Khảo sát khả năng kháng oxi hóa từ cao chiết bí kì nam (hydnophytum formicarum jack)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI : Khảo sát khả kháng oxi hóa từ cao chiết Bí Kì Nam (Hydnophytum formicarum jack) KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGHÀNH Y DƯỢC GVHD: TS Nguyễn Thị Lệ Thuỷ SVTT: Võ Phạm Gia Huy MSSV: 1853010052 Khóa: 2018-2022 Tp Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2022 NHẬN XÉT CỦA GVHD LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện để em có hội học tập thuận lợi Lời em xin cảm ơn đến thầy cô mà em có hội tiếp xúc học hỏi suốt quãng đời sinh viên em, đặc biết thầy khoa Cơng nghệ Sinh học nói chung thầy cô chuyên ngành y dược nói riêng Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Qua hướng dẫn truyền đạt tận tình q thầy em hồn thành xong thực tập tốt nghiệp với đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HĨA TỪ CAO CHIẾT BÍ KÌ NAM (HYDNOPHYTUM FORMICARUM JACK)” Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến TS Nguyễn Thị Lệ Thủy – giảng viên khoa Công nghệ Sinh học giảng viên hướng dẫn em thực đề tài thực tập Cô dành thời gian để đồng hành em, giúp đỡ hướng dẫn em tận tình để em hồn thành tốt đề tài Khơng dạy kiến thức chun ngành mà Cơ cịn chia sẻ cho em kinh nghiệm làm việc, dạy cách làm việc cho đạt hiệu cao Em xin chúc Cô khỏe mạnh, hạnh phúc đạt nhiều thành công sống Em gửi lời cảm ơn đến anh Bùi Thanh Tùng cựu sinh viên khóa 2015 cho em lời động viên, góp ý dẫn tận tình cho em kiến thức kinh nghiệm mà anh có qua nhiều năm tích lũy Và em muốn gửi lời cảm ơn đến bạn bè Những người bên cạnh giúp đỡ, động viên em gặp khó khăn Cuối em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ba mẹ Người sinh thành, nuôi nấng dạy dỗ em nên người, lo cho em để em có hội học hỏi tiếp xúc với sống Em xin chân thành cảm ơn! Mục Lục DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ i DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan loài Hydnophytum formicarum Jack 1.1.1 Tổng quan chi Hydnophytum 1.1.2 Mô tả thực vật 1.1.3 Phân bố .2 1.1.4 Giá trị kinh tế 1.1.5 Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .4 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 2.1.3 Hóa chất thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu .4 2.2.2 Phương pháp ngâm (Maceration) 2.2.3 Phương pháp cô lập hợp chất 2.2.4 Phương pháp xác định khả kháng oxy hóa 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng q trình trích ly đến chất lượng chế phẩm cao chiết 2.3.2 Khảo Sát quà trình điều chết cao phân đoạn 2.3.3 Khảo sát khả kháng oxy hóa PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát quy trình trích ly tạo cao chiết từ Bí Kì Nam .8 3.2 Kết 3.3 Kết khảo sát khả kháng oxi hóa sáu phân đoạn cao 1011 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1112 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1213 DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ Đ Hình 1:Hình ảnh trái Bí Kì Nam Hình 2:Cơ chế kháng oxi hóa Hình 3:Bản sắc kí hai phương pháp chiết .8 Hình 4:Bản sắc kí phân đoạn cao .9 Hình 1: hình Hình ảnh trái Bí Kì Nam Hình 2: Cơ chế kháng oxi hóa Hình 3:bản sắc kí hai phương pháp chiết Hình 4:bản sắc kí phân đoạn Hình 5:bản sắc kí phân đoạn Hình 6:bản sắc kí phân đoạn 10 Hình 7:bản sắc kí phân đoạn 10 Hình 8:bản sắc kí phân đoạn 10 Hình 9:bản sắc kí phân đoạn 11 YSơ đồ 1: Sơ đồ quy trình trích ly cao chiết từ Bí Kì Nam Sơ đồ 2:Sơ đồ quy trình chạy sắc kí cột cao phân đoạn Sơ đồ 1: Sơ đồ quy trình trích ly cao chiết từ Bí Kì Nam Sơ đồ 2:Sơ đồ quy trình chạy sắc kí cột cao phân đoạn DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng oxy hóa từ cao chiết Bảng 2:Kết thí nghiệm kháng oxi hóa phân đoạn cao 10 Bảng 1: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng