Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http //www lrc tnu edu vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÝ THỊ BÍCH THỦY THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu dƣới tơi nhóm cộng nghiên cứu phịng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201… Học viên Trần Thị Mai Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lý Thị Bích Thủy – Nghiên cứu viên phịng Sinh hóa thực vật – Viên Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn tạo điều kiện kinh phí, hóa chất thiết bị suốt thời gian tơi thực luận văn phịng Tơi xin chân thành cảm ơn CN Đoàn Hữu Thanh chú, anh chị cán phịng Sinh hóa thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến q báu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh thầy cô giáo nhà trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, thầy cô Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập Tôi xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) cung cấp kinh phí để chúng tơi thực nghiên cứu đề tài mã số 106-NN.02-2013.57 Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ngƣời ln bên tơi, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập thực luận văn Bằng lịng biết ơn sâu sắc tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201… Học viên Trần Thị Mai Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích µg Micro gram µM Micromol µl Microlit AdR Adrenodoxin reductase Adx Adrenodoxin APS Amonium persulphate bp Base pair CYP Cytochrome P450 CPR Cytochrcome P450 reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate FAD Flavin adenin dinucleotid Fdx Ferredoxin FdR Ferredoxin reductase Fldx Flavodoxin FMN Flavin mononucleotide GCMS Gas chromatography mass spectometry HPLC High pressure liquid chromatography IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton KppG Kali phosphate glycerol LB Lysogeny broth Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn NMR Nuclear Magnetic Resonance NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PCB Polychlorinate biphenyl PCR Polymerase chain reaction SDS – PAGE Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis TB Terrific Broth TLC Thin layer chromatography v/p Vòng/phút Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC .V DANH MỤC CÁC HÌNH VII DANH MỤC CÁC BẢNG IX MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytochrome P450 1.1.1 Định nghĩa phân loại 1.1.2 Cấu trúc cytochrome P450 1.1.3 Cơ chế xúc tác cytochrome P450 1.1.4 Ứng dụng cytochrome P450 1.2 Nghiên cứu CYP264B1 10 1.3 Hợp chất sesquiterpene 13 1.3.1 Định nghĩa nguồn gốc 13 1.3.2 Phân loại sesquiterpene 13 1.3.3 Vai trò ứng dụng sesquiterpene 15 1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa hệ thống cytochrome P450 16 1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene giới Việt Nam 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 21 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.4 Dung dịch đệm 22 2.1.5 Môi trƣờng 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Nuôi cấy E.coli 24 2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli phƣơng pháp sốc Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn nhiệt 24 2.2.3 Kiểm tra có mặt gene CYP264B1, AdR Adx 25 2.2.4 Kiểm tra khả biểu gene 27 2.2.5 Kiểm tra khả chuyển hóa nootkatone 30 2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu 30 2.2.7 Chuyển hóa số hợp chất sesquiterpene 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Nhân dịng plasmid pETC4AA kiểm tra có mặt gene mã hóa CYP264B1, AdR Adx 34 3.2 Kiểm tra khả biểu gene 35 3.2.1 Khả biểu gene CYP264B1 35 3.2.2 Khả biểu Adx 36 3.3 Kiểm tra khả chuyển hóa nootkatone hệ xúc tác tế bào C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx 38 3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu 39 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng mơi trƣờng lên khả chuyển hóa chất 39 3.4.2 Ảnh hƣởng mật độ tế bào lên khả chuyển hóa chất 41 3.