc nano (AgNPs) và bạc nano/ZIF-8

(AgNPs/ZIF-8)  Đánh giá và lựa chọn giá thể phủ hợp để xây dựng đế cảm biến  Phủ vật liệu nano lên giá thể

 Gắn đầu dò sinh học DNA lên đế cảm biến  Ghi nhận tín hiệu DNA của Escherichia coli phát hiện bằng cảm biến sinh học II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/05/2024 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

-

ii IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: 1 PGS TS Đặng Vũ Bích Hạnh

2 PGS TS Nguyễn Thúy Hương

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 (Họ tên và chữ ký)

PGS TS ĐẶNG VŨ BÍCH HẠNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 (Họ tên và chữ ký)

PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Tp HCM ngày , tháng , năm 2024 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

iii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Đặng Vũ Bích Hạnh và PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, những người thầy đã luôn dành thời giờ quý báu để đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Cảm ơn cô Đặng Vũ Bích Hạnh đã gợi mở cho tôi nhiều ý tưởng , đốc thúc tôi tiến lên trong suốt quá trình thực hiện luận văn Thạc sĩ Tôi cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương, những ý kiến đóng góp và sự động viên của cô đã tạo động lực cho tôi đi đến cuối quãng đường này

Tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn các Thầy Cô, đặc biệt là cô Trịnh Thị Bích Huyền và thầy Lâm Phạm Thanh Hiền Thầy Cô đã luôn đồng hành, hỗ trợ tôi toàn bộ kỹ thuật, thiết bị, cũng như mọi công tác trong phòng thí nghiệm, nếu không có sự hỗ trợ to lớn ấy, chắc rằng luận văn này đã không thể thực hiện thành công suôn sẻ Luận văn này là một hành trình đầy ý nghĩa đối với bản thân tôi và tôi cảm thấy may mắn và tự hào khi được học hỏi từ những người thầy xuất sắc như vậy

Tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân yêu đã luôn ở bên cạnh và động viên tôi trong suốt hành trình nghiên cứu này; đặc biêt là đấng sinh thành của tôi Cảm ơn người bạn thân của tôi, Trịnh Minh Như Ý, cảm ơn bạn đã đồng hành cùng tôi trong những giai đoạn khó khăn nhất, cùng tôi tôi vượt qua biến cố tưởng chừng đã khiến tôi phải từ bỏ hành trình này Sự ủng hộ vững vàng từ mọi người đã giúp tôi vượt qua những thử thách và khó khăn, đồng thời tạo điều kiện tốt nhất cho tôi để tiến xa hơn trên con đường học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Bách Khoa, Khoa Kỹ thuật Hóa Học - Bộ môn Công Nghệ Sinh Học; Khoa Môi Trường và Tài Nguyên đã tin tưởng và cho phép tôi thực hiện các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm và hoàn thành dự án này Sự hỗ trợ và khuyến khích của khoa và nhà trường đã giúp tôi phát triển trong suốt hành trình vừa qua

Trân trọng

iv TÓM TẮT Luận văn này tập trung nghiên cứu chế tạo phát triển cảm biến sinh học nhằm phát hiện DNA của E coli dựa trên phương pháp sử dụng tia Raman Nhận diện cảm biến được làm bằng đế phủ vật liệu nano, xác nhận thông qua các phương pháp UV-vis, SEM và EDS và quá trình phát hiện DNA E coli được đánh giá qua phương pháp tán xạ Raman

Nghiên cứu đã thu nhận được các kết quả như sau: Nghiên cứu đã thành công tổng hợp hai loại vật liệu bạc nano (AgNPs) và bạc nano ZIF-8 (AgNPs/ZIF-8) bằng phương pháp hóa học Hạt nano bạc có bước sóng hấp thu UV-vis 397 nm và kích thước hạt trung bình 20 - 25 nm AgNPs/ZIF- có kích thước trung bình khoảng 700 nm và chứa các nguyên tố C, N, Zn và Ag AgNPs được chọn làm vật liệu nano phủ lên giá thể do độ đồng đều, tốt hơn so với AgNPs/ZIF-8

Thủy tinh được đánh giá là vật liệu ổn định nhất và thu hồi được tín hiệu Raman khi so với hai loại giấy celullose nitrate và celullose acetate Giấy cellulose nitrate bị biến dạng trong quá trình xử lý bề mặt và giấy celullose acetate không thu nhận được tín hiệu Raman

Tín hiệu Raman của đầu dò xuất hiện các đỉnh hấp thu trong vùng phổ tín hiệu DNA tại bước sóng 480 và 780 cm-1 DNA E coli và tín hiệu lai có hai đỉnh hấp thu Raman tại bước sóng 560 và 1094 cm-1 Phương pháp Raman phát hiện được DNA của E coli ở nồng độ 100ng/mL, 50 ng/mL và 25 ng/mL; trong đó, nồng độ 50 ng/mL cho tín hiệu tốt nhất

Cảm biến sinh học dựa trên AgNPs phát hiện DNA của E coli ở nồng độ DNA 25 ng/mL với cái đỉnh hấp thu Raman tại bước sóng 673 cm-1 và 1573 cm-1, khuếch đại cường độ tín hiệu gấp 2.5 – 6 lần so với tín hiệu Raman khi không dùng cảm biến

v ABSTRACTS This thesis focuses on fomulating a biosensor for the detection of E coli DNA using Raman spectroscopy The biosensor is constructed with a nano-material coated substrate, evaluated through UV-vis, SEM, and EDS methods, and the E coli DNA detection process is assessed using Raman scattering

The research yielded the following results: Successfully synthesized two types of silver nanomaterials (AgNPs) and silver nano ZIF-8 (AgNPs/ZIF-8) using chemical methods The silver nanoparticles exhibited a UV-vis absorption wavelength at 397 nm and an average particle size of 20 - 25 nm AgNPs/ZIF-8 had an average size of about 700 nm and contained the elements C, N, Zn, and Ag AgNPs were chosen as the nano-material for coating the substrate due to their better uniformity compared to AgNPs/ZIF-8

Glass was evaluated as the most stable material, recovering the Raman signal compared to two types of cellulose nitrate and cellulose acetate paper Cellulose nitrate paper was deformed during surface treatment, and cellulose acetate paper did not recover the Raman signal

Raman signals from the probes show absorption peaks in the DNA signal spectrum at wavelengths of 480 and 780 cm-1 E coli DNA and detected signals have two Raman absorption peaks at wavelengths of 560 and 1094 cm-1 The Raman method can detect E coli DNA at concentrations of 100 ng/mL, 50 ng/mL, and 25 ng/mL The concentration of 50 ng/mL provides the best signal

The biosensor based on AgNPs detects E coli DNA at a DNA concentration of 25 ng/mL with Raman absorption peaks at wavelengths of 673 cm-1 and 1573 cm-1, amplifying the signal intensity by 2.5 to 6 times compared to the Raman signals without using the sensor

vi LỜI CAM ĐOAN Tôi, Nguyễn Hồng Yến Nhi, cam đoan rằng luận văn thạc sĩ này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS TS Đặng Vũ Bích Hạnh và PGS TS Nguyễn Thúy Hương tại Trường Đại học Bách Khoa Tất cả các tài liệu, ý kiến, và ý tưởng từ các tác giả khác đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ trong phần tham khảo Tôi xin cam đoan rằng tất cả các phần của luận văn này được viết bởi tôi và không sao chép từ bất kỳ nguồn nào khác Bất kỳ thông tin hoặc ý kiến từ các nguồn bên ngoài đã được trích dẫn theo quy định của trường và tôi chịu trách nhiệm về sự chính xác và tính hợp lệ của các trích dẫn đó

Tôi cũng cam đoan rằng luận văn này chưa từng được nộp cho bất kỳ trường, tổ chức hay cơ quan nào khác để nhận bằng cấp hoặc vinh danh Tôi hiểu rằng bất kỳ hành vi gian lận nào sẽ bị coi là vi phạm nghiêm trọng và có thể dẫn đến hậu quả pháp lý và hình phạt hành chính

Cuối cùng, tôi xin cam đoan rằng tôi đã tuân thủ mọi quy định và hướng dẫn của trường trong quá trình thực hiện và viết luận văn này

