Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chuyển gen coda mã hóa enzyme sinh tổng hợp glycine betain dưới sự điều khiển của promote

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TẠ THỊ ĐƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA MÃ HĨA ENZYME SINH TỔNG HỢP GLYCINE BETAIN DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) Mã số: 60 42 01 14 Người hướng dẫn: PGS TS CHU HỒNG HÀ Đơn vị: Viện Cơng nghệ sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội, 10/2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn PGS TS Chu Hoàng Hà Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thơng tin, số liệu hình ảnh từ báo nguồn tài liệu tác giả khác thích trích dẫn đầy đủ Nếu có gian lận nào, tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn nội dung luận văn Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Tạ Thị Đông ii LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hồng Hà tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt trình học tập, làm việc hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn TS Phạm Bích Ngọc, Ths Nguyễn Văn Đoài, tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Ban đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn đến bạn bè gia đình giúp đỡ chia sẻ, động viên suốt trình học tập thực luận văn Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Tạ Thị Đông iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng đậu tương 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.2 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.2.1 Tác động hạn đến hệ rễ 1.2.2 Tác động hạn đến khả cố định đạm 1.2.3 Tác động hạn đến hình thái 10 1.3 GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB 10 1.3.1 Cơ chế chống chịu điều kiện bất lợi môi trường thực vật 10 1.3.2 Các đường sinh tổng hợp GB 12 1.3.3 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả chống chịu điều kiện môi trường bất lợi 14 1.4 PROMOTER VÀ PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A 20 1.4.1 Cấu trúc chức promoter 20 1.4.2 Promoter cảm ứng khô hạn RD29A 20 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN 21 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28 iv 2.1.1 Vật liệu thực vật 28 2.1.2 Chủng vi khuẩn vector 28 2.1.3 Hóa chất thiết bị 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen pIBTII- rd29A-codA 29 2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium 34 2.2.3 Phương pháp đánh giá thuốc chuyển gen codA 34 2.2.4 Phương pháp tạo đậu tương chuyển gen 34 2.2.5 Phương pháp phân tích đậu tương chuyển gen phản ứng PCR 36 2.2.6 Phương pháp phân tích đậu tương chuyển gen Phosphinothricin 36 2.2.7 Xây dựng đường chuẩn xử lý hạn giống đậu tương ĐT22 37 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .38 3.1 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A 38 3.1.1 PCR nhân promoter rd29A từ Arabidopsis với mồi RD29A-HindIII-F RD29A-Xbal-R 38 3.1.2 Tách dòng rd29A vector pBT, cắt pBT-rd29A pIBTII-35S-codA với HindIII Xbal 38 3.1.3 Nối rd29A với pIBTII-codA, biến nạp vào E.coli, chọn dòng băng phản ứng cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F RD29A-XbaL-R 39 3.1.4 Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng băng phản ứng colony PCR với mồi RD29A-HindIII-F RD29A-Xbal-R 40 3.2 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO THUỐC LÁ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM 41 3.2.1 Kết chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào giống thuốc K326 41 3.2.2 Kết đánh giá phân tích dịng thuốc chuyển gen 42 3.2.3 Kết đánh giá khả chống chịu dòng thuốc chuyển gen 43 3.3 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 44 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ khuẩn A Tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả cảm ứng tạo chồi 44 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ ppt (Phosphinothricin) đến hiệu chuyển gen 45 v 3.3.3 Kết chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương 46 3.4 PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DỊNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 49 3.4.1 Kết kiểm tra dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA phản ứng PCR 49 3.4.2 Kết kiểm tra dòng đậu tương T0 T1 chuyển cấu trúc rd29A-codA ppt 50 3.4.3 Kết xây dựng đường xử lý hạn giống đậu tương DT22 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 68 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU AS Acetosyrigone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine purin GB Glycine Betain bp Base pair CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Germination medium - Môi trường nảy mầm IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction PPT Phosphinothricin RM Rooting medium - Môi trường rễ SIM Shoot induction medium - Môi trường tạo chồi SEM Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật T0, T1 Các hệ đậu tương chuyển gen YEP Yeast extract peptone vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) Bảng 1.2 Một số loài trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp GB, tăng khả chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi .18 Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt mầm đậu tương giới 23 Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt mầm đậu tương Việt Nam 26 Bảng 2.1 Các cặp mồi dung cho phản ứng PCR đậu tương 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A .30 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối promoter rd29A với vector tách dòng pBT 30 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt enzyme HindIII XbaI 31 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối với nhờ enzyme T4 ligase 31 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng phản ứng colony PCR 32 Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 33 Bảng 2.9 Chu trình nhiệt PCR 33 Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót mảnh thuốc biến nạp qua giai đoạn chọn lọc 41 Bảng 3.2 Kết gây hạn nhân tạo dòng thuốc chuyển gen 43 Báng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả cảm ứng tạo chồi 45 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ ppt đến khả tạo chồi 46 Bảng 3.5 Kết biến nạp vector chuyển gen vào mảnh mầm đậu tương 47 Bảng 3.6 Kết kiểm tra dòng T1 Phosphinothricin 250mg/l 52 Bảng 3.7 Sự phát triển thân rễ đậu tương ĐT22 thí nghiệm .54 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Diện tích trồng sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) Hình 1.2 Sinh tổng hợp GB thực vật bậc cao 13 Hình 1.3 Sinh tổng hợp GB A globiformis 13 Hình 2.1 Sơ đồ khái qt thí nghiệm tái sinh đậu tương qua đa chồi từ nách mầm hạt chín 35 Hình 3.1 Kết PCR nhân promoter rd29A từ Arabidopsis 38 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR xử lý HindIII / XbaI 39 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm colony – PCR 40 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu 41 Hình 3.5 Các giai đoạn trình chuyển gen thuốc 42 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR dịng thuốc 42 Hình 3.7 Kết gây hạn nhân tạo dòng thuốc chuyển gen 44 Hình 3.8 Các mảnh mầm môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác 46 Hình 3.9 Các giai đoạn trình chuyển gen đậu tương .48 Hình 3.10 Kết kiểm tra T0 PCR 49 Hình 3.11 Kết kiểm tra T1 PCR 50 Hình 3.12 Kết kiểm tra dịng Đậu Tương T0 Phosphinothricin .50 Hình 3.13 Kết kiểm tra dòng đậu tương T1 Phosphinothricin .51 Hình 3.14 Sinh trưởng giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm 53 Hình 3.15 Sự phát triển thân rễ giống DT22 54 Hình 3.16 Các phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo .55 MỞ ĐẦU Đậu tương trồng quan trọng cho nông nghiệp giới, loại trồng sử dụng làm nguồn thức ăn cho người vật nuôi, cơng nghiệp… Hạt đậu tương có chứa hàm lượng protein dầu cao, ngồi ra, cịn có chất khác carbohydrate, vitamin khoáng chất Do vậy, đậu tương trở thành đối tượng cho nghiên cứu nâng cao tính trạng số lượng, chất lượng khả chống chịu Hiện nay, chuyển gen phương pháp ứng dụng nghiên cứu chọn giống trồng nói chung đậu tương nói riêng Cây đậu tương loại trồng quan trọng bậc nhiều quốc gia với vị trí đứng sau lúa, ngơ lúa mì, có khả thích nghi rộng với điều kiện khí hậu sinh thái khác nên đậu tương trồng rộng rãi năm châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ tiếp đến Châu Á Bình quân hàng năm giới có khoảng 91 triệu đậu tương gieo trồng với suất bình quân cao 22-23 tấn/ha Mỹ nước có diện tích gieo trồng sản lượng đậu tương lớn giới, Brazil, Achentina, Trung Quốc Trong năm 2014 sản lượng đậu tương brazil đạt 90.700.000 Ngày 11/4/17, IBGE- Viện Địa lý Thống kê Brazil dự báo sản lượng đậu tương nước năm đạt mức kỷ lục 110,9 triệu tăng 15,9% so với năm 2016 Bước vào thời kỳ tại, biến đổi khí hậu ảnh hưởng tới suất chất lượng trồng, yếu tố bất lợi môi trường thách thức lớn cho mục tiêu trì phát triển bền vững cho sản xuất lương thực cho người, hạn mặn hai số yếu tố quan trọng kìm hãm phát triển sản xuất nông nghiệp Những năm gần đây, giới Việt Nam thường xuyên phải gánh chịu biến động lớn Sự gia tăng hạn hán, lũ lụt, xói mịn, thối hóa đất gây ảnh hưởng đến trồng Đậu tương trồng chịu hạn thiếu nước thời kỳ khác có ảnh hưởng xấu đến suất Như vậy, việc chọn tạo giống đậu tương có khả chống chịu hạn nhu cầu cần thiết sản xuất xem định hướng nghiên cứu phát triển đậu tương Việt Nam 55 Hình 3.16 Các phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo Các xử lý hạn sau 3, 6, 9, 10, 11, 12 ngày chuyển sang buồng sinh trưởng không xử lý hạn để tiến hành phục hồi Theo Hình 3.16, ta quan sát thấy sau ngày gây hạn phục hồi phát triển tốt, hình thái thời gian hoa đậu hồn tồn kịp với khơng xử lý hạn Các sau ngày 10 ngày gây hạn sinh trưởng phát triển chậm hơn, thân bé hoa đậu muộn số lượng Cây sau 11 ngày xử lý hạn sống phát triển không tạo hoa đậu thời điểm với dòng xử lý chịu hạn khả thu nhