Hạt sau khi khử trùng được cho nảy mầm trên môi trường GM từ 4-5 ngày, sau đó cắt lấy phần lá mầm để tạo nguyên liệu cho biến nạp. Lá mầm được tách làm đôi sau đó loại đỉnh sinh trưởng và gây tổn thương bằng dao nhọn và kim châm để tạo đa chồi (Hình 3.4). Kết quả tạo đa chồi ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen.
Hình 3.3. Hạt đậu tương DT84 nảy mầm trên môi trường GM chuẩn bị nguyên
liệu biến nạp (A: Hạt nảy mầm t ê m t ng GM;B: Hạt DT84 sau 4-5 ngày tuổi)
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Sau khi gây tổn thương mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1 trong thời gian 30 phút và sau đó chuyển mẫu sang môi trường đồng nuôi cấy (Hình 3.4).
ch m
A B C
3.4. Lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm
: N mầm B: mầm tổ t m t ị uy C: u ế ạ uy m t ồng nuôi cấy
Mẫu biến nạp được chuyển sang môi trường cảm ứng tạo đa chồi chọc lọc trên SIM lần 1 và SIM lần 2, sau đó chuyển sang môi trường kéo dài chồi (Hình 3.5).
A B C
3.5. Mẫu biến nạp nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi,
kéo dài chồi và chọn lọc (A: Cảm ứng tạ ồi và chọc lọc trên SIM lần 1; B: Cảm ứng tạ ồi và chọn lọc trên SIM lần 2; C: Kéo dài chồi)
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Mỗi mẫu sau khi biến nạp được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh, những mẫu sống sót qua 2 lần chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ sau đó đem trồng trên giá thể trong nhà lưới (Hình 3.6).
Hình 3.6. A: Ra rễ ên mô ường RM; B: Ra cây và trồng trong chậu ở
n lưới[ 39]
Đồng thời với thí nghiệm chuyển gen qua nách lá mầm thông qua A. tumefaciens thí nghiệm, ở lô đối chứng 1 (ĐC1)- lá mầm đậu tương không được chuyển gen và cấy trên môi trường có kháng sinh, và ở lô đối chứng 2 (ĐC2) với lá mầm đậu tương không được chuyển gen cấy trên môi trường không có kháng sinh. Kết quả biến nạp, tạo đa chồi và kéo dài chồi trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1 là kết quả biến nạp cấu trúc pK7GW-CPi-SMV vào giống đậu tương DT84 ở ba lần thí nghiệm lặp lại ngẫu nhiên là 285 mẫu, số mẫu tạo đa chồi là 144, số mẫu kéo dài chồi là 91. Trong đó mẫu ĐC1 với 35 mẫu nhưng không còn mẫu nào sống sau khi cho tái sinh trên môi trường tạo đa chồi có bổ sung kháng sinh do không có gen chọn lọc, các cây chết dần qua các dần chọn lọc và kết quả không có cây nào được trồng ra ngoài giá thể. Mẫu ĐC2 với 82 mẫu thu được 33 mẫu tạo đa chồi trên môi trường cảm ứng SIM, và 27 mẫu kéo dài chồi.
A B
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn