(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng soybean mosaic virus​

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC N NG Đ N T N TR TƯ NG T G N RN TẠ NG LU N ĂN T Ạ N G NG NG N R Ĩ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – / 2015 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NG NG G N NG Đ T N N TR RN TƯ NG T NG N NG TẠ NG N R Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LU N VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC N ọ : GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên – 5/2015 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), cơng nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng Ngồi trồng đậu tương cịn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng suất giống trồng khác Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nông nghiệp nước, 65% miền Bắc 35% miền Nam Hiện suất sản lượng đậu tương thấp phải nhập từ nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng làm thức ăn cho gia súc [53] Bên cạnh yếu tố hạn hán, kĩ thuật canh tác ngun nhân bệnh trùng, vi khuẩn virus gây ảnh hưởng không nhỏ đến suất, chất lượng đậu tương Hiện người ta xác định khoảng 30 loại bệnh hại đậu tương, có bệnh nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13] Bệnh khảm đậu tương bệnh hại xuất phổ biến đậu tương Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây Đậu tương bị nhiễm SMV thời điểm trước hoa suất giảm tới 40% 91% hạt đậu thu có vết lốm đốm, chất lượng [35] SMV lan truyền quần thể đậu tương rệp, học Hiện nay, biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn lan truyền SMV có tính chất phịng bệnh mà chống lại triệt để Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta tạo trồng có khả kháng lại bệnh virus cách đưa ch nh gen virus gây bệnh vào hệ gen chủ Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống trồng chuyển gen kháng loại bệnh virus khác tạo ra, đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), thuốc chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc (TMV) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com Xuất phát từ l trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng chuyển gen kháng Soybean mosaic virus” ục t ê c u Tạo dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV giống đậu tương DT84 Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mơ nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích có mặt gen chuyển dòng chuyển gen kỹ thuật PCR Xác định hiệu suất chuyển gen Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com ươ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 C đậu tươ 1.1.1 iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin muối khoáng Đậu tương loại hạt mà giá trị đánh giá đồng thời protein lipid Protein đậu tương có phẩm chất tốt loại protein thực vật Hàm lượng protein cao cá, thịt cao gấp hai lần hàm lượng protein có loại đậu đỗ khác [14] Hàm lượng axit amin có chứa lưu huỳnh methionin, sistein,… đậu tương gần với hàm lượng chất trứng Hàm lượng cazein, đặc biệt lizin cao, gần gấp rưỡi trứng Vì mà nói giá trị protein đậu tương cao nói hàm lượng lớn đầy đủ cân đối loại axit amin cần thiết Protein đậu tương dễ tiêu hóa thịt khơng có thành phần tạo nên cholesteron Khơng có dạng axit uric… Ngày nay, người ta biết thêm có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ tái sinh mô, làm cứng xương tăng sức đề kháng thể Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao loại đậu đỗ khác nên coi cung cấp dầu thực vật Hiện nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật mỡ động vật Lipid đậu tương chứa tỷ lệ cao axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật tránh xơ vữa động mạch [14] Trong đậu tương cịn có nhiều loại vitamin, đặc biệt hàm lượng vitamin B1 B2, ngồi cịn có loại vitamin PP, A, E, K, D, C… Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com loại muối khoáng khác [14] Do mà từ hạt đậu tương người ta chế biến 600 sản phẩm khác nhau, có 300 loại thức ăn phương pháp cổ truyền, thủ công đại dạng tươi, khô, lên men… làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… sản phẩm cao cấp đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… nước ta, từ hàng ngàn năm đậu tương cung cấp phần nhu cầu chất đạm cho người gia súc, thơng qua ăn cổ truyền chế biến từ đậu tương, phần tạo cân dinh dưỡng phẩn thức ăn cho người dân Đậu tương chế biến thành giị, chả cho người ăn chay Đậu tương vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dày ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, ốm dậy lao động sức Các chất lexithin cazein có đậu tương dùng riêng phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng Bột đậu tương sau ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp Thân đậu tương dùng làm thức ăn gia súc gia cầm tốt Ở nhiều nước phát triển người ta dùng đậu tương vào ngành công nghiệp khác chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn ngành hàng không Đậu tương cịn có khả t ch lũy chất đạm khí trời để tự túc làm giàu đạm cho đất nhờ cộng sinh vi khuẩn nốt sần rễ Trong điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nốt sần t ch lũy lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha Do nói nốt sần “nhà máy đạm tý hon”, nên trồng đậu tương tốn t phân đạm mà cịn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực việc cải tạo bồi dưỡng đất [14] Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 1.1.2 Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm phát Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Chúng có nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [14] Rễ đậu tương khác với rễ hồ thảo có rễ rễ phụ Rễ ăn sâu 30-50cm 1m Trên rễ mọc nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp tập trung nhiều tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt sần Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu kỹ thuật trồng [14] Trong điều kiện đất chua kiềm nốt sần hình thành pH thích hợp cho hình thành nốt sần 6-7, việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp quan trọng Điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến phát triển nốt sần Nhìn chung bón đầy đủ NPK nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy phát triển nốt sần, cịn hiệu kali khơng rõ Bón đạm khơng thích hợp ức chế hình thành phát triển nốt sần Nốt sần rễ đậu tương thường tập trung tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần dần sâu có khơng có Nốt sần đóng vai trị q trình cố định đạm khí trời cung cấp cho Lượng đạm cung cấp cho lớn khoảng 30-60 kg/ha Nốt sần dài l cm, đường kính mm, hình thành có màu trắng sữa, tốt có màu hồng Quan hệ vi sinh vật nốt sần với đậu tương mối quan hệ cộng sinh: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự không khí chuyển sang dạng đạm hữu sử dụng [14] Thân đậu tương thuộc thân thảo, có hình trịn, thân có nhiều lơng nhỏ Thân cịn non có màu xanh màu tím già chuyển sang màu Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com nâu nhạt, màu sắc thân cịn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc cịn non màu xanh hoa màu trắng cịn non thân có màu t m hoa có màu t m đỏ Thân có trung bình 14-15 lóng, lóng ph a thường ngắn, lóng ph a thường dài (vì lóng phía phát triển từ ngày 35-40 trở vào lúc sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tuỳ theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ - 10 cm Cây đậu tương vụ hè thường có lóng dài vụ xuân vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bị thường làm thức ăn cho gia súc Những giống thân to thường thân đứng có nhiều hạt chống gió bão Tồn thân có lớp lơng tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cuống Thực tế có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khoẻ Ngược lại giống khơng có lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều dài ngắn, dày thưa đặc điểm phân biệt giống với Từ lúc mọc đến có thật (3 kép) khoảng 25-30 ngày sau gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường [14] Về trình phát triển đậu tương, có 6-7 thật (4-5 kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh vào lúc hoa rộ Sự khác biệt đậu tương với trồng khác hoa rộ lại lúc thân cành phát triển mạnh Đây giai đoạn trình sinh trưởng sinh dưỡng sinh trưởng sinh thực cạnh tranh dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng, cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước vào thời kỳ tạo điều kiện cho rễ phát triển thuận lợi Trong kỹ thuật chăm sóc ta phải xới vun kết hợp với bón thúc phân cho đậu tương vào giai đoạn 3-5 kép, lúc có đầy đủ hoa sinh trưởng chậm dần dừng hẳn Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com Cây đậu tương có loại lá: mầm, nguyên, kép Lá mầm mọc có màu vàng hay xanh lục, tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng ni mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo đi, kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ chọn hạt to mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng Lá đơn to màu xanh bóng biểu sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Mỗi kép có chét, có 4-5 chét Lá kép mọc so le, kép thường có màu xanh tươi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh, giống thích hợp trồng làm thức ăn gia súc Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tuỳ theo giống, giống nhỏ dài chịu hạn khoẻ thường cho suất thấp Những giống to chống chịu hạn thường cho suất cao Nếu kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tích to hay nhỏ chi phối lớn đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các nằm cạnh chùm hoa giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Nếu điều kiện làm cho bị úa vàng vị tr thường bị rụng lép Các nhà chọn giống đậu tương đưa sở để nâng cao suất đậu tương tăng cường trình quang hợp muốn quang hợp với hiệu cao phải chọn có nhỏ, dày, đứng có dạng hình trứng Số nhiều to khoẻ vào thời kỳ hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi biểu sinh trưởng khoẻ có khả cho suất cao [14] Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc hoa thay đổi tuỳ theo giống thường có màu tím, tím nhạt trắng Đa phần giống có hoa màu tím tím nhạt Các giống đậu tương có hoa màu trắng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 10 thường có tỷ lệ dầu cao giống màu tím Hoa phát sinh nách lá, đầu cành đầu thân Hoa mọc thành chùm, chùm có từ 1-10 hoa thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương nhiều tỷ lệ rụng cao khoảng 30% có lên tới 80% [14] Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính hoa có nhị nhụy, hoa gồm đài, cánh hoa có 10 nhị nhụy Đài hoa có màu xanh, nhiều Các cánh hoa vươn khỏi đài từ ngày hôm trước việc thụ phấn xẩy vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 sáng trước nụ hoa chưa nở hoàn toàn Mùa hè hoa thường nở sớm mùa đông thời gian nở hoa ngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu tương thường thụ phấn trước hoa nở tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn thấp chiếm trung bình 0,5 - 1% Thời gian bắt đầu hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống thời tiết khác Giống chín sớm sau mọc 30 ngày hoa giống chín muộn 45-50 ngày hoa Thời gian hoa dài hay ngắn theo giống theo thời vụ Có giống thời gian hoa kéo dài 10-15 ngày Kết nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ đến ngày thứ 10 sau hoa bắt đầu nở Hoa đợt rộ tạo nhiều, trước sau đợt hoa rộ tỷ lệ đậu thấp Điều kiện thích hợp cho nở hoa nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ khơng khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80% Căn vào phương thức hoa người ta chia giống đậu tương làm nhóm: (i) Nhóm hoa hữu hạn: Thuộc giống sinh trưởng hữu hạn, hướng hoa theo trình tự từ xuống từ vào Những giống thường thấp hoa tập trung, hạt đồng (ii) Nhóm hoa vơ hạn: Thuộc giống sinh trưởng vơ hạn, có hướng hoa theo trình tự từ lên từ Những giống thường hoa phân tán, chín khơng tập trung phẩm chất hạt khơng đồng Trong thực tế, giống hoa tập trung gặp điều kiện bất thuận, hoa rụng nhiều nên thất thu nặng Còn giống thời gian hoa dài chín khơng tập trung bị rụng vào đợt hoa tiếp đợt sau nên khơng thất thu nặng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com ... tài ? ?Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng chuyển gen kháng Soybean mosaic virus” ục t ê c u Tạo dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV giống. .. đậu tương DT84 Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mơ nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng đậu tương chuyển gen mang cấu. .. hạt đậu tương chuyển gen Các nhà khoa học Việt Nam năm gần quan tâm vào việc nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gen, tập trung vào hướng cải thiện, nâng cao khả chịu hạn, kháng bệnh Việc tạo chuyển