ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb ) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thá[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN THỊ THU HÀ TS NGUYỄN XUÂN VŨ Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb.) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro” trung thực, thực Viện Nghiên cứu Phát triển Lâm nghiệp Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng phép cơng bố Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm tính trung thực nội dung đề tài Học viên ii LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Trần Thị Thu Hà TS Nguyễn Xn Vũ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Viện Nghiên cứu Phát triển Lâm nghiệp cán bộ, quý đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Chi Sói rừng lồi Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.1.1.Phân loại, phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Giá trị Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.2 Cơ sở việc định danh loài xác định quan hệ di truyển 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng nước ta 1.4 Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống) .9 1.4.1 Ưu điểm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.4.2 Nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.4.3 Các phương pháp nuôi cấy mô 10 1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật 11 1.4.5 Các giai đoạn nhân giống invitro 15 Chương 2.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .18 iv 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu .18 2.3.1 Điều tra đánh giá thực trạng phân bố thu thập mẫu nghiên cứu 18 2.3.2 Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng đặc điểm hình thái 21 2.3.3 Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng thị DNA .22 2.3.4 Phương pháp nhân giống in vitro Sói rừng 25 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .29 3.1 Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của lồi Sói rừng thu thập mẫu 29 3.2 Kết nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng đặc điểm hình thái 34 3.2.1 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Xín Mần .34 3.2.2 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Mèo Vạc .35 3.2.3 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Quản Bạ 36 3.2.4 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Hồng Su Phì .37 3.2.5 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Vị Xuyên 38 3.3 Kết nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng chị thị DNA 40 3.3.1 kết tách chiết DNA tổng số mẫu Sói rừng nghiên cứu 40 3.3.2 Kết PCR mẫu Sói rừng nghiên cứu .41 3.3.3 Kết giải trình tự vùng ITS-rDNA mẫu Sói rừng nghiên cứu 42 3.3.4 Kết phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu 43 3.4 Kết nghiên cứu nhân giống in vitro Sói rừng 45 3.4.1 Chọn vật liệu khởi đầu 45 3.4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu vô trùng 45 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng 47 v 3.4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh đến khả rễ chồi Sói rừng .55 3.4.5 Nghiên cứu đưa nhà kính .58 3.4.6 Chăm sóc giai đoạn in vitro KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 1.Kết luận 64 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ, thuật Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ ngữ viết tắt (Cả tiếng anh tiếng việt) DNA Deoxyribonucleic acid PCR Plolemerase Chain reaction SR Sói rừng Cs Cộng IAA Indole - 3- acetic acid NAA Naphthylacetic acid BAP Benzylaminopurine IBA Indo – – butyric acid MS Murashige Skoog CT Công thức LSD Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ có ý nghĩa CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố Sói rừng theo tuyến điều tra 31 Bảng 3.2 Đặc điểm mẫu thu thập .33 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Xín Mần 34 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Mèo Vạc 35 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Quản Bạ 36 Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Hồng Su Phì 37 Bảng 3.7 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Vị Xuyên 38 Bảng 3.8 Danh sách 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .40 Bảng 3.9 Độ dài trình tự 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .42 Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu mẫu tham chiếu 44 Bảng 3.11 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu vô trùng (sau tuần nuôi cấy) 46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng (sau tuần ni cấy) 48 Bảng 3.13 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin đến hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy (sau tuần nuôi cấy) 50 Bảng 3.14 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin với NAA đến hệ số nhận chồi (sau tuần nuôi cấy) 52 Bảng 3.15 Ảnh hưởng tổ hợp BAP, Kinetin với IBA đến hệ số nhận chồi sau tuần nuôi cấy 54 Bảng 3.16 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ chồi Sói rừng .56 Bảng 3.17 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ chồi Sói rừng .57 Bảng 3.18 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống Sói rừng in vitro sau tuần theo dõi 59 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Sói rừng Hình 3.1 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Xín Mần 35 Hình 3.2 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Mèo Vạc 36 Hình 3.3 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Quản Bạ 37 Hình 3.4 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Hồng Su Phì 38 Hình 3.5 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Vị Xuyên 39 Hình 3.6 kết tách chiết DNA tổng số 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .41 Hình 3.7 Kết PCR 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA .42 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus KP317601.1 Sarcandra glabra 44 Hình 3.9 Kết khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng HgCl2 0,1% 47 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi Sói rừng 49 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân chồi Sói rừng 51 Hình 3.12 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin với NAA đến đến hệ số nhận chồi chồi Sói rừng 53 Hình 3.13 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin với IBA đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng 55 Hình 3.14 Ảnh hưởng NAA đến kết rễ chồi Sói rừng 57 Hình 3.15 Ảnh hưởng IBA đến kết rễ chồi Sói rừng 58 Hình 3.16 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống Sói rừng 59 Hình 3.17 Sói rừng giai đoạn sau in vitro MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây Sói Rừng cịn gọi sói nhẵn, cửu tiết trà, thảo san hơ, quan âm trà, tiếp cốt mộc, cửu tiết phong, cửu tiết lan, sơn hồ tiêu, cốt thuộc họ Hoa sói (Chloranthaceae) Sói Rừng loại giàu dược tính nên khai thác để sử dụng làm thuốc chữa trị nhiều bệnh Đông y cho rằng, sói rừng có vị đắng, cay, tính ấm Có tác dụng kháng khuẩn tiêu viêm, khu phong trừ thấp, hoạt huyết thống Chủ trị viêm phổi, viêm phế quản, viêm ruột thừa cấp tính, viêm dày ruột cấp tính, nhiễm khuẩn, phong thấp đau nhức, đòn ngã tổn thương, gãy xương Trong dân gian, thường dùng rễ ngâm rượu uống để chữa tức ngực, đau nhức xương khớp; cịn dùng tồn sắc uống trị cảm mạo, kinh nguyệt không viêm phổi Lá sắc uống trị ho, giã đắp chữa rắn cắn Cây Sói rừng phân bố nhiều nước Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam Malaysia Ở Việt Nam, Sói rừng mọc hoang khắp nơi, khu vực đất ẩm ướt, mát, hốc đất núi đá Sói rừng phân bố tỉnh Hà Giang, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc Kạn, Điển hình Hà Giang có 1.100 loài dược liệu tổng số 5000 loài dược liệu nước; đánh giá vùng trọng điểm đa dạng dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao vùng trọng điểm nước ta để phát triển dược liệu gắn với phát triển du lịch sinh thái vùng cao Hà Giang có điều kiện tự nhiên, sinh thái thuận lợi cho sinh trưởng phát triển nhiều loại dược liệu có Sói rừng, đặc biệt sản xuất giống, bảo tồn sản xuất loài dược liệu quý Tuy nhiên, loài thuốc quý bị khai thác cạn kiệt nhiều loài đứng trước nguy