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả chuyển hóa chất 42 3.4.4 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả chuyển hóa chất 44 3.4.5 Lựa chọn nồng độ chất thích hợp để chuyển hóa 45 3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa số hợp chất sesquiterpene 47 3.5.1 Kết chuyển hóa longipinene 48 3.5.2 Kết chuyển hóa isolongifolene 50 3.5.3 Tinh nhận dạng sản phẩm chuyển hóa 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Nội dung Tên hình 1.1 Trang Cách gọi tên enzyme P450 Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử hệ thống cytochrome 1.2 P450 1.3 Cấu trúc không gian Cytochrome P450cam 1.4 Cấu tạo nhân heme enzyme cytochrome P450 Sắp xếp gene mã hóa CYP264B1 terpene cyclase 10 1.5 GeoA cụm gene myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 1.6 Cấu trúc nhóm sắt-lƣu huỳnh 11 1.7 Cấu trúc nhóm FAD 12 1.8 Một số sesquiterpene phổ biến 13 1.9 Một số Sesquiterpene mạch thẳng 14 1.10 Một số sequiterpene mạch vòng đơn 14 1.11 Một số sesquiterpene đa vòng 15 2.1 Plasmid pET C4AA 20 2.2 Sơ đồ nghiên cứu đề tài 24 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR colony 34 3.2 Cấu trúc đa gene vector pETC4AA 35 Phổ hấp thụ ánh sáng vùng 400-500 nm dịch 36 3.3 chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 cảm ứng 3.4 Kết điện di protein ngoại bào 37 Phân tích khả biểu Adx với kháng thể đặc hiệu 38 3.5 kỹ thuật Western blot Sắc ký đồ HPLC phân tích kết chuyển hóa nootkatone 39 3.6 hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA 3.7 Chuyển hóa glycerol tế bào vi sinh vật 43 3.8 Cấu trúc longipinene isolongifolene 47 3.9 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.10 3.11 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene 50 Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) cấu 51 trúc dự đoán GCMS (b) Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) cấu 3.12 trúc dự đoán GCMS (b) 3.13 Cấu trúc phân tử 15-hydroxy longipinene Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 52 52 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Nội dung Trang 2.1 Danh sách thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 21 2.2 Danh sách hóa chất đƣợc sử dụng thí nghiệm 22 Danh sách dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 22 2.3 2.4 Danh sách môi trƣờng sử dụng thí nghiệm 23 2.5 Thành phần phản ứng PCR 26 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 26 2.7 Thành phần gel co gel tách 29 2.8 Bố trí thí nghiệm xác định mơi trƣờng tối ƣu 31 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả 40 3.1 chuyển hóa chất Kết khảo sát ảnh hƣởng mật độ tế bào đến khả 3.2 chuyển hóa chất Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả 3.3 42 44 chuyển hóa chất Kết khảo sát ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả 3.4 chuyển hóa chất 3.5 Kết lựa chọn nồng độ chất thích hợp để chuyển hóa Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 45 46 http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sesquiterpene nhóm hợp chất terpene phổ biến thực vật, có cơng thức phân tử C15H24 Các dẫn xuất oxy hóa chúng thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học, tính chất hƣơng liệu chất trung gian để tổng hợp hợp chất có giá trị [11] Tuy nhiên, tự nhiên dẫn xuất oxy hóa sesquiterpene thƣờng tồn với hàm lƣợng nhỏ so với tiền chất sesquiterpene chúng Việt Nam quốc gia có hệ thực vật phong phú đa dạng nên việc khai thác nguồn sesquiterpenes từ cỏ nƣớc có ý nghĩa thiết thực Để tạo dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc đƣờng hóa học thƣờng địi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao tạo nhiều chất thải độc hại ảnh hƣởng đến môi trƣờng Ngƣợc lại, chất xúc tác sinh học, đặc biệt enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) thực phản ứng điều kiện nhẹ nhàng [47] Tuy nhiên, để thực chức xúc tác, đại đa số enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một vài protein vận chuyển điện tử, gọi redox partner [13] Để khắc phục điều này, xu hƣớng nghiên cứu gần P450 tạo hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời gene mã hóa P450 redox partner Giải pháp có lợi tận dụng nguồn cofactor nội sinh tế bào chủ, enzyme thực chức chuyển hóa chất mơi trƣờng tự nhiên nên bền vững khơng địi hỏi q trình tinh tốn k m Trong nghiên cứu trƣớc, CYP264B1 - enzyme cytochrome P450 có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đƣợc