Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số : 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Đỗ Hữu Nghị 2.TS Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ quy tắc Kết trình bày luận văn thu thập trình nghiên cứu trung thực, chưa công bố trước Thái Nguyên, tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Xuân Thành Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Luận văn thực phịng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) có liên quan đến nội dung nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá hợp chất có hoạt tính chống ung thư mức độ tế bào hướng đích phân tử" (VAST 04.05/18-19) Để hồn thành luận văn tơi nhận động viên, giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân tập thể Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Hữu Nghị TS Nguyễn Xuân Vũ, người thầy trực tiếp hướng dẫn tơi tận tình q trình thực đề tài, giúp tơi vượt qua khó khăn hồn thành tốt luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Hồng Nhung cán phịng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, cán Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên giúp đỡ, trang bị kiến thức tạo điều kiện cho tơi q trình học tập Cuối tơi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ động viên tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tầm quan trọng ý nghĩa vấn đề cần nghiên cứu 1.2 Tổng quan vấn đề nghiên cứu .2 1.2.1 Tổng quan ung thư .2 1.2.2 Ung thư cổ tử cung 1.2.3 Sàng lọc hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.2.4 Hoạt tính điều hịa chu kỳ tế bào (cell cycle) 11 1.2.5 Hoạt tính điều hịa yếu tố nhân kappa B (NF-B) 12 1.2.6 Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào đích phân tử 15 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ nghiên cứu tối ưu kỹ thuật huỳnh quang tế bào 22 2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng chất thử phân tích tín hiệu huỳnh quang đặc trưng 22 2.2.3.Nghiên cứu phát chuyển vị yếu tố nhân NF-κB 22 2.3 Vật liệu 22 2.3.1.Dòng tế bào 22 2.3.2.Mẫu thử nghiệm .22 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 2.3.3 Môi trường nuôi cấy tế bào 23 2.3.4 Hóa chất thiết bị 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu .24 2.4.1 Ni cấy hoạt hóa tế bào 24 2.4.2 Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào – phương pháp MTT .25 2.4.3 Kích hoạt yếu tố NF-κB 27 2.4.4 Cố định tế bào 27 2.4.5 Nhuộm huỳnh quang tế bào đích phân tử 28 2.4.6 Thu nhận phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào hệ Olympus scanR 28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư .30 3.2 Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB dòng tế bào HeLa 32 3.2.1 Kích thích chuyển vị NF-κB 32 3.2.2 Thu nhận hình ảnh huỳnh quang 33 3.2.3 Thiết lập thơng số phân tích hình ảnh 35 3.2.4 Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB .37 3.2.5 Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB tế bào HeLa 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 Kết luận .43 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHLB: Cơng hịa liên bang CTC: Cổ tử cung DMEM: Dulbecco’s modified Eagle medium – Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM DMSO: Dimethyl Sunfoxide EMEM: Eagle’s Minium Essential Medium – Môi trường EMEM GFP: Green fluorescent protein – Protein huỳnh quang xanh HBV: Hepatitis B virus – Viêm gan B HCTN: Hợp chất tự nhiên HCV: Hepatitis C virus – Viêm gan C Hela: Human cervical cancer cells – Tế bào ung thư cổ tử cung Hep-G2: Hepatocellular carcinoma – Tế bào ung thư gan HPV: Human papilloma virus – Virus u nhú người IC50: Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% cá thể KHCNVN: Khoa học công nghệ Việt Nam MTT: Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide NF-κB: Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – Yếu tố nhân kappa B OD: Optical density – Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphate TB: Tế bào Tp: Thành phố UTCTC: Ung thư cổ tử cung UTG: Ung thư gan Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh sách mẫu hóa học sử dụng nghiên cứu sàng số hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 23 Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào số mẫu hợp chất thiên nhiên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa 30 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết bệnh ung thư toàn giới năm 2018 hai giới Hình 1.3: Sự phát triển tế bào ung thư Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan bệnh viêm 13 Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang 21 Hình 2.1: Cấu trúc phân tử tetrazolium formazan 26 Hình 3.1: Biểu đồ khả ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ khác mẫu tinh có biểu hoạt tính 32 Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng chuyển vị NF-κB dòng tế bào HeLa Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) TNF ( ▲ ) 33 Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa kênh lọc DAPI theo peak chỉnh tinh (Fine) chỉnh thô (Coarse) trục Z 34 Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFP-p65), DNA nhân tế bào (DAPI) chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE) Hình ảnh ghi thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR 35 Hình 3.6: Lựa chọn thơng số xác định viền kích thước hình ảnh đối tượng phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 36 Hình 3.7: Tạo thơng số xác định đường viền đối tượng phân tích Main Object (kênh DAPI) phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP) Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách (distance) = -1 37 Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB IL-110 ng/mL 30 phút 38 Hình 3.9: Phân tích chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang protein p65 vùng tế bào chất nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 39 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn viii Hình 3.10: Xác định hệ số Z' nhóm đối chứng (control) tế bào HeLa kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên) Biểu đồ phân tán cường độ tín hiệu vùng tế bào chất nhân với đối chứng Control (-) kích hoạt với IL-1 (hình dưới) 41 Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hịa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa chuyển vị NF-κB (p65 gắn GFP) Nhân xác định đồng thời với nhuộm DAPI 42 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển đất liền) chiếm quan tâm lớn nghiên cứu phát triển sản phẩm có ích cho người từ xa xưa tới Sự đa dạng sinh học hóa học sinh giới đóng vai trị quan trọng lĩnh vực Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm làm để phát khai thác chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên cách có hiệu Qua q trình phát triển với việc áp dụng công nghệ tiên tiến, ngày nghiên cứu hóa học định hướng hoạt tính sinh học trở thành sở sàng lọc hiệu cao (High Throughput Screening -HTS) nhiều nước giới nhằm phát hợp chất tiềm Các phương pháp thử nghiệm sinh học sàng lọc hoạt tính trở thành cơng cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm hợp chất tiềm cho nhiều mục đích sinh học khác Trong lĩnh vực mà hợp chất thiên nhiên giữ vai trò quan trọng khai thác thuốc chống ung thư Điển gần nghiên cứu hợp chất từ sinh vật biển có nhiều thành cơng lĩnh vực với 15 chất chứng nhận FDA qua thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư Cơng nghệ ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động phát triển nhằm truy suất kết phân tích kiểu hình cho mục đích khác phát triển quy mơ sàng lọc giảm thiểu bước thực nghiệm Bằng việc sử dụng marker huỳnh quang tương thích sinh học quan sát ảnh hưởng lên chức sinh lý thay đổi kiểu hình tế bào từ đưa chuẩn đốn phương thức tác động chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint) Đó thường q trình đóng vai trị then chốt q trình sống phân chia tế