Ngày 20, tháng 05, năm 2024

Nguyễn Hồng Yến Nhi

vii MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

1.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 10

1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC PHÁT HIỆN E COLI 12

1.3.1 Cấu tạo cơ bản của cảm biến 12

1.3.2 Phân loại cảm biến 13

1.3.3 Giá thể của cảm biến 18

1.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CẢM BIẾN SINH HỌC TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 20

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

viii

1.5 THẢO LUẬN TỔNG QUAN 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 23

2.1.1 Hóa chất 23

2.1.2 Vật liệu 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.3 Phương pháp xác nhận 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Kết quả tổng hợp các hạt nano kim loại 33

3.1.1 Kết quả tổng hợp AgNPs 33

3.1.2 Kết quả tổng hợp AgNPs/ZIF-8 34

3.2 Kết quả phủ nano lên giá thể và lựa chọn giá thể 35

3.2.1 Kết quả phủ nano lên giấy Cellulose Nitrate (CN) 35

3.2.2 Kết quả phủ nano lên giấy Cellulose Acetate (CA) 36

3.2.3 Kết quả phủ nano lên tấm thủy tinh 41

3.3 Kết quả tăng sinh và tách chiết DNA của E coli VTCC12272 45

3.3 Tín hiệu Raman của đầu dò và DNA E coli 47

3.3.1 Tín hiệu Raman của đầu dò 47

3.3.2 Tín hiệu Raman của DNA E coli 48

3.3.2 Tín hiệu Raman của DNA E coli lai với đầu dò 48

3.4 Tín hiệu Raman của cảm biến sinh học 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

ix DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo cơ bản của E coli 6

Hình 1.2 Các thành phần điển hình của một cảm biến sinh học 13

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa tổng hợp ABs/GOxext/AuNPs/MBs–GOx@PDA PMNCs 14 Hình 1.4 Cấu trúc khung kim loại ZIF-8 15

Hình 1.5 Nguyên lý phát hiện E coli của công nghệ SPR 16

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên chất nền là các hạt nano 24

Hình 2.2 Mô phỏng quá trình chế tạo cảm biến DNA quang sinh học sử dụng hạt nano làm chất nền 25

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa quá trình hình thành AgNPs/ZIF8 27

Hình 2.4 Cơ chế phát hiện của tán xạ Raman và SERS 32

Hình 3.1 Kết quả tổng hợp nano bạc 33

Hình 3.2 Kết quả tổng hợp AgNPs/ZIF-8 34

Hình 3.3 Giấy cellulose nitrate trước và sau khi xử lý 35

Hình 3.4 Giấy cellulose acetate trước và sau khi phủ AgNPs 36

Hình 3.5 Ảnh chụp SEM của giấy cellulose acetate trước và sau khi phủ AgNPs 37

Hình 3.6 Kết quả EDS của giấy cellulose acetate sau khi phủ AgNPs 37

Hình 3.7 Giấy cellulose acetate trước và sau khi phủ AgNPs/ZIF-8 38

Hình 3.8 Ảnh chụp SEM của giấy cellulose acetate trước và sau khi phủ AgNPs/ZIF-8 39

Hình 3.9 Kết quả EDS của giấy cellulose acetate sau khi phủ AgNPs/ZIF-8 39

Hình 3.10 Các lần đo tín hiệu Raman của đế AgNPs trên giấy CA 40

Hình 3.11 Tấm thủy tinh trước và sau khi phủ AgNPs 41

Hình 3.12 Ảnh chụp SEM của tấm thủy tinh trước và sau khi phủ AgNPs 42

Hình 3.13 Kết quả EDS của tấm thủy tinh sau khi phủ AgNPs 42

Hình 3.14 Bề mặt giá thể thủy tinh trước và sau khi phủ AgNPs/ZIF-8 43

x

Hình 3.15 Sự khác biệt giữa các lần phủ AgNPs/ZIF-8 lên giá thể 43

Hình 3.16 Ảnh chụp SEM của thủy tinh trước và sau khi phủ AgNPs/ZIF-8 43

Hình 3.17 Kết quả EDS của thủy tinh trước sau khi phủ AgNPs/ZIF-8 44

Hình 3.18 Tín hiệu Raman của đế AgNPs/ thủy tinh 45

Hình 3.19 Quá trình tăng sinh và tách chiết DNA của vi khuẩn E coli VTCC12272 46

Hình 3.20 Nồng độ DNA tổng sau tách chiết 46

Hình 3.21 Tín hiệu Raman của đầu dò 47

Hình 3.22 Tín hiệu Raman của DNA E coli nồng độ 50 ng/ml 48

Hình 3.23 Tín hiệu Raman sau khi lai DNA E coli với đầu dò 49

Hình 3.24 So sánh ba nồng độ DNA E coli sau khi lai với đầu dò 50

Hình 3.25 Tín hiệu Raman của cảm biến sinh học phát hiện DNA của E coli 51

Hình 3.26 So sánh tín hiệu Raman phát hiện DNA của E coli và mẫu trắng trên cảm biến sinh học 52

Hình 3.27 So sánh tiến hiệu Raman trong phát hiện DNA E coli khi sử dụng và không sử dụng cảm biến sinh học 53

xi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin về chủng E coli VTCC12271 24

1 MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề

Escheriachia coli (E coli) là một trong những tác nhân phổ biến gây ô nhiễm trong nguồn nước và thực phẩm E coli đặc biệt gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm về đường ruột bao gồm tiêu chảy, kiết lị và các bệnh nhiễm trùng ngoài đường ruột khác như viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm phúc mạc tiên phát [1] Trong đó theo WHO, bệnh tiêu chảy là một trong ba nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ em từ 1-59 tháng tuổi Mỗi năm có khoảng 443 832 trẻ em dưới năm tuổi và 50 851 trẻ em từ 5 đến 9 tuổi tử vong do bệnh tiêu chảy, đồng thời số ca nhiễm bệnh tiêu chảy trên toàn cầu lên đến 1,7 tỉ [2] Chỉ riêng tiêu chảy và bệnh viêm phổi chiếm 29% tổng số ca tử vong ở trẻ em trên toàn thế giới, ước tính lên đến hơn 2 triệu trẻ em tử vong mỗi năm [3] Tại Việt Nam có khoảng 500 000 đến 700 000 trường hợp tiêu chảy cấp mỗi năm được báo cáo Đợt dịch gần đây nhất xảy ra vào cuối năm 2007-2008 với hàng ngàn trường hợp bệnh được báo cáo từ 19 tỉnh thành phía Bắc [4]

Trước đây, E coli thường được phát hiện và đánh giá thông qua thông qua một hoặc nhiều phương pháp truyền thống kết hợp với nhau như nuôi cấy, đếm đĩa, lên men nhiều ống, màng lọc, nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi [5] Theo Quy Chuẩn Việt Nam (QCVN) về quy định nước uống, yêu cầu chỉ tiêu của E coli là bằng không Chỉ tiêu đánh giá E coli được thực hiện thông qua phương pháp lọc màng và phương pháp nhiều ống theo Tiêu Chuẩn Quốc Gia - TCVN 6187 (ISO 9308) [6] Các phương pháp này khá đơn giản, chi phí thực hiện thấp Tuy nhiên, các phương pháp này mất nhiều thời gian, và không thể đáp ứng được nhu cầu liên tục của các quá trình công nghiệp Từ đó, thế hệ tiếp theo của phương pháp phát hiện E coli - các phương pháp sinh học phân tử như ELISA, FISH và PCR - ra đời nhằm rút ngắn thời gian, giảm thời gian chờ từ vài ngày xuống còn vài giờ Dù vậy, các phương pháp này đòi hỏi các thiết

2 bị đắt tiền, người thực hiện có kỹ thuật và trình độ cao, đồng thời nắm vững các thao tác tiến hành phân tích

