3.2.2 .Kết quả phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI
3.3. Thảo luận kết quả nghiên cứu
Có nhiều phương pháp để thực hiện chuyển một gen ngoại lai mong muốn vào thực vật, trong đó bao gồm hai phương pháp chính là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen trực tiếp phổ biến như súng bắn gen, sốc điện, sốc nhiệt, còn chuyển gen gián tiếp thông qua những vi sinh vật trung gian. Tuy nhiên các phương pháp chuyển gen trực tiếp yêu cầu phải có thiết bị, hóa chất hiện đại, kỹ thuật cao nên chi phí cho phương pháp này rất cao, ngược lại chuyển gen gián tiếp qua các vi sinh vật lại dễ dàng thực hiện, không đòi hỏi quá nhiều chi phí. Chuyển gen gián tiếp chủ yếu là thông qua hai loại vi khuẩn Agobacterium tumefaciens và Agrobacterium zhirogens do hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua viết thương của hầu hết các loài thực vật hai lá mầm. Trong đó vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn vì phương pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém nhưng vẫn hiệu quả, thuận lợi cho phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào.
Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, người ta thường sử dụng một số loại promoter như 35S, act, mas,... Trong đó 35S là một promoter mạnh được phân lập từ virus gây bệnh khảm lá súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV). Trong nghiên cứu của chúng tôi, vùng promoter CaMV35S được đưa vào cấu trúc vector chuyển gen pCB301 chứa gen chuyển GmCHI (Hình 2.2). Promoter CaMV35S được lựa chọn nhằm hướng đến việc khởi động hoạt động phiên mã của gen GmCHI để tăng cường sinh tổng hợp enzyme CHI trong mục đích nâng cao hiệu suất tổng hợp isoflavone ở đậu tương. Một số thành phần khác trong cấu trúc làm chỉ thị cho chọn lọc trong quá trình biến nạp và tái sinh cây chuyển gen. Trong cấu trúc chuyển gen, gen nptII mã hóa cho protein kháng kanamycin, là tín hiệu hiệu quả cho chọn lọc cây chuyển
gen; đoạn nucleotide mã hóa cho kháng nguyên c-myc sử dụng cho kỹ thuật Western blot và ELISA. Hai kỹ thuật nói trên đều dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu và ngưng kết giữa kháng thể với kháng nguyên là protein đính kèm với protein ngoại lai. Việc gắn đuôi c-myc là một lựa chọn tốt và phù hợp vì tính hiệu quả, phổ biến và kinh tế cho nhiều nghiên cứu hiện nay [10].
Trong những năm gần đây, ở nước ta đã có một số công trình công bố về chuyển gen vào đậu tương, đó là các nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa (2007), Nguyễn Thị Thúy Hường và cs (2009, 2011), Nguyễn Thu Hiền và cs (2012), Lò Thị Mai Thu và cs (2014), Lò Thanh Sơn và cs (2015), Đào Xuân Tân (2017). Các nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật chuyển gen vào đậu tương nhờ A.tumefacies lây nhiễm qua nách lá mầm. Trong nghiên cứu chuyển gen của chúng tôi, khi sử dụng lá mầm đậu tương làm vật liệu nhận gen đã cho thấy, lá mầm gây tổn thương vùng nách thuận lợi cho việc xâm nhiễm của
A.tumefaciens tái tổ hợp, điều này cũng được khẳng định ở nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014).
Kết quả thí nghiệm chuyển gen của Nguyễn Thúy Hường (2011) vào giống đậu tương DT84 thu được 28 cây sống sót trong 1262 mẫu biến nạp (2,2%) [5]; còng nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền (2011) khi chuyển gen vào giống đậu tương ĐT12 thu được 32 cây chuyển gen từ 650 mẫu biến nạp (4,9%) [7]. Lò Thị Mai Thu (2014) tiến hành chuyển cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương đã thu được 16 cây sống sót từ 370 mẫu ở giống ĐT12 (4,3%) và 32 cây sống sót từ 850 mẫu ở giống DT2008 (3,7%) [4]. Nghiên cứu của Lò Thanh Sơn (2015) khi biến nạp cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 thu được 9 cây sống sót từ 380 mảnh lá mầm (2,3%) [3]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi chuyển cấu trúc pCB301_GmCHI
vào giống đậu tương ĐT51 thu được 9 cây chuyển gen sống sót trong 225 mẫu ở ba lần biến nạp, chiếm tỷ lệ 4,0%. Như vậy tỷ lệ cây chuyển gen sống
sót ở thế hệ T0 nằm trong khoảng từ 2,0% đến 5%. Về hiệu suất chuyển gen ở T0, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 đạt hiệu suất là 0,24% [6], Hiệu suất chuyển gen trong nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền (2011) là 1,23% [7], của Lò Thị Mai Thu là 1,35% và 2,24% [4], của Lò Thanh Sơn là 1,23% [3]. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành biến nạp 225, số cây đem trồng trên giá thể là 28 và có 9 cây đậu tương chuyển gen phát triển bình thường trong nhà lưới. Gen chuyển GmCHI có mặt trong hệ gen của 8 cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 và đã được xác nhận bằng kết quả phân tích PCR. Hiệu suất chuyển gen đạt 3,56%.
Trong chuyển gen ở cây đậu tương, ngoài những khó khăn chung đối với chuyển gen thực vật còn gặp một số khó khăn khác như: hàm lượng protein trong tế bào và mô lớn nên dễ nhiễm khuẩn vệ tinh không mong muốn, hạt giống khó bảo quản và nhanh mất khả năng nảy mầm; hạt đậu tương chứa nhiều protein và lipid nên tái sinh các mẫu biến nạp rất khó khăn, điều kiện khí hậu thời tiết cũng là một trong những nguyên nhân làm cho các mẫu tái sinh bị nhiễm khuẩn. Khó khăn về mùa vụ sinh thái làm giảm khả năng tái sinh, sinh trưởng phát triển và sinh sản bình thường của cây biến đổi gen. Để khắc phục những khó khăn riêng nói trên cần tính toán, khảo sát nồng độ và chủng loại kháng sinh phù hợp với từng giống sao cho vừa bảo đảm mẫu tái sinh không bị nhiễm khuẩn và nấm lại vừa bảo đảm khả năng tái sinh của tế bào và mô tiếp nhận. Đặc điểm về mùa vụ sinh thái là do yếu tố di truyền của mỗi giống đã được xác lập qua chọn lọc tự nhiên nên khó có thể thay đổi, lựa chọn giải pháp tính toán thời gian biến nạp và tái sinh sao cho trùng khớp với thời gian sinh thái của mỗi giống là tốt nhất. Nhìn chung, đối với cây đậu tương, nghiên cứu tái sinh cây chuyển gen và ra cây trồng vào vụ xuân hay xuân hè là thích hợp và cho hiệu quả tạo cây chuyển gen có
tỷ lệ sống là cao nhất. Ngoài ra có thể sử dụng buồng sinh trưởng để chủ động điều tiết nhiệt độ và thời gian chiếu sáng cũng là một giải pháp kỹ thuật được chấp nhận.
Hiệu suất biến nạp gen thấp sẽ khó khăn cho việc chọn lọc cây chuyển gen, do vậy nghiên cứu tìm biện pháp làm tăng hệ số tái sinh đa chồi, tăng tỷ lệ sống sót của các cây chuyển gen và đồng thời số lượng mẫu biến nạp phải rất lớn. Chính vì vậy nghiên cứu điều kiện tối ưu cho tái sinh và chuyển gen ở cây đậu tương vẫn đang là vấn đề được tiếp tục quan tâm và nghiên cứu.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