bào Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào ứng dụng phân tích tín hiệu tế bào (yếu tố NF-κB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor ), sinh lý tế bào (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, trình chết theo chương trình TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro thuốc/chất thử, sinh lý bệnh Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn (miễn dịch, tim mạch, bệnh truyền nhiễm ) đánh giá chức phân tử đích Sử dụng kỹ thuật đánh giá chất tiềm giúp nhà hóa học, nhà dược học đánh giá xác hiệu chất thử tiết kiệm thời gian, kinh phí cho thử nghiệm động vật (in vivo) đồng thời cung cấp thông tin tác dụng dược lý chất thử Do vậy, kỹ thuật sàng lọc hiệu cao dựa phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào nhân tố cốt lõi khoa học sống nghiên cứu phát triển thuốc đại Nhằm tiếp cận bước đầu ứng dụng kỹ thuật đại sàng lọc đánh giá chất có hoạt tính sinh học, tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào sàng lọc số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học" Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài luận văn nghiên cứu khả ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào sàng lọc chất có hoạt tính chống ung thư hướng đích phân tử (yếu tố nhân NF-κB) điều kiện nước Đối tượng nghiên cứu * Họat tính chống ung thư mức độ tế bào sàng lọc dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa * Đánh giá hoạt tính chống ung thư dựa phân tích chuyển vị protein nội bào (yếu tố nhân NF-κB) sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi huỳnh quang tự động Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu phát chuyển vị yếu tố nhân NF-κB thử nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn tương tác protein nội bào xẩy nhanh phức tạp Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA (electrophoretic mobility shift assay) thường sử dụng để phát liên kết đặc hiệu NF-κB DNA sử dụng kỹ thuật Western blot Một yếu điểm phương pháp chúng không cung cấp đầy đủ thơng tin mẫu phân tích phức tạp thiếu độ tin cậy Ví dụ, quan sát giảm 50 % độ mạnh tín hiệu phát không đồng nghĩa với việc giảm 50 % 100 % Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn quần thể Trong phân tích trắc lưu tế bào flow cytometry cung cấp nhiều liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, nhiên rõ ràng kỹ thuật thu liệu phân tích nội bào từ tín hiệu huỳnh quang Những hạn chế khắc phục kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang Do nghiên cứu kết hợp phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân tích hình ảnh nội hàm cao hệ thiết bị hiển vi tự dộng Olympus scanˆR với quy trình đơn giản chi phí thấp, phù hợp với điều kiện nước Hơn nữa, quy trình đồng thời phát triển ứng dụng cho phân tích phân tử đích protein khác với đặc tính tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ NRF2 (nuclear factor erythroid-related factor 2) - yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy hóa, ung thư q trình viêm Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tầm quan trọng ý nghĩa vấn đề cần nghiên cứu Ung thư nguyên nhân gây chết hàng đầu nước có kinh tế phát triển thứ hai nước phát triển Gánh nặng ung thư nước phát triển tăng lên hậu lối sống không lành mạnh hút thuốc lá, uống rượu bia, vận động hay nhiễm thực phẩm môi trường Chúng ta biết thực phẩm lành mạnh đóng vai trị quan trọng phịng điều trị bệnh mãn tính khơng lây có ung thư Chính vậy, nhà khoa học khơng ngừng nghiên cứu tìm hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc thực vật, góp phần tích cực hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm mưa nhiều nên có thảm thực vật vô phong phú đa dạng Với nguồn thực vật phong phú không cung cấp dinh dưỡng cho người mà phương thuốc chữa bệnh quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng bệnh khác nói chung Bởi vậy, nghiên cứu tìm hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có