Bước nhảy vọt trong phát hiện E coli diễn ra khi công nghệ cảm biến ra đời, công nghệ này giúp thu ngắn thời gian, giảm chi phí và quá trình thực hiện đơn giản Trong những năm gần đây, đã có hàng loạt cảm biến với đa dạng đầu dò ra đời nhằm phục vụ cho nhu cầu phát triển của thế giới Phần lớn các công trình này vẫn đang dừng lại ở mức nghiên cứu và chỉ một số lượng rất ít được đưa ra thương mại Dù vậy không thể phủ nhận tiềm năng to lớn của các cảm biến sinh học mở ra trong tương lai, khi những viễn cảnh robot cảm biến có thể thay thế con người giám sát ở các vị trí hiểm trở khác nhau Từ số liệu tử vong, cũng như số ca nhiễm bệnh đường ruột do E coli gây ra chứng tỏ tính cần thiết và quan trọng của việc phát hiện E coli trong các mẫu thực phẩm, nước uống và môi trường Hiện nay, các phương pháp phát hiện và đánh giá vẫn dừng lại ở các kỹ thuật tiêu chuẩn, tiêu tốn nhiều thời gian Các cảm bến sinh học mang nhiều ưu điểm, dù vậy, chỉ dừng lại ờ bước nghiên cứu và chưa được thương mại hóa rộng rãi Riêng tại Việt Nam cảm biến sinh học phát hiện vi khuẩn vẫn còn là lĩnh vực mới và hầu như có rất ít tài liệu về lĩnh vực này Đây cũng chính là những lý do đề tài được lựa chọn:

“Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện Escherichia coli ứng dụng trong giám sát môi trường”

2 Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế, chế tạo cảm biến để phát hiện Escherichia coli từ DNA tổng số bằng phương pháp tia Raman nhằm ứng dụng trong quan trắc môi trường

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu chính của luận văn này là vi khuẩn E coli và cảm biến sinh học phát hiện ra E coli

3  Phạm vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn tiến hành thử nghiệm trong luận văn này là chủng Escherichia coli (VTCC12272) trong môi trường nước, chủng giống gốc được cung cấp bởi Trung Tâm Nguồn Gen Vi Sinh Vật Quốc Gia

Các giá thể lựa chọn để xây dựng đế cảm biến bao gồm thủy tinh, giấy cellulose acetate và giấy cellulose nitrate

Hai loại hạt nano được tiến hành nghiên cứu phủ lên đế cảm biến gồm có nano bạc (AgNPs) và nano bạc trên khung ZIF-8 (AgNPs/ZIF-8)

Xác nhận tín hiệu bằng các kỹ thuật quang học UV-vis, SEM, EDS và Raman 4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Tổng hợp các hạt nano AgNPs và AgNPs/ZIF8 - Nội dung 2: Xác định giá thể phù hợp cho cảm biến sinh học - Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả phủ các hạt nano lên giá thể đã chọn - Nội dung 4: Gắn đầu dò DNA lên đế cảm biến

- Nội dung 5: Phát hiện DNA của E.coli bằng cảm biến đã chế tạo

4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 ESCHERICHIA COLI

1.1.1 Đặc điểm sinh học Vi khuẩn Escherichia coli thường sống trong ruột của người và động vật máu nóng Hầu hết vi khuẩn E coli là vô hại và là một phần thực sự quan trọng trong đường ruột của con người Tuy nhiên, một số vi khuẩn E coli có khả năng gây bệnh và được biết đến nhiều nhất cũng như phổ biến nhất là bệnh tiêu chảy Các loại E coli gây bệnh có thể lây truyền thông qua nước uống hoặc thức ăn, hoặc thông qua quá trình tiếp xúc giữa người với động vật hoặc giữa người và người

Vào năm 1885, Theodor Escherich lần đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn E coli từ mẫu phân của trẻ sơ sinh Một thời gian sau đó được thay tên là Escherichia coli và trong rất nhiều năm, vi khuẩn này chỉ đơn giản được coi là vi khuẩn sống trong ruột già Mãi đến năm 1935, một chủng của E coli mới được chứng minh là nguyên nhân gây ra đợt bùng phát bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh [7]

 Đặc điểm hình thái và cấu tạo Về đặc điểm sinh lý, E coli rất linh hoạt, thích nghi tốt với môi trường sống và có thể phát triển trong môi trường chỉ có glucose là thành phần hữu cơ duy nhất Về hình thái, E coli là trực khuẩn gram âm, sinh trưởng hiếu khí và kị khí Chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở 37oC Chủng vi khuẩn này không tạo bào tử, do đó có thể dễ dàng bị loại bỏ thông qua quá trình đun sôi hoặc khử trùng cơ bản [8]

Tương tự các tế bào prokaryote khác, tế bào của vi khuẩn E coli có màng nguyên sinh chất (màng tế bào) bao bọc, nhân không có màng hay còn được biết đến là vùng nhân, nguyên sinh chất (tế bào chất), ribosome, ngoài ra còn có vách tế bào, lông và roi (Hình 1.1) Kích thước tế bào của E coli rơi vào khoảng 0.5-1.5 x 2.0-6.0 μm [8]

5 Hình 1.1 Cấu tạo cơ bản của E coli 1.1.2 Đặc điểm bệnh học

Phần lớn các chủng E coli không gây bệnh và thậm chí còn là một phần quan trọng trong đường ruột của động vật máu nóng Tuy nhiên, một vài chủng E coli gây ra các căn bệnh nghiêm trọng liên quan đến đường ruột như tả hoặc tiêu chảy, hoặc các bệnh ngoài đường ruột như viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm phúc mạc tiên phát [1] [9] Các chủng E coli gây tiêu chảy chính bao gồm E coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic E coli - EPEC), E coli gây độc đường ruột (enterotoxigenic E coli -ETEC), E coli xâm lấn đường ruột (enteroinvasive E coli - EIEC), E coli gây xuất huyết đường ruột (enterohemorrhagic E coli - EHEC) và E coli gây ngưng tập kết đường ruột (enteroaggregative E coli - EAEC) [10]

1.1.2.1 Enteropathogenic E coli (EPEC) Enteropathogenic E coli (EPEC) là nhóm chủng được ghi nhận đầu tiên là tác nhân gây ra đợt bùng dịch tiêu chảy tại các quốc gia phát triển tại Anh Quốc năm 1945, nhóm chủng gây bệnh này đã được phân lập từ phân của trẻ em bị nhiễm bệnh, và cơ chế gây bệnh của EPEC được xác định dựa trên kiểu huyết thanh O:H [11] Các nghiên cứu ở Brazil, Mexico, Nam Phi và Bangladesh đã chỉ ra rằng 30–40% trường hợp tiêu chảy ở

6 trẻ sơ sinh là do nhiễm EPEC và ước tính gây ra cái chết cho hàng ngàn trẻ em mỗi năm [10] Đường ruột khi bị nhiễm EPEC sẽ bị các vi khuẩn nhóm này sẽ bám chặt vào thành ruột thông qua bó lông và chất kết dính, thay đổi cấu trúc khung các tế bào thành ruột và làm cho các nhung mao của tế bào bị bong tróc [12] Dù dịch tiêu chảy hầu như đã dừng bùng phát các nước phát triển, nhưng nhóm EPEC đến hiện tại vẫn là nguyên nhân chính gây ra tử vong ở trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 2 tuổi [11] Một số chủng đặc trưng của nhóm EPEC gồm E coli O86:H34, O114:H2, O127:H6 và O127:H40 [13]

1.1.2.2 Enterotoxigenic E coli (ETEC) Vào năm 1960, tại Ấn Độ, Enterotoxigenic E coli (ETEC) được phát hiện lần đầu tiên Nhóm ETEC gây bệnh thông qua việc tiết ra các độc tố làm cho niêm mạc ruột mất cân bằng ion gây ra tiêu chảy [14] ETEC là nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy cho người du lịch và là nguyên nhân chính gây ra dịch tiêu chảy ở các nước kém phát triển, đặc biệt là ở trẻ em ETEC lây truyền qua thực phẩm hoặc nước bị nhiễm phân động vật máu nóng [9] Đặc điểm chính của nhóm ETEC là sinh ra hai loại độc tính bền nhiệt và không bền nhiệt, đặc tính này hoàn toàn không xuất hiện ở các chủng E coli gây bệnh khác [10] Khi ETEC tiếp xúc và bám vào thụ thể của tế bào ruột, hai loại độc tố bền nhiệt và không bền nhiệt phosphoryl hóa kênh CTFR thông qua các con đường chuyển hóa, tạo nên sự bài tiết các chất điện giải, gây mất nước và dẫn đến tiêu chảy [14]

