Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống đậu tương ĐT51 được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện cây Lương thực và Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Hình 2.1 thể hiện hình thái hạt của giống đậu tương ĐT51 được sử dụng trong nghiên cứu này.
Hình 2.1. Hạt của giống đậu tương ĐT51
Giống đậu tương ĐT51 được chọn tạo bằng con đường lai hữu tính. Giống được công nhận tạm thời, và hiện đang được đưa vào sản xuất thử nghiệm trong vùng đồng bằng, trung du Bắc Bộ trong 3 vụ hè, đông và xuân. Giống đậu tương ĐT51 có hoa màu tím, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu vàng. Chiều cao cây 45 - 55cm, phân cành khá, hơn 2 cành/cây, số quả chắc cao, tỷ lệ quả 3 hạt đạt 25 - 30 %. Khối lượng 100 hạt khoảng từ 17,5 - 20,0 g. Thời gian sinh trưởng trung bình 90 - 95 ngày, năng suất 20 - 29 tạ/ha,
tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. ĐT51 có khả năng gieo trên chân đất vừa mới thu hoạch mạ, đất ướt nhưng tỷ lệ nảy mầm vẫn đạt rất cao. Ngoài ra, trong giai đoạn sinh trưởng phát triển nếu có bị ngập 4 - 5 ngày, giống này vẫn có khả năng sống được, lá không bị héo, rễ không bị thối. Theo thông tin của nhóm nghiên cứu năm 2016, hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của giống đậu tương ĐT51 (41,28 mg/100g) cao hơn hẳn so với 3 giống đậu tương còn lại là DT90 (30,62 mg/100g), DT2008 (26,17 mg/100g) và ĐT84 (29,43 mg/100g) [2].
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc mang gen GmCHI do Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp.
Vector chuyển gen pCB301_GmCHI chứa mang gen chuyển GmCHI có cấu trúc được trình bày ở hình 2.2. Trong cấu trúc chuyển gen này, gen
GmCHI được phân lập từ giống đậu tương ĐT26 có hàm lượng isoflavone cao. Vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector pCB301 mang cấu trúc
35S-GmCHI-cmyc-KDEL được làm mới bằng nuôi trên môi trường chọn lọc chứa kanarmycine và nuôi phục hồi khi mật độ tế bào đạt giá trị OD600nm là 0,8 tạo dịch huyền phù phục vụ cho lây nhiễm.
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc trong vector chuyển gen pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens. nptII: gen kháng kanamycin; CaMV35S: promoter 35S; GmCHI: gene mã hóa chalcone isomerase phân lập
2.2. Hóa chất và thiết bị
Đề tài đã sử dụng các loại hóa chất cho các thí nghiệm tái sinh in vitro, chuyển gen, phân tích PCR và các hóa chất được mua từ một số hãng nổi tiếng như: Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma.
Các hóa chất chính bao gồm: agar, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, KCl, tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol; các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác.
Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen được sử dụng các thiết bị nuôi cấy mô tế bào thực vật của Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. Các loại thiết bị chính bào gồm: box cấy, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy quang phổ, ...
Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser cùng với các trang thiết bị khác sử dụng tại Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học.
Môi trường tái sinh in vitro từ nách lá mầm đậu tương được trình bày ở
Phụ lục 1.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen
Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương từ nách lá mầm được tiến hành theo phương pháp của Olhoft và cs (2001) và Nguyễn Thu Hiền (2011) có cải tiến [7], [32].
Tạo nguyên liệu biến nạp gen: Hạt đậu tương khử trùng bằng khí clo tạo ra từ hỗn hợp Javen 15ml + HCl 5ml đậm đặc rồi cho nảy mầm trên môi trường MS. Sau 4 - 5 ngày, lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Nuôi chọn lọc vi khuẩn trong 15ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc là kanamycin 50 mg/l và rifamicine 50 mg/l ở 28 oC, 200 rpm, 48 giờ. Chuyển 10ml dịch huyền phù tế bào trên vào 50ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28 oC, 200 rpm đến khi OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế bào ở 4 oC, 5000 rpm, 15 phút. Hoà tan tế bào lắng tạo huyền phù vi khuẩn vào 40ml dung dịch môi trường CCM đặt trong nước đá lạnh.
Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Các mảnh lá mầm đậu tương được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7 - 8 lần vào phần nách lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25 oC trong thời gian 5 ngày.
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung 400 cefotaxime mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo chồi SIM có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 50 mg/l (lần 1). Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 75 mg/l (lần 2).
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm
được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM) có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
Tạo nguyên liệu biến nạp gen
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM Lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Kéo dài chồi trên môi trường SEM
Tạo rễ trên môi trường RM
Tạo rễ: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 4 cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 50 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh.
Cây ra giá thể: Những cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh được đưa ra bầu trấu hun : cát (tỷ lệ 1 : 1). Sau khoảng 1 - 2 tuần, các cây sống sót được trồng ra nhà lưới. Tính toán thời gian biến nạp và tái sinh để thời điểm ra cây trùng với thời vụ gieo trồng đậu tương.
2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Edwards (1991).
Thành phần đệm tách DNA tổng số được thể hiện ở bảng 2.2
Bảng 2.1. Thành phần đệm tách DNA tổng số STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 Mm 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 Mm 4 CTAB 2% (w/v)
5 Nước khử ion vô trùng
Các bước tách chiết DNA tổng số:
1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ.
2) Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl đệm tách, đảo đều và ủ ở 65 oC trong 90 phút.
3) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
4) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống Eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20 oC trong 30 phút.
5) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70 oC.
6) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20 oC.
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc-
SacI-R để nhân bản đoạn GmCHI-cmyc-KDEL chứa gen chuyển GmCHI. Trình tự nucleotide của cặp mồi CHI-NcoI-F/ CHI-NotI-R được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI- cmyc-SacI-R
Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’ - 3’) Sản phẩm
dự kiến
CHI-NcoI-F CATGCCATGGATGGCAACGATCACCGCGGTT
702 bp
GmCHI-
cmyc-SacI-R
CCGAGCTCCTAGAGTTCGTCTTTGGAACC
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân bàn đoạn GmCHI-cmyc- KDEL STT Thành phần Nồng độ 1 Nước khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2.5µl 3 MgCl2 (25mM) 2µl 4 dNTPs (10mM) 2.5µl
5 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 1µl
6 Mồi ngược (10 pmol/µl) 1µl
7 Taq DNA polymerase ( 5 đơn vị/ µl) 1µl
8 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2µl
Tổng 25µl
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 30 giây Lặp lại
30 chu kỳ
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 90 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:
Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá mầm được tái sinh chồi từ nách lá mầm và hai lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây trồng trên giá thể của mỗi mẫu biến nạp dương tính với PCR tạo thành một dòng cây chuyển gen.
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Các thí nghiệm chuyển gen ở cây đậu tương được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên. Thí nghiệm phân tích PCR thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHUYỂN CẤU TRÚC 35S-GmCHI-cmyc VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 NHỜ A.tumefaciens ĐT51 NHỜ A.tumefaciens
Chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 qua nách lá mầm bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật nhờ A.tumefaciens. Kỹ thuật chuyển gen được thực hiện theo quy trình đã được mô tả ở mục 2.3.1
3.1.1. Kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu tương ĐT51 sau khi chín, đem phơi khô, loại bỏ những hạt lép, xấu và bị sâu bệnh, sứt mẻ, chỉ lựa chọn những hạt lành lặn, mẩy, có kích thước tương đương nhau. Sau khi lựa chọn hạt, tiến hành rửa sạch hạt trực tiếp dưới vòi nước sạch, lấy tay xoa đều để loại bỏ bụi bẩm bám vào hạt. Đổ hạt đã rửa sạch ra giấm thấm, đợi hạt khô, cho hạt đậu tương đã lựa chọn kĩ vào một bình tam giác thủy tinh sạch và khô, đậy nút bông, gấp nắp và đem đi khử trùng. Hạt sẽ được khử trùng bằng khí clo trong bình thủy tinh đậy kín nắp đặt trong tủ hút. Tiến hành lấy 15ml javen cho vào cốc thủy tinh, đặt vào trong bình thủy tinh. Tiếp tục cho bình tam giác chứa hạt đậu tương đã rửa sạch vào, bỏ nắp và nút bông ra để hạt trong bình được tiếp xúc trực tiếp với khí clo. Từ tử nhỏ 5ml dung dịch HCl đặc vào cốc thủy tinh đã chứa javen. Đậy kín bình thủy tinh trong thời gian từ 14 đến 16h, sau đó lấy hạt chuẩn bị cho bước gieo hạt trên môi trường GM.
