3.1. CHUYỂN CẤU TRÚC 35S-GmCHI-cmyc VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 NHỜ A.tumefaciens ĐT51 NHỜ A.tumefaciens
Chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 qua nách lá mầm bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật nhờ A.tumefaciens. Kỹ thuật chuyển gen được thực hiện theo quy trình đã được mô tả ở mục 2.3.1
3.1.1. Kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu tương ĐT51 sau khi chín, đem phơi khô, loại bỏ những hạt lép, xấu và bị sâu bệnh, sứt mẻ, chỉ lựa chọn những hạt lành lặn, mẩy, có kích thước tương đương nhau. Sau khi lựa chọn hạt, tiến hành rửa sạch hạt trực tiếp dưới vòi nước sạch, lấy tay xoa đều để loại bỏ bụi bẩm bám vào hạt. Đổ hạt đã rửa sạch ra giấm thấm, đợi hạt khô, cho hạt đậu tương đã lựa chọn kĩ vào một bình tam giác thủy tinh sạch và khô, đậy nút bông, gấp nắp và đem đi khử trùng. Hạt sẽ được khử trùng bằng khí clo trong bình thủy tinh đậy kín nắp đặt trong tủ hút. Tiến hành lấy 15ml javen cho vào cốc thủy tinh, đặt vào trong bình thủy tinh. Tiếp tục cho bình tam giác chứa hạt đậu tương đã rửa sạch vào, bỏ nắp và nút bông ra để hạt trong bình được tiếp xúc trực tiếp với khí clo. Từ tử nhỏ 5ml dung dịch HCl đặc vào cốc thủy tinh đã chứa javen. Đậy kín bình thủy tinh trong thời gian từ 14 đến 16h, sau đó lấy hạt chuẩn bị cho bước gieo hạt trên môi trường GM.
Hình 3.1. Hình ảnh khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín
3.1.2. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp
Sau khi được khử trùng, hạt được cấy trên môi trường nảy mầm GM và mỗi bình 10 hạt với khoảng cách giữa các hạt đồng đều nhau để tạo điều kiện cho các hạt nảy mầm (Hình 3.2 A). Tiếp sau, hạt được chuyển sang phòng nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì, 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25 oC ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux. Khi được 5 ngày, mầm đạt được kích thước 1,5 cm đến 2 cm gồm rễ mầm, thân mầm và lá mầm (Hình 3.2 B).
Tiến hành cắt bỏ rễ mầm, chồi mầm, bỏ vỏ và thu lá mầm. Tách lá mầm bằng panh và kéo, cắt bỏ cuống, gây tổn thương nhẹ nhàng nách lá mầm bằng mũi dao nhọn để tạo vật liệu nhận gen.
A B
Hình 3.2. Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn chuẩn bị
nguyên liệu cho biến nạp. A: Hạt đậu tương ĐT51 cấy trên môi trường nảy mầm (GM); B: Hạt đậu tương ĐT51 nảy mầm được 5 ngày kể từ khi cấy trên
môi trường.
3.1.3. Kết quả biến nạp và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
Quá trình biến nạp được tiến hành trong box vô trùng. Sau khi tiến hành nuôi vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc trong LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamicine 50 mg/ml trong 4 giờ. Tiếp tục bổ sung LB lỏng và nuôi tiếp thêm 3 giờ nữa, đến khi nồng độ vi khuẩn đạt OD600 = 0,8 thì tiến hành biến nạp.
Lá mầm đã tổn thương đem ngâm trong dịch huyền phù chứa vi khuẩn mang cấu trúc chứa gen GmCHI trong 30 phút (Hình 3.3 A). Sau khi ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù, vừa đủ thời gian thì chuyển các mảnh lá sang các đĩa petri chứa môi trường đồng nuôi cấy (CCM) đặc (Hình 3.2 B). Đem các đĩa này để trong phòng tối trong khoảng thời gian 5 ngày, nhiệt độ phòng 25oC ± 2.
A B
Hình 3.3. Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương nách lá
mầm và biến nạp. A: Mảnh lá mầm tổn thương được nhiễm khuẩn
A.tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc; B: Mảnh lá mầm được cấy trên môi trường đồng nuôi cấy (CCM) đặc.
Khi được 5 ngày đồng nuôi cấy trong tối, tiến hành rửa khuẩn. Các mẫu biến nạp được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime trong thời gian 10 – 15 phút để rửa khuẩn ngoại vi. Loại bỏ dịch lỏng, đưa các mẫu biến nạp lên giấy thấm đã khử trùng. Dùng panh lấy mẫu biến nạp cấy vào môi trường tạo đa chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxime đã chuẩn bị trước.
Sau 2 tuần, chuyển mẫu sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và kháng sinh thích hợp. Tiếp theo là chọn lọc những cụm chồi phát triển tốt trên môi trường SIM, khi các mẫu phát sinh cụm chồi gồm các chồi nhỏ, tiến hành cắt bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường chọn lọc kéo dài chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 50 mg/l kanamycin.
bổ sung BAP (3,5 mg/l) và kanamycin 5 mg/l trong khoảng thời gian 2 tuần và kết quả kéo dài chồi trên môi trường SEM có bổ sung thêm IAA (0,1 mg/l), GA3 (0,5 mg/l) và kanamycin 50 mg/l.
A B
C D
Hình 3.4. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo chồi và kéo
dài chồi. A: Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong 1 tuần, bổ sung BAP 2mg/l và kanamycin; B: Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong
2 tuần bổ sung BAP 2 mg/l và kanamycin; C: Kéo dài chồi trên môi trường SEM trong 1 tuần bổ sung IAA (0,1 mg/l) + GA3 (0,5 mg/l) + kanamycin 50mg/l); D: Kéo dài chồi trên môi trường SEM trong 2 tuần bổ sung thêm
Các chồi sống sót được kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxime để tạo cây hoàn chỉnh. Khi đã tạo được cây hoàn chỉnh tiến hành đem cây trồng trên giá thể. Cây tái sinh được đưa ra nhà lưới và chăm sóc để ra hoa, quả và thu hạt, phục vụ phân tích cây chuyển gen (Hình 3.5).
A B
C
Hình 3.5. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn ra rễ trong ống
nghiệm và trồng cây đậu tương chuyển gen trên giá thể. A, B: Chồi đậu tương chuyển gen ra rễ trên môi trường RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxime; C:
Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmCHI nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín Đối chứng và thí nghiệm Tổng số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi tái sinh Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây đem trồng trên giá thể Số cây sống sót trong nhà lưới ĐC0* 50 0 0 0 0 0 0 ĐC1* 50 50 112 57 30 10 10 Thí nghiệm Lần 1 100 60 130 76 58 11 4 Lần 2 75 49 126 65 51 9 3 Lần 3 50 32 98 55 50 8 2 Tổng 225 141 354 196 159 28 9
Ghi chú: ĐC0* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.
Thí nghiệm với tổng số mẫu biến nạp là 225 mẫu, lặp lại 3 lần kết quả thu được 141 mẫu phát sinh chồi và cho 354 chồi, trong đó có 196 chồi sinh trưởng tốt trong môi trường kéo dài chồi SEM có bổ sung kanamycin 50 mg/l.
đem trồng trên giá thể là 28 cây và 9 cây đậu tương chuyển gen phát triển bình thường trong nhà lưới. Song song với lô thí nghiệm chuyển gen GmCHI, hai lô đối chứng không chuyển gen cũng được nuôi cấy trong các môi trường tạo chồi, ra rễ. Ở lô ĐC0, lá mầm đậu tương không chuyển gen tái sinh trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh, kết quả thu được là tất cả số mầm đều không phát sinh chồi và chết, còn ở lô ĐC1, lá mầm đậu tương không chuyển gen tái sinh trên môi trường chọn lọc không bổ sung kháng sinh, kết quả thu được cả 50 mẫu đều tạo chồi, 57 chồi kéo dài, 30 chồi ra rễ và 10 cây được trồng trong nhà lưới làm đối chứng.