1.1.2.3 Enteroinvasive E coli (EIEC) Enteroinvasive E coli – EIEC lần đầu tiên được phát hiện vào khoảng 1950, là nhóm vi khuẩn gây bệnh có các đặc tính sinh hóa, di truyền và đặc tính bệnh học tương tự như Shigella, EIEC gây ra tiêu chảy hoặc bệnh kiết lỵ đặc trưng bởi các cơn co thắt bụng, phân lỏng, nôn mửa, sốt và ớn lạnh [13] Độc tính của nhóm EIEC không chỉ gây ra bởi bộ gen mà còn được gây ra bởi một plasmid độc tố đặc trưng là pINV Plasmid pINV khi tiếp xúc với tế bào chủ sinh ra VirF bám lên promoter và cho phép tổng hợp ra protein icsA và VirB Sau khi xâm nhập qua thành tế bào, EIEC nhân lên bằng cách sử

7 dụng tế bào chủ và nhờ vào VirB kích thích phiên mã toàn bộ gen và cả các gen cần thiết khác trên plasmid Thành tế bào tiếp đến bị ly giải và EIEC lan ra các tế bào lân cận [14] EIEC thường không khảo sát nhiều trong dịch tễ học do các biểu hiện lâm sàng ít nghiêm trọng hơn các chủng khác Ngoài ra, các chủng EIEC có sự tương đồng về sinh hóa, di truyền và gây bệnh rất giống Shigella dẫn đến có thể bị phân loại sai Do đó, không có khu vực quốc gia nào cụ thể nào thống kê các trường hợp mắc bệnh do nhiễm EIEC Muốn đánh giá số ca nhiễm do EIEC gây ra chỉ có dùng các nghiên cứu thiết kế đặc biệt dành riêng cho chủng EIEC, bao gồm các di truyền đặc trưng của EIEC hoặc giải mã trình tự [13]

1.1.2.4 Enterohemorrhagic E coli (EHEC) Enterohemorrhagic E coli (EHEC) gây nhiễm trùng dẫn đến bệnh lỵ ra máu và tăng nguy cơ mắc hội chứng urê tán huyết (Hemolytic uremic syndrome-HUS) EHEC có mẫu huyết tương O157:H7 là nguyên nhân gây ra các đợt bùng phát bệnh tiêu chảy ra máu và HUS trên toàn cầu [15] Hội chứng urê huyết tán huyết là một bệnh đặc trưng do tan máu, giảm tiểu cầu và chấn thương thận cấp tính Các mạch máu nhỏ trong thận có thể bị tổn thương, viêm và hình thành cục máu đông Các biến chứng của hội chứng này có thể đe dọa đến tính mạng, gây suy thận cấp tính hoặc mãn tính, đột quỵ, co giật, rối loạn đông máu dẫn đến xuất huyết và các vấn đề tim mạch tiêu hóa khác [16]

EHEC đưa các độc chất của chúng vào tế bào chủ thông qua hệ bài tiết loại III (T3SS), đốc tố tiến vào sớm nhất trong tế bào chủ là Tir và tiếp đến là các độc chất khác Trong suốt quá trình gây nhiễm, EHEC tăng tiết độc Shiga toxic vào tế bào chủ, độc tính này là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh lý nghiêm trọng, thậm chí dẫn đến tử vong[14]

Theo thống kê E coli O157:H7 là nguyên nhân chính gây ra các đợt bùng phát dịch, đáng kể nhất là trong những tháng mùa hè, khi nhiệt độ tăng cao và tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan nhanh chóng [15] Theo trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa

8 dịch bệnh (CDC), E coli O157:H7 gây ra hơn 63 000 ca bệnh hàng năm, số ca nhập viện và tử vong ở riêng Hoa Kỳ là hơn 2100 và gánh nặng kinh tế do EHEC gây ra theo số liệu thống kê từ năm 2006 đến 2017 ước tính lên đến 405 triệu USD mỗi năm [17], [18]

1.1.2.5 Enteroaggregative E coli (EAEC) EAEC được định nghĩa là mầm bệnh tiêu chảy dựa trên sự bám dính tổng hợp đặc trưng (AA) của nó với các tế bào HEp-2 và sự hình thành màng sinh học trên niêm mạc ruột với kiểu hình bám dính xếp chồng lên nhau do plasmid 60 MDa (pAA) gây ra [19] Bệnh tiêu chảy do EAEC có thể gây ra những cơn sốt, đau bụng và thậm chí là tiêu chảy ra máu [14] EAEC sử dụng hai nhân tố bám dính là AA và desperin để liên kết các EAEC rời rạc lại với nhau, đồng thời plasmid 60 MDa cho phép chúng xếp chồng, trải dài trên bề mặt tế bào chủ [14][19] Khi EAEC xâm nhập vào ruột, bản thân chúng sản sinh các nhân tố bảo vệ bản thân khỏi hệ thống miễn dịch và các nhân tố kháng khuẩn, kể cả kháng sinh tác động Chính điều này giúp EAEC tồn tại bền vừng và lâu hơn trong tế bào chủ Một số độc tính đặc trưng do EAEC tiết ra là Pet, Pic, ShET1, EAST-1 và HlyE Các độc tố này gây mất cân bằng ion, dẫn đến mất nước và gây ra tình trạng tiêu chảy [14]

1.1.3 Vi sinh vật chỉ thị Trong môi trường nước, E coli là một vi sinh vật chỉ thị mạnh về mức độ ô nhiễm nước Các nguồn nước thải, đặc biệt là nguồn nước thải chăn nuôi cũng như nước thải sinh hoạt có thể chứa nhiều loại vi sinh vật gây bệnh do nhiễm từ chất thải từ động vật và con người Sử dụng nguồn nước bị nhiễm phân của động vật máu nóng có thể gây ra nhiều loại bệnh, từ các triệu chứng nhẹ phổ biến như đưởng tiêu hóa gặp các vấn đề khó chịu như nôn mửa, tiêu chảy, hoặc gây ra các tình trạng nghiêm trọng hơn thậm chí dẫn đến tử vong, nhất là nhóm trẻ em dưới năm tuổi, người già và những người có hệ thống miễn dịch suy giảm [20]

9 Đóng vai trò là một sinh vật chỉ thị, E coli được kiểm tra, đo lường thường xuyên và liên tục trong các mẫu nước sinh hoạt, nước thải đầu ra, và thậm chí là trong các mẫu thực phẩm để đảm bảo sự an toàn cho người tiêu dùng Lượng lớn E coli hay các loại vi khuẩn khác có mặt trong nước làm nước đục màu, có mùi khó chịu, làm tăng nhu cầu oxy đồng thời làm giảm lượng oxy hòa tan trong nước Nồng độ E coli đồng thời tương quan với một vài thông số đo lường khác trong nước như tổng chất rắn lơ lửng (TSS), độ đục do vi khuẩn thường tồn tại dưới các dạng hạt lơ lửng Ngoài ra, nồng độ cao E coli cũng có thể dẫn đến nồng độ phospho, nitrate và nhu cầu oxi sinh học (BOD) tăng [21]

Như vậy, E coli là một trong những chỉ thị sinh học cần được phát hiện sớm, để kịp thời đưa ra các giải pháp xử lý

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E COLI

1.2.1 Phương pháp truyền thống E coli có thể được phát hiện thông qua một hoặc nhiều phương pháp truyền thống kết hợp với nhau như nuôi cấy, đếm đĩa, lên men nhiều ống, màng lọc, nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi, [5] Các phương pháp này khá đơn giản, chính xác và chi phí thực hiện thấp Tính đến nay, các phương pháp này vẫn thường được dùng trong đánh giá sự hiện diện của E coli trong nguồn nước nhờ vào những kết quả đáng tin cậy, dù vậy, quá trình thực hiện các phương pháp này mất đến vài ngày và đòi hỏi người thực hiện phải có đủ kiến thức liên quan trong lĩnh vực sinh học cũng như các thao tác thí nghiệm chuẩn xác Từ đó, thế hệ tiếp theo của phương pháp phát hiện E coli - các phương pháp sinh học phân tử - ra đời nhằm rút ngắn thời gian, giảm thời gian chờ từ vài ngày xuống còn vài giờ

