Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tách chiết, tinh sạch và xác định Glucan từ tế bào nấm men Sacharomyces Cerevisiae

Phương pháp đếm bạch cầu được sử dụng dé khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích hệ thông miễn dịchbeta-glucan trên đối tượng là chuột trong khoảng thời gian 8 ngày với các ham lượng - Cá

TRỊNH THỤY HOÀNG LAN

TÁCH CHIET, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH

GLUCAN TU TE BAO NAM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hoc

Tp Hồ Chi Minh, tháng 12 năm 2009

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Hoang Quốc Khanh

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi và chữ ky)

Cán bộ chấm nhận xét l : TS 2111151515 1155 1215551511 11212111 rna

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi và chữ ky)

Cán bộ chấm nhận xét 2 : - 1 SH 2111151511 1111 1215515511 112111 na

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi và chữ ky)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐÔNG CHAM BẢO VỆ LUAN VĂN THAC SĨTRƯỜNG ĐẠI HOC BACH KHOA, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRINH THUY HOÀNG LAN Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 24/04/1984 Nơi sinh: TP.HCMChuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học MSHV: 03107115

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: Tháng 12/2009V-CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học ham, học vi, họ, tên): TS Hoang Quốc KhánhNội dung và dé cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN TRUỞNG KHOA QL NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) QUAN LY CHUYEN NGANH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ky)

luận nghiên cứu của minh Đây là thời điểm tốt dé tôi được bày tỏ lòng biết ơn đến

những người thân đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện bải luận

này.

Trước tiên tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thay, người hướngdẫn khoa học, định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận vănnày, TS Hoang Quốc Khánh Cảm ơn thay đã cho tôi những kiến thức để tôi có théđến với khoa học thật sự

Xin chân thành cảm ơn chị Bích Hanh, chị Mỹ Hang, em Tố Hong, em Lê

Thủy và các bạn đồng nghiệp ở Trung tâm Y Tế Dự Phòng Quận 3 Tp HCM đã tậntình giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

luận văn.

Con xin gửi lời cảm ơn đến chú Ba, anh Thanh đã giúp đỡ và dạy cho tôi

những bai học về cuộc sống, về tình người

Con xin cảm ơn gia đình, nơi có ba me, chi và em gái đã luôn hết sức thông

cảm va chia sẻ với con những khó khăn trong thời gian làm dé tai

Xin cảm ơn những người bạn thân yêu, những người đã yêu mến, chia sẻ với

tôi trong cuộc sống hăng ngày

Luận văn này là món quà mà tôi dành tặng cho tất cả mọi người thân yêu của

t61, với tat cả tâm lòng minh!

Thanh phô Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 12 năm 2009

Trịnh Thụy Hoàng Lan

TÓM TẮTĐề tài tập trung nghiên cứu, xây dựng quy trình tách chiết, tinh sạch và xác địnhhàm lượng beta-glucan ở tế bào nằm men Saccharomyces cerevisiae Đồng thời, thử

nghiệm trên chuột với các hàm lượng khác nhau để thây ảnh hưởng của beta-glucanđến hệ thông miễn dich ở chuột

Trong quá trình tách chiết, dung dịch kiềm, acid ở được sử dụng dé phân cắt va

hòa tan các thành phan trong tế bào như lipid, protein, chitin nhằm tinh sạch hơnsản phẩm beta-glucan thu nhận Trong quy trình, thiết bị đồng hóa tế bảo French Pressđược sử dụng với mục đích so sánh sản phẩm của hai quy trình tách chiết có và không

có xử lý nguồn nguyên liệu nắm men trước khi áp dụng quy trình Phương pháp đếm

bạch cầu được sử dụng dé khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích hệ thông miễn dịchbeta-glucan trên đối tượng là chuột trong khoảng thời gian 8 ngày với các ham lượng

- Các chi tiêu sinh hóa như hàm lượng cacbonhydrate, protein, tro,

lipid cho thây được mức độ tinh sạch ở hai mẫu sản phẩm

Thử nghiệm ảnh hưởng của beta-plucan trên hệ thống miễn dịch ở chuột thu

được kết quả là có sự dao động vẻ số lượng bach cau trên chuột vào ngày thứ 6 với

hàm lượng 6mg/ngay.

The thesis focuses on researching into the process of extracting, purifying andquantifying beta-glucan from baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae At the sametime, we performed study the effect of different quantity of beta-glucan on immunesystem on mice.

During extracting, alkali and acid are used to hydrolyse and solubilize lipid, thecellular protems, chitin to purify the production of beta-glucan from yeast cellwalls The high pressure homogenizer French Press was used and then the chemicalcomposition was compared between the homonized and non-homogenized products.Surveying the effect immunotheraphy glucan on mice after experiment in 8 days withdifferent quantity, the white blood cells were counted.

The comparative results of two sample products from extraction andpurification procedures with or without processing yeast cells are :

— Quality of beta-glucan in products by using the high pressurehomogenizer French Press was higher than that which did not used.— Analysis of chemical quantities such as cacbonhydrate, protein, lipid

and ash was shown the purify of products.After 8 investigated days the effect beta-glucan on mice, the white blood cellson the sixth day was higher than other the others.

MỤC LỤC

PHAN 1: MO ĐẦU S1 n1 SH HH ng ng yêu |PHẦN2: TONG QUAN S222 2n n1 HH1 ereye 32.1 SƠ LƯỢC DAC DIEM CHUNG CUA TE BAO NAM MEN 3

2.1.1 Phân Ï0qi SH HH HH 1n 1t nguyên 32.1.2 Hình thái - ST TH TH HH 1 t1 2a 3

2.1.3 Cấu trúc tẾ bào NAM H€H1 S2 S5 TT 121111 nnn HH Hee 4

2.2 KHÁI QUAT VE BETA-GLUCAN 2 5 c2 H202 re ryên 102.3 KHÁI QUÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ XÁCĐỊNH THÀNH PHAN TE BAO NAM MEN S0 SH re 12

2.3.1 Phương pháp tách chiễt, - 5 c1 1T HH HH trên 12

2.3.1.1 Thự phậj ST HE HH t1 HH ng ga 12

2.3.1.2 Xử lý bằng eHzVIH€ SE E1 1111211tererei 14

2.3.2 Phương php tinh SẠCỈI Q ĐG Q SH HS SH HS H HT Tnhh ki 17

2.3.3 Phương pháp xác định thành tẾ bào NGM MEN o5 Sccccceeererree 172.4 TONG QUAN VE CHAT KÍCH THÍCH MIEN DICH VA CƠ CHE TÁCDONG CUA B-GLUCAN ooicccccccccccsscscsssssssesseseesesuesuesesucserssreersresnssnsueacsatesevsneaneneaneans 182.4.1 Khái niệm về chất kích thích miễn dich o c.ccccccccccccccccscsscsssscssssvssesvesesveresveseees 182.4.2 Nguôn gốc các chất kích thích miễn dich c.cccccccccccccccccsccscescssesssssteveseseseeseeseees 192.4.3 Lợi ích khi dùng chất kích thích miễn dich c.c.cccccccccscccccscssescsscsseesesesseeseeseees 20

PHAN 3 : NGUYEN VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 VAT LIEU — THIẾT BỊ - HÓA CHẤTT 52 sS 21 522125111251 11215511x 5531 sEe2 22

BADD VG j nngg Ả 22

3.1.2 Các thiết bị chíÍnh 5 ST HE HH 1211k 22EnN 1i .nnn ẻeẶc adẢỶ 233.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55.5522 SE EEtereeg 243.2.1 Phương pháp tách chiết và tỉnh sạch befa-gÌucqn' cc¿ 243.2.2 Phương pháp xác định khối lượng chất khô .- 5 cccsrrereeerrres 283.2.3 Phương pháp định lượng đướng khử bằng 3,5-Dinitrosalycylic acid 28

3.2.4, Xác định hàm lượng ØÏJCOĐCGHH Q Q Q TS nnn SH S HH TH nga 3l3.2.5, Xác định hàm [WONG ØÏHCŒH à 2G Q cece cece ce S TH hen ưa 3l

3.2.6 Phương pháp xác định nito tổng số - Phương pháp Kjeldahiẳ 32

3.2.7, Phương pháp xác định ham lượng lipid — Phương pháp Soxhlet 343.2.8 Phương pháp xác định hàm [WONG EfO àẶ cect ĂẶ Si seẰi 35

3.2.9 Phương pháp bố trí thí nghiệm và thu nhận mẫu nuôi thí nghiệm 373.2.10 Phương pháp xác định số lượng bạch câu csccccicecrrreerrre 403.2.11 Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thong kê 5s ccc cseererrrre 41PHAN 4: KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 52.5 2222221121212 ESEEerrrei 424.1 DIEU CHE B-GLUCAN 52 5 S2 E221 1121121 T1 EEE tt Hee 424.1.1, Y7) 1 Nngg ẻ.ốốan.Ặa 434.1.2 Về hiệu suất điều chế s St TT TH Hxn Hee 454.2 ĐỊNH LƯỢNG DUONG KHU BẰNG 3,5-DINITROSALYCYLIC ACID.47

4.3 HAM LƯỢNG BETA — GLUCAN - S n S12 E122 tren 49

4.3.1 Hàm lượng ØÏJCOGII Q QC Q HS SHn HS ST n HT ng KT nhu 494.3.2 Hàm lượng befd-gÏHC(ŒH ĂẶ Q22 S ST nhe ưa 49

4.4 HAM LƯỢNG PROTEIN 5 221 121 122111 1T ng Hee 5]

4.5 HAM LƯỢNG LIPID S22 221112121 212E 1E 1c ng trời 534.6 HAM LƯỢNG TRO 0 1 1 22112121 11111 11t 2n HH re 554.7 KET QUA THEO DOT THÍ NGHIEM - 2.252 S22E121121251251125E 1x Exsee2 574.7.1 Quan sát hình thái té bào bạch COU ooo ccccccccccccccsesessescssssestssescsssesvesesestesesveees 574.7.2 SỐ lượng té bào bạch cau khi thử nghiệm beta-glucan trên chuột 58

PHAN 5: KET LUẬN VA DE NGHI oooeccccccccccccccscescsccscscssesescsenecsscesscanseeteteeteneeeans 61

5.1 „0609 ằằằ.ằ 6l5.2 DE NGAI 1 ằằẽẼẽẼẽẻằằ 61

DANH MỤC CÁC BANG

Bang 2.1 : Thanh phan thành tế bao nấm Men 5-52 2c 2E cE2EEEcrxrsre 5Bang 2.2 : Chức năng sinh lý của thành tế bào nắm MeN - 25c czcs+2 6

Bàng 2.3 : Các loại Br ØÏUCan L7 2 122201222 v SH n TH TH TH hen 10

Bang 3.1 : Hàm lượng beta-glucan được cung cấp cho chuột -s-=s: 38

Bang 4.1 : Nhận xét về mặt cảm quan của sản phẩm -5cccc+cccszzxsee2 45

Bang 4.2 : Hiệu suất điều chế sản pham - 5.252 St S2 SEE2E2EEEE2EEkrrrreei 45

Bảng 4.3 : Hàm lượng cacbonhydrate_ - . 2 222212221 Sssssssrrxei 47Bang 4.4 : Hàm lượng glycogen - - 2G 2202 22011212111 221 1112 11 H111 111k nếu 49Bảng 4.5 : Hàm lượng beta-plucan - - + - 22C 122211221112 2112111 se vea 50

Bang 4.6 : Ham lượng nitơ tổng ooo ccccccseesceseseescesesecsvsscsssersrvsnsevseeessetssevseansevsesens 31

Bang 4.7 : Hàm lượng lipid thô - 2c 2222 1222311223112 1118 111111118111 kea 53Bảng 4.8 : Hàm lượng tro 2L - c1 2212120121231 125111125111 211191111111 11H kg 55

Bang 4.9 : Số lượng bạch cầu khi thử nghiệm beta-glucan trên chuột _ 58

DANH MUC CAC HINH

Hình 2.1 : TẾ bao nằm men dưới kính hiỂn vi - -525252222222ccs2cxccrs 4

Hình 2.2 : Cau tạo nắm men ooeccccccccccccccccssscsesesesesesesesesesesssesesesesesessstsestsesesessseseseseseseseseees 4Hình 2.3 : Cấu trúc mạch befa-pÏuCan - 2 22 3221122 112 1111 1111811118111 ke 10

Hình 2.4 : Vị tri glucan trong vách tế bào s T SEEHH12121122 yeu 12Hình 3.1 : Thiết bi đồng hóa tế bào French Press_ 5-7cccszcecse 25

Hình 3.2 : Chuột Mus musculus được nuÔt -cc 222252222 rssrerre 38

Hình 3.3 : Cho chuột dùng thử nghiệm chế phẩm beta-glucan 39

Hình 3.4 : Lay máu đuôi chuột 2 SE EEEE21821115011E11210111121112 xe 40

Hình 4.1 : Sản phẩm beta-glucan của quy trình có xử lý tế bao nằm men qua thiết bi

đồng hóa S51 s2 1111 111117121111 111111111 1E 1H11 tt grgrrng 43

Hình 4.2 : Sản phẩm beta-glucan của quy trình không có xử lý tế bào nắm men qua

thiết bị đồng hóa - + n1 SE1 1222111111 2E TE HH TH grgeg 43Hình 4.3 : Sản phẩm beta-glucan (ở dạng bột) của quy trình có xử lý tế bao nằm menqua thiết bị đồng hóa_ - 2 5+ E13 E1 S11211 157 2171111101111 1E1EEE.EE net 44

Hình 4.4 : Sản phẩm beta-glucan (ở dạng bột) của quy trình không có xử lý tế bao

nấm men qua thiết bị đồng hóa _ - ¿2-5252 2EEEEEEEEEEE2E1212E111EEE112EEE2EEErrrrs 44

