Đang tải... (xem toàn văn)
1 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http //www lrc tnu edu vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC N T NG N N TR RN G NG Đ TƯ NG T 4 TẠ NG N G N NG N R LU N ĂN T Ạ Ĩ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái N[.]
1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC N NG Đ N T N TR TƯ NG T G N RN TẠ NG LU N ĂN T Ạ N G NG NG N R Ĩ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – / 2015 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NG NG G N NG Đ T N N TR RN TƯ NG T NG N NG TẠ NG N R Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LU N VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC N ọ : GS.TS Chu Hồng Mậu Thái Ngun – 5/2015 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng Ngoài trồng đậu tương cịn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng suất giống trồng khác Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nông nghiệp nước, 65% miền Bắc 35% miền Nam Hiện suất sản lượng đậu tương thấp phải nhập từ nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng làm thức ăn cho gia súc [53] Bên cạnh yếu tố hạn hán, kĩ thuật canh tác ngun nhân bệnh trùng, vi khuẩn virus gây ảnh hưởng không nhỏ đến suất, chất lượng đậu tương Hiện người ta xác định khoảng 30 loại bệnh hại đậu tương, có bệnh nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13] Bệnh khảm đậu tương bệnh hại xuất phổ biến đậu tương Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây Đậu tương bị nhiễm SMV thời điểm trước hoa suất giảm tới 40% 91% hạt đậu thu có vết lốm đốm, chất lượng [35] SMV lan truyền quần thể đậu tương rệp, học Hiện nay, biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn lan truyền SMV có tính chất phịng bệnh mà chống lại triệt để Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta tạo trồng có khả kháng lại bệnh virus cách đưa ch nh gen virus gây bệnh vào hệ gen chủ Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống trồng chuyển gen kháng loại bệnh virus khác tạo ra, đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), thuốc chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc (TMV) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Xuất phát từ l trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng chuyển gen kháng Soybean mosaic virus” ục t ê c u Tạo dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV giống đậu tương DT84 Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mơ nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích có mặt gen chuyển dòng chuyển gen kỹ thuật PCR Xác định hiệu suất chuyển gen Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ươ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 C đậu tươ 1.1.1 iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin muối khoáng Đậu tương loại hạt mà giá trị đánh giá đồng thời protein lipid Protein đậu tương có phẩm chất tốt loại protein thực vật Hàm lượng protein cao cá, thịt cao gấp hai lần hàm lượng protein có loại đậu đỗ khác [14] Hàm lượng axit amin có chứa lưu huỳnh methionin, sistein,… đậu tương gần với hàm lượng chất trứng Hàm lượng cazein, đặc biệt lizin cao, gần gấp rưỡi trứng Vì mà nói giá trị protein đậu tương cao nói hàm lượng lớn đầy đủ cân đối loại axit amin cần thiết Protein đậu tương dễ tiêu hóa thịt khơng có thành phần tạo nên cholesteron Khơng có dạng axit uric… Ngày nay, người ta biết thêm có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ tái sinh mô, làm cứng xương tăng sức đề kháng thể Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao loại đậu đỗ khác nên coi cung cấp dầu thực vật Hiện nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật mỡ động vật Lipid đậu tương chứa tỷ lệ cao axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật tránh xơ vữa động mạch [14] Trong đậu tương cịn có nhiều loại vitamin, đặc biệt hàm lượng vitamin B1 B2, cịn có loại vitamin PP, A, E, K, D, C… Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn loại muối khoáng khác [14] Do mà từ hạt đậu tương người ta chế biến 600 sản phẩm khác nhau, có 300 loại thức ăn phương pháp cổ truyền, thủ công đại dạng tươi, khô, lên men… làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… sản phẩm cao cấp đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… nước ta, từ hàng ngàn năm đậu tương cung cấp phần nhu cầu chất đạm cho người gia súc, thơng qua ăn cổ truyền chế biến từ đậu tương, phần tạo cân dinh dưỡng phẩn thức ăn cho người dân Đậu tương chế biến thành giị, chả cho người ăn chay Đậu tương vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dày ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, ốm dậy lao động sức Các chất lexithin cazein có đậu tương dùng riêng phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng Bột đậu tương sau ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp Thân đậu tương dùng làm thức ăn gia súc gia cầm tốt Ở nhiều nước phát triển người ta dùng đậu tương vào ngành công nghiệp khác chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn ngành hàng không Đậu tương cịn có khả t ch lũy chất đạm khí trời để tự túc làm giàu đạm cho đất nhờ cộng sinh vi khuẩn nốt sần rễ Trong điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nốt sần t ch lũy lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha Do nói nốt sần “nhà máy đạm tý hon”, nên trồng đậu tương tốn t phân đạm mà cịn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực việc cải tạo bồi dưỡng đất [14] Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1.1.2 Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm phát Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Chúng có nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ơn đới đến nhiệt đới [14] Rễ đậu tương khác với rễ hồ thảo có rễ rễ phụ Rễ ăn sâu 30-50cm 1m Trên rễ mọc nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp tập trung nhiều tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt sần Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu kỹ thuật trồng [14] Trong điều kiện đất chua kiềm nốt sần hình thành pH thích hợp cho hình thành nốt sần 6-7, việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp quan trọng Điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến phát triển nốt sần Nhìn chung bón đầy đủ NPK nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy phát triển nốt sần, hiệu kali khơng rõ Bón đạm khơng thích hợp ức chế hình thành phát triển nốt sần Nốt sần rễ đậu tương thường tập trung tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần dần sâu có khơng có Nốt sần đóng vai trị q trình cố định đạm khí trời cung cấp cho Lượng đạm cung cấp cho lớn khoảng 30-60 kg/ha Nốt sần dài l cm, đường kính mm, hình thành có màu trắng sữa, tốt có màu hồng Quan hệ vi sinh vật nốt sần với đậu tương mối quan hệ cộng sinh: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự khơng khí chuyển sang dạng đạm hữu sử dụng [14] Thân đậu tương thuộc thân thảo, có hình trịn, thân có nhiều lơng nhỏ Thân cịn non có màu xanh màu tím già chuyển sang màu Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn nâu nhạt, màu sắc thân non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc non màu xanh hoa màu trắng cịn non thân có màu t m hoa có màu t m đỏ Thân có trung bình 14-15 lóng, lóng ph a thường ngắn, lóng ph a thường dài (vì lóng phía phát triển từ ngày 35-40 trở vào lúc sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tuỳ theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ - 10 cm Cây đậu tương vụ hè thường có lóng dài vụ xn vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc Những giống thân to thường thân đứng có nhiều hạt chống gió bão Tồn thân có lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cuống Thực tế có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khoẻ Ngược lại giống lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều dài ngắn, dày thưa