10 1.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử Hiện nay các phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện và định danh vi sinh vật nói chung cũng như E coli nói riêng, đặc biệt được biết đến nhiều nhất đó là phương pháp PCR nhờ vào độ nhạy cao, tính đặc hiệu và linh hoạt trong phòng thí nghiệm Vào năm 2005, Leigh Watterworth cùng cộng sự của mình đã phát triển 6 phản ứng PCR để phát hiện 4 loại E coli gây bệnh chính Trong đó, 6 cặp mồi và 6 đầu dò huỳnh quang được thiết kế cho các gene đích bao gồm: Shiga like toxin I và II (stxI và stxII) để phát hiện verotoxigenic E coli (VTEC), gen heat-stable và heat-labile toxin để phát hiện enterotoxigenic E coli (ETEC), gen cho nhân tố bám dính (EAF) để phát hiện enteropathogenic E coli (EPEC) và một đoạn của plasmid xâm nhập (IAL) để phát hiện enteroinvasive E coli (EIEC) Các phản ứng được thực hiện trên 31 chủng gây bệnh và 9 chủng không gây bệnh và cho kết quả đặc hiệu giữa mồi và đầu dò lên các chủng gây bệnh tương ứng, đồng thời không có phản ứng với các chủng không chưa gene đích Kết quả cho thấy những tiềm năng to lớn của Multiplex PCR trong việc định danh các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là E coli [22]

Phương pháp phân tích hóa sinh ELISA (Enzym-linked Immunosorbent assay) cũng được áp dụng trong quá trình định danh E coli Phản ứng này sử dụng kháng thể và sự thay đổi màu để xác định một chất Dựa trên cơ chế kháng nguyên kháng thể đặc hiệu, phương pháp này cho nhiều hứa hẹn bởi tính đơn giản và thời gian cho kết quả nhanh chóng đồng thời tiết kiệm chi phí Trong một bài nghiên cứu vào năm 2015, ELISA trên nền giấy đã được phát triển để phát hiện E coli trong vòng 5 giờ và có thể phát hiện 105 tế bào/mL mà không cần dùng các thiết bị đắt tiền [23] Dù vậy, phương pháp này đôi khi cho trường hợp dương tính giả hoặc âm tính giả, khiến cho kết quả bị sai lệch và cần đi kèm các phương pháp khác để kiểm chứng Tuy nhiên, có thể dùng nó như một phương pháp sàng lọc nhanh trước khi tiến hành các phương pháp khác

Phương pháp được biết đến tiếp theo là FISH (Fluorescent in situ hybridization), phương pháp này kết hợp ứng dụng giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử Trong kỹ

11 thuật này, một đoạn đầu dò (DNA, RNA hoặc PNA) sẽ được đánh dấu huỳnh quang và bắt cặp với các vị trí trên đoạn gene đích mong muốn Sau khi lai, sản phẩm sẽ được quan sát dưới kính hiển vi để tìm tín hiệu huỳnh quang của các đoạn dò lai thành công Sự có mặt hay không có tín hiệu huỳnh quang giúp suy ra có hay không có sự hiện diện của các đoạn gene đích tương ứng

Gần đây, PNA-FISH được nghiên cứu để phát hiện sự hiện diện của E coli trong nước Vào năm 1999, Prescott và Fricker đã phát triển một đầu dò Peptide Nucleic Acid (PNA) đặc hiệu để gắn vào vùng 16S rRNA đặc hiệu của E coli Để xác định tính chính xác của đầu dò, các nhà khoa học tiến hành kiểm tra lai trong một môi trường bao gồm nhiều loài Escherichia, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter Kết quả cho phép phát hiện E coli trong vòng 3 giờ, đồng thời thí nghiệm này cũng thành công trên các mẫu nước máy và số lượng tế bào phát quang tương quan với phương pháp đếm đĩa Điều này mở ra nhiều cơ hội mới cho đầu dò PNA trong lai tại chỗ phát hiện các vi sinh vật và đưa ra giải pháp về mặt thời gian cũng hiệu quả so với các phương pháp sinh học phân tử trước đó [24]

So sánh với các phương pháp truyền thống, các phương pháp sinh học phân tử cho nhiều ưu thế vượt trội về mặt thời gian cũng như tính chính xác cao Dù vậy, nhược điểm lớn nhất của những phương pháp này là tiêu tốn hóa chất và máy móc thiết bị đắt tiền; đồng thời đòi hỏi người thực hiện phải có kiến thức và chuyên môn cao Bước nhảy vọt trong phát hiện vi sinh vật diễn ra khi công nghệ cảm biến ra đời Không chỉ dừng lại ở cảm biến vật lý, hóa học để giám sát các tác nhân hóa lý, hóa học và các cơ chất; công nghệ cảm biến ngày nay tiếp tục nâng cao vai trò và tiềm năng phát triển của mình khi kết hợp các đầu dò sinh học để phát hiện các yếu tố sinh học, cụ thể là vi sinh vật và virus

Như vậy, phương pháp hiện đại phát hiện vi sinh vật nói chung cũng như là E coli nói riêng, luôn cần được cải tiến và phát triển

12 1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC PHÁT HIỆN E COLI

1.3.1 Cấu tạo cơ bản của cảm biến Trước đây, các phương pháp điển hình để phát hiện và giám sát các chất gây ô nhiễm trong môi trường, đặc biệt là vi sinh khuẩn chủ yếu dựa vào các thí nghiệm hóa học và vật lý trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, như trình bày ở trên các phương pháp đó hầu như tiêu tốn rất nhiều thời gian và đòi hỏi người tiến hành phải có kinh nghiệm và kỹ thuật nhất định khi thực hiện thao tác Chính những yếu tố này cản trở áp dụng các phương pháp trên vào quy trình công nghiệp liên tục Kể từ khi phát minh ra công nghệ cảm biến, đã có một cuộc cách mạng lớn trong việc giám sát và kiểm soát môi trường

Cảm biến sinh học về cơ bản là một thiết bị phân tích có thể chuyển đổi các tín hiệu sinh học thành các tín hiệu có thể đo lường được (tín hiệu điện, điện hóa, quang học, trọng lực hoặc âm thanh) nhờ vào sự tương tác giữa các chất cần phân tích với các đầu dò sinh học [25] Cảm biến sinh học được cấu thành trên 3 bộ phận chính: cảm biến, bộ chuyển đổi và hệ thống tín hiệu đầu ra Dựa vào cấu tạo đầu dò, có thể chia cảm biến sinh học thành 4 loại chính: cảm biến sinh học dựa trên tế bào, cảm biến sinh học dựa trên kháng nguyên-kháng thể, cảm biến sinh học dựa trên enzyme và cảm biến sinh học dựa trên nucleic acid (DNA, RNA,…) (Hình 1.2) [26] Nếu dựa vào các bộ phận chuyển đổi, cảm biến sinh học cũng được phân thành 4 loại: cảm biến quang sinh học, cảm biến sinh học điện hóa, cảm biến nhiệt sinh học, cảm biến cơ sinh học Tuy nhiên, hiện nay loại cảm biến phát triển mạnh nhất trong phát hiện vi khuẩn là cảm biến quang sinh học và cảm biến sinh học điện hóa

13 Hình 1.2 Các thành phần điển hình của một cảm biến sinh học 1.3.2 Phân loại cảm biến

1.3.1.1 Cảm biến sinh học điện hóa – Electrochemical Biosensors Một trong số các cảm biến được nghiên cứu phát triển nhiều nhất hiện nay là cảm biến sinh học điện hóa Có cấu tạo chung tương tự như các cảm biến sinh học khác, cảm biến sinh học điện hóa bao gồm một đầu dò sinh học, bộ chuyển đổi tín hiệu dựa trên điện hóa (thông thường là các điện cực) và hệ thống tín hiệu đầu ra Các điện cực này có thể được lựa chọn bằng nhiều loại vật liệu khác nhau nhằm tăng độ chính xác đầu ra cũng như phù hợp với từng mục đích khác nhau

Để phát hiện ra các vi sinh vật gây bệnh, các loại vật liệu nano khác nhau đã lần lượt được tích hợp vào cảm biến sinh học để mang lại những cải tiến về sự ổn định, độ nhạy, độ chọn lọc và đặc biệt là tốc độ phát hiện các vi sinh vật gây bệnh [27] Một ví dụ của cảm biến sinh học phát hiện vi khuẩn E coli O157:H7 là cảm biến điện hóa dựa