Hình 4.5 : Tế bào bạch cầu quan sát dưới kính hiển vi s2 nen ren 58

DANH MỤC CÁC ĐỎ THỊ

Đồ thị 4.1 : Đồ thị hàm lượng cacbonhydrate _ - 2-52 48Đồ thị 4.2 : Đồ thị hàm lượng beta-plÏucan _ - 22c s22 sec 50

Đồ thị 4.3 : Đồ thị hàm lượng DTOf€IT 2 2 2.1222 v SH sưe 52

Đồ thị 4.4 : D6 thị hàm lượng lipid thô - 52- 2 s2 EEEEEE2EEEE2EEEErEskrkerrreei 54

Đồ thị 4.5 : Đô thị hàm lượng tro_ -.-5 52252 CS E Ex EtEtteEgrrererryeg 56

Đồ thị 4.6 : Đồ thị biến thiên hàm lượng bạch cau theo thời gian 59

PHAN 1: MO DAUQuá trình sản xuất công nghiệp từ nắm men ngày cảng có giá trị quan trọngtrong đời sông, nhờ vào đặc tính sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein củachúng nên có thể tạo ra các sản phẩm đa dạng, số lượng lớn Như ứng dụng trongngành thực phẩm, nam men được sử dụng làm men nở bánh mi; lên men rượu, bia;sản xuất glycerol Trong nông nghiệp, nam men được sử dung để kiểm soát sinh học

trong quá trình thu hoạch trái cây

Ngoài những hướng sản xuất được áp dụng vào thực tiễn trên, nắm men cònđược dùng dé sản xuất ra beta-glucan, một polysaccharide không tan, với hai ứngdụng chính là tăng cường hệ thống miễn dịch và làm giảm lượng cholesterol trong

máu ở người và động vật Tuy nhiên, với hướng ứng dụng trên chỉ mới áp dụng trên

lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là ngành nuôi tôm, bởi ngành này tại Việt Namđang phải đối mặt với các dịch bệnh, gây ra tốn thất nặng né cho người nuôi trồngcũng như cho nên kinh tế Nhưng với thời gian gân đây, ngành công nghiệp thựcphẩm đang chú ý đến beta-glucan với lợi ích đã được chứng minh là chất cải thiện

những đặc tính thực phẩm như chất làm sệt dung dịch, hay chất ôn định Bên cạnh đó,

beta-glucan còn là nguồn thực phẩm có ít giá trị về mặt dinh dưỡng, thực phẩm khôngchứa calories, hữu ich cho sức khỏe, và thuận tiện trở thành mục tiêu ứng dụng nguôn

nguyên liệu mới này cho ngành thực phẩm Vì hiện nay, ngành công nghiệp thựcphẩm là một ngành công nghiệp cạnh tranh trong việc phát hiện nguồn nguyên liệu

mới với giá thành thấp, thêm vao đó người tiêu dùng quan tâm nhiều hơn đến nguônthực phẩm tự nhiên có lợi cho sức khỏe, như thực phẩm it calories, cholesterol thap

Với những lợi ich của beta-glucan nêu trên và với mục tiêu tim ra phương pháp

thích hợp dé thu nhận bước đâu ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành thực

hiện dé tài :

Tách chiết, tỉnh sạch và xác định

glucan từ nam men Saccharomyces cerevisiae.

PHẢN2: TONG QUAN2.1 SƠ LƯỢC ĐẶC DIEM CHUNG CUA TE BAO NAM MEN

2.1.1 Phân loại [10]

Phân loại khoa học :

Giới : NắmNgành : Nam túi

Phân ngành : Saccharomycotina

Lớp : SaccharomycetesBộ : SaccharomycetalesHọ : Saccharomycetaceae

Chi : SaccharomycesLoài : Saccharomyces cerevisiae

2.1.2 Hình thai [7]

Nắm men là thuộc cơ thể đơn bào, phân bố rộng rãi khắp nơi Tế bào nắm menthường lớn hơn gấp 10 lần so với vi khuẩn, loại nắm men nha máy rượu, nha máy biathường sử dụng là Saccharomyces cerevisiae có kích thước thay đổi trong khoảng

2,5-10 wm x 4,5-21 wm, do đó có thé thay rõ dưới kính hiển vi quang học.Hình dang của nắm men hau như không 6n định Tùy vào nắm men mà tế bảo cóhình cau, hình trứng, hình ovan, hình elip Ngoai ra, còn phụ thuộc vào điều kiện

nuôi cay và tuổi của nắm men Vi dụ : Saccharomyces cerevisiae có hình bầu dục nếuở trong môi trường có giau chất dinh dưỡng, còn trong điều kiện yếm khí thì nằm men

có hình tròn.

Có loài nắm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt, mà chỉ là

nhiều tê bao nôi với nhau thành chuối dài.

Hình 2.1 : Tê bao nam men dưới kính hiên vi

2.1.3 Cau trúc té bào nam men |7]Tê bào nam men, cũng như nhiêu loại tê bào khác, được câu tạo chủ yêu từ cácphân cơ bản như sau : thành tê bào, màng nguyên sinh chât, nhân, các cơ quan conkhác.

Hình 2.2 : Cấu tạo nắm men

Dac diém thành tê bào nâm men

Thanh tế bảo nam men khá day, chiếm 15-25% sinh khối khô của tế bảo, là điểm

đặc trưng nổi bật của tat cả nâm men Thanh phan cấu tạo chính của thành tế bao là

polysaccharide, chiếm khoảng 80-90% thành tế bao Thanh phân co bản gồm glucan,

mannan và chitin Nam men nhận năng lượng từ glucan của thanh tế bào Trong thành

tế bào nim men có cả £-1,6 và Ø-],3-plucan và được phân biệt bởi tinh chất hòa tancủa chúng trong acid hay kiềm Mannan là một phân tử có liên kết a -1,6 bên trongtâm liên kết với chuỗi øz-l,2 và øz-l,3 Con chitin là một polymer của N-acetylglucosamine, chiếm một lượng nhỏ trong S cerevisiae (khoảng 2-4%), là thànhphan chính ở seo mầm Một vài nắm men sợi (ví dụ như C albican) có chứa nhiều

chitin trong khi đó một số nắm men khác lại hoàn toàn không chứa chitin Thanh té

bào nam men chứa các thành phan khác như : protein, lipid va phosphate vô cơ.Thành phân hóa học của thành tế bào sẽ phụ thuộc vào chủng nắm men, vào tuổi của

té bào và điêu kiện phát trién.

Bang 2.1 : Thanh phan thành tế bào nâm men

` Tỉ lệThành phân Trọng lượng phân tử | % trọng lượng

phan tử(mức độ polymer hóa) trung bình (kDa) thành „

tương đôi

£-1,3-glucan (1500) 240 50 1,0£-1,6-glucan (150) 24 10 2

Mannoprotein 100 - 200 40 12-2,4

Chitin (120) 25 1-3 0,1 —0,3

Thành tế bao là một câu trúc phân lớp, vị tri ngoai cùng gồm nhiều

mannoprotein Chúng liên kết chéo với nhau bởi quá trình tương tác ky nước và câu

nối disulfua Các mannoprotein nay liên kết với glucan bên trong bằng liên kết cộnghóa trị Nhiều mannoprotein quan trọng trong việc xác định tính xốp của thành tế bàonam men Một vai #-glucan của thành bên trong liên kết chéo với chitin Ban thân

chitin là một thành phan lớn trong chéi sẹo khi nắm men nảy chôi va chitin tổng hop

nên isozyme, đóng vai tro là chia khóa hình thành và tạo hình vách ngăn.