đặc điểm phân biệt giống với Từ lúc mọc đến có thật (3 kép) khoảng 25-30 ngày sau gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường [14] Về trình phát triển đậu tương, có 6-7 thật (4-5 kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh vào lúc hoa rộ Sự khác biệt đậu tương với trồng khác hoa rộ lại lúc thân cành phát triển mạnh Đây giai đoạn trình sinh trưởng sinh dưỡng sinh trưởng sinh thực cạnh tranh dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng, cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước vào thời kỳ tạo điều kiện cho rễ phát triển thuận lợi Trong kỹ thuật chăm sóc ta phải xới vun kết hợp với bón thúc phân cho đậu tương vào giai đoạn 3-5 kép, lúc có đầy đủ hoa sinh trưởng chậm dần dừng hẳn Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Cây đậu tương có loại lá: mầm, nguyên, kép Lá mầm mọc có màu vàng hay xanh lục, tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng ni mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo đi, kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ chọn hạt to mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng Lá đơn to màu xanh bóng biểu sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Mỗi kép có chét, có 4-5 chét Lá kép mọc so le, kép thường có màu xanh tươi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh, giống thích hợp trồng làm thức ăn gia súc Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tuỳ theo giống, giống nhỏ dài chịu hạn khoẻ thường cho suất thấp Những giống to chống chịu hạn thường cho suất cao Nếu kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tích to hay nhỏ chi phối lớn đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các nằm cạnh chùm hoa giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Nếu điều kiện làm cho bị úa vàng vị tr thường bị rụng lép Các nhà chọn giống đậu tương đưa sở để nâng cao suất đậu tương tăng cường trình quang hợp muốn quang hợp với hiệu cao phải chọn có nhỏ, dày, đứng có dạng hình trứng Số nhiều to khoẻ vào thời kỳ hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi biểu sinh trưởng khoẻ có khả cho suất cao [14] Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc hoa thay đổi tuỳ theo giống thường có màu tím, tím nhạt trắng Đa phần giống có hoa màu tím tím nhạt Các giống đậu tương có hoa màu trắng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 thường có tỷ lệ dầu cao giống màu tím Hoa phát sinh nách lá, đầu cành đầu thân Hoa mọc thành chùm, chùm có từ 1-10 hoa thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương nhiều tỷ lệ rụng cao khoảng 30% có lên tới 80% [14] Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính hoa có nhị nhụy, hoa gồm đài, cánh hoa có 10 nhị nhụy Đài hoa có màu xanh, nhiều bơng Các cánh hoa vươn khỏi đài từ ngày hôm trước việc thụ phấn xẩy vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 sáng trước nụ hoa chưa nở hoàn toàn Mùa hè hoa thường nở sớm mùa đông thời gian nở hoa ngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu tương thường thụ phấn trước hoa nở tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn thấp chiếm trung bình 0,5 - 1% Thời gian bắt đầu hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống thời tiết khác Giống chín sớm sau mọc 30 ngày hoa giống chín muộn 45-50 ngày hoa Thời gian hoa dài hay ngắn theo giống theo thời vụ Có giống thời gian hoa kéo dài 10-15 ngày Kết nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ đến ngày thứ 10 sau hoa bắt đầu nở Hoa đợt rộ tạo nhiều, cịn trước sau đợt hoa rộ tỷ lệ đậu thấp Điều kiện thích hợp cho nở hoa nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ khơng khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80% Căn vào phương thức hoa người ta chia giống đậu tương làm nhóm: (i) Nhóm hoa hữu hạn: Thuộc giống sinh trưởng hữu hạn, hướng hoa theo trình tự từ xuống từ vào Những giống thường thấp hoa tập trung, hạt đồng (ii) Nhóm hoa vơ hạn: Thuộc giống