14 trên enzyme GOx@PDA Cảm biến này dựa trên sự kết hợp của lõi MBs (Magnetic Beads) phủ glucose oxidase (GOx) và polydopamine (PDA) và tăng cường nano vàng trên bề mặt (Hình 1.3) Đầu dò này cho phép phát hiện E coli O157:H7 (ATCC 43888) với giới hạn là 102 CFU/mL trong điều kiện có mặt các loại vi khuẩn khác như E.coli K12 (ATCC 29425) và Salmonella typhimurium (ATCC 14028) [28]

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa tổng hợp ABs/GOxext/AuNPs/MBs–GOx@PDA PMNCs [28] Ngoài việc sử dụng các nano kim loại, hiện nay, để tăng hiệu quả khuếch đại tín hiệu người ta thường kết hợp các nano kim loại và các khung hữu cơ kim loại (Metal Organic Frameworks-MOFs) để tạo nên một đầu dò có hiệu suất cao hơn MOFs là một nhóm các hợp chất bao gồm các ion hoặc cụm kim loại phối hợp với các phối tử hữu cơ để tạo thành các cấu trúc một, hai hoặc ba chiều tạo nên diện tích bề mặt lên tới 7.800 m2/gram [29] Trong đó, zeolite imidazolate framework-8 (ZIF-8) là một trong số các MOFs được ứng dụng khá phổ biến trong cảm biến sinh học Dù diện tích bề mặt không quá ấn tượng như các MOFs khác khi ZIF-8 chỉ đạt 1.400 m2/gr, tuy nhiên cấu trúc khung ZIF-8 có xu hướng giống khung tinh thể của zeolite (hình 1.4) do đó có khả năng chịu nhiệt và tính ổn định hóa học tốt hơn tạo nền tảng tuyệt vời để ứng dụng trong các quá trình hóa học [30] [31] [32]

Một nghiên cứu vào 2019, đã kết hợp cadmium sulfide quantum dots (CdS QDs) và khung kim loại zeolite imidazolate framework-8 (ZIF-8) để tăng khả năng khuếch đại tín hiệu điện thế trong chế tạo cảm biến điện hóa phát hiện E coli O157:H7 Trong nghiên cứu này, kháng thể đặc hiệu của E.coli O157:H7 được gắn lên bề mặt CdS@ZIF-8 nhờ vào lớp polyethyleneimine phủ trên bề mặt phức hợp kim loại này Đầu dò này được thực hiện theo cấu trúc sandwich, trong đó các hạt CdS@ZIF-8 đóng vai trò phát

15 tín hiệu Quá trình phát hiện E coli thông qua sự thay đổi xung điện khi các Cd (II) được phóng thích, và kết quả thu được nằm trong phạm vi tuyến tính từ 10-108 CFU/mL Cảm biến điện hóa dựa trên cơ chế miễn dịch này cũng cho kết quả với độ nhạy và độ chọn lọc tốt [27]

Hình 1.4 Cấu trúc khung kim loại ZIF-8 (a) Hình ảnh ZIF-8 dưới kính hiển vi quang học điện tử SEM (ACS Material) (b) Cấu

trúc hóa học của khung ZIF-8 [31] Một loại cảm biến khác được nghiên cứu phát triển song song với cảm biến điện hóa là các cảm biến quang học Các cảm biến này có thể nói là một đối thủ cạnh tranh đầy tiềm năng với các cảm biến điện hóa, chính bởi thời gian cho kết quả nhanh chóng, độ đặc hiệu cao và tín hiệu đầu ra ổn định

1.2.1.2 Cảm biến quang sinh học - Optical Biosensors Bộ khuếch đại của cảm biến quang học được phát triển dựa trên các công nghệ quang học chính như cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance – SPR), cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (Localized Surface Plasmon Resonance – LSPR) và phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Surface-Enhanced Raman Scattering – SERS) kết hợp với các kim loại hay các nano kim loại để tăng cường hiệu quả thu nhận tín hiệu đầu ra

16 Phát hiện dựa trên cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) là một kỹ thuật phát hiện sinh hóa tiên tiến dựa trên quang học vật lý Phương pháp này cho phép phát hiện quá trình liên kết của nhiều phân tử sinh học thông qua phép đo thay đổi chỉ số khúc xạ (Refractive Index-RI) trên bề mặt cảm biến do các liên kết phân tử gây ra [33] Trong phát hiện E coli, sự thay đổi RI xảy ra do vi khuẩn hấp phụ trên bề mặt kim loại Trong một nghiên cứu của Mondani và công sự vào năm 2014, kháng thể đặc hiệu được cố định lên bề mặt kim loại của cảm biến để theo dõi E coli O157: H7 (Hình 1.5) Lúc này sự hình thành liên kết của E.coli lên kháng thể làm thay đổi RI của cảm biến quang học dẫn đến sự thay đổi tín hiệu SPR đầu ra[33] [34]

Ngoài những ưu điểm vượt trội, SPR sử dụng các tấm kim loại mỏng để tăng cường tín hiệu của mình do đó chi phí thực hiện là một trở ngại cần giải quyết Trong khi đó, công nghệ SPR cục bộ (Localized SPR-LSPR) sử dụng các hạt nano kim loại để tăng cường tín hiệu, chính điều này giải quyết được vấn đề chi phí của các tấm kim loại được giải quyết

Hình 1.5 Nguyên lý phát hiện E coli của công nghệ SPR [33] LSPR dùng một chùm tia thẳng đứng để kích thích các hạt nano do đó không có các yêu cầu nghiêm ngặt như SPR Công nghệ này chỉ cần một tần số photon tới phù hợp

17 với tần số rung của các hạt nano kim loại hoặc các electron dẫn phủ trên cảm biến Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu ứng LSPR là hình dạng hạt, kích thước, vật liệu và môi trường xung quanh hạt Khi môi trường xung quanh các hạt thay đổi, tần số cộng hưởng của các hạt sẽ thay đổi [35] Gần đây, độ ổn định và độ nhạy của phương pháp này được cải thiện thông qua việc thay đổi hình thái hoặc chức năng bề mặt của các hạt nano kim loại Trong đó, nano vàng (AuNPs) phủ lớp vỏ SiO2 giúp cải thiện độ nhạy trong phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp LSPR [36]

Một phương pháp quang học khác cũng được ứng dụng trong lĩnh vực cảm biến là sử dụng hiệu ứng tán xạ Raman Hiệu ứng này được phát hiện vào năm 1928 bởi nhà vật lý học Ấn Độ Chandrasekhara Venkata Raman, là hiện tượng mà tần số của ánh sáng bị thay đổi sau khi tán xạ, từ đó thu nhận được tín hiệu khác biệt trước và sau khi tán xạ Tuy nhiên, xác suất xảy ra tán xạ Raman không cao, rơi vào khoảng 10-8 ánh sáng tới, do đó rất khó để thu được tín hiệu Raman của các phân tử với nồng độ thấp Một bước ngoặt lớn đã xảy ra vào năm 1974, khi nhóm nghiên cứu của Fleischmann đã phát hiện ra rằng sự có mặt của một điện cực Ag nhám sẽ làm cho cường độ tín hiệu Raman của pyridin hấp thụ trên bề mặt điện cực đó tăng lên nhiều lần [37] Từ đây, bắt đầu thời kỳ phát triển của ‘Tán xạ Raman tăng cường bề mặt-SERS’ như một kỹ thuật phân tích xác định lượng vết của các phân tử hữu cơ và sinh học

Các chất nền được ứng dụng phổ biến nhất trong SERS là các hạt vật liệu nano như AuNPs, AgNPs và CuNPs với nhiều đặc tính vượt trội [35] Với sự phát triển của công nghệ và vật liệu nano, các vật liệu nano có cấu trúc phức hợp ra đời để nâng cao hiệu suất cho phương pháp SERS trong phát hiện E coli Trong đó, Au-Ag, Au-SiO2 với các đặc tính hóa học và vật lý độc đáo của chúng cho kết quả với độ nhạy tốt hơn các phương pháp đánh dấu huỳnh quang đáng kể [38][39] Cụ thể, sự kết hợp SiO2/Au tạo nên độ ổn định và là một phức hợp chất nền hoạt động SERS tuyệt vời Trong nghiên cứu này, E.coli O157:H7 được phát hiện thông qua cơ chế miễn dịch kiểu sandwich, kháng thể được gắn lên vật liệu nền và khi phức hợp miễn dịch hình thành, độ tán xạ bề mặt sẽ thay