Thành tế bào không chỉ đơn thuần là bộ xương ngoài trơ đóng vai trò bảo vệmàng sinh chất Trái lại, thành tế bào nắm men được coi như cơ thể sống mà chức

năng của nó thay đổi trong suốt quá trình trao đổi chất và phát triển ở nắm men S

cerevisiae |2,28]

Bảng 2.2 : Chức năng sinh lý của thành tế bào nắm men

Chức năng Chú thích

Bảo vệ cơ thé - Citing như bảo vệ thé nguyên sinh và duy trì

hình dạng tế bào nâm men

Ôn định thâm thấu - Sự di chuyển của thành tế bảo dẫn đến sự

tiêu thê nguyên sinh với sự có mặt của chât ôn

ølucanases) va hydrolase (ví du: invertase) thì

được giữ cố định trên chất nền của vách tế bào

Liên kết cation - Nhiều cation biết đến được cô lập có kết

quả bởi vách tế bào, bao gồm nhiêu kim loại nặng.Nhận biết tế bào — tế bao - Nhận biết vị trí của pheromone và các độc

tố giết năm trên vách tế bào

Dính chặt tê bào với tê bào - Su dính kêt giới tính nâm men — nam men,

sự kết bông, sự kết tụ là hiện tượng liên kết tê bào.Sự kết dính tế bảo nắm men — người thi trong hop

ở khả năng gây bệnh của một số loài (ví dụ:

rồi vận chuyền vào bên trong tế bảo chat

Y Mane té bào chấtMang tế bao chat day khoảng 7nm với một vài chỗ lõm vao trong tế bao chất.Cũng giống như các màng khác, màng tế bao chat được cấu tạo bởi lớp lipid kép kết

hợp với protein Thanh phan lipid chứa chủ yếu là phosphatidycholine,

phophadityl-ethanolamine va một lượng nhỏ phosphatidylinositol, phosphadityl-serine,

phophaditylglycerol, sterol (ergosterol va zymosterol) Mang protein nắm men có vaitrò bảo vệ nguyên sinh chat, enzyme tong hợp thành tế bào, điều hòa vận chuyển mộtcách chọn lọc các chất dinh dưỡng từ bên ngoài vào bên trong và bài tiết các thànhphân có hại cho cơ thể từ bên trong ra ngoài

Y Tế bào chátTế bảo chất của nâm men là một dung dịch keo, có tính acid (pH = 5,5), chứacác ion, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp và trung bình hoặc nhữnghop chất cao phân tử hòa tan (như enzyme, factor, glycogen) Những enzyme có mặt

trong tế bào chất chủ yếu gôm các enzyme tham gia chu trình đường phân, sinh tổng

hợp acid béo, protein.

v_ Nhân tế bàoNhân tế bào là cơ quan hình cầu có nhân thùy, đường kính khoảng 1,5 ym,được bao bọc bởi mảng nhân Lớp màng bao bọc cấu tạo từ 2 lớp có chứa các lễ nhỏđường kính 50-100 nm Nhân đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia tếbào, phân bảo và tạo chổi Đối lập với các eukaryote khác, mang nhân của nâm menkhông bị hòa tan trong suốt quá trình phân bào

Trong nhân có vùng chứa các thông tin di truyền, xuất hiện trong suốt quá trìnhphân bảo và sửa chữa sai sót trong quá trình sao chép, năm trong dịch nhân là DNAcùng với histone và non-histone trong chuỗi nhiễm sắc thẻ

Y Khong bào

Mỗi tế bào nắm men có một hoặc nhiều không bào Không bao chứa day dịch,

bên ngoài được bao bọc bởi lớp màng lypoprotem gọi là màng không bào Hình dạng

của màng không bào có thé thay đổi tùy theo độ tuôi và trạng thái sinh lý của tế bao

Không bảo là nơi chứa đựng các enzyme protease tham gia vào quá trình tự phân.Chức năng của không bào : chứa các enzyme tiêu hóa như endopeptidase,aminopeptidase, carboxypeptidase, tích trữ các acid amin, polyphosphate và các ion

kim loai can thiét, điều chỉnh su thâm thấu

- - Là chất dự trữ chứa các chất dự trữ dinh dưỡng của tế bào.

- Tham gia vảo việc điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bảo.- Lam nguồn năng lượng cho tế bào như polyphosphate của volutin dùng làm

nguông năng lượng cho quá trình sinh hóa học của tế bào, thông qua hệ

thống ATP Polyhosphate của volutin có thể tham gia vảo quá trình lên

men, hô hấp

⁄ Ty theLà những bao quan rat nhỏ năm trong tế bao chat, hình bầu dục, chiều rộng từ0,2 - 0,5 wm, chiều dài khoảng 0,4 - 1 zm Được cau tao từ protein, acid ribonucleicvà các hop chất phospho Ty thé gồm 3 lớp :

- Lop mảng ngoài : chứa các enzyme liên quan đến sự chuyền hóa lipid

- - Khoảng cách giữa các lớp nơi xảy ra các phản ứng tao ATP.

- _ Lớp màng trong : chứa các NADH va những thành phan của chuỗi hô hap

Ngoài ra, mạng ty thể còn chứa các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, chu

trình acid citric.

Chức năng : thực hiện phản ứng oxy hóa khử giải phóng điện tử, tham gia tổng

hợp ATP, tham gia giải phóng năng lượng từ ATP và chuyên chúng thành các dạngnăng lượng khác cung cấp cho tế bảo

Y kibosome

Ribosome của nắm men tôn tại hai loại :- _ Loại 80S gồm hai tiêu thé 40S và 60S, tôn tại trong nguyên sinh chat.- _ Loại 70S gồm hai tiểu thé 50S va 40S, chúng liên kết với cau trúc mang

và có khả năng tổng hợp mạnh.Chức năng của ribosome : tham gia vào quá trình tổng hợp protein ở tế bảo

2.2 KHÁI QUÁT VE BETA-GLUCAN [24]

Polysaccharide là một nhóm các polymer sinh học rất quan trọng Chúng baogdm một chuỗi dài các đơn vi đường lặp lại Một nhóm đặc biệt của các polyglucoseliên kết j-1,3 thường gọi là ”glucan” hoặc ”/-glucan” hiện diện nhiều trong vi

khuân, vi nâm, nâm ăn, tảo và thực vật.