sinh trưởng vơ hạn, có hướng hoa theo trình tự từ lên từ Những giống thường hoa phân tán, chín khơng tập trung phẩm chất hạt không đồng Trong thực tế, giống hoa tập trung gặp điều kiện bất thuận, hoa rụng nhiều nên thất thu nặng Còn giống thời gian hoa dài chín khơng tập trung bị rụng vào đợt hoa tiếp đợt sau nên không thất thu nặng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11 Số biến động từ đến 20 chùm hoa đạt tới 400 Một chứa từ tới hạt, hầu hết giống thường từ đến hạt Quả đậu tương thẳng cong, có chiều dài từ tới cm Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu đen Màu sắc phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc lông, có mặt sắc tố antocyanin Lúc non có màu xanh nhiều lơng (có khả quang hợp có diệp lục) ch n có màu nâu Hoa đậu tương nhiều tỷ lệ đậu thấp 20-30% Ví dụ vụ xn có 120 hoa đậu 30-40 cao, chùm 5-8 hoa đậu 2- Những đốt phía gốc thường khơng có quả, từ đốt thứ 5-6 trở lên tỷ lệ đậu cao nhiều Trên cành thường từ đốt 2-3 trở lên có chắc, đầu cành thường lép nhiều Sau hoa nở ngày cánh hoa héo rụng, ngày thứ đến ngày thứ sau hoa nở hình thành -8 ngày sau thấy nhân xuất Trong 18 ngày đầu lớn nhanh sau chậm dần, vỏ dày lên chuyển từ màu xanh sang màu vàng Hạt lớn nhanh vịng 30-35 ngày sau hình thành Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: Hình trịn, hình bầu dục, trịn dẹt vv Hạt to nhỏ khác tuỳ theo giống, khối lượng nghìn hạt thay đổi từ 20-400g trung bình từ l00g-200g Rốn hạt giống khác có màu sắc hình dạng khác nhau, biểu đặc trưng giống [14] 1.1.3 T uất đậu tươ t ê t v ệt N Hiện có 45% diện tích trồng đậu tương 55% sản lượng đậu tương giới nằm Mỹ Nước Mỹ sản xuất 75 triệu đậu tương năm 2000, phần ba xuất Các nước sản xuất đậu tương lớn khác Brazil, Argentina, Trung Quốc Ấn Độ Phần lớn sản lượng đậu tương Mỹ để nuôi gia súc, để xuất khẩu, tiêu thụ đậu tương Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 12 người đất nước tăng lên Dầu đậu tương chiếm tới 80% lượng dầu ăn tiêu thụ Mỹ [66] Theo ước tính Bộ Nơng nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương giới năm 2011/12 đạt 236,03 triệu tấn, giảm 28,71 triệu so với sản lượng 264,74 triệu sản lượng giảm Brazil (-10,00 triệu tấn), Mỹ (-7,44 triệu tấn), Achentina (-8,00 triệu tấn), Trung Quốc (-1,60 triệu tấn), Ấn Độ (-1,2 triệu tấn) Paragoay (-4,37 triệu tấn) Sản lượng đậu tương năm 2011/12 ước tính đạt (đơn vị: triệu tấn): Brazil 65,50; Mỹ 83,17; Achentina 41,00; Trung Quốc 13,50; ấn Độ 11,00; Paragoay 4,00; Canađa 4,25 nước khác 13,61.Tổng xuất đậu tương giới năm 2011/12 ước đạt 90,54 triệu tấn, giảm so với 92,64 triệu năm 2010/11 Trong đó, xuất nước ước tính đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 36,70; Mỹ 36,74; Achentina 7,80; Paragoay 3,10; Canađa 2,80 nước khác 3,40 [54] Tổng sản lượng đậu tương giới năm 2012- 2013 dự báo đạt 260,46 triệu tấn, điều chỉnh giảm 6,70 triệu (-2,51%) so với dự báo đưa hồi tháng 7/2012, song tăng 24,43 triệu (+10,35%) so với sản lượng 236,03 triệu năm 2011- 2012, sản lượng mỹ tiếp tục giảm 9,91 triệu (11,91%) Sản lượng đậu tương năm 2012- 2013 nước dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 81,00; Mỹ 73,27; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ 11,40; Paragoay 8,10; Canađa 4,50 nước khác 14,59 Tổng xuất đậu tương giới năm 2012- 2013 dự báo đạt 93,97 triệu tấn, tăng so với 90,54 triệu năm 2011- 2012 Xuất đậu tương nước năm 2012- 2013 dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 37,60; Mỹ 30,21; Achentina 13,50; Paragoay 5,40; Canađa 3,00 nước khác 4,26 (Oilseeds: World Markets and Trade, August 2012) NVT [54] Theo dự báo Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương giới năm 2012/13 đạt 258,13 triệu tấn, điều chỉnh giảm 2,33 triệu (-0,89%) so với dự báo hồi tháng 8/2012, song tăng 21,04 triệu (+8,88%) so với 237,09 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 13 triệu năm 2011/12 Diện t ch đậu tương toàn cầu dự báo