phát có khả chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes Hệ thống vận chuyển điện tử cho enzyme đƣợc xác định, bao gồm NADPH protein vận chuyển điện tử AdR (Adrenodoxin reductase) Adx (Adrenodoxin) Đặc biệt, CYP264B1 có khả hydroxyl hố chọn lọc số hợp chất (nootkatone / ionone) vị trí mà khó thực đƣợc trình chuyển hóa sinh học khác Các dẫn xuất có tính chất thú vị so với chất ban đầu nhƣ tăng hoạt tính kìm hãm phát triển số dòng tế bào ung thƣ (dẫn xuất nootkatone), hay sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp carotenoids (dẫn xuất / -ionone) [26] Vì vậy, CYP264B1 có tiềm lớn việc chuyển hóa hợp chất sesquiterpene thành dẫn xuất có đặc tính sinh học Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp để chuyển hóa hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phịng Sinh hóa thực vật - Viện Công nghệ sinh học thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1 redox partner nó, đƣợc điều khiển promoter T7 Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h ên h h ng ch nh c c c i h ch i i h n Mục tiêu đề tài - Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa hệ thống CYP264B1 - Ứng dụng hệ xúc tác để chuyển hóa số hợp chất sesquiterpene Nội dung nghiên cứu chuy n h - Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t ch t + Nhân dòng plasmid kiểm tra có mặt gene kỹ thuật PCR colony giải trình tự gene + Kiểm tra khả biểu gene phƣơng pháp đo nồng độ CYP264B1 kiểm tra khả biểu Adx phƣơng pháp western blot + Kiểm tra khả chuyển hóa nootkatone phƣơng pháp HPLC + Tối ƣu điều kiện chuyển hóa nootkatone - Tách chi t nhận dạng sản phẩm chuy n hóa + Chuyển hóa số hợp chất sesquiterpene phân tích sản phẩm chuyển hóa kỹ thuật GCMS + Tinh sản phẩm chuyển hóa sắc ký cột selicagel + Nhận dạng cấu trúc sản phẩm kỹ thuật NMR CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytochrome P450 1.1.1 Định nghĩ v hân ại * Định nghĩ Cytochrome P450 (thƣờng viết tắt CYP hay P450) thuộc họ enzyme monooxygenease có nhóm heme - thiolate trung tâm hoạt động, hấp thụ bƣớc sóng cực đại điển hình 450 nm chúng trạng thái khử tạo phức hợp với CO (cacbon monooxit) [13] P450 có mặt hầu hết sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, chí virus [20] P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh ngoại sinh Số lƣợng P450 cao thực vật, ngƣời có 57 enzyme P450 [13] E.coli khơng có enzyme P450 Tên gọi enzyme cytochrome P450 đƣợc quy định chữ CYP, theo sau số thứ tự Ả Rập họ gen, tiếp chữ viết hoa phân họ số Ả Rập gen riêng biệt Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1, CYP260A1 Hình 1.1 Cách gọi tên enzyme P450 * Phân loại Hiện có 11000 P450 khác đƣợc tách dòng từ động vật, thực vật, vi nấm, vi khuẩn động vật bậc cao khác [33] Để thực chức xúc tác, đại đa số enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một vài protein vận chuyển điện tử, gọi redox partner Do P450 đa dạng tự nhiên nên redox partner chúng phong phú Dựa vào kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử, Hannemann cộng phân loại P450 thành 10 nhóm khác - Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 vi khuẩn ty thể tế bào nhân chuẩn Hệ thống thuộc nhóm gồm protein riêng biệt: enzyme reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trị chuyển điện tử từ NAD(P)H cho thành viên thứ ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lƣu huỳnh, đến lƣợt ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme thực chức xúc tác - Nhóm 2: bao gồm enzyme cytochrome P450 cytochrome P450 reductase (CPR) phụ thuộc NADPH mạng lƣới nội chất CPR enzyme chứa nhóm ngoại FAD FMN có vai trị chuyển điện tử từ NADPH tới P450 - Nhóm 3: tìm thấy vi khuẩn Citrobacter braakii Hệ thống bao gồm Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN enzyme cytochrome cytochrome P450cin - Nhóm 4: đƣợc tìm thấy vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm Fdx enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase - Nhóm 5: bao gồm enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H enzyme cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450) - Nhóm 6: bao gồm enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450) - Nhóm 