Bang 2.3: Các loại Ø- glucan

Loại 7 - glucan Cau trúc Mô tảVi khuẩn B-1,3—glucan dang thăng (Curdlan)

: 8-l3-pglucan phan nhánh £-1,6Vi nâm [iti I |

ngan (Schizophyllan)

, £-1,3—glucan phan nhánh £-1,6 dai

Nam men _]} 4] ¬

(Beta glucan WGP, BetafectIn )

: B-1,3/ B-1,4-glucan (yên mạch, lúa

Ngũ côc

mi, lúa mạch den)

6 (1-3)-linked Branch

A.£ kì

+ 6 (1-3)-Iinked Backbone >

Hình 2.3 : Cấu trúc mach beta-glucan

Chúng được quan tâm đến vì được tính và có hoạt tính sinh học, như kích thích

miễn dịch, tính kháng viêm, kháng vi sinh vật, kháng lây lan, kháng virus, kháng u

bướu, giảm cholesterol, chống phóng xa, làm lành vết thương Tác dụng của D-glucan chưa được biết đến day đủ và có thé phụ thuộc vao cấu trúc phân tử đặc biệt(do trọng lượng phân tử, tính chất phân nhánh quyết định)

Ø-1,3-Nguồn quan trọng cung cấp #-1,3-D-glucan là thành tế bào nắm men Nammen là vi nắm đơn bào được dùng làm bánh mì hay sản xuất ethanol từ rất lâu Một sốnhà máy sản xuất dịch chiết nắm men dùng phương pháp tự phân có kèm enzyme haymáy móc để tách phan nội bào và ngoại bào Phan bên trong tế bao được cô lập dùngcho chất phụ gia thực phẩm do có chứa nhiều protein va nucleotide Còn phan ngoạibào, thành tế bào đang được sử dụng với mục đích phi thương mại như chất bổ sungđể nuôi động vật, do dây là nguồn nguyên liệu thô rẻ và cho nhiều glucan nên rất lýtưởng để sản xuất

Năm 1073, Manners đã tim thay sự hiện diện của 2 glucan khác nhau trong váchtế bao nắm men: beta-1,3-D glucan 3% chứa liên kết beta-1,6- glucosidic (85%) va

beta-1,6-D glucan it hon gọi là pustulan với các nhánh beta-1,3-glucosidic (15%).

Dé phân biệt #-glucan với polysacchride khác (tinh bột, glycogen, dextrin )thông qua các dạng liên kết của các phân tir glucose Các liên kết (1,4-) được tim thaytrong các chuỗi chính của beta-glucan với các chuỗi phụ liên kết (1,6-) Khác với hìnhdáng cau tạo theo đường thăng của các polysaccharide thông thường, beta-glucan théhiện cấu trúc xoắn đặc trưng do sự tồn tại các dang liên kết duy nhất và các liên kết

hydrogen nội phân tử Hình dáng cấu trúc đặc trưng này có thể được nhận biết bởi hệ

thống miễn dịch ở động vật, và có thể kích thích hệ thống này thông qua nó

=a fl

Ụ Amorphous 2

6Ø eal sian polysaccharide Chitin Protein Transmembrane

anchored (::1,3glucan, gatactomannan} (tiger

proteins (glucan-, chitin synthase)

Yeast Cell Wall

sĩ s 7

xảy vấtA >

| Mannoprotein

Hinh 2.4 : Vi tri glucan trong vach té bao2.3 KHÁI QUAT CÁC PHƯƠNG PHAP TÁCH CHIET, TINH SẠCH VAXÁC ĐỊNH THÀNH PHAN TE BAO NAM MEN

2.3.1 Phương pháp tách chiếtCó hai phương pháp để thủy phân thành tế bào nắm men : tự phân và xử lý băng

enzyme.

2.3.1.1 Tự phân (14,26,27]

Quá trình tự phân là quá trình phá vỡ hoặc bẻ gãy tế bao nắm men Sự phá vỡcủa tế bào nâm men thông qua quá trình này là một ứng dụng quan trọng trong việc

sản xuất dịch chiết nằm men ở nên công nghiệp thực phẩm Một số tác nhân lý, hóa,sinh quan trọng sau ảnh hưởng đến sự phá vỡ tế bào nắm men.

Y Tác nhân vật lý :

Tế bào nắm men sẽ bị vỡ nếu chúng phải chịu đựng với nhiệt độ quá cao hoặcquá thấp, phóng xạ ion hóa, áp suất thủy tĩnh va áp suất thâm thấu cao Các tế baonam men chết khi các phản ứng sinh lý của tế bao (phản ứng có enzyme hoặc khôngcó enzyme) không đủ để chồng lại những hư hại của tế bao dẫn đến gây ức chế về mặt

vật lý.

¥ Tác nhân hóa học :

Có nhiều phản ứng hóa học và phản ứng sinh hóa xảy ra bên ngoài và bên trongdẫn đến sự phá vỡ tế bào Những tác nhân bên ngoài gây chết tế bảo bao gôm : cáchợp chất hữu cơ độc, pH không bình thường, thiếu chất dinh dưỡng, các nhóm oxy tự

do, kim loại nặng những tác nhân hóa học bên trong như : ethanol được sinh ratrong nội bào.

¥ Tác nhân sinh hoc:

Nhiều tác nhân bên trong và bên ngoài dẫn đến sự phá vỡ tế bao nắm men Cáctác nhân bên trong như : những diễn biến về sinh lý, di truyền, hình thái, sinh thái diễnra trong tế bào đều dẫn đến sự tự gây chết của chúng Đối với các phản ứng sinh hóa,sự tự phân nắm men có thé được xem như sự tự hủy của tế bào khi tế bào lay di chatdinh dưỡng hoặc khi su đồng hóa dừng nhưng di hóa van tiếp tục xảy ra Sự tự phânxảy ra khi protease thủy phân trong không bào phân hủy chất nguyên sinh và cácenzyme cacbohydrate thủy phân vách tế bào Những enzyme thủy phân vách tế bàobao gôm : glucanase, chitinase, mannose Trong san xuất việc sử dụng nhiệt độ caovừa phải, muối hoặc các dung môi lipid làm tăng các hoạt tính của enzyme tựphân Khi thêm vào các enzyme thủy phân (ví dụ như papain) có thé hỗ trợ cho việc

phá vỡ vách tê bào nâm men.

2.3.1.2 Xử lý bằng enzyme [3]

Khái quát chung

Enzyme hay còn gọi là men, là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein

Enzyme có trong tế bào của mọi co thé sinh vật Enzyme không những làm chat xúctác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thé sinh vật (phản ứng củacác quá trình trao đối chất trong tế bao cơ thé sống, ‘in vivo’) ma còn xúc tác cácphan ứng ngoài té bao “in vitro’ Vì có nguôn gốc từ vi sinh vật nên enzyme còn đượcgọi là chất xúc tác sinh học nhăm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác

Tính ưu việt của enzvme

* Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện ”nhẹ nhàng ”, nhiệt độ từ

30-35°C với áp suất thông thường, pH thường là acid yếu, kiểm yếu hay trung

chuyển hóa một lượng lớn cơ chat, trong khoảng thời gian ngắn.Nguôn nguyên liệu thu nhận enzyme

Nguyên liệu thu nhận enzyme thường là tế bào thực vật mô động vật, va vi sinh

vật Tuy nhiên, việc khai thác enzyme từ thực vật và động vật thường gặp khó khăn vì

nguôn nguyên liệu thu nhận hạn chế, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao, nên hiện

nay phân lớn các enzyme được thu nhận từ các tế bào vi sinh vật So với việc thu nhậnenzyme từ các nguồn động vật, thực vật thì việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có

những ưu điềm sau :

- - Vị sinh vật có tốc độ sinh sản cao, sinh trưởng và phát triển mạnh, vivậy tốc độ tổng hợp enzyme cũng rất cao.