18 đổi dẫn đến tín hiệu được ghi nhận, ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 102 tế bào/mL [39]

Như vậy, với sự ra đời và không ngừng cải tiến của công nghệ cảm biến kết hợp với các loại vật liệu, phức hợp vật liệu nano khác nhau mở ra một thời đại mới cho công nghệ cảm biến sinh học, rút ngăn thời gian phát hiện, giảm chi phí đồng thời áp dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

1.3.3 Giá thể của cảm biến Đối với một cảm biến sinh học, giá thể là một lớp rắn có chức năng như một bề mặt cố định của các cơ quan thụ cảm sinh học Việc lựa chọn chất nền được coi là bước đầu tiên cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công trong việc thiết kế và chế tạo cảm biến sinh học Chất nền được lựa chọn, tổng hợp dựa trên các yếu tố như nguyên liệu sẵn có, giá thành, trình độ công nghệ trong nước hoặc nhập khẩu từ bên ngoài Trong những năm qua, một lượng lớn vật liệu đã được sử dụng làm chất nền, chẳng hạn như vàng, thủy tinh, hydrogel, silicon,…[40] Các vật liệu được chọn cho mục đích làm chất nền phải đáp ứng các yêu cầu quan trọng để hạn chế phản ứng sinh học không đặc hiệu giữa bề mặt với một trong hai chất phân tích hoặc chất nhận cảm sinh học Chất nền phải tương đối trơ, có độ đồng nhất bề mặt tối ưu để gắn phân tử sinh học và phù hợp với thiết kế mạch điện tử cũng như thiết kế quang học

1.3.3.1 Thủy tinh Thủy tinh là một trong những vật liệu phổ biến nhất làm giá thể của cảm biến sinh học dựa trên các đặc tính quang học phổ biến của nó, tính chất hóa học liên kết đặc trưng, khả năng tự phát huỳnh quang thấp và giá thành rẻ Tuy nhiên, thủy tinh có khả năng liên kết phân tử thấp, dẫn đến tiêu tốn thời gian của quá trình chức năng hóa bề mặt Do đó, một quy trình chuẩn bị thủy tinh phức tạp được thực hiện thông qua quá trình làm sạch và silan hóa nghiêm ngặt trước khi sử dụng cho cảm biến sinh học [41] Trong những năm gần đây, các phương pháp phủ khác đã được phát triển nhằm nâng cao hiệu

19 quả và thời gian chuẩn bị cho bề mặt thủy tinh Các phiến kính được bao phủ bởi acrylate có thể áp dụng ở phạm vi giá trị pH rộng và hiển thị tín hiệu sáng hơn và ổn định hơn so với các phiến kính được phủ silane [42] Để tăng cường cường độ điểm, tính đồng nhất, khả năng cố định đầu dò protein, phiến kính cũng được phủ bởi một lớp đa lớp và có kết cấu nano vi mô plasma, tạo thành các phiến có kết cấu nano vi mô plasma ba chiều (3D) [41]

1.3.3.2 Silicon Silicon là một vật liệu đầy hứa hẹn thay thế thủy tinh với những ưu điểm khi sử dụng làm giá thể cho cảm biến sinh học: tăng cường khả năng điều chỉnh bước sóng và chi phí thấp [42] Một đặc điểm quan trọng khiến silicon được sử dụng rộng rãi cho các cảm biến sinh học quang học là chỉ số khúc xạ cao Tuy nhiên, silicon không thể tương thích với việc cố định các thụ thể sinh học (đầu dò) Do đó, cần kết nối Si-C để neo các đầu dò trên bề mặt silicon Bề mặt silicon được hydro hóa, tạo điều kiện cho các chất hữu cơ liên kết với bề mặt hydro hóa thông qua phản ứng hydrosilylation và sau đó hình thành liên kết Si-C cộng hóa trị mạnh Các đầu dò có thể bám chặt vào bề mặt thông qua liên kết nhóm đuôi hữu cơ [43] Tuy nhiên, giới hạn Si-C phải được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm khắc nghiệt, bề mặt kỵ nước có thể gây biến tính đầu dò SiO2 không ổn định với ngoại lực trong quá trình chế tạo nên rất khó thao tác [44] Silicon tiêu chuẩn có thể được biến đổi để trở thành silicon xốp nhằm tăng cường khả năng cố định oligonucleotide trên chất nền bề mặt Silicon xốp đã được sử dụng để cố định các nhận dạng sinh học khác như enzyme, kháng thể [45]

1.3.3.3 Nhựa Những năm gần đây, polyme và nhựa đã được các nhà khoa học quan tâm đáng kể Một số ưu điểm khiến polyme trở thành ứng cử viên quan trọng trong chế tạo giá thể bao gồm nhẹ về khối lượng, có thể uốn cong, co giãn, có thể gập lại và giá thành thấp Các tính năng quan trọng đối với hiệu suất cảm biến là độ nhạy, thời gian phản hồi tín hiệu

20 chủ yếu phụ thuộc vào cấu trúc hóa học và kích thước của polyme Nhựa công nghiệp thường được bổ sung thêm các hóa chất ổn định để kéo dài tuổi thọ, điều này khiến chúng trở nên không thân thiện với môi trường và sức khỏe con người [46] Vì vậy, nhựa sinh học và nhựa phân hủy sinh học ra đời nhằm cải thiện những vấn đề đó Một số loại nhựa sinh học nổi tiếng trong cảm biến sinh học là chitosan và các dẫn xuất của nó, axit polylactic (PLA), rượu Polyvinyl (PVA) [47][48][49] Thêm một loại nhựa thân thiện với môi trường/có thể tái chế như LDPE, PET, PP Chúng cũng được coi là nền tảng tiềm năng để tạo ra cảm biến sinh học vì tuổi thọ cao, khả năng tái sử dụng và tính linh hoạt

2.3.3.4 Giấy Gần đây, giấy cũng được lựa chọn để sử dụng làm chất nền cho cảm biến sinh học Giấy được tạo thành từ các sợi cellulose kết nối với nhau tạo thành ma trận sợi cellulose với nhiều lỗ nhỏ Ngoài ra, ma trận sợi cellulose còn cung cấp cấu trúc vi mô phân cấp ba chiều (3D) để gắn các phân tử sinh học Cảm biến sinh học dựa trên giấy có một số ưu điểm như độ nhạy cao, phản ứng nhanh, chi phí thấp, chế tạo đơn giản và yêu cầu kỹ thuật thấp Hơn nữa, giấy có khả năng chứa lượng phân tử sinh học cao, mang lại lợi ích trong việc nạp và giữ các thành phần sinh học (thụ thể) vào giá thể giấy cellulose để phát hiện chất phân tích Dựa trên các đặc tính, giấy cellulose đã được nghiên cứu ứng dụng ngày càng nhiều trong cảm biến sinh học, mang lại hiệu quả kinh tế [50]

1.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CẢM BIẾN SINH HỌC TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Khái niệm cảm biến sinh học được biết đến từ những năm 1960 nhưng đến tận những năm 1980-2000 với sự phát triển về công nghệ điện tử, vi mạch tích hợp thì cảm biến sinh học mới được tập trung nghiên cứu nhiều hơn Từ 2000 cho đến nay, nhờ vào công nghệ nano, hàng loạt các nghiên cứu về cảm biến sinh học ra đời mở ra kỷ nguyên

21 mới cho ngành công nghệ cảm biến và robot cảm biến ứng dụng trong nhiều lĩnh vực từ y tế, thực phẩm, công nghiệp đến đánh giá và quan trắc môi trường

Trong môi trường nói chung và môi trường nước nói riêng thì E coli là một đối tượng luôn được quan tâm nghiên cứu Một nghiên cứu của Mondani cùng cộng sự vào năm 2014 đã sử dụng kháng thể đặc hiệu cố định lên tấm kim loại mỏng của cảm biến sinh học để theo dõi phát hiện sự có mặt của E coli O157: H7 có mặt trong nước Cảm biến này phát hiện vi khuẩn dựa trên thay đổi chỉ số khúc xạ RI quang học cho giới hạn phát hiện 104 -105 CFU/mL và thời gian phát hiện dưới 7 giờ [33] [34]

