STT Thành phần Th tích (µl) 1 Nước khử ion 8,6µl 2 Master Mix 12,5µl 3 SMV-CPi-Fi (10pmol/µl) 0,7µl 4 SMV-CPi-Ri (10pmol/µl) 0,7µl 5 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2,5µl Tổng Tổng thể tích 25µl 2.2.5. c đ ệu uất c u e
Hiệu suất chuyển gen được t nh theo công thức:
Hiệu suất chuyển gen = (%) Số dòng cây chuyển gen dương t nh với PCR
Tổng số mẫu biến nạp
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ươ 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N
3.1. t u c u cấu t c CPi v ố đậu tươ T 4
Vector chuyển gen pK7GW-CPi-SMV có cấu trúc gồm promoter 35S, đoạn gen CPi-SMV, các gen kháng kháng sinh CmR, Km và chứa accs điểm cắt của một số loại enzyme giới hạn (Hình 3.1).
Hình 3.1. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV) [15]
P35S: Promoter CaMV35S; attB1 và attB2: các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR; LB:
left T-DNA border; RB: right T-DNA border; T35S: terminator 35S; Kan: gen kháng kanamycin; CmR: gen kháng chloramphenicol; CPi: vị t í ạn CPi chèn vào; vị trí cắt gi i hạn c e zyme t ứng; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám mồ t ứng.
Tiến hành chuyển cấu trúc CPi -SMV vào giống đậu tương DT84 bằng kĩ thuật tái sinh đa chồi và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefacien qua nách lá mầm ở đậu tương theo phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001) [42]. Các nghiên cứu quy trình tái sinh đậu tương chủ yếu sử dụng hai phương pháp là tái sinh đa chồi và tái sinh qua phôi soma. Tuy nhiên phương pháp tái sinh qua phôi soma được nghiên cứu trên nhiều giống đậu tương khác nhau và cho thấy một số hạn chế, đó là nguồn nguyên liệu khó thu thập, thời gian tái sinh kéo dài (8 tháng), quy trình tương đối phức tạp. Trong khi đó phương pháp tái sinh qua đa chồi có nhiều ưu điểm hơn: chủ động được nguồn nguyên liệu, ít phụ thuộc vào
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thời vụ, rút ngắn thời gian tạo cây (3 tháng), đồng thời việc khử trùng nguyên liệu cũng tiến hành khá đơn giản. Có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen công bố gần đây đã thành công bằng việc sử dụng phương pháp này [40], [41], [43], [45].
Hạt đậu tương DT84 được khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ trong bình thủy tinh ở tủ hút (Hình 3.2).
A B
Hình 3.2. Giai đoạn khử trùng hạt đậu tương DT84