- Hé enzyme cua vi sinh vật vô cùng phong phú va có hoạt tính khá cao.

- _ Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chung vi sinh vat có khanăng tong hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện dé dang

trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường vi sinh vật là

rat cao.- Visinh vật không đòi hỏi nghiên cứu nghiêm ngặt về môi trường dinh

dưỡng nên có thé tận dụng những phế liệu công nông nghiệp dé sản xuấtenzyme từ vi sinh vật và có thé dé dang điều khiến các yếu tố ảnhhưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu nhận được hiệu suất cao

trong sản xuất

- San xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thé thực hiện theo qu1 mô

công nghiệp, hiệu quả kinh tế cao hơn so với cách sản xuất enzyme từ

động vật, thực vật.

Tóm lại, vi sinh vật vô cùng nhỏ bé nhưng về phương diện khai thác enzyme lạivượt xa động vật và thực vật Hiện nay, người ta đã sản xuất được hàng trăm loạienzyme khác nhau băng phương pháp tông hợp nhờ vi sinh vật

Phương pháp thu nhận enzvme

Thu nhận chế phẩm enzyme tỉnh khiết là một quá trình gồm nhiều giai đoạn : thu

nhận, tách chiết, tinh sạch dé loại bỏ các tạp chat không cần thiết nhưng vẫn giữ đượchoạt tính của enzyme, việc nay phụ thuộc rất nhiều vào các tính chất lý hóa của

enzyme cũng như nguồn liệu để thu nhận Do đó, cần một sơ đồ tinh sạch enzyme

đúng đăn, trước tiên cân quan tâm đên một sô tính chât cơ bản của enzyme như : hoạt

tính và độ 6n định của enzyme đối với pH, nhiệt độ, lực 1on, tính hòa tan và tính bềnvững trong các dung môi hữu cơ, trong dung dịch muối

Hiện nay về cơ bản người ta thường dùng các phương pháp cơ bản sau để thuĐối với enzyme ngoại bảo, người ta chỉ việc loại bỏ xác tế bào băng phương

pháp lọc hoặc ly tâm, phan dịch thu được dùng dé tinh sạch enzyme gọi là dung dich

enzyme thô Đôi với enzyme nội bảo thì việc đầu tiên cần phá vỡ màng tế bảo băng

một số phương pháp sau :

- Phuong pháp co học : nghiền- Phuong pháp vật lý : sử dụng nhiệt, áp suất thấm thâu, làm lạnh nhanh,

sóng siêu âm, 1on hóa.

- Phuong pháp hóa học : sử dụng các loại acid, kiểm, mudi, dung môi hữucơ, chất hoạt động bề mặt

- Phuong pháp enzyme va sinh học : sử dụng enzyme dé phá hủy mảng tế

bào (như dùng lyzozyme, dich ốc sên Helix pomatia), Đối với tế bao động vật, thực vật có thé dùng phương pháp nghiền cơ học dé phávỡ màng tế bào một cách dễ dàng, nhưng với những tế bào vi sinh vật phải sử dụngcác phương pháp lý hóa học khác nhau vì vách tế bảo của chúng rất bền vững, ở mộtvai chủng vi sinh vật vách tế bào của chúng có thé so sánh với độ bên của thép Trongmột số trường hợp để tăng khả năng phá vỡ mảng tế bảo người ta nghiên với bột thủy

tinh hay cát trắng tinh sạch

Sau khi phá vỡ vách tế bào, các enzyme được chiết rút ra băng nước, dung dịch

đệm thích hợp hay dung dich NaCl 1-3% ta thu được dung dịch enzyme thô [9,20]

2.3.2 Phương pháp tỉnh sạch |6]

Tình sạch protein là bước cần thiết, nhưng thường chỉ được thực hiện với nhữngprotein có giá trị cao, và quá trình tinh sạch quyết định đến sự chọn lựa kỹ thuật phântách, vì một số kỹ thuật gặp nhiều khó khăn khi tiến hành trên quy mô lớn

Sau khi phá vỡ tế bảo, quá trình phân tách vật răn ra khỏi chất lỏng là hoạt độngcơ bản rất quan trọng, và thường được tiến hành băng phương pháp ly tâm hoặc lọc

Ly tâm mẻ : thích hợp với các dung tích ly tâm trong khoảng nhỏ hơn ImL đếnmột vài lít, và có khả năng sử dụng một lực ly tâm tương đối lên đến 100.000 xg Tuynhiên, loại bỏ các tế bao vi khuẩn, mảnh vỡ tế bào và các kết tủa protein thì lực ly tâmchỉ cân đạt khoảng 20.000 xg

Ly tâm dòng chảy liên tục : thường được dùng cho qua trình tinh sạch protein ở

quy mô lớn để loại bỏ các chất dạng hạt Có ba kiểu ly tâm chính thích hợp là : ly tâm

thùng rỗng, ly tâm thùng có nhiều buông hoặc đĩa, và ly tâm thúng

Lọc bằng màng : là phương pháp để gạn dịch chiết tế bào Tuy nhiên, dịch nuôicay vi sinh vật và các dich chiết có khuynh hướng trở thành dạng sệt nên lọc sẽ gặpnhiều khó khăn khi lọc băng cách phương pháo truyền thống, trừ khi diện tích mànglọc được sử dụng là rất lớn Khắc phục nhược điểm này băng cách dùng phương pháplọc dòng chảy ngang hoặc tiếp tuyến Trong phương pháp này dịch chiết chảy ở gócphải theo hướng lọc, và sử dụng tốc độ dòng chảy cao sẽ có khuynh hướng giảm sựtắc nghẽn băng các hoạt động tự làm sạch

2.3.3 Phương pháp xác định thành tế bào nắm men |6]Các phương pháp sac ky là các kỹ thuật phân tách các thành phan khác nhau củahỗn hop, và có thé xác định được hàm lượng riêng của các thành phan Các kỹ thuậtphân tach băng sắc ký được sử dụng pho biến, bao gồm :

Sắc ký tương tác ky nước : các protein lần lượt được phân tách ra tùy theo tương

tác của chung vói nhóm chat mang có chứa các nhóm ky nước (ưa béo) Cac protein

chứa các nhóm ky nước trên bề mat, chất mang ky nước va dung môi ua nước taothành một hệ ba thành phân và tương tác được với nhau Các tương tác sẽ mạnh nếu tatăng lực ion Cac protein sé bi giữ lại và được rửa giải một cách chọn lọc băng cách

giảm lực ion hoặc bằng cách giảm độ phân cực của dung môi rửa

Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC): phương pháp phân tách các chấtbang cách dùng áp suất cao dé day nhanh dung dịch qua cột sắc ký với hiệu suất cao