Với sự ra đời của các vật liệu nano, trong đó phổ biến là nano vàng, bạc và phức SiO2-vàng là các hạt nano thường được ứng dụng trong cảm biến sinh học Kết hợp với tán xạ Raman hoặc cộng hưởng bề mặt tán xạ Raman (SERS) làm tăng tín hiệu thu nhận và giảm nồng độ E coli phát hiện được xuống 2 CFU/mL [51]

Ngoài ra, hiện nay các cảm biến sinh học điện hóa, cụ thể là điện cực đã thương mại hóa có thể phát hiện E coli ở nồng độ 755 tế bào/mL nhờ vào ứng dụng công nghệ điện di và điện dung xen kẽ Các điện cực này được đánh giá là đáp ứng được các nhu cầu phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm cũng như môi trường với chi phí thấp[52]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Tại Việt Nam, cảm biến sinh học được các nhà nghiên cứu quan tâm và bắt đầu phát triển từ đầu những năm 2010 Năm 2011, một nhóm các nhà khoa học nghiên cứu cảm biến sinh học dựa trên sự cố định kháng thể trong huyết thanh để phát hiện nhanh các kháng nguyên virus Cảm biến này hoạt động dựa trên lớp kháng thể huyết thanh cố định trên bề mặt cảm biến kỹ thuật số Tín hiệu phát hiện của cảm biến được xác nhận thông qua phổ hồng ngoại Fourier và kính hiển vi huỳnh quang và cho phạm vi phát hiện từ 1-10 µg/mL [53]

22 Vào năm 2012 cảm biến sinh học phát hiện chủng Escherichia coli O157:H7 mở ra cánh cửa mới cho các cảm biến dựa trên DNA phát triển trong nước Cảm biến này hoạt động dựa trên các ống carbon đa thành, sự tương tác giữa DNA và nano carbon được đánh giá thông qua quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Cảm biến đáp ứng tốt trong thời gian siêu âm 120 phút, pH 9.0 và nồng độ DNA là 20µM, với độ nhạy 0.19 nM/mV, cảm biến được đánh giá là có tiềm năng trong việc phát hiện E coli gây bệnh [54] Tiếp đến vào năm 2013, các que thử phát hiện độc tố trong vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococus aureus, E coli, Salmonella, virus đốm trắng trên tôm được Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Cục Hóa sinh và tài liệu nghiệp vụ (Bộ Công An) nghiên cứu phát triển dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch và định tính bằng dòng chảy đẳng hướng Các que thử này cho kết quả nhanh chóng và tiện lợi, dù vậy, ở mức độ nghiên cứu hiện tại các que thử dừng lại ở mức định tính và độ đặc hiệu không cao; nhiều trường hợp cho ra kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả [55]

1.5 THẢO LUẬN TỔNG QUAN Dù chỉ mới bắt đầu xuất hiện từ những năm 1960 nhưng đến nay cảm biến sinh học đã có những phát triển vượt trội và ưng dụng tiềm năng trong phát hiện các nguyên nhân gây bệnh cũng như gây ô nhiễm trong môi trường Hai loại cảm biến sinh học phổ biến nhất hiện nay là cảm biến điện hóa và cảm biến quang sinh học với những ưu điểm khác nhau, nhưng đều mang nhiều tiềm năng ứng dụng xa hơn trong tương lai Với các điều kiện hiện có ở phòng thí nghiệm và những ưu điểm vượt trội về giới hạn nồng độ có thể phát hiện từ các hạt nano cũng như phương pháp quang học mang lại, nghiên cứu này chọn lựa xây dựng cảm biến dựa trên các hạt nano và phương pháp tán xạ Raman Trong đó, hai loại hạt nano được tập trung nghiên cứu ứng dụng là nano bạc và nano bạc ZIF-8 Hai loại giá thể được ưu tiên chọn lựa là giấy và thủy tinh Trong đó, thủy tinh với đặc tính nhạy quang đã được Tsougeni lựa chọn để xây dựng cho cảm biến quang học vào năm 2018 [42], và giấy với cấu trúc lỗ rỗng và tối ưu chi phí đã được chọn lựa bởi Fang-Chi Wu cho xây dựng thiết bị Lab-on-Chips của mình vào năm 2021 [51]

23 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Hóa chất Kẽm nitrat (Zn(NO3)2, Merck), 2-metylimidazol (CH3C3H2N2H 99%, Sigma Aldrich), methanol (CH3OH, Merck), ethanol (C2H5OH, Merck), bạc nitrat (AgNO3, Merck), natri borohydride (NaBH4, Sigma Aldrich), (3-Aminopropyl) trithoxysilan 98% (C9H23NO3Si, A Johnson Matthey Company), bovine serum albumin (BSA 3%, Sigma Aldrich), và phosphate buffered saline (PBS, Sigma Aldrich) Môi trường Trypton Soya Broth (TSB, TM Media), DNA extraction kit (Thermo Scientific), Ultrapure water

2.1.2 Vật liệu 2.1.2.1 Giá thể Tấm thủy tinh kích thước 22 x 22 mm dày 0.13-0.17 mm(cover glass-DeckGlaser-Marienfeld)

Giấy mixed cellulose ester, kích thước lỗ rỗng 0.45μm (Advantec®) Giấy micro-glass fiber filter – cellulose acetate, kích thước lỗ rỗng 0.45 μm (Finetech®)

2.1.2.2 Đầu dò Trình tự đầu dò: 5’-SH-TACAAAGGGAGAAGGGCATG-3’[56] (Gene Wiz) Trình tự đầu dò được tham khảo theo công trình nghiên cứu của Padmavathy Bakthavathsalam và cộng sự vào năm 2012 Trình tự này được thiết kế dựa trên đoạn malB gene, khu vực này có trình tự tương đồng cao trong hầu hết các chủng E coli và không chia sẻ trình tự tương đồng với bất kỳ thành viên nào không thuộc họ Escherichia coli Trình tự đầu dò dài 20 nucleotide và được điều chỉnh thêm nhóm thiol (S-H) ở đầu 5’ giúp sự gắn kết lên các hạt nano vàng hoặc bạc trở nên dễ dàng [56]

24 2.1.2.3 Chủng vi sinh vật

Chủng E coli mã VTCC12272 được cung cấp bởi Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, ĐHQG Hà Nội, với thông tin mô tả theo Bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin về chủng E coli VTCC12271

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên chất nền là

các hạt nano

Mã số tại bảo tàng khác ATCC 25922

Môi trường và pH nuôi cấy NA, 6.5-7.0 Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy 37oC, 24-48 giờ, hiếu khí Đặc điểm chung Là chủng thường dùng trong kiểm soát, kiểm

tra môi trường làm các mẫu đối chứng chẩn đoán và không sinh ra độc tính [57]

25 Nội dung nghiên cứu được thực hiện theo Hình 2.1 và Hình 2.2 Sau khi đánh giá lựa chọn giá thể và thành công tổng hợp được các hạt nano kim loại, giá thể sẽ được xử lý bề mặt và quá trình phủ nano lên giá thể sẽ được diễn ra Lúc này, hiệu quả phủ sẽ được đánh giá thông qua hình ảnh, kết quả UV-vis, SEM và EDS Tiếp đến, đầu dò được thiết kế sẽ gắn lên đế vừa phủ, quá trình này được đánh giá thông qua phương pháp đo tán xạ Raman, tín hiệu của đầu dò được ghi nhận Bước cuối cùng là tiến hành lai DNA của E coli với cảm biến, sau đó đánh giá tín hiệu bằng phương pháp tán xạ Raman, tín hiệu lai được ghi nhận và so sánh với tín hiệu đầu dò trước đó

Hình 2.2 Mô phỏng quá trình chế tạo cảm biến DNA quang sinh học sử dụng hạt nano

làm chất nền 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Tổng hợp các hạt nano Trong nghiên cứu này, các hạt nano được tổng hợp bằng phương pháp hóa học Trong đó, bạc nano được tổng hợp dựa trên phản ứng khử của AgNO3 và NaBH4 và