Kéo d i chồi v tạo cây ho n chỉnh
Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng như chất lượng chồi.
Loại môi trường
Thành phần
GM 3,052 g/l muối B5 + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,8 Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5
CCM 0,316 g/l muối B5 + 3,9 g/l MES + 30 g/l sucrose + 5 g/l agar, pH = 5,4
Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5 + 0,2 mM AS + 400 mg/l L-cysteine + 158 mg/l Sodium thiosulfate + 154 mg/l DTT + 0,25 mg/l GA3 + BAP
SIM 3,052 g/l muối B5 + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,6 Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5 + BAP
SEM 4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6. Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5 + 50 mg/l L-asparagine + 100 mg/l L- pyroglutamic acid + IAA + GA3
RM 1,58 g/l MS + 0,59 g/l MES + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6. Bổ sung: IBA + 1 mg/l vitamin B5
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang môi trường ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được đặt trên giá thể ra cây. Cây sống sót trên giá thể được đưa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.
Chuyển gen v o nách lá mầm hạt chín thông qua A. tumefacien
Dựa trên quy trình tái sinh đã được hoàn thiện tiến hành chuyển gen thông qua nách lá mầm hạt ch n, các bước thực hiện theo sơ đồ hình 2.1. Hạt đậu tương ch n sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm. Lá mầm đã bị tổn thương được nhiễm khuẩn Agrobacterium chứa gen quan tâm.
Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1trong thời gian 30 phút. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium bằng cách lấy một khuẩn lạc mang cấu trúc CPi ( SMV) nuôi trong môi trương 15ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh rifamycin và spectinomycin, bình lỏng được cho vào tủ lắc 117 vòng 280C nuôi qua đêm (16-20h), sau đó tiếp tục bổ sung 1ml LB lỏng nuôi khỏe thêm 1-2h đến khi OD600 đạt 0,6-1.
Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu thấm khô sau đó đặt mẫu đã lây nhiễm lên mặt môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 4- 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được cho vào trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM lỏng) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim lắc với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt phần chồi chính trên các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh th ch hợp. Sau 2 tuần, các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh th ch hợp. Khi các chồi đạt k ch thước từ 3-5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM).
2.2.4. ươ ọc tử
P t ết DN tổ ố
DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của Saghai và cộng sự (1984) [47] với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2.