oxy hóa từ cao chiết Bảng 2:kết thí nghiệm kháng oxi hóa phân đoạn cao .11 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CC Phương pháp sắc ký cột C Chlorofrom (CHCl3) DPPH Dimethyl sulfoxide H n-Hexan EA Ethyl acetate (EtOAc) Me Methyl (CH3OH) ppm Part Per Million ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xưa đến người biết đến cách sử dụng loài cỏ tự nhiên để chữa loại bệnh,nên thuốc quý lưu truyền nhiều dân gian,và đặc biệt vùng cao nguyên Tây Nguyên nơi có nhiều cánh rừng già với vơ số lồi dược liệu quý, đặc biệt Sâm Ngọc linh thảo dược quý, mang đến nhiều tác dụng tuyệt vời dành cho người sử dụng Nhiều người khơng ngại bỏ tiền trăm, chí tiền tỷ để mua cho thảo dược quý với mong muốn sức khỏe thân gia đình tốt lên Qua nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng cho thấy, Sâm Ngọc Linh có tác dụng bồi bổ thể, giảm stress, chống mệt mỏi, tăng cường sinh lực, phục hồi sức khỏe Đồng thời nghiên cứu khác cịn cho thấy Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng cường sức đề kháng, nâng cao hệ miễn dịch, chống suy nhược tốt.Sâm Ngọc Linh có hoạt tính tốt vậy, mơi trường khí hậu thổ nhưỡng Tây Nguyên góp phần làm cho thuốc có hợp chất sinh học có tác dụng kì diệu vậy,bên cạnh Sâm Ngọc Linh vùng Tây Nguyên cịn có nhiều loại thuốc có tác dụng tốt điển Bí Kì Nam thuốc để điều trị số bệnh bệnh gan,cải thiện chức thận,ung thư,hơn Bí Kì Nam loại tìm thấy nhiều vùng cao nguyên Tây Nguyên góp mặt nhiều phương thuốc bí truyền dân gian bà vùng Tây Nguyên Từ sở trên, đề tài : “Khảo sát khả kháng oxi hóa từ cao chiết Bí Kì Nam (Hydnophytum formicarum Jack) ” đề xuất nhằm xác định khả kháng oxi hóa từ cao chiết Bí Kì Nam (Hydnophytum formicarum Jack) Mục tiêu đề tài - Khảo sát khả kháng oxy hoá từ cao chiết Bí Kì Nam (Hydnophytum formicarum Jack) PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan loài Hydnophytum formicarum Jack 1.1.1 Tổng quan chi Hydnophytum Chi Hydnophytum chi epiphytic myrmecophytes có nguồn gốc từ Đông Nam Á 1.1.2 - Họ: Rubioideae - Chi: Hydnophytum - Lồi: Hydnophytum formicarum Jack Mơ tả thực vật Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.) thuộc chi Hydnophytum, họ Cà phê (Rubiaceae) Đây loài sống cộng sinh với kiến (cây kiến cộng sinh để sinh trưởng phát triển) Theo tác giả Phạm Hồng Hộ [1], Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.) cịn gọi Kỳ nam kiến, có dạng củ trơn, xám vàng vàng, có lỗ hang cho kiến ở, thân 2-4, trịn, khơng lơng Lá có phiến xoan ngược, dày, không lông, gân phụ mảng 8-10 cặp; cuống ngắn, bẹ thấp nhọn Hoa không cọng, trắng; vành có ống dài mm; tiểu nhụy Quả nhân cứng cam, ngọt, cao 5-7 mm, nhân 2, cao mm 1.1.3 Phân bố Ở nước ta, bí kỳ nam thường thấy mọc tỉnh phía nam,điển hình tình Tây Nguyên Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng, Đắk 1.1.4 Nông…[1] Giá trị kinh tế Hiện Bí Kì Nam chưa nhóm nghiên cứu,nghiên cứu nhiều thành phần hóa học hoạt tính sinh học Hình 1: Hhình ảnh trái Bí Kì Nam 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng q trình trích ly đến chất lượng chế phẩm cao chiết 2.3.1.1 Trích ly nhiệt độ bình thường trích ly nóng Bột trái khơ (2.5 kg) tiến hành ngâm với dung môi ethanol 96o với tỷ lệ 1:3 (w/v),tại chia làm hai trình trình thứ tiến hành trích ly nhiệt độ phịng 3h,q trình thứ hai tiến hành trích ly nhiệt độ 600c 3h Trong suốt thời gian ngâm, ngày khuấy lần nhằm giúp q trình trích ly hợp chất bột trái diễn thuận lợi Mỗi 3h , phần dịch trích ethanol lọc qua bơng gịn để loại bã đem cô quay bay dung môi áp suất để thu nhận phần cao trái Phần bã lại tiếp tục ngâm với dung môi ethanol (hoặc phần dung môi thu hồi trước đó) sau lại lọc thu phần dịch trích, quay thu nhận cao Sơ đồ 1: Sơ đồ quy trình trích ly cao chiết từ Bí Kì Nam Q trình trích ly hai