Như vậy ở giai đoạn tái sinh in vitro, kết quả chọn lọc bằng kháng sinh thu được 9 cây đậu tương được chuyển gen T0. Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn chọn lọc bằng kháng sinh chiếm tỷ lệ 4% (9/225).
3.2. PHÂN TÍCH SỰ CÓ MẶT CỦA GEN CHUYỂN GmCHI TRONG CÁC CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN Ở THẾ HỆ T0
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách từ lá non của các cây đậu tương chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen. Dung dịch chứa DNA tổng số được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.6). Hình ảnh điện di DNA tổng số ở hình 3.6 cho thấy ở tất cả các làn chạy điện di đều cho băng DNA sắc nét, rõ ràng và ít bị đứt gãy.
Đồng thời với việc chạy điện di, DNA tổng số còn được kiểm tra bằng quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm. Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm, tính tỷ lệ OD260/OD280 thu được kết quả là 1,8 – 2,0.
Kết quả kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di và quang phổ hấp thụ đã chứng tỏ các mẫu DNA tổng số tách từ lá non các cây đậu tương chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch và có thể sử dụng cho các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo.
◄
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách từ lá các cây
đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen. 1-9: DNA tổng số tách từ các mẫu lá của các cây đậu tương chuyển gen; 10: DNA tổng số tách từ các
mẫu lá của các cây đậu tương không chuyển gen
3.2.2. Kết quả phân tích PCR khuếch đại gen chuyển GmCHI
DNA tổng số của 9 cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 và cây đối chứng không chuyển gen được sử dụng cho PCR để khuếch đại cấu trúc
GmCHI-cmyc-KDEL. Kết quả PCR với với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI- cmyc-SacI-R khuếch đại đoạn GmCHI-cmyc-KDEL được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen
GmCHI-cmyc-KDEL từ các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc- SacI-R. (+): Sản phẩm PCR từ vector pCB301- GmCHI; (-): Kết quả PCR từ cây không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Kết quả PCR từ các cây đậu tương chuyển gen T0; M; thang
DNA 1 kb.
Sản phẩm điện di ở hình 3.7 cho thấy, trong 9 cây đậu tương chuyển gen T0 được phân tích đã thu được 8 cây cho kết quả PCR nhân đoạn
GmCHI-cmyc-KDEL từ hệ gen có kích thước khoảng 0,7kb. Hiệu quả chuyển gen ở giai đoạn T0 đạt 3,56% (8/225). Như vậy, ở thế hệ T0 đã tạo được 8 cây đậu tương chuyển gen GmCHI.
Gen GmCHI nội tại có kích thước 657 bp [2], [24], cấu trúc GmCHI- cmyc-KDEL có kích thước 702 bp và khi khuếch đại bằng PCR với cặp mồi
GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc-SacI-R thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 700 bp (Hình 3.8). Như vậy bước đầu có thể nhận xét rằng gen chuyển GmCHI đã xâm nhập vào hệ gen cây đậu tương được chuyển gen. Tuy nhiên, gen chuyển GmCHI có hợp nhất vào hệ gen và có biểu hiện thành
protein tái tổ hợp ở cây đậu tương chuyển gen hay không cần phải tiếp tục phân tích bằng Southern blot và Western blot.
3.3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Có nhiều phương pháp để thực hiện chuyển một gen ngoại lai mong muốn vào thực vật, trong đó bao gồm hai phương pháp chính là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen trực tiếp phổ biến như súng bắn gen, sốc điện, sốc nhiệt, còn chuyển gen gián tiếp thông qua những vi sinh vật trung gian. Tuy nhiên các phương pháp chuyển gen trực tiếp yêu cầu phải có thiết bị, hóa chất hiện đại, kỹ thuật cao nên chi phí cho phương pháp này rất cao, ngược lại chuyển gen gián tiếp qua các vi sinh vật lại dễ dàng thực hiện, không đòi hỏi quá nhiều chi phí. Chuyển gen gián tiếp chủ yếu là thông qua hai loại vi khuẩn Agobacterium tumefaciens và Agrobacterium zhirogens do hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua viết thương của hầu hết các loài thực vật hai lá mầm. Trong đó vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn vì phương pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém nhưng vẫn hiệu quả, thuận lợi cho phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào.
Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, người ta thường sử dụng một số loại promoter như 35S, act, mas,... Trong đó 35S là một promoter mạnh được phân lập từ virus gây bệnh khảm lá súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV). Trong nghiên cứu của chúng tôi, vùng promoter CaMV35S được đưa vào cấu trúc vector chuyển gen pCB301 chứa gen chuyển GmCHI (Hình 2.2). Promoter CaMV35S được lựa chọn nhằm hướng đến việc khởi động hoạt động phiên mã của gen GmCHI để tăng cường sinh tổng hợp enzyme CHI trong mục đích nâng cao hiệu suất tổng hợp isoflavone ở đậu tương. Một số thành phần khác trong cấu trúc làm chỉ thị cho chọn lọc trong quá trình biến nạp và tái sinh cây chuyển gen. Trong cấu trúc chuyển gen, gen nptII mã hóa cho protein kháng kanamycin, là tín hiệu hiệu quả cho chọn lọc cây chuyển
gen; đoạn nucleotide mã hóa cho kháng nguyên c-myc sử dụng cho kỹ thuật Western blot và ELISA. Hai kỹ thuật nói trên đều dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu và ngưng kết giữa kháng thể với kháng nguyên là protein đính kèm với protein ngoại lai. Việc gắn đuôi c-myc là một lựa chọn tốt và phù hợp vì tính hiệu quả, phổ biến và kinh tế cho nhiều nghiên cứu hiện nay [10].
Trong những năm gần đây, ở nước ta đã có một số công trình công bố về chuyển gen vào đậu tương, đó là các nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa (2007), Nguyễn Thị Thúy Hường và cs (2009, 2011), Nguyễn Thu Hiền và cs (2012), Lò Thị Mai Thu và cs (2014), Lò Thanh Sơn và cs (2015), Đào Xuân Tân (2017). Các nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật chuyển gen vào đậu tương nhờ A.tumefacies lây nhiễm qua nách lá mầm. Trong nghiên cứu chuyển gen của chúng tôi, khi sử dụng lá mầm đậu tương làm vật liệu nhận gen đã cho thấy, lá mầm gây tổn thương vùng nách thuận lợi cho việc xâm nhiễm của
A.tumefaciens tái tổ hợp, điều này cũng được khẳng định ở nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014).
Kết quả thí nghiệm chuyển gen của Nguyễn Thúy Hường (2011) vào giống đậu tương DT84 thu được 28 cây sống sót trong 1262 mẫu biến nạp (2,2%) [5]; còng nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền (2011) khi chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 thu được 32 cây chuyển gen từ 650 mẫu biến nạp (4,9%) [7]. Lò Thị Mai Thu (2014) tiến hành chuyển cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương đã thu được 16 cây sống sót từ 370 mẫu ở giống ĐT12 (4,3%) và 32 cây sống sót từ 850 mẫu ở giống DT2008 (3,7%) [4]. Nghiên cứu của Lò Thanh Sơn (2015) khi biến nạp cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 thu được 9 cây sống sót từ 380 mảnh lá mầm (2,3%) [3]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi chuyển cấu trúc pCB301_GmCHI
vào giống đậu tương ĐT51 thu được 9 cây chuyển gen sống sót trong 225 mẫu ở ba lần biến nạp, chiếm tỷ lệ 4,0%. Như vậy tỷ lệ cây chuyển gen sống
sót ở thế hệ T0 nằm trong khoảng từ 2,0% đến 5%. Về hiệu suất chuyển gen ở T0, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 đạt hiệu suất là 0,24% [6], Hiệu suất chuyển gen trong nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền (2011) là 1,23% [7], của Lò Thị Mai Thu là 1,35% và 2,24% [4], của Lò Thanh Sơn là 1,23% [3]. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành biến nạp 225, số cây đem trồng trên giá thể là 28 và có 9 cây đậu tương chuyển gen phát triển bình thường trong nhà lưới. Gen chuyển GmCHI có mặt trong hệ gen của 8 cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 và đã được xác nhận bằng kết quả phân tích PCR. Hiệu suất