Bên cạnh đó, còn các phương pháp hóa học thông thường để xác định hàm lượngcác thành phan có trong thành tế bào nắm men

2.4 TONG QUAN VE CHAT KÍCH THÍCH MIEN DICH VA CƠ CHE TÁCDONG CUA £-GLUCAN

2.4.1 Khái niệm về chất kích thích miễn dich [23]

Các chất kích thích miễn dịch là các chất hóa học hoạt hóa tế bào bạch cầu

(white blood cells - leukocytes) Các chất như thé làm cho động vật có sức dé khángtốt hơn đối với các bệnh lây lan va làm giảm thiệt hại do bùng phát bệnh nêu nhưđược quản ly tốt ngay từ ban dau

Nhóm chat kích thích triển vọng nhất là £-1,3/8-1,6—glucan, bởi vì chúng có

câu trúc hóa học xác định và mô hình hoạt động lên hệ miễn dịch, được mô tả trongnhiều bài báo khoa học Hơn nữa, đØ-l1,3//-1,6—-plucan không độc, hoạt hóa hệ miễndịch thông qua bộ máy cơ bản giống nhau đối với tat cả các nhóm ngành động vật chođến con người Ø -1,3/ Ø -1,6—glucan không chỉ có hoạt tính khi được tiêm, ma còn cóhoạt tính khi cung cấp qua đường tiêu hd, hoặc trên các bé mặt niêm mạc

Các chất kích thích miễn dich là những hop chat hóa học hoạt hóa tế bao bach

cầu, vì thế làm cho động vật kháng lại các tác nhân xâm nhiễm như virus, vi khuẩn,nam và ký sinh trùng Các chat kích thích miễn dịch cũng hoạt động chồng lại bệnhung thư ở người do chúng hoạt hóa tế bao bạch cau nhận biết và phá hủy tế bào ung

thư Trong suốt quá trình tiến hóa, động vật phát triển các bộ máy phát hiện cấu trúchóa học đặc trưng cho các vi sinh vật gây hại và sử dụng những cấu trúc này nhưnhững tín hiệu báo động cho sự phòng vệ chống lại quá trình xâm nhiễm Trong sựhiện diện của các tín hiệu hóa học như thế, hệ miễn dịch sẽ được đáp ứng như đượcthử thách bởi một vi sinh vật có thể gây bệnh Vì thế, khi cung cấp chất kích thíchmiễn dịch đối với một tác nhân gây bệnh cho vật nuôi, có thé làm tăng cường hangrao phòng vệ của vật nuôi va vi thé cung cấp sự bảo vệ chống lại một sự xâm nhiễmgây chết.

2.4.2 Nguôn gốc các chất kích thích miễn dịch [23]Hau hết các chat đều tôn tại dưới dạng các yếu tố phân tử cau trúc của vi khuẩn,

nấm sợi và nam men Tuy nhiên, cũng có một vai hợp chất hoản toàn được tổng hopnhân tạo cho những mục đích khác nhau, và phát hiện được đặc tính kích thích miễn

dich.

Ban chất hóa học va mô hình hoạt động của nhiều chất kích thích miễn dịch

khác nhau được mô tả trong bài báo của Raa, 1996 Và được nhóm lại như sau :

- Cac yếu tố cau trúc của vi khuẩn (lipopolysaccharide (LPS), lipopeptide,

các glycoprotein vỏ (capsular glycoprotein) và muramylpeptide)

- Cac sản phẩm j-1,3 — glucan khác nhau từ vi khuẩn (curdlan) va nam sợi

(krestin, lentinan, schizophyllan, scleroglucan, )

- £-1,3/B-1,6—-glucan từ vách tế bào nấm men bánh mi (macrogard,

- _ Các sản phẩm tông hợp (bestatin, muramylpeptide, )Các chất kích thích miễn dịch nay thường được xác định thông qua kha năng củachúng hoạt hóa tế bào bạch cầu trong điều kiện in vitro Tuy nhiên, các thí nghiệmnhư thế cung cấp ít thông tin về ảnh hưởng của một số chất kích thích miễn dịch lêntoàn bộ cơ thé Các thí nghiệm đối với sinh vật sống đòi hỏi phải thé hiện hiệu quatoàn diện của một chất kích thích miễn dịch.

Ø-1.3 — glucan được tim thấy trong nắm soi và nắm men, khác các chất kíchthích miễn dịch có nguồn gốc từ vi khuẩn về mặt cấu trúc hóa học và mô hình hoạtđộng Các sản phẩm này về mô hình hoạt động rất thích hợp sử dụng vì những hiệuquả chung cao, theo một quy luật nhất định Ø-1,3 — glucan có thé được xác định kháchính xác về mặt cấu trúc hóa học và mô hình hoạt động của chúng đối với hệ miễndich là rat đặc hiệu và được thé hiện chi tiết Hơn nữa, các nghiên cứu chỉ ra rang Ø-1,3 — glucan tăng cường sức khỏe, khả năng tăng trưởng và hình dạng tổng quan củanhiều động vật khác nhau Vì /-1,3 — glucan có hoạt tính khi hấp thụ qua thức ăn, cónhiều ứng dụng thực tế của sản phẩm này trong lĩnh vực mỹ phẩm và lĩnh vực sứckhỏe từ sản phẩm đang phát triển nhanh chóng

2.4.3 Lợi ích khi dùng chất kích thích miễn dịch [23]Các chất kích thích miễn dịch được sử dụng ngày nay ở cả hai lĩnh vực nuôitrồng thủy sản và nuôi động vật theo truyền thống nhăm giảm bớt tỉ lệ chết do nhiễmvà tăng cường biéu hiện tong quan của vật nuôi

Y Giảm tỉ lệ chết do các mầm bệnh cơ hộiCác mâm bệnh gây chết vật nuôi khi kí chủ bị suy yếu thông qua các điều kiệnmội trường bat lợi Các vi sinh vật như thế làm giảm biểu hiện chung của vật nuôithậm chí khi các điều kiện môi trường và thức ăn tốt, và vật nuôi không biểu hiện mộtdấu hiệu bệnh lâm sàng nào Các chất kích thích miễn dịch làm tăng cường các bộ

máy phòng vệ chống lại sự xâm nhiễm của các mầm bệnh cơ hội va vì thế làm tăng

cường năng suất và sự tăng trưởng, làm giảm tỉ lệ chết của vật nuôi

Y Ngăn ngừa các bệnh do virus

Phát triển các vaccine chồng lại các bệnh do virus đòi hỏi nhiều thời gian va tiénbac, va thuc té khong thé tạo ra các sản phẩm hiệu quả chống lại một lượng lớn cácvirus khác nhau hiện đang tac động đến nhiều vật nuôi khác nhau Vì thé, chién luoclam giảm ton thương của các bệnh là kết hop chăm sóc tốt với việc dùng các chat kích