tuyệt chủng Vì vậy, việc nghiên cứu, bảo tồn phát triển loài dược liệu, đặc biệt lồi dược liệu q, có giá trị kinh tế cao tỉnh Hà Giang xem nhiệm vụ trọng tâm cấp bách theo Kết luận số 71-KL/TW ngày 24/9/2014 Ban Bí thư Trung ương triển khai mục tiêu phát triển bền vững nguồn tài nguyên dược liệu tỉnh vùng Tây Bắc Ở nước ta cơng tác bảo tồn lồi dược liệu chưa thực gắn với phát triển Để phát triển, công tác chọn tạo giống, công nghệ nhân nuôi trồng giống tốt cung cấp nguyên liệu chất lượng cần quan tâm Chính vậy, việc cải tiến áp dụng công nghệ bảo tồn, nhân giống giải pháp hữu hiệu giải vấn đề phát triển dược liệu Theo báo cáo hầu hết tỉnh vùng núi phía Bắc, việc bảo tồn phát triển loài dược liệu địa phương nhiều hạn chế từ giống trồng thu hoạch Giống sử dụng không rõ nguồn gốc, giống tạp, chất lượng chưa cao, nhân giống phương pháp truyền thống nên giống không đảm bảo số lượng chất lượng Từ lý tơi thực nghiên cứu "Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro” làm sở khoa học cho cơng tác bảo tồn phát triển lồi Sói rừng tỉnh Hà Giang Mục tiêu nghiên cứu * Mục tiêu chung Xây dựng quy trình nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào * Mục tiêu cụ thể - Điều tra, đánh giá, thu thập mâu nghiên cứu - Nhận dạng lồi Sói rừng đặc điểm hình thái - Nhận dạng lồi Sói rừng thị DNA - Nghiên cứu chất khử trùng thời gian khử trùng cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao - Nghiên cứu chất kích thích sinh trưởng phù hợp đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng - Nghiên cứu chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) cho giai đoạn rễ chồi Sói rừng - Nghiên cứu loại giá thể phù hợp cho Sói rừng giai đoạn sau in vitro Địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu thực Viện Nghiên cứu Phát triển Lâm nghiệp – Đại học Nông lâm Thái Nguyên Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Chi Sói rừng lồi Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.1.1.Phân loại, phân bố Sói rừng có tên khoa học là: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai Giới: Plantae; Bộ: Chloranthales; Họ: Chloranthaceae; Chi: Sarcandra; Loài: Glabra (Đỗ Huy Bích, 2011) [3] Ngồi cịn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus glaber (Thunb.) makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói Chloranthaceae Ở Việt Nam Sói rừng cịn có số tên gọi khác như: sói lãng, sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên, thảo sách hồ, tiếp cốt mộc (Võ Văn Chi, 2012) [4] Cây Sói rừng phân bố nhiều nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam Malaysia Ở Việt Nam mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La (Mộc Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng, Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum (Đác lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc) (Võ Văn Chi, 1996) [5] 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Hình 1.1 Cây Sói rừng Cây Sói rừng có chiều cao - mét, thân nhẵn, mấu phồng Nhánh trịn, khơng có lơng, mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình giáo, chiều dài - 20 cm rộng - cm với - cặp gân bên Mép có cưa nhọn thô Cuống dài - mm Bông kép, nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng khơng có cuống có nhị Bầu nhụy có hình trứng khơng có vịi Cây mọng nhỏ, hình gần trịn đường kính - mm, chín có màu đỏ hay đỏ gạch Cây hoa vào tháng - chín vào tháng - Sói rừng mọc hoang vùng núi đất, rìa rừng ven đồi ẩm nhiều nơi lên đến độ cao 1000m Thu hái toàn vào mùa hạ thu, dùng tươi phơi khô (Võ Văn Chi, 1997) [5] 1.1.3 Giá trị Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.1.3.1 Giá trị kinh tế Sói rừng dược liệu có hiệu kinh tế cao thu hái nhiều tỉnh miền núi nước ta 1.1.3.2 Giá trị dược liệu Theo Đơng y, Sói rừng có vị đắng, tính ấm, có tác dụng hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc Trong dân gian, rễ ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực Lá sắc uống hỗ trợ trị bệnh lao, giã đắp hỗ trợ trị rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp hỗ trợ trị vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau nhức xương Theo Perrot Hurrier (1906), toàn sói rừng dùng để hỗ trợ điều trị bệnh động kinh Kết nghiên cứu đại cho thấy, sói rừng có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn vàng staphylococcus aureus, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn bacillus coli, trực khuẩn mủ xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩhn thương hàns… Lá có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất; rễ cành tươi có tác dụng mạnh rễ cành khô Hỗ trợ điều trị ho, suy nhược, viêm khớp, đau nhức xương, nắn bó gẫy xương làm giảm u bướu, giảm ứ đọng máu, cải thiện chức tuyến tụy, hỗ trợ trị đau dầy Tồn Hoa sói rừng có tác dụng chống ung thư, lẫn tác dụng kháng khuẩn, nên dùng để hỗ trợ trị ung thư có biến chứng nhiễm khuẩn tốt Đã thấy có hiệu tốt loại ung thư dầy, ung thư gan, ung thư tuyến tụy, ung thư thực quản, bệnh bạch cầu sarcom lưới dòng lympho (Mai Hải Yến, 2010) [15] Cây Sói rừng có tác dụng mạnh chống lại ơxi hóa, giúp giải nhiệt, tiêu độc, làm tăng sản xuất tiểu cầu máu (từ giúp tiêu trừ huyết khối), tăng tuần hồn máu chống viêm Cũng có tài liệu cho S glabra giúp giảm mệt mỏi điều trị ung thư đề xuất sử dụng giải pháp thay điều trị, chưa có thử nghiệm chứng thực điều Sói rừng sử dụng tác nhân dự phịng hóa học, bệnh nhân điều trị tác nhân hóa trị liệu, có tác dụng tăng cường miễn dịch ức chế phát triển tế bào ung thư Nước sắc tồn sói rừng có tác dụng thực bào, dạng tác dụng chống ung thư, tinh dầu sói rừng, lại có tác dụng ức chế thực bào, giống tác dụng không mong muốn cyclophosphamid, trước sử dụng sói rừng, nên đun sơi thật kỹ, để loại bỏ tinh dầu isoilaxidin chiết xuất từ sói rừng, có tác dụng ức chế manh bệnh bạch cầu dòng lympho Một số cách sử dụng Sói rừng: Hỗ trợ phịng cảm mạo: Dùng sói rừng 10 – 15g, mùa đơng thêm tía tơ 6g, mùa hè thêm kim ngân hoa 6g, sắc nước uống thay trà ngày Hỗ trợ điều trị chứng viêm nhiễm (có tác dụng chống viêm tốt): Mỗi ngày dùng 30 - 40g cành sói rừng tươi, sắc lấy nước, chia lần uống, liên tục - ngày kéo dài ngày Hỗ trợ điều trị đau lưng: Dùng cành sói rừng 10 - 15g, sắc với nửa rượu nửa nước, chia uống ngày Hỗ trợ điều trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, viêm khớp xương phong thấp: Dùng tươi, giã nát, rượu, đắp; dùng 15-30g rễ sắc với nước ngâm rượu uống Hỗ trợ điều trị ngoại thương xuất huyết: Dùng tươi, giã nát, đắp; dùng 15 - 30g rễ, ngâm rượu uống Hỗ trợ điều trị vết thương loét, không liền miệng: Dùng cành lá, lượng thích hợp, nấu nước rửa, ngày 1- lần Hỗ trợ điều trị bỏng: Dùng sói rừng, phơi khô, tán mịn, trộn thêm phần dầu hạt sở dầu vừng; hàng ngày bôi vào chỗ bị bỏng 1.2 Cơ sở việc định danh loài xác định quan hệ di truyển Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác phân loại xác định loài động, thực vật hầu hết phương pháp dựa ngun tắc lồi có chung nguồn gốc, có tính chất giống nhau, gần tính chất giống nhiều Sự giống đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hố, phơi sinh học Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học lồi thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp trực quan dựa vào thống kê phân tích nhiều tính trạng thể bên nên hiệu thấp Điều thật gặp nhiều khó khăn mẫu vật cần giám định khơng cịn ngun vẹn, hình thái bên Do vậy, việc định danh dựa quan sát hình thái kinh nghiệm dân gian hỗ trợ xác sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại Các phương pháp phân loại học phân tử xác định loài hướng nghiên cứu phát triển mạnh giới nay, xây dựng dựa việc nhận biết thành phần cấu trúc gen đặc hữu taxon sinh vật Hiện nay, kỹ thuật dựa phân tích DNA phương pháp có hiệu cao việc định loại giám định loài Phân loại học phân tử dựa nghiên cứu gen hệ gen nhân, hệ gen bào quan ti thể, lục lạp sản phẩm gen protein, enzyme Mỗi loại gen, sản phẩm gen lại phù hợp với đối tượng mục đích nghiên cứu khác Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein có ý nghĩa lớn thành công hướng nghiên cứu Các kỹ thuật thường sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), kỹ thuật phân tích so sánh trình tự nucleotide đoạn DNA phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), kỹ thuật sở phản ứng PCR SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) (Harvey cộng sự, 1996; Roman cộng sự, 2003), đa hình chiều dài đoạn DNA nhân - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), phân tích trình tự DNA … (Phạm Hồng Sơn, 2006; Lê Duy Thành cộng sự, 2005) giúp giải mối nghi ngờ vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại tiến hoá nhiều loài động, thực vật vi sinh vật Thêm vào kỹ thuật sử dụng thị phân tử để xác định gen kiểm sốt có liên quan đến tính trạng cá thể, lồi hay nhóm lồi [12], [13], [25] 7 Gần đây, việc sử dụng DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu có đóng góp đáng kể việc phân loại loài Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hố lồi nhóm gen thường sử dụng gen ribosome rRNA, gen ty thể, gen lục lạp (thực vật) gen rRNA 18S, 5S 16S hay dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá sinh vật So với thị hình thái thị hố học, thị DNA cho độ xác cao mà không lệ thuộc vào yếu tố khách quan Quá trình tìm kiếm thị DNA chung cho loài thực vật gặp nhiều khó khăn Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp thị DNA hệ gen nhân, vùng DNA nằm gen hay gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường sử dụng làm DNA thị số nghiên cứu (Borsch cộng sự, 2003; Shaw cộng sự, 2007; Van cộng sự, 2000) [16] Trong nhiều năm gần đây, nhiều vùng gen nghiên cứu đề xuất thị DNA cho thực vật Tuy nhiên chưa có thị DNA đa phần nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận Mặc dù vậy, nhà nghiên cứu tới quan điểm thống cần không mà nhiều vùng DNA thị để định danh loài thực vật (Chase cộng sự, 2005; Kress cộng sự, 2008) [17] 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng giới Sói rừng nhân giống hữu tính hạt, vơ tính giâm hom, ni cấy mô tế bào Ở Trung Quốc, S glabra nhân giống giâm hom Cây năm tuổi cho tỷ lệ hom rễ đạt 88,7% sử dụng hom nhúng vào dung dịch 200mg/L ABT-1 30 phút (Qiu, 2012; Zhu et al., 2010); 82% xử lý với dung dịch 200mg/L IBA (Liu et al., 2008) [24] Ở Trung Quốc, dùng để chữa số bệnh ung thư: ung thư tụy, dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt không đều, hoa dùng để ướp trà Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật Bản kết luận thành phần hóa học chủ yếu Sói rừng là: sesquiterpen lactose, curmarin, flavonoid (Collons, 1992) Hiện tài liệu tìm thấy Sói rừng tập trung nghiên cứu hoạt chất hóa học loài hỗ trợ điều trị bệnh Kang et al., (2008) nghiên cứu tác dụng ức chế khối u dịch chiết S glabra gây chết tế bào gây ung thư biểu mô mũi - họng người Kết cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản phát triển khối u in vivo [22] Zhu et al., (2010) nghiên cứu tạo rễ in vitro mơi trường MS, kết NAA khơng có tác dụng cải thiện rễ Môi trường tốt cho rễ 1/2MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose30 g/L 1/4 MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L[29] Li et al., (2008) nhân giống in vitro Sói rừng mơi trường MS, 80 % chồi phát sinh môi trường MS+BA 1.0 mg/L Môi trường cấy chuyển MS + BA 2.0 mg/L +NAA0 mg/L cho hệ số nhân chồi 6.2 Môi trường tốt cho rễ 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L với tỷ lệ 100 % Zhu et al., (2007) thu mẫu cấy vô trùng cách nhúng mẫu cồn 75% 30 giây, sau HgCl2 0.1% 10 phút Tiếp rửa nước vô trùng nhúng vào dung dịch 120 mg/l rifampicin ngày; Cuối mẫu nhúng vào HgCl2 0.1% rửa nước vô trùng cấy vào mơi trường tái sinh chồi [31] 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng nước ta Mai Hồng Oanh (2016) nghiên cứu mẫu Sói rừng thu nhận từ Lạng Sơn, tách chiết tinh DNA tổng số Nhân thành công hai vùng gen ITS rpoC1 phương pháp PCR tạo dịng thành cơng hai gen nhân được, xác định trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 ITS [9] Bùi Văn Trọng cs (2014) nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng tới hình thành