phân phương pháp tính theo cơng thức : H= m2 ×100 m1 Trong : H hiệu suất trích ly M2 khối lượng sau trích ly M1 khối lượng trước trích ly 2.3.2 Khảo Sát quà trình điều chết cao phân đoạn Cao tổng ban đầu chia nhỏ phương pháp sắc ký cột silica gel (cột: 120 x ϕ cm) với hệ dung môi H:EA (100:0 – 0:100, v/v),EA:ME(100:0 – 0:100, v/v) Sau thu phân đoạn nhỏ ký hiệu từ cao phân đoạn – cao phân đoạn 6.Các dịch chiết cô quay chân không để loại dung môi thu cao chiết phân đoạn Cao tổng 240g Chạy cột sắc kí với hệ dung môi H:EA (100:0 – 0:100, v/v),EA:ME(100:0 – 0:100, v/v) Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Sơ đồ 2:Sơ đồ quy trình chạy sắc kí cột cao phân đoạn 2.3.3 Khảo sát khả kháng oxy hóa Cách tiến hành - Cân 7,88 mg DPPH🞄 định mức cồn 960 thành 100 ml Để ổn định tối 30 phút 40 0C Lúc DPPH🞄 có nồng độ 0,2 mM - Mẫu thử: pha mẫu thí nghiệm cồn 960, lắc cho mẫu tan hoàn toàn, pha thành dãy nồng độ từ 75- 200 g/ml Tiến hành cho ml mẫu thí nghiệm với ml DPPH🞄 (0,2 mM) Lắc đều, dung dịch mẫu Để yên mẫu tối 30 phút nhiệt độ phòng, tiến hành đo độ hấp thụ bước sóng 517 nm - Mẫu đối chứng: tiến hành tương tự mẫu thí nghiệm thay dung dịch vitamin C - Mẫu chuẩn: thay cồn - Mẫu trắng: gồm dung dịch ethanol DPPH🞄 (0,2 mM) - Thí nghiệm lặp lại lần, % ức chế giá trị trung bình lần lặp lại xử lý thống kê phần mềm Statgraphicplus 3.0 Sau chuẩn bị mẫu, tiến hành khảo sát khả ức chế gốc tự bảng bố trí thí nghiệm 1,các mẫu bơm vào giếng 96 lỗ đưa vào máy ELISA đọc kết giá trị mật độ quang 517 nm Bảng 1: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng oxy hóa từ cao chiết Nồng độ (µg/ ml) 25 50 75 Mẫu Thí Nghiệm Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn 12.5 100 A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 C3 C4 C5 D1 D2 D3 D4 D5 E1 E2 E3 E4 E5 F1 F2 F3 F4 F5 Khả kháng oxy hóa đánh giá giá trị IC50 Giá trị IC50 mẫu tính dựa phương pháp hồi quy từ đồ thị % ức chế gốc tự với nồng độ chất ức chế 10 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát quy trình trích ly tạo cao chiết từ Bí Kì Nam Kết chạy bảng sắc kí silica gel hai phương pháp trích ly nóng nguội hình : Hình 3:Bbản sắc kí hai phương pháp chiết Hai phương pháp trích ly nóng trích ly nhiệt độ bình thường thị kết hình Qua hình nhận thấy phương pháp trích ly nhiệt độ thường giữ đầy đủ hợp chất có hoạt tính sinh học phương pháp trích ly nóng.Vì phương pháp trích ly nóng có số hợp chất bị phân giải phần tác nhân nhiệt độ.Vì nhóm nghiên cứu chọn phương pháp trích ly nhiệt độ bình thường để giữ nguyên vẹn hợp chất có mẫu Hiệu suất trích ly hai q trình trích ly nóng nguội cho kết quả: - Trích ly nóng: 12% - Trích ly nguội: 8% Qua hiệu suất trích ly nhóm nghiên cứu đề nghị phương pháp trích ly nguội phương pháp có hiệu suất trích ly thấp khơng đáng kể so với phương pháp trích ly nóng giữ lại hầu hết hợp chất có cao chiết 11 3.2 Kết 12 Tổng lượng cao ban đầu (240g) sau chia nhỏ phương pháp sắc ký cột silica gel (cột: 120 x ϕ6 cm) với hệ dung môi H:EA (100:0 – 0:100,v/v), EA:Me (100:0 – 0:100,v/v) thu phân đoạn Hình 4:Bản sắc kí phân đoạn cao  Cao phân đoạn 1: 40.3212g  Hình 5:bản sắc kí phân đoạn  Cao phân đoạn 2:32.6132g 13 ... Nguyên Từ sở trên, đề tài : ? ?Khảo sát khả kháng oxi hóa từ cao chiết Bí Kì Nam (Hydnophytum formicarum Jack) ” đề xuất nhằm xác định khả kháng oxi hóa từ cao chiết Bí Kì Nam (Hydnophytum formicarum. .. 2.3.3 Khảo sát khả kháng oxy hóa PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát quy trình trích ly tạo cao chiết từ Bí Kì Nam .8 3.2 Kết 3.3 Kết khảo sát khả kháng. .. thầy em hồn thành xong thực tập tốt nghiệp với đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HÓA TỪ CAO CHIẾT BÍ KÌ NAM (HYDNOPHYTUM FORMICARUM JACK)? ?? Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến cô