Các bước tiến hành:
(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl dung dịch đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong 90 phút.
(2) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.
STT Nồ độ gốc Nồ độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 4 CTAB 2% (w/v) 5 Nước khử ion download by : skknchat@gmail.com
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hạt đậu tương Khử trùng bề mặt (khí cClo, 16 giờ) Nảy mầm trên GM
Nuôi lỏng tạo huyền phù Ly tâm thu cặn khuẩn, hoà cặn
trong CCM (OD6000,6-1)
Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn Lây nhiễm 30 – 40 phút
Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l)
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM
(bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l )
Ra rễ trên RM (bổ sung IBA0,1 mg/l)
5 ngày
2 tuần
Ra cây
(giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin75 mg/l )
2 tuần
2 tuần/lần
14-20 ngày
Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen ở đậu tương qua nách lá mầm nhờ A. tumefaciens [8]
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70oC.
(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20o
C.
Ki m t m ợ v tinh sạch c a DNA bằ ện di
Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
Khuế ạ ạn gen CPi-SMV
DNA tổng số tách chiết từ lá đậu tương được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sử có mặt của gen chuyển trong các dòng đậu tương. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%. Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri có trình tự nucleotide thể hiện ở bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR bào gồm: biến tính ở 940C trong 3 phút; mỗi chuỗi phản ứng 35 chu kì với biến tính ở 940
C trong 1 phút, gắn mồi ở 570C trong 45 giây, tổng hợp chuỗi polynucleotid ở 720C; hoàn tất tổng hợp ở 720C trong 5 phút và kết thúc phản ứng ở 40C.
2.3. Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR khuếch đại đoạn CPi
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide c t ư c
đ N
SMV-CPi-Fi 5‟- CACCGCAGCAGAAGCTTACA - 3‟
294 bp SMV-CPi-Ri 5‟ - GCCCAAAAGAGTGTGCATGT - 3‟
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen CPi (SMV-BYMV) được trình bày ở bảng 2.4.