rễ hom Sói rừng (Sarcandra glaba (Thunb.) Nakai.) Lâm Đồng Nhóm tác giả sử dụng NAA nồng độ 1% cho kết giâm hom Sói rừng tốt đạt 86.67%, hom sống rễ, số lượng rễ trung bình 5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình 3,68 cm so với đối chứng (66,67%; 3,9; 3,65 cm, tương ứng) [10] 9 Le Hong En et al., (2016) nghiên cứu nhân giống Sói rừng giâm hom Tác giả sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng chất kích thích rễ Nồng độ IBA 1-1,5% cho rễ tốt Hom bánh tẻ cho rễ tốt loại hom khác Nguyễn Quỳnh Anh (2013), Nghiên cứu ứng dụng Sói rừng Cao Bằng để hỗ trợ điều trị số bệnh ung thư Tác giả nghiên cứu quy trình bào chế dạng bào chế thành phẩm từ Sói rừng Sau năm nghiên cứu đề tài đạt mục tiêu đề ra, kết nghiên cứu thành phần hóa học, số hoạt tính sinh học, độc tính tác dụng điều trị ung thư động vật thực nghiệm bột Sói rừng Sarcandra glabra (Thunb) Nakai, thu hái vùng rừng núi xã Bạch Đằng, huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng Kết nghiên cứu đưa quy trình Nghiên cứu làm viên tế; Nghiên cứu làm dạng thuốc bột (thuốc tán); Nghiên cứu làm dạng cao thuốc (cao nước) [1] 1.4 Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống) Nuôi cấy mô tế bào thực vật khái niệm chung cho tất q trình ni cấy từ ngun liệu thực vật môi trường nhân tạo điều kiện vô trùng Nhân giống in vitro hay gọi vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng phận khác thực vật với kích thước nhỏ (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [11] Trong thực tế, nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay cho để phương thức nhân giống thực vật điều kiện vơ trùng với mục đích khác Ngun lý ni cấy mơ tính tồn tế bào (Totipotency) Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đặt móng cho ni cấy mơ - tế bào thực vật Ơng đưa giả thuyết tính tồn tế bào sách “Thực nghiệm nuôi cấy tế bào tách rời” Theo ông, tế bào thể sinh vật mang toàn lượng thơng tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Quang Thạch, 2009) 10 1.4.1 Ưu điểm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Q trình ni cấy mơ tế bào thực vật có ưu điểm sau (Dương Cơng Kiên, 2006): - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết trường hợp từ sau ni cấy từ – năm tạo hàng triệu - Sản phẩm đồng nhất: Tạo quần thể có độ cao dù xuất phát từ mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp - Tiết kiệm không gian: Không phụ thuộc vào thời tiết bên vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ tạo đơn vị diện tích lớn nhiều so với sản xuất truyền thống đồng ruộng - Lợi vận chuyển: Cây có kích thước nhỏ, vận chuyển xa dễ dàng thuận lợi - Sản xuất quanh năm: Qúa trình sản xuất tiến hành vào thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ 1.4.2 Nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật - Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị đại, tiêu tốn nhiều lượng,….nên giá thành sản xuất giống cao so với phương pháp truyền thống chiết, ghép nhân giống hạt - Chất lượng giống bị biến dị: ni cấy sai khác với mẹ ban đầu tượng biến dị tế bào soma 1.4.3 Một số phương pháp nuôi cấy mô Các phương pháp thường áp dụng phổ biến sau (Nguyễn Như Khanh, 2011, Vũ Văn vụ, 2009) [14]: - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, phương thức đơn giản thường hay sử dụng để tái sinh chồi invitro nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Trên thực tế người ta thường ni cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm Đó đỉnh chồi đỉnh chồi nách, đỉnh sinh trưởng nuôi cấy điều kiện thích hợp tạo hay nhiều chồi chồi phát triển thành hoàn chỉnh ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Mã... cứu "Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro? ?? làm sở khoa học cho cơng tác bảo tồn phát triển lồi Sói rừng tỉnh Hà Giang Mục tiêu nghiên cứu. .. tài “ Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb. ) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro? ?? trung thực, thực Viện Nghiên cứu Phát triển Lâm nghiệp Đại học Nơng lâm - Đại học Thái Ngun