7: bao gồm enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450 (PFOR-P450) - Nhóm 8: bao gồm enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử tƣơng tự tế bào nhân chuẩn diflavin reductase (CPR-P450) - Nhóm 9: bao gồm enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng NADH làm chất cho điện tử P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện tử khác - Nhóm 10: bao gồm P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện tử nhƣ: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether synthase, prostacyclin synthase thromboxane synthase [13] Hình 1.2 Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử hệ thống cytochrome P450 microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) (D) Trong đó: CPR: NADPH-P450 reductase FDX: ferredoxin FDR:NAD(P)H-ferredoxin ADX: Adrenodoxin reductase RH: Cơ chất ADR: NADPH - ROH: Sản phẩm adrenodoxin reductase 1.1.2 c củ cytochrome P450 P450 họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lƣợng phân tử khoảng 45- 60 kDa, phân tử có chứa nhân heme dạng Fe protoporphyrin IX chu i polypeptide Cấu trúc bậc I P450 cho thấy trình tự amino acid phân tử m i chu i isozyme thƣờng khác nhiều (có trƣờng hợp khác đến 70%), đoạn amino acid đầu N thƣờng không giống P450 Sự khác biệt trình tự amino acid isozyme loài dao động từ 30% đến 95% M i isozyme đƣợc mã hóa gene riêng biệt khác biệt trình tự amino acid phân tử trình tự nucleotide gene mã hóa protein quy định [6] Đến ngƣời ta biết đƣợc 1200 cấu trúc bậc I P450 Các trình tự amino acid P450 nhƣ trình tự nucleotide mã hóa chúng đƣợc lƣu GenBank Trung tâm hoạt động P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên kết lực hydro kỵ nƣớc Vị trí thứ vịng porphyrin liên kết với aminothiol thƣờng gốc cysteine Vị trí thứ gắn với phân tử nƣớc có khả trao đổi Mặc dù có khác biệt trình tự amino acid nhƣng số cấu trúc đƣợc bảo tồn tất isozyme, ví dụ nhƣ gốc cysteine gắn với heme gần đầu carboxyl Trong số cytochrome đƣợc tách chiết, cytochrome P450cam enzyme P450 đƣợc mô tả cấu trúc bậc I cách hoàn chỉnh Poulos cộng [2] Hình dạng tổng thể P450cam tƣơng tự nhƣ hình lăng trụ tam giác với đƣờng kính cực đại khoảng 60 Ǻ Hình 1.3 Cấu trúc không gian Cytochrome P450cam Vùng liên kết hem đƣợc mô tả màu đen Một nguyên tử sắt hình cầu trung tâm heme Cấu trúc bậc II P450 đƣợc nghiên cứu, kết cho thấy chu i -helix phiến β tồn phân tử enzyme Sự khác biệt cấu trúc không gian trung tâm hoạt động P450 nguyên nhân cho đặc hiệu chất isozyme Vào đầu năm 1990, ngƣời ta xác định đƣợc cấu trúc số enyme cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF (CYP107) P450nor (CYP55) [6] Cho đến chuyên gia nghiên cứu cấu trúc tinh thể xác định đƣợc cấu trúc số P450 vi khuẩn Mặc dù tƣơng đồng trình tự enzyme P450 thuộc phân họ dƣới 20%, nhƣng enzyme lại có tƣơng đồng lớn phƣơng thức cuộn xoắn hình học Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn phiến β phân tử protein P450 Cấu trúc trung tâm bảo thủ P450 đƣợc tạo nên bó gồm chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song D, L, Ihelix chu i xoắn ngƣợc E-helix) Nhóm heme định vị chu i I-helix xa chu i L-helix gần liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành vùng khoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ P450 FxxGx(H/R)xCxG Phân tử cystein liền kề tuyệt đối bảo thủ nằm liên kết “thứ năm” nguyên tử sắt Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành liên kết hydrogen với nhóm amide gần kề [9] Chu i xoắn dài I-helix tạo thành tƣờng khoang chứa nhóm hem trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung chu i xoắn Chu i xoắn I-helix chứa phân tử threonine có tính bảo thủ cao định vị trung tâm hoạt động đƣợc tin có tham gia vào trình xúc tác [13], [29], [17] Dựa vào trình tự amino acid thành viên nhóm CYP2 P450cam, Gotoh cộng cho có vùng tham gia vào việc nhận biết chất Các vùng protein đƣợc xem linh hoạt chuyển động theo liên kết với chất trƣớc sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9] Hình 1.4 Cấu tạo nhân heme enzyme cytochrome P450 Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IX liên kết với phối tử cysteine gần 1.1.3 ch c c củ cytochrome P450 Có 20 phản ứng khác đƣợc xúc tác enzyme P450 nhƣ phản ứng hydroxyl hóa liên kết C-H, N-dealkyl hóa, N-hydroxyl hóa, O-dealkyl hóa, Soxy hóa epoxy hóa Trong đó, phản ứng phổ biến đƣợc thực enzyme phản ứng monooxy hóa: nguyên tử oxy đƣợc chuyển vào chất (RH) nguyên tử oxy lại đƣợc khử thành nƣớc [28] RH + O2 + NAD(P)H + H+→ ROH + H2O + NAD(P)+ Ngồi phân tử oxi, hệ thống enzyme cịn cần có NAD(P)H cung cấp H2 cho phản ứng Cơ chế phản ứng đƣợc Coon cộng tìm mơ tả chi tiết vào năm 1979 [29] Cơ chất muốn chuyển hóa đƣợc cần phải gắn vào enzyme P450 (ở dạng oxi hóa) tạo thành h n hợp enzyme - chất Sau điện tử từ pyridine nucleotide dạng khử đƣợc chuyển đến hợp chất nhờ phân tử cytochrome P450 – reductase Phức hệ enzyme chất bị khử lại gắn với phân tử oxi tiếp nhận điện tử thứ hai Qua chuyển điện tử (e-) nội phân tử, phân tử oxi đƣợc hoạt hóa sau phân tử nƣớc tách nguyên tử oxi thứ hai đƣợc gắn vào chất Sau tái lập lại cytochrome P450 dạng oxi hóa 1.1.4 Ứng dụng cytochrome P450 Hiện nay, enzyme P450 đƣợc sử dụng nghiên cứu nhiều lĩnh vực: hóa sinh, y dƣợc học, sinh lý học, hóa học nội bào, công nghệ sinh học môi trƣờng Bộ gen ngƣời có 57 gen mã hóa cho P450, phần tƣ enzyme tham gia vào q trình chuyển hóa chất xenobiotics, P450 cịn tham gia vào q trình tổng hợp sterol, vitamin, acid béo eicosanoids Chính vậy, P450 có vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp dƣợc phẩm đặc biệt nghiên cứu chế tạo thuốc chữa bệnh Ngồi ra, P450 cịn xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa hydrocarbon béo, hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn phức tạp nhƣ hydrocarbons polyaromatic (PAHs); hợp chất halogen nhƣ polychlorinated biphenyls (PCBs), chất thải từ thuốc nổ quân thuốc diệt cỏ [45] Nhiều loại P450 đƣợc nghiên cứu phục vụ cho ứng dụng xử lý sinh học Do khả thực nhiều phản ứng khác nhiều nhóm chất khác nhau, đặc biệt khả oxy hóa chọn lọc vị trí allyl, liên kết đơi chí liên kết C-H khơng đƣợc hoạt hóa khó thực xúc tác hóa học, nên cytochrome P450 có tiềm ứng dụng to lớn việc chuyển hóa hợp chất tự nhiên thành sản phẩm có giá trị [7] Ngồi ra, P450 ứng dụng xử lý mơi trƣờng để chuyển hóa chất độc hại thành chất thân thiện hay ứng dụng để tạo biosensor nhằm phát có mặt chất mẫu nghiên cứu Trên thực tế, P450 đƣợc ứng dụng nhiều để sản xuất thuốc, vitamin, hƣơng liệu, nƣớc hoa hay thuốc trừ sâu Chẳng hạn, P450 đƣợc ứng dụng thành công qui mô công nghiệp việc sản xuất pravastatin thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, dùng để điều trị cho bệnh nhân bị xơ vữa động mạnh Pravastatin đƣợc chuyển hóa từ compactin CYP105A3 thơng qua hydroxyl hóa carbon vị trí 6β Một ví dụ khác ứng dụng P450 sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol P450 qua phản ứng hydroxyl hóa vị trí 11-β, đƣợc sản xuất công ty Schering AG (Germany) qui mơ cơng nghiệp [39] Trong chuyển hóa hợp chất terpene, thêm vào khung carbon một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể tính chất nhƣ khả hịa tan, hoạt tính sinh học hay tăng đặc tính mùi hợp chất Chẳng hạn dạng đột biến P450cam có th xỳc tỏc phn ng oxi húa monoterpene (ỵ)-a-pinene thnh (ỵ)-cis-verbenol hoc h n hp ca (ỵ)-verbenone v (ỵ)-cis-verbenol Verbenol verbenone pheromones hoạt động chống lại nhiều loại bọ cánh cứng sử dụng chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp Sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính kháng sinh đƣợc thực (CYP170A1) qua hai bƣớc oxy hóa allyl hợp chất epi-isozizaene [51] Sự hydroxyl hóa chọn lọc „regio‟ valencene vị trí allyl C2 CYP109B1 tạo nootkatone, hợp chất có giá trị cơng nghiệp thực phẩm hƣơng liệu ... ứng dụng sesquiterpene 15 1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa hệ thống cytochrome P450 16 1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene giới Việt...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E. COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE. .. bào E coli tái tổ hợp để chuyển hóa hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phịng Sinh hóa thực vật - Viện Công nghệ sinh học thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1 redox