thích miễn dịch làm tăng cường tính kháng bệnh của vật nuôi

Mô hình hoạt động của #-1,3 — glucan ở đông vật có xương sống

Ø-1,3/1,6 — glucan kết hợp đặc hiệu với một “phân tử receptor” trên bề mặt của

các thực bào (tế bao bach câu) Receptor của /j-1,3/1,6 — glucan được giữ lại trongsuốt quá trình tiến hóa và được tìm thấy ở tất cả các nhóm động vật cho đến con

người Khi recerptor này kết hợp j-1,3/1,6 — glucan, các té bào nay trở nên có hoạttính hơn đối với quá trình “nhận chìm”, giết chết và tiêu hủy vi khuẩn, cùng lúc đó

các tế bảo này tiết ra các phân tử tín hiệu (cytokine) kích thích quá trình hình thànhcác tế bào bạch cầu mới Ở các động vật có hệ miễn dịch đặc hiệu bên cạnh hệ miễn

dịch không đặc hiệu, các thực bao được hoạt hóa này sản sinh các cytoine hoạt hóa

các tế bao bạch cau sinh kháng thể (tế bảo Bv và T) Vi thé, ø-1,3/1,6 — glucan tácđộng đến nhiều quá trình sinh học khác nhau, bao gồm không chỉ việc kháng bệnh,ma còn tăng trưởng, làm lành vết thương, sữa chữa các tế bảo bị tôn thương

PHẢN 3 : NGUYÊN VẬT LIỆU VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 VAT LIEU — THIET BỊ - HOA CHAT

3.1.1 Vật liệu

- Nam men bánh mì Saccharomyces cerevisiae được cung cấp bởi công ty

men thực phẩm Mauri La Nga

Y Độ ẩm (%) : <= 6.0Tý lệ men sông (%) : >= 75Khả năng chịu cồn : 10 -16%

Nhiệt độ bảo quản : 20 — 28°C

Màu : nâu vàng nhạt

S NN Á Mùi : đặc trưng của nâm men.

v Thành phân : chỉ có tê bào nâm men, không có các phụ gia khác

- _ Chuột nhat trăng Mus musculus

- May Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo

- Thiết bị đồng nhất tế bảo French Press của hãng Thermo Electron

Coporation.

3.1.3 Hóa chất :

- Sodium potassium tartrate- Dhinitrosalicylic acid- NaOH 2M

- Cén 80”- Cổn 90°

- Enzyme amyloglucosidase- Acetate 0.2M 0 pH 4.2- H,SO, đậm đặc

- NaOH 32%.- HCI0,25N

- HCIIN

- Natri citrate 5%- Acid acetic 3%- Acid boric 4%- Aceton

- _ NazSO¿ khan nước hay cát sạch

- Ete etyl hay ete dầu hỏa

- HNO; đậm đặc, H;O; 30%

- Chat xúc tác: Là hỗn hop của 60 g selenium + 75 g CuSO, + 865 g

K›;SO¿.

- H6n hợp chat chỉ thị màu:

+- Hoa tan 0,264 g methyl đỏ trong 250 ml côn tuyệt đối+ Hoa tan 1,28 g bromocresol blue trong 50 ml côn tuyệt đối

+ Tron đều 2 dung dich trên , bồ sung 96 ml HCl 0,25N Bồ sung

đến một lít băng côn tuyệt đối.3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

3.2.1 Phương pháp tách chiết và tỉnh sạch beta-glucan

Phương pháp

Theo kết quả nghiên cứu của TS Hoàng Quốc Khánh và Phan Thị Thúy Phượng(Khảo sát các phương pháp thủy phân t bào nắm men và phân tích thành phancacbohydrate và protein, 2005) đã đưa ra kết luận : phương pháp thủy phân tế baonam men băng NaOH cho hàm lượng cacbohydrate cao nhất Điều kiện tối ưu chophương pháp này là thủy phân trong 1 giờ ở 90°C với nồng độ NaOH IM Như vậy,phương pháp này có thé được thay đối có cải tiến để thu nhận j-glucan trong bai

nghiên cứu này.

Nguyên tắc hoạt động của thiết bị đồng hóa tế bào :Nguyên liệu tế bao đã đông lạnh được đây qua một lỗ hep ở áp suất cao và mộtnhiệt độ thoát ra ngoài khoảng -20°C Các tế bao được làm lạnh và huyền phù trongdung dịch trước khi đưa vào trong thiết bị

Hình 3.1: Thiết bị đồng hóa tế bao French Press

Thực hiện

Khảo sát hai quy trình tách chiết khi có và không có xử lý tế bảo nắm men bánh

mì băng thiết bị đồng nhất French Press

Quy trình 1 : Quy trình có xử lý tế bào nắm men băng thiết bị đồng hóa

Thiết bị đồng hóa : French Press discrupter (hãng Thermo Electron Coporation),

cell pressure : 30000, Gauge Pressure (Piston 1” Dia) :1900

Huyén phù nâm men trong nước (15%)

ụGiữ lạnh ở 4°C trong 3h

Quy trình 2 : Quy trình không có xử lý tế bao nam men bang thiết bị đồng hóa

Huyện phù nâm men trong dung dịch NaOH 1M (1:5(w/v))

Mau nguyên liệu va mẫu sản phẩm của hai quy trình trên, dem phân tích được ký

hiệu như sau :

Mau | : nguyên liệu

Mẫu 2 : sản phẩm B-glucan sấy khô của quá trình tế bao nắm men có xử ly quathiết bị đông hóa

Mau 3 : sản phẩm B-glucan say khô của quá trình tế bao nấm men không có xửlý qua thiết bị đồng hóa

3.2.2 Phương pháp xúc định khối lượng chất khô [1]Trong thành phần câu tạo của tế bào, mô, cơ quan, nước ton tại dưới dang tự dovà liên kết với một tỉ lệ lớn so với một số hợp chất hữu cơ khác Vì thế, để xác định

chính xác hàm lượng protein, saccharide, lipid trong nguyên liệu, cần xác định

hàm lượng của chúng có trong nguyên liệu khô tuyệt đối

Thực hiện :

Xác định khối lượng vỏ hộp khô tuyệt đối : sấy hộp ở nhiệt độ 105°C trong 3

giờ, dé nguội trong bình hut âm, cân, xác định được khối lượng vỏ hộp khô tuyệt đối

Xác định được khối lượng vỏ hộp khô tuyệt đối của mẫu : cho 3g mẫu (vách tếbao nắm men) vào hộp, đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ : 50 — 60°C trong 30 phút Sau đónâng dan nhiệt độ đến 105°C và sấy trong 6 giờ Dé nguội hộp trong bình hút âm, cân.Tiếp tục sây thêm 1 giờ ở nhiệt độ 105°C, dé ngudi trong binh hut am, can Néu khéilượng hộp có chứa mẫu không thay đổi, chứng tỏ mẫu khô tuyệt đối

3.2.3 Phương pháp định lượng đướng khử bằng 3,5-Dinitrosalycylic acid [8]Nguyên tắc phản ứng :

Có một vài tác nhân được sử dụng để định lượng đường nhờ các đặc tính khửcủa đường 3,5 — dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị

khử thành acid 3 — amino — 5 — nitrosalicylic có màu vàng đỏ cam.