sẵn nước ta để hỗ trợ điều trị ung thư nhiều nhà khoa học thầy thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu nhiều năm [1] Trong khoa học khám phá sử dụng nhiều hợp chất thiên nhiên (HCTN) có hoạt tính sinh học quý từ động, thực vật vi sinh vật Tuy nhiên, giới sinh vật phong phú đa dạng, cịn nhiều lồi sinh vật chưa nghiên cứu khai thác, đặc biệt sinh vật biển sâu [3] Do vậy, nguồn HCTN (sinh vật biển đất liền) chiếm quan tâm lớn nghiên cứu phát triển dược phẩm có ích cho người từ xa xưa tới Việc sàng lọc hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học để xác định chất tiềm vấn đề cần quan tâm trình nghiên cứu phát triển thuốc Trong đó, lĩnh vực mà HCTN bán tổng hợp giữ vai trò quan trọng khai thác thuốc chống ung thư Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Cơng nghệ ghi hình ảnh tế bào (TB) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động phát triển nhằm truy xuất kết phân tích kiểu hình cho mục đích khác phát triển quy mơ sàng lọc giảm thiểu bước thực nghiệm ngày nhà khoa học quan tâm nhiều phịng thí nghiệm điểm quốc gia đầu tư đại Bằng việc sử dụng marker huỳnh quang tương thích sinh học quan sát ảnh hưởng lên chức sinh lý thay đổi kiểu hình TB từ đưa chẩn đốn phương thức tác động chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint) Đó thường q trình đóng vai trị then chốt chu trình sống phân chia TB Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang TB ứng dụng phân tích tín hiệu TB (yếu tố NF-KB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor,…), sinh lý TB (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, trình chết theo chương trình TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro thuốc/chất thử, sinh lý bệnh (miễn dịch, tim mạch, bệnh truyền nhiễm,…) đánh giá chức giúp nhà hóa học, nhà dược học đánh giá xác hiệu chất thử tiết kiệm thời gian, kinh phí cho thử nghiệm động vật (in vivo) đồng thời cung cấp thông tin tác dụng dược lý chất thử Đề tài luận văn thực phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học HCTN) – đơn vị trang bị hệ thống sàng lọc phân tích nội hàm cao thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scan’R (Heidelberg, CHLB Đức) sử dụng cho mục đích sàng lọc, đánh giá chất hoạt tính sinh học Do vậy, đề tài xuất phát từ yêu cầu tính cấp thiết việc phát triển phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học đạt trình độ tiên tiến, có độ xác cao, mặt khác nội dung thực đề tài bao gồm sàng lọc, phân tích hoạt tính chống ung thư số mẫu hợp chất thiên nhiên ứng dụng kỹ thuật sàng lọc/phân tích hình ảnh huỳnh quang TB 1.2 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.2.1 Tổng quan ung thư Ung thư thuật ngữ sử dụng cho bệnh mà tế bào bất thường phân chia khơng kiểm sốt thể xâm nhập vào mô khác Các TB ung thư lan tới phận khác thể thông qua hệ thống máu hạch bạch huyết Có 100 loại ung thư khác biết đến y văn giới, hầu Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn hết chúng đặt tên dựa vào mô quan mà chúng gây bệnh [11] Mỗi loại ung thư trải qua nhiều giai đoạn thứ tự thời gian: giai đoạn khởi phát, giai đoạn tăng trưởng thúc đẩy, giai đoạn lan tràn, giai đoạn tiến triển – xâm lấn - di Từ tế bào, qua trình khởi phát dẫn đến biến đổi mà khồi phục kết hình thành ung thư Nếu khơng có sửa chữa có khơng kết cuối ung thư có biểu lâm sàng dẫn đến tử vong Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư Ngày nay, ung thư trở thành mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng thu hút ý tồn giới Ngun nhân ung thư gây theo ba yếu tố, là: chế độ ăn uống không lành mạnh, yếu tố di truyền yếu tố môi trường Người ta ước tính khoảng 95% loại ung thư lối sống khoảng 20 - 30 năm để phát triển thành ung thư Con người phải đối mặt với tỷ lệ ung thư tử vong ung thư ngày tăng [20] Trong năm 2018, có khoảng 9,6 triệu người tử vong 18 triệu người bị ảnh hưởng trực tiếp loại ung thư