(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương đt51

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM HẢI YẾN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2018 download by : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM HẢI YẾN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN – 2018 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn kết nghiên cứu hướng dẫn trực tiếp GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết sử dụng luận văn trung thực đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu Tác giả luận văn Phạm Hải Yến i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu, người thầy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt giúp tơi thực nghiên cứu hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ Đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone đậu tương bằng công nghệ gen”, mã số B2016-TNA-18 TS Hoàng Phú Hiệp làm chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn cô Trần Thị Hồng, nghiên cứu sinh Lê Thị Hồng Trang toàn thể thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp tơi q trình nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tác giả luận văn Phạm Hải Yến ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Trang Lời cam đoan………………………………………………………… i Lời cảm ơn…………………………………………………………… ii Mục lục……………………………………………………………… iii Danh mục bảng………………………………………………… iv Danh mục hình……………………………………………………… v Danh mục chữ viết tắt……………………………………………… vi Mở đầu ……………………………………………………………… 1 Đặt vấn đề …………………………………………………… Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………… Nội dung nghiên cứu………………………………………… Chương Tổng quan tài liệu……………………………………… 1.1 Cây đậu tương…………………………………………………… 1.1.1 Đặc điểm hình thái đậu tương……………………… 1.1.2 Vai trò đậu tương…………………………………… 1.2 Isoflavone enzyme chìa khóa q trình sinh tổng hợp isoflavone ………………………………………………… 1.2.1 Isoflavone …………………………………………………… 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp isoflavone đậu tương…… 1.2.3 Enzyme chalcone isomerase (CHI) gen GmCHI…… 10 1.3 Chuyển gen đậu tương nhờ Agrobacterium………….………… 13 iii download by : skknchat@gmail.com 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen đậu tương 13 1.3.2 Nghiên cứu biểu gen CHI……… .…………………… 17 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… 19 2.2 Hóa chất thiết bị……………………………………………… 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 21 2.3.1 Phương pháp tạo đậu tương chuyển gen………………… 21 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử………………………… 24 2.4 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận văn…………… 27 Chương Kết thảo luận……………………………… 28 3.1 Chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 nhờ A.tumefaciens……………………………………… 28 3.1.1 Kết khử trùng hạt………………………………… 28 3.1.2 Kết tạo nguyên liệu biến nạp……………………………… 29 3.1.3 Kết lây nhiễm tái sinh đậu tương ………………… 30 3.2 Phân tích có mặt gen chuyển GmCHI đậu tương chuyển gen hệ T0………………………………………………… 35 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số……………………………… 35 3.2.2.Kết phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI…………… 36 3.3 Thảo luận kết nghiên cứu…………………………………… 38 Kết luận đề nghị………………………………………………… 42 Kết luận…………………………………………………………… iv download by : skknchat@gmail.com 42 Đề nghị…………………………………………………………… 42 Cơng trình cơng bố liên quan đến luận văn………………………… 43 Tài liệu tham khảo…………………………………………… 44 Phụ lục 1……………………………………………………… 50 Phụ lục 2……………………………………………………… 51 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần đệm tách DNA tổng số 24 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide cặp mồi GmCHI-coI- 25 F/GmCHI-cmyc-SacI-R Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn GmCHI- 26 cmyc-KDEL………….…………………………………………… Bảng 2.4 Chu kì nhiệt phản ứng PCR……………………… 26 Bảng 3.1 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi khuẩn A.tumefaciens qua nách mầm hạt chín………………… iv download by : skknchat@gmail.com 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử isoflavone ………………………… Hình 1.1 Chu trình chuyển hóa isoflavone ………………… 11 Hình 2.1 Giống đậu tương ĐT51………………………………… 19 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHi-cmyc vector chuyển gen pCB301_GmCHI vi khuẩn A.tumefaciens…………… 20 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào đậu tương qua nách mầm……………………………………………… 23 Hình 3.1 Khử trùng hạt khí clo bình thủy tinh kín 29 Hình 3.2 Hình ảnh hạt đậu tương hạt nảy mầm giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu cho biến nạp……………………………… 30 Hình 3.3 Hình ảnh đậu tương giai đoạn gây tổn thương nách mầm biến nạp………………………………………… 31 Hình 3.4 Hình ảnh đậu tương chuyển gen giai đoạn tạo chồi kéo dài chồi……………………………………… 32 Hình 3.5 Hình ảnh đậu tương chuyển gen giai đoạn rễ trồng đậu tương chuyển gen giá thể ……… 33 Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách từ đậu tương chuyển gen không chuyển gen 36 Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ đậu tương chuyển gen không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHIcmyc- SacI-R……………………………………… v download by : skknchat@gmail.com 37 DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT GmCHI Glycine max chalcone isomerase CHI Chalcone isomerse PCR Polymerase Chain Reaction A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng áp suất cao) ER Estrogens receptor (thụ thể estrogens) CHR Chalcone reductase CHS Chalcone synthease IFS Isoflavones synthease PAL Phenylalanine amoni-lyase DNA Deoxyribonucleotide acid cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid BAP 6-Benzylaminopurine GA3 Gibberillic acid IAA Indole-3-acetic acid DNTPs Deoxynucleotide triphosphate vi download by : skknchat@gmail.com Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ đậu tương chuyển gen không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc- SacI-R (+): Sản phẩm PCR từ vector pCB301- GmCHI; (-): Kết PCR từ không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Kết PCR từ đậu tương chuyển gen T0; M; thang DNA kb Sản phẩm điện di hình 3.7 cho thấy, đậu tương chuyển gen T0 phân tích thu cho kết PCR nhân đoạn GmCHI-cmyc-KDEL từ hệ gen có kích thước khoảng 0,7kb Hiệu chuyển gen giai đoạn T0 đạt 3,56% (8/225) Như vậy, hệ T0 tạo đậu tương chuyển gen GmCHI Gen GmCHI nội có kích thước 657 bp [2], [24], cấu trúc GmCHIcmyc-KDEL có kích thước 702 bp khuếch đại PCR với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc-SacI-R thu đoạn DNA có kích thước khoảng 700 bp (Hình 3.8) Như bước đầu nhận xét gen chuyển GmCHI xâm nhập vào hệ gen đậu tương chuyển gen Tuy nhiên, gen chuyển GmCHI có hợp vào hệ gen có biểu thành 37 download by : skknchat@gmail.com protein tái tổ hợp đậu tương chuyển gen hay không cần phải tiếp tục phân tích Southern blot Western blot 3.3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Có nhiều phương pháp để thực chuyển gen ngoại lai mong muốn vào thực vật, bao gồm hai phương pháp chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếp phổ biến súng bắn gen, sốc điện, sốc nhiệt, cịn chuyển gen gián tiếp thơng qua vi sinh vật trung gian Tuy nhiên phương pháp chuyển gen trực tiếp yêu cầu phải có thiết bị, hóa chất đại, kỹ thuật cao phí cho phương pháp cao, ngược lại chuyển gen gián tiếp qua vi sinh vật lại dễ dàng thực hiện, khơng địi hỏi q nhiều chi phí Chuyển gen gián tiếp chủ yếu thông qua hai loại vi khuẩn Agobacterium tumefaciens Agrobacterium zhirogens hai lồi có khả xâm nhiễm qua viết thương hầu hết loài thực vật hai mầm Trong vi khuẩn A.tumefaciens sử dụng rộng rãi phương pháp dễ thực hiện, tốn hiệu quả, thuận lợi cho phân tích chuyển gen không gây tổn thương tế bào Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, người ta thường sử dụng số loại promoter 35S, act, mas, Trong 35S promoter mạnh phân lập từ virus gây bệnh khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus CaMV) Trong nghiên cứu chúng tôi, vùng promoter CaMV35S đưa vào cấu trúc vector chuyển gen pCB301 chứa gen chuyển GmCHI (Hình 2.2) Promoter CaMV35S lựa chọn nhằm hướng đến việc khởi động hoạt động phiên mã gen GmCHI để tăng cường sinh tổng hợp enzyme CHI mục đích nâng cao hiệu suất tổng hợp isoflavone đậu tương Một số thành phần khác cấu trúc làm thị cho chọn lọc trình biến nạp tái sinh chuyển gen Trong cấu trúc chuyển gen, gen nptII mã hóa cho protein kháng kanamycin, tín hiệu hiệu cho chọn lọc chuyển 38 download by : skknchat@gmail.com gen; đoạn nucleotide mã hóa cho kháng nguyên c-myc sử dụng cho kỹ thuật Western blot ELISA Hai kỹ thuật nói dựa nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu ngưng kết kháng thể với kháng nguyên protein đính kèm với protein ngoại lai Việc gắn đuôi c-myc lựa chọn tốt phù hợp tính hiệu quả, phổ biến kinh tế cho nhiều nghiên cứu [10] Trong năm gần đây, nước ta có số cơng trình cơng bố chuyển gen vào đậu tương, nghiên cứu Trần Thị Cúc Hòa (2007), Nguyễn Thị Thúy Hường cs (2009, 2011), Nguyễn Thu Hiền cs (2012), Lò Thị Mai Thu cs (2014), Lò Thanh Sơn cs (2015), Đào Xuân Tân (2017) Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chuyển gen vào đậu tương nhờ A.tumefacies lây nhiễm qua nách mầm Trong nghiên cứu chuyển gen chúng tôi, sử dụng mầm đậu tương làm vật liệu nhận gen cho thấy, mầm gây tổn thương vùng nách thuận lợi cho việc xâm nhiễm A.tumefaciens tái tổ hợp, điều khẳng định nghiên cứu Lị Thị Mai Thu (2014) Kết thí nghiệm chuyển gen Nguyễn Thúy Hường (2011) vào giống đậu tương DT84 thu 28 sống sót 1262 mẫu biến nạp (2,2%) [5]; còng nghiên cứu Nguyễn Thu Hiền (2011) chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 thu 32 chuyển gen từ 650 mẫu biến nạp (4,9%) [7] Lò Thị Mai Thu (2014) tiến hành chuyển cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương thu 16 sống sót từ 370 mẫu giống ĐT12 (4,3%) 32 sống sót từ 850 mẫu giống DT2008 (3,7%) [4] Nghiên cứu Lò Thanh Sơn (2015) biến nạp cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 thu sống sót từ 380 mảnh mầm (2,3%) [3] Trong nghiên cứu chúng tôi, chuyển cấu trúc pCB301_GmCHI vào giống đậu tương ĐT51 thu chuyển gen sống sót 225 mẫu ba lần biến nạp, chiếm tỷ lệ 4,0% Như tỷ lệ chuyển gen sống 39 download by : skknchat@gmail.com sót hệ T0 nằm khoảng từ 2,0% đến 5% Về hiệu suất chuyển gen T0, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 đạt hiệu suất 0,24% [6], Hiệu suất chuyển gen nghiên cứu Nguyễn Thu Hiền (2011) 1,23% [7], Lò Thị Mai Thu 1,35% 2,24% [4], Lò Thanh Sơn 1,23% [3] Trong nghiên cứu mình, chúng tơi tiến hành biến nạp 225, số đem trồng giá thể 28 có đậu tương chuyển gen phát triển bình thường nhà lưới Gen chuyển GmCHI có mặt hệ gen đậu tương chuyển gen hệ T0 xác nhận kết phân tích PCR Hiệu suất chuyển gen đạt 3,56% Trong chuyển gen đậu tương, khó khăn chung chuyển gen thực vật cịn gặp số khó khăn khác như: hàm lượng protein tế bào mô lớn nên dễ nhiễm khuẩn vệ tinh khơng mong muốn, hạt giống khó bảo quản nhanh khả nảy mầm; hạt đậu tương chứa nhiều protein lipid nên tái sinh mẫu biến nạp khó khăn, điều kiện khí hậu thời tiết nguyên nhân làm cho mẫu tái sinh bị nhiễm khuẩn Khó khăn mùa vụ sinh thái làm giảm khả tái sinh, sinh trưởng phát triển sinh sản bình thường biến đổi gen Để khắc phục khó khăn riêng nói cần tính tốn, khảo sát nồng độ chủng loại kháng sinh phù hợp với giống cho vừa bảo đảm mẫu tái sinh không bị nhiễm khuẩn nấm lại vừa bảo đảm khả tái sinh tế bào mô tiếp nhận Đặc điểm mùa vụ sinh thái yếu tố di truyền giống xác lập qua chọn lọc tự nhiên nên khó thay đổi, lựa chọn giải pháp tính tốn thời gian biến nạp tái sinh cho trùng khớp với thời gian sinh thái giống tốt Nhìn chung, đậu tương, nghiên cứu tái sinh chuyển gen trồng vào vụ xuân hay xuân hè thích hợp cho hiệu tạo chuyển gen có 40 download by : skknchat@gmail.com tỷ lệ sống cao Ngồi sử dụng buồng sinh trưởng để chủ động điều tiết nhiệt độ thời gian chiếu sáng giải pháp kỹ thuật chấp nhận Hiệu suất biến nạp gen thấp khó khăn cho việc chọn lọc chuyển gen, nghiên cứu tìm biện pháp làm tăng hệ số tái sinh đa chồi, tăng tỷ lệ sống sót chuyển gen đồng thời số lượng mẫu biến nạp phải lớn Chính nghiên cứu điều kiện tối ưu cho tái sinh chuyển gen đậu tương vấn đề tiếp tục quan tâm nghiên cứu 41 download by : skknchat@gmail.com KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã chuyển thành công gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51 nhờ A.tumafaciens qua nách mầm 1.2 Trong 225 mẫu biến nạp có 141 mẫu phát sinh chồi tạo 354 chồi Kết chọn lọc kháng sinh thu 196 chồi sống sót mơi trường SEM có 159 chồi sống sót rễ mơi trường RM Số đem trồng giá thể 28 có đậu tương chuyển gen phát triển bình thường nhà lưới 1.3 Gen chuyển GmCHI có mặt hệ gen đậu tương chuyển gen hệ T0 xác nhận kết phân tích PCR Hiệu suất chuyển gen giai đoạn thí nghiệm đạt 3,56% Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu để phân tích biểu gen chuyển GmCHI hệ T1, T2, nhằm tạo dịng đậu tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao làm vật liệu chọn giống 42 download by : skknchat@gmail.com CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phạm Hải Yến, Lê Thị Hồng Trang, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu Quân, Chu Hoàng Mậu (2017), “Chuyển gen mã hóa chalcone isomerase vào giống đậu tương ĐT51 thơng qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Thái Nguyên, 171(11), tr.135 43 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đào Xuân Tân (2016), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn đậu tương (Glycine max L Merrill), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đặc điểm gen GmCHI phân lập từ số giống đậu tương khác hàm lượng isoflavone”, Tạp chí Sinh học 38(2), tr 236-242 Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ đậu tương (Glycine max (L.) Merrill, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo đậu tương chuyển gen kháng bệnh, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sỹ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh invitro đậu tương (Glycine max L Merrill) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, 52(4), tr 82-88 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2011), “Nghiên cứu khả tái sinh và biến nạp gen qua nách mầm hai 44 download by : skknchat@gmail.com giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 và DT84 bằng Agrobacteriun”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(38), tr.1035-1310 Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, 18:11-16 Trần Văn Điền, (2007), Giáo trình đậu tương, NXB Nông nghiệp Tiếng Anh 10 Ahn J., Lee K J., Ko K (2014), “Optimization of ELISA conditions to quantify colorectal cancer antigen-antibody complex protein (GA733FcK) expressed in transgenic plant", Monoclon Antib Immunodiagn Immunother., 33(1), pp - 11 Barros R.P., Gustafsson J.A (2011), “Estrogen receptors and the metabolic network”, Cell Metab, pp.289–299 12 Cheng H, Li L, Cheng S, Cao F, Wang Y, Yuan H (2011), “Molecular cloning ang function assay of a chalcone isomerase gene (GbCHI) from Ginkgo biloba”, Plant Cell Report, 30(1), pp.49-62 13 Conklin C.M., Bechberger J.F., MacFabe D., Guthrie N., Kurowska E.M., Naus C.C (2007), “Genistein and quercetin increase connexin43 and suppress growth of breast cancer cells”, Carcinogenesis, pp.93–100 14 Dastmalchi M, Dhaubhadel S (2015), “Soybean chalcone isomerase: evolution of the fold, and the differential expression and localization of the gene family”, Planta, pp.507 15 Dhaubhadel “Isoflavonoid S, McGarvey BD, Williams biosynthesis and R, Gijzen M accumulation developing soybean seeds”, Plant Molecular Biology, pp.733 45 download by : skknchat@gmail.com (2003), in 16 Gutierrez-Gonzalez JJ, Guttikonda SK, Tran LS, Aldrich Dl, Zhong R, Yu O, Nguyen HT, Sleper DA (2010), “Differential expresstion of isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant Cell Physiol, pp.936-948 17 Hany El-Shemy (2011), “Soybean and health”, Agricultural and biological sciences, pp.1 18 Huilan Chen, Philippe Seguin, Annie Archambault, Lea Constan, and Suha Jabaji (2009), “Gene expression and isoflavone concentrations in soybean sprouts treated with chitosan”, Crop Science, pp.224–236 19 Hussain RM, Ali M, Feng X, Li X (2017), “The essence of NAC gene family to the cultivation of drought-resistant soybean (Glycine max L Merr.) cultivars”, BMC Plant Biology, 17(1), pp.55 20 Jie Yu, Xiaojuan Bi, Bing Yu, and Daiwen Chen, (2016), “Isoflavones: Anti-inflammatory benefit and possible caveats”, Nutrient, pp.361 21 Jin-Ho Kang, John McRoberts, Feng Shi, Javier E Moreno, A Daniel Jones, Gregg A Howe (2014), “The flavonoid biosynthetic enzyme chalcone isomerase modulates terpenoid production in glandular trichomes of tomato”, Plant Physiology, Vol.164, No.3, pp.1161-1174 22 Juan J Gutierrez-Gonzalez,Satish K Guttikonda, Lam-Son Phan Tran,Donavan L Aldrich, Rui Zhong, Oliver Yu, Henry T Nguyen, David A Sleper (2010), “Differential expression of isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant and Cells Physiology, pp.1 23 Kuiper G.G., Lemmen J.G., Carlsson B., Corton J.C., Safe S.H., van der Saag P.T., van der Burg B., Gustafsson J.-A.K (1998), “Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor β”, Endocrinology, pp.4252–4263 46 download by : skknchat@gmail.com 24 Le T H T., Ho T M., Hoang H P., Le S V and Chu M H (2016), Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase (CHI) gene), cultivar ĐT51 GenBank: LT594995.1 25 Lyle R., Senthil S., Michiyo M., Oliver Y., (2005), “Partial Reconstruction of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast Using Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases”, Plant Physiol, 137(4), pp 1375–1388 26 M Chen, W.J Zhu, X You, Y.D Liu, G.M Kaleri, Q Yang (2015), “Isolation and characterization of a chalcone isomerase gene promoter from potato cultivars”, Genetics and Molecular Resaerch, pp.18873 27 Marugame T., Katanoda K (2006), “International comparisons of cumulative risk of breast and prostate cancer, from cancer incidence in five continents vol”, Viii Jpn J Clin Oncol, pp.399–400 28 Medjakovic S., Mueller M., Jungbauer A., (2010), “Potential healthmodulating effects of isoflavones and metabolites via activation of ppar and ahr”, Nutrients, pp.241–279 29 Mehran Dastmalchi, Sangeeta Dhaubhadel (2015), “Soybean chalcone isomerase: evolution of the fold, and the differential expression and localization of the gene family”, Planta, Vol 241, Is 2, pp 507-523 30 Messina M (2014), “Soy foods, isoflavones, and the health of postmenopausal women”, Am J Clin Nutr, pp.423–430 31 Nguyen HT, Quach TN, Tran LS, Valliyodan B, , Kumar R, Neelakandan AK, Guttikonda SK, Sharp RE (2014), “Functional analysis of water stress-responsive soybean GmNAC003 and GmNAC004 transcription factors in lateral root development in arabidopsis”, PLoS One 9(1) 47 download by : skknchat@gmail.com 32 Olhoft, P.M., D.A Agrobacteriummediated Somer T – “L-Cystein (2001), DNA delivery into increases soybean cotyledonarynode cells”, Plant Cell Report, 20, pp.706-711 33 Phetnoo N., Werawatganon D., Siriviriyakul P (2013), “Genistein could have a therapeutic potential for gastrointestinal diseases”, Thai J Gastroenterol, pp.120–125 34 Qu J, Liu SY, Wang PW, Guan SY, Fan YG, Yao D, Zhang L, Dai JL (2016), “Agrobacterium-mediated transformation of the β-subunit gene in 7S globulin protein in soybean using RNAi technology”, Genetics Molecular Research, 15(2) 35 Verdrengh M., Jonsson I.M., Holmdahl R., Tarkowski A (2003), “Genistein as an anti-inflammatory agent”, Inflamm Res Off J Eur Histamine Res So, pp.341–346 36 Vitale D.C., Piazza C., Melilli B., Drago F., Salomone S (2013), “Isoflavones: Estrogenic activity, biological effect and bioavailability”, Eur J Drug Metab Pharmacokinet, pp.15–25 37 Wang L, Liu X, Meng X, Wu G, Xu F (2018), “Cloning and expression analysis of a chalcone isomerase (CnCHI) gene from Chamaemelum nobile”, Biotechology, 17(1), pp.19-25 38 Wang RK, Zhan SF, Zhao TJ, Zhou XL, Wang CE (2015), “Positive selection sites in tertiary structure of Leguminosae chalcone isomerase 1”, Genetics and Molecular Reasearch, pp.1 39 Wang W, Wang L, Wan B, Zhang P, Zhan C, Huang D (2012), “Chalcone isomerase in grape vine: gene expression and localization in the developing fruit”, Biologia Plantarum, 56(3), pp.545-550 40 Wenbo Giang, Qinggang Yin, Ranran Wu, Guangshun Zheng, Jinyue Liu, Richard A Dixon, Yongzhen Pang (2015), “Role of a chalcone isomerase-like protein in flavonoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana”, Journal of Experimental Botany, pp.7165-7179 48 download by : skknchat@gmail.com 41 Yang WJ, Wu YM, Tang YX (2009), “Expressing and functional analysis of GmMYBJ6 from soybean”, Yi Chuan, 31(6) 42 Yu O, Shi J, Hession AO, Maxwell CA, McGonigle B, Odell JT (2003), “Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed”, Plant Physiology, pp.1 43 Yue Zhang, Han Xia, Mei Yuan, Chuanzhi Zhao, Aiqin Li, Xingjun Wang, (2011), “Cloning and expression analysis of peanut (Arachis hypogaea L.) CHI gene”, Electronic Journal of Biotechnology, pp.0717-3458 Một số trang web 44 http://ajcn.nutrition.org/content/83/5/1118.long 45 http://en.wikipedia.org/wiki/Isoflavone 46 http://eol.org/pages/641527/overview 47 http://khoahoc.tv/doisong/yhoc/suc-khoe/37895_dau-nanh-phuongthuoc-quy-gia.aspx 48 http://www.agi.gov.vn/files/files/HNKH2017/3_%20Bao%20cao%20dau %20tuong%20(N_V_Dong)%20%5BCompatibility%20Mode%5D%20t hu.pdf 49 http://www.ducquanam.com/SuuTam/chuabenh_daunanh.htm 50 http://www.isoflavone.info/what-are-isoflavone.php 49 download by : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC Thành phần môi trường tái sinh đậu tương Môi Thành phần trường Nảy mầm Muối B5(3,052 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), pH = 5,8 + (GM) vitamin B5 (1 mg/l).0 Đồng nuôi Muối B5 (0,316 g/l ) + MES (3,9 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 cấy (CCM) g/l), pH = 5,4 Bổ sung box vitamin B5 (1 mg/l) + acetosyringon (0,2 mM) + L-cystatin (400 mg/l) + sodium thiosulfate (200 mg/l) + DTT (154 mg/l) + GA3 (0,25 mg/l) + BAP (2,5 mg/l) Cảm ứng -Môi trường SIM lần 1: Muối B5 (2,0 g/l ) + MES (0,6 g/l) + tạo chồi đường (30 g/l) + agar (9 g/l), pH = 5,6 Bổ sung box (SIM) vitamin B5 (1 mg/l) + BAP (3,5 mg/l) + cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l - Môi trường SIM lần 2: Muối B5 (3,052 g/l ) + MES (0,59 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), PH = 5,6 Bổ sung vitamin B5 (1 mg/l) + BAP (3,5 mg/l) + 400 mg/l + kanarmycin 75 mg/l Kéo dài MS (4,3 g/l) + MES (0,6 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), chồi (SEM) pH = 5,6 Bổ sung box vitamin B5 + L-asparagine + Lpyron glutamic acid + IAA (0,1 mg/l)+ GA3 (0,5 mg/l) + cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l Tạo rễ MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), (RM) pH = 5,6 Bổ sung IAA (0,5 mg/l)+ vitamin B5 (1 mg/l) + cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l 50 download by : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pcB301 51 download by : skknchat@gmail.com ... hành đề tài: ? ?Nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51? ?? Mục tiêu nghiên cứu Chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51 phục vụ tạo dịng đậu tương chuyển gen có hàm lượng... Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI qua nách mầm đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo đậu tương chuyển gen 3.2 Phân tích đậu tương chuyển gen thơng... thể số 20 [26] 1.3 CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƯƠNG NHỜ AGROBACTERIUM 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen đậu tương Hiện có nhiều nghiên cứu khoa học thực đối tượng nghiên cứu đậu tương giới nói chung