Hình 3.1. Hình ảnh khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín
3.1.2. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp
Sau khi được khử trùng, hạt được cấy trên môi trường nảy mầm GM và mỗi bình 10 hạt với khoảng cách giữa các hạt đồng đều nhau để tạo điều kiện cho các hạt nảy mầm (Hình 3.2 A). Tiếp sau, hạt được chuyển sang phòng nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì, 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25 oC ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux. Khi được 5 ngày, mầm đạt được kích thước 1,5 cm đến 2 cm gồm rễ mầm, thân mầm và lá mầm (Hình 3.2 B).
Tiến hành cắt bỏ rễ mầm, chồi mầm, bỏ vỏ và thu lá mầm. Tách lá mầm bằng panh và kéo, cắt bỏ cuống, gây tổn thương nhẹ nhàng nách lá mầm bằng mũi dao nhọn để tạo vật liệu nhận gen.
A B
Hình 3.2. Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn chuẩn bị
nguyên liệu cho biến nạp. A: Hạt đậu tương ĐT51 cấy trên môi trường nảy mầm (GM); B: Hạt đậu tương ĐT51 nảy mầm được 5 ngày kể từ khi cấy trên
môi trường.
3.1.3. Kết quả biến nạp và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
Quá trình biến nạp được tiến hành trong box vô trùng. Sau khi tiến hành nuôi vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc trong LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamicine 50 mg/ml trong 4 giờ. Tiếp tục bổ sung LB lỏng và nuôi tiếp thêm 3 giờ nữa, đến khi nồng độ vi khuẩn đạt OD600 = 0,8 thì tiến hành biến nạp.
Lá mầm đã tổn thương đem ngâm trong dịch huyền phù chứa vi khuẩn mang cấu trúc chứa gen GmCHI trong 30 phút (Hình 3.3 A). Sau khi ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù, vừa đủ thời gian thì chuyển các mảnh lá sang các đĩa petri chứa môi trường đồng nuôi cấy (CCM) đặc (Hình 3.2 B). Đem các đĩa này để trong phòng tối trong khoảng thời gian 5 ngày, nhiệt độ phòng 25oC ± 2.
A B
Hình 3.3. Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương nách lá
mầm và biến nạp. A: Mảnh lá mầm tổn thương được nhiễm khuẩn
A.tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc; B: Mảnh lá mầm được cấy trên môi trường đồng nuôi cấy (CCM) đặc.
Khi được 5 ngày đồng nuôi cấy trong tối, tiến hành rửa khuẩn. Các mẫu biến nạp được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime trong thời gian 10 – 15 phút để rửa khuẩn ngoại vi. Loại bỏ dịch lỏng, đưa các mẫu biến nạp lên giấy thấm đã khử trùng. Dùng panh lấy mẫu biến nạp cấy vào môi trường tạo đa chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxime đã chuẩn bị trước.
Sau 2 tuần, chuyển mẫu sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và kháng sinh thích hợp. Tiếp theo là chọn lọc những cụm chồi phát triển tốt trên môi trường SIM, khi các mẫu phát sinh cụm chồi gồm các chồi nhỏ, tiến hành cắt bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường chọn lọc kéo dài chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 50 mg/l kanamycin.
bổ sung BAP (3,5 mg/l) và kanamycin 5 mg/l trong khoảng thời gian 2 tuần và kết quả kéo dài chồi trên môi trường SEM có bổ sung thêm IAA (0,1 mg/l), GA3 (0,5 mg/l) và kanamycin 50 mg/l.
A B
C D
Hình 3.4. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo chồi và kéo
dài chồi. A: Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong 1 tuần, bổ sung BAP 2mg/l và kanamycin; B: Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong
2 tuần bổ sung BAP 2 mg/l và kanamycin; C: Kéo dài chồi trên môi trường SEM trong 1 tuần bổ sung IAA (0,1 mg/l) + GA3 (0,5 mg/l) + kanamycin 50mg/l); D: Kéo dài chồi trên môi trường SEM trong 2 tuần bổ sung thêm
Các chồi sống sót được kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxime để tạo cây hoàn chỉnh. Khi đã tạo được cây hoàn chỉnh tiến hành đem cây trồng trên giá thể. Cây tái sinh được đưa ra nhà lưới và chăm sóc để ra hoa, quả và thu hạt, phục vụ phân tích cây chuyển gen (Hình 3.5).