khác quy mô giới theo số liệu GLOBOCAN toàn cầu gần cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế [28] Các số liệu thống kê cho thấy đàn ông thường bị ung thư phổi, gan, ruột kết, trực tràng ung thư tuyến tiền liệt, phụ nữ thường bị ung thư vú, ruột già, trực tràng ung thư dày [6] Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo kỷ 21 kỷ ung thư, bệnh tim mạch bệnh khơng lây nhiễm khác q trình thị hóa, cơng nghiệp hóa, cộng thêm di chứng chiến tranh tồn đe dọa đến sức khỏe người ngày [7] Theo thống kê số bệnh viện ung bướu Hà Nội, Hồ Chí Minh số tỉnh khác năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn người mắc phải loại ung thư khác 73% bệnh nhân (khoảng 70.000 bệnh nhân) tử vong cao giới số có xu hướng tăng tương lai gần Dự báo đến năm 2020 có khoảng 200.000 ca ung thư 100.000 ca tử vong năm Việt Nam [31] Những bệnh ung thư phổ biến giới Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết bệnh ung thư toàn giới năm 2018 hai giới Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Ung thư bệnh di truyền hầu hết loại ung thư phát sinh từ thay đổi (đột biến) ADN (deoxyribonucleic acid) TB bình thường Ung thư bắt đầu gây tổn hại tới nhiều gen TB đơn lẻ Tổn thương làm cho TB tăng sinh khơng kiểm sốt tạo TB bất thường Ở giai đoạn này, hệ thống miễn dịch thể không tiêu diệt hay sửa chữa TB bất thường này, chúng phát triển cuối chuyển thành TB ung thư Các đặc tính TB ung thư chúng phân chia nhanh TB bình thường hình thành khối u ác tính, khối u xâm nhập mơ khỏe mạnh Q trình TB bình thường trở thành khối ung thư thường nhiều năm để phát triển Hình 1.3: Sự phát triển tế bào ung thư Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Trong nghiên cứu in vitro phân lập 200 dòng tế bào ung thư người ngày phịng thí nghiệm giới quan tâm ứng dụng cho việc sàng lọc để tìm kiếm thuốc tiềm chống ung thư tương lai Trong kể đến hai dòng ung thư phổ biến dòng tế bào ung thư gan người (HepG2) dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) Ngày nay, việc nghiên cứu sàng lọc để tìm kiếm hoạt chất chống lại ung thư quan tâm hàng đầu từ nhà khoa học theo hướng ức chế biểu hoạt tính enzyme tham gia vào trình phát triển di khối u, ức chế hình thành mạch xâm nhập khối u nguyên phát mức độ tế bào, sử dụng để ức chế di khối mô ung thư 1.2.2 Ung thư cổ tử cung Ung thư cổ tử cung (UTCTC) ung thư hình thành mơ cổ tử cung (CTC) gây việc nhiễm virus sinh nhú người (HPV) Hầu hết trường hợp UTCTC bắt đầu vùng chuyển tiếp cổ cổ ngoài, TB vùng chuyển tiếp bị tổn thương, nhiễm HPV biến đổi dẫn dần, phát triển thành tổn thương tiền ung thư UTCTC UTCTC bệnh ung thư tiến triền chậm, giai đoạn đầu thường khơng có triệu chứng phát thông qua phương pháp sàng lọc UTCTC [2] UTCTC gồm hai loại ung thư TB biểu mơ vảy ung thư TB tuyến, khoảng 80% đến 90% UTCTC ung thư TB biểu mô vảy phát triển TB vảy bao phủ bề mặt vùng cổ CTC, thường bắt đầu vùng chuyển tiếp Ung thư TB tuyến CTC phát triển từ TB trụ vùng cổ CTC Có tỷ lệ nhỏ UTCTC có tổn thương hai loại ung thư biểu mô TB vảy TB tuyến gọi ung thư hỗn hợp [2] 1.2.2.1 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam Thế giới UTCTC loại ung thư hay gặp nữ giới Bệnh tiến triển qua nhiều năm, ước tính giới có khoảng 1,4 triệu phụ nữ mắc UTCTC nhiều gấp - lần (khoảng triệu) phụ nữ có triệu chứng tiền lâm sàng cần phát điều trị Theo kết ghi nhận ung thư giới, UTCTC đứng hàng thứ ba loại ung thư chung, đứng thứ hai ung thư nữ giới sau ung thư Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ... đại sàng lọc đánh giá chất có hoạt tính sinh học, chúng tơi tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào sàng lọc số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC... tính sinh học" Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài luận văn nghiên cứu khả ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào sàng lọc chất có hoạt tính chống ung thư hướng đích phân