đạt 108,12 triệu ha, tăng so với 102,10 triệu năm 2011/12; suất đậu tương dự báo đạt bình quân 2,39 tấn/ha, tăng so với 2,32 tấn/ha năm 2011/12 Sản lượng đậu tương năm 2012/13 nước dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 81,00; Mỹ 71,69; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ 11,40; Paragoay 8,10; Canađa 4,40 nước khác 13,94 [54] Mặc dù có lịch sử phát triển lâu đời nước ta, trải qua thời gian dài đậu tương chiếm vị trí khiêm tốn sản xuất nông nghiệp nước ta Năm 1976, diện t ch đậu tương đạt gần 40 ngàn ha, suất 5,2 tạ/ha, sản lượng 20,7 ngàn Năm 1995 có diện tích lớn đạt 121,1 ngàn ha, suất 10,3 tạ/ha, sản lượng 125,5 ngàn [65] Trong năm gần điều kiện thời tiết không thuận lợi khiến sản lượng đậu tương nước ta giảm đáng kể cụ thể năm 2013 giảm 3% so với năm 2012, xuống cịn 168 nghìn Mưa bão nặng nề kéo dài suốt năm khiến suất trồng diện t ch thu hoạch đậu tương (Bảng 1.1 Hình 1.4) Quy mơ sản xuất nhỏ lẻ so với loại trồng khác ch nh nguyên nhân khiến ngành đậu tương không đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước Tổ chức USDA dự báo điều kiện thời tiết thuận lợi, diện t ch gieo trồng đậu tương năm 2013 2014 đạt 120 nghìn 130 nghìn héc-ta, với mức sản lượng tăng nhẹ khoảng 176 192 nghìn Khả cạnh tranh đậu tương so với ngơ cịn thấp sản lượng t nh héc-ta trồng đậu tương thấp so với trồng ngô Khu vực trồng đậu tương ch nh tập trung vùng Đồng sông Hồng, miền Bắc nước ta [65] Theo USDA, sản lượng đậu tương năm tới tăng đạt mục tiêu mà Ch nh phủ đề Quy hoạch Tổng thể cho ngành hạt có dầu 350 nghìn héc-ta diện t ch trồng trọt 700 nghìn sản lượng vào năm 2020 Tuy nhiên, suất nhìn chung thấp việc mở rộng diện t ch trồng trọt ngành chưa cao, nguyên nhân ch nh khả cạnh tranh đậu tương Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 14 Bảng 1.1 n n ng ản lượng đậ ương 11-2015 [65] 2011 2012 2013 2014* 2015* Diện t ch (nghìn ha) 181,1 119,6 117,8 120 130 Năngsuất (tấn/ha) 1,47 1,45 1,43 1,47 1,48 Tổng sản lượng(nghìn tấn) 266,9 173,7 168,4 176,4 192,4 N uồ : Tổ ệu ụ T ố ê V ệt N m (GSO), B N ệ v P tt N t ,* ố USD Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu d báo 1.1 Diện t ch trồng sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) [65] 1.2 Bệ d SMV t ê c đậu tươ 1.2.1 Bệnh khảm đậu tương Soybean mosaic virus (SMV) nhân tố biotic gây bệnh khảm đậu tương, xảy tất vùng sản xuất đậu tương giới Triệu chứng biểu bệnh SMV khác với vật chủ, chủng virus, tuổi nhiễm mơi trường Giống nhiễm nặng cịi cọc yếu ớt đơi bị lùn, Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 15 khơng có lơng, khơng có hạt Lá chét mọc lên có màu xanh đậm, nhạt sau bị rộp phồng lên, đặc biệt dọc theo gân Lá số giống thấy vùng hoại tử tổn thương, tượng vàng rụng Các triệu chứng gần giống triệu chứng đậu tương bị ngộ độc thuốc diệt cỏ 2,4D Hạt giống từ bị nhiễm bệnh bị đốm nâu đen, tùy thuộc vào màu sắc rốn hạt Hạt nhỏ nảy mầm so với hạt không bị nhiễm Những vết lốm đốm có mặt virus khơng phải tất hạt chứa virus tất hạt từ nhiễm virus lốm đốm Bệnh khảm đậu tương lần phát Mỹ vào năm 1900 đến virus khảm có mặt hầu hết vùng trồng đậu tương giới [35] Việt Nam công bố phát loại virus từ năm 1994, chủ yếu tập trung vùng trồng đậu tương lớn, khu vực trung du, miền núi Bắc Bộ, khu vực đồng Sông Hồng Tây Nguyên [2], [11] SMV gây thiệt hại đáng kể suất, chí số trường hợp tổn thất lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương Những bị nhiễm SMV thường sinh trưởng chậm, hình thái lá, thân, bị biến dạng, bị nhiễm giai đoạn muộn làm giảm sản lượng chất lượng hạt [35], [36] SMV hình que cong queo gồm chuỗi RNA đơn Nhiều chủng virus xác định dựa phản ứng tập hợp giống khác Tại hoa kỳ, SMV phân loại thành chủng chủng biết từ G1 đến G7, G7a, C14 Có thể có chủng khác tồn tại, đặc biệt Trung Quốc Nhật Bản [65] SMV lan truyền quần thể đậu tương nhờ rệp người ta biết đến t có 32 lồi rệp thuộc 15 chi khác truyền SMV cách không ổn định Kết bị nhiễm bệnh lan truyền qua hạt đóng vai trị quan trọng nghiên cứu bệnh SMV Những nguồn Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 16 truyền cho SMV Trong hầu hết giống đậu tương, lan truyền bệnh qua hạt vài giống giống khác lên đến 75% [65] 1.2.2 Đặc điểm c a SMV SMV sinh thể vùi tế bào bệnh Thể vùi có dạng hình múi khế hay hình chong chóng [11] Thời gian tồn virus bệnh 2-5 ngày, nhiệt độ hoạt tính 55-700C Khi bị chiếu tia cực tím virus bị hoạt tính hai Nhiệt độ thích hợp để virus nhân lên tế bào bệnh 21-260C SMV tồn lan truyền qua hạt giống Trong hạt giống virus tồn hai năm Ngồi ra, virus lan truyền quần thể đậu tương qua loài rệp Aphis SMV có phạm vi ký chủ rộng gây hại 30 loài trồng đặc biệt họ đậu Bệnh phát triển mạnh đậu tương trồng vào vụ đông vào giai đoạn hoa hình thành Bệnh gây hại nặng ruộng đậu tương chăm sóc kém, bón nhiều đạm bón phân khơng cân đối Khi bị bệnh đậu tương thường có phần xanh nhạt, đậm biến vàng xen kẽ, nhăn nheo, mép cong xuống, đốt thân co ngắn, chùn lại, phát triển chậm Lá non khảm mạnh biến dạng Số lượng nốt sần bệnh thường giảm so với khoẻ nên vai trò cố định đạm giảm, rễ bệnh thường bị thối đen Ở giống mẫn cảm chết Bệnh gây hại làm thường lép, vỏ mầu nâu, nhăn nheo biến dạng, sần sùi có vị đắng Cây bị nhiễm bệnh thể triệu chứng rõ nhiệt độ 10-200 150C 300C thường triệu chứng [11], [49], [58] SMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây bệnh khảm đậu tương, phát lần Clinton (1915), Gardener Kendrick (1921) Hoa Kỳ Chúng có dạng hình sợi mềm với chiều dài khoảng 750nm, đường kính khoảng 11-15nm [48] Hệ gen SMV RNA dạng sợi đơn dương, phân tử lượng 3,25 x 106 kDa, tổng k ch thước gen khoảng 10,4 Kb Hệ gen SMV gồm gen mã hóa 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polypeptid: P1 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 17 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), kDa protein (6K2), Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP) Hệ gen SMV gồm gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polipeptid mô theo sơ đồ hình 1.2 Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen SMV [48] HC-Pro: thành phần trợ giúp protease; CI: protein hình trụ; NIb RNA polymerase phụ thu c RNA; P1, P3, NIa protease; CP: protein vỏ c a virus; VPg: protein liên kết Hạt SMV tạo thành từ khoảng 2000 tiểu đơn vị tạo nên lớp vỏ protein (coat protein) xếp theo kiểu xoắn ốc xung quanh hệ gen RNA virus [16] Gen CP SMV có k ch thước 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, từ amino acid thứ 33 đến 264 CP gọi vùng Poty- coat [37] Trong nghiên cứu Lị Thị Mai Thu (2014), trình tự đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 SL2 có k ch thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid vùng Poty- coat protein có 208 amino acid [16] 1.3 ng ng ậ RNAi ong o đậ ương ng n ng 1.3.1 Cơ chế ức chế gen c a RNAi Năm 1998, hai nhà khoa học Mỹ Andrew Fire Craig Mello công bố phát họ chế làm suy biến RNA thông tin (mRNA) mã từ gen xác định họ gọi “RNA can thiệp” Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 18 Cơ chế kích hoạt phân tử RNA kép (dsRNA) xuất tế bào Khi chuỗi dsRNA kích hoạt “cỗ máy” sinh hoá, làm suy biến phân tử mRNA mã di truyền từ ADN không biểu chức giải mã, cho chuỗi protein tương ứng Đặc biệt, can thiệp RNA với chuỗi dsRNA ngắn trực tiếp thực tế bào động vật có vú mà khơng gây nên hiệu ứng khơng đặc hiệu Từ đó, ứng dụng cơng nghệ RNAi sử dụng để xác định đánh giá chức hàng ngàn gene hệ gen có tiềm tham gia vào kiểu hình bệnh Mặt khác, cơng nghệ RNAi cung cấp phương tiện hiệu để ngăn chặn biểu gen cụ thể có liên quan đến bệnh tật [25] Hình 1.3 mơ tả chế RNAi phân hủy RNA Các phần tử quan trọng tham dự vào chế can thiệp RNA hai enzymes, Dicer Argonaute, RNA k ch thước nhỏ (si RNA) tạo từ RNA sợi đôi (ds RNA) Khi có xâm nhập chuỗi xoắn kép RNA vào tế bào, Dicer cắt chuỗi kép RNA đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotides, gọi siRNA có tiêu hao phân tử ATP Sau bị cắt ngắn Dicer, chuỗi kép RNA can thiệp tách làm hai chuỗi đơn, chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA xảy phức hệ RISC (RNA-induced silencing complex), có chứa Argounaute Helicase Phức hệ RISC sau thu nhận phân tử phiên mã mRNA tế bào có trình tự tương đồng với trình tự đoạn chuỗi đơn siRNA lúc có mặt phức hệ RISC Sau nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp base tương đồng với trình tự siRNA, mRNA bị cắt đứt khoảng chuỗi kép siRNA-mRNA Phức hệ RISC cắt mRNA, làm phân tách phân tử mRNA mà khơng giải mã nên khơng có protein tổng hợp hay nói cách khác làm cho RNA bị suy thối [63] Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 19 1.3 Cơ chế RNAi phân hủy RNA [55] RNAi đóng vai trị quan trọng việc chống lại xâm nhiễm virus vào thể vật chủ, đặc biệt sinh vật bậc thấp Bên cạnh RNAi cịn đưa nhiều ứng dụng thú vị kỹ thuật gen tạo hội nghiên cứu sinh học y dược, kỹ thuật gen chăm sóc sức khỏe Khám phá RNAi không cung cấp cho công cụ thí nghiệm mạnh mẽ để nghiên cứu chức gene mà cịn có nhiều tiềm ứng dụng tương lai can thiệp RNA y học, sinh học Dựa vào hoạt động chế RNAi, tiến hành thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả ức chế hoạt động gen ngoại lai, nhằm tạo giống chuyển gen kháng bệnh virus hữu hiệu 1.3.2 Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens ứng dụng rộng rãi để chuyển hay nhiều gen vào trồng nhiều đặc t nh ưu việt hệ thống chuyển gen A.tumefaciens loài vi khuẩn đất, gram (-), gây bệnh ung thư thực vật, chủ yếu lấy nhiễm thực vật qua vết thương [11] Có thể Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 20 truyền bệnh từ loài sang loài khác Thực vật bị thương ứa hợp chất amino acid, đường acid vơ yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm cách hóa hướng động A.tumefaciens có khả chuyển đoạn DNA từ Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào tế bào thực vật Ti plasmid phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử 3-5% so với trọng lượng phân tử nhiễm sắc thể vi khuẩn Ti plasmid có k ch thước khoảng 200 kb, tế bào chúng tồn đơn vị chép độc lập gồm vùng tương đồng: A, B, C D Ti plasmid không dùng trực tiếp thí nghiệm chuyển gen số nhược điểm: có k ch thước lớn, mang gen gây khối u, khơng thể tự nhân lên… Vì vậy, nhà khoa học cải tiến Ti plasmid, cắt bỏ hầu hết gen không cần thiết thay vào gen thị cho chọn lọc, gen đánh dấu promoter thích hợp để Ti plasmid nhân lên biểu E.coli, A.tumefaciens tế bào thực vật Các vector sử dụng có hiệu chuyển gen thơng qua A.tumefaciens là: vector liên hợp vector nhị thể Vector (cointegrate) liên hợp Ti plasmid vector mang số đoạn chức vector thông thường khác E coli, thường gồm phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E coli; ii) Gen thị có t nh kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động E coli A tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu E coli, không hoạt động A tumefaciens Như vậy, vector liên hợp thực chất vector lai có chỗ cho GOI nhờ hành khách vào tế bào thực vật [1], [12] Hệ vector nhị thể (binary vector) đặc trưng việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid vector T – DNA Khắc phục tình trạng khó nhân A tumefaciens, loại vector nhị thể thiết kế bao gồm phần sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái hoạt động Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... tài ? ?Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng chuyển gen kháng Soybean mosaic virus? ?? ục t ê c u Tạo dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV giống. .. đậu tương DT84 Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng đậu tương chuyển gen mang cấu. .. ta tạo trồng có khả kháng lại bệnh virus cách đưa ch nh gen virus gây bệnh vào hệ gen chủ Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống trồng chuyển gen kháng loại bệnh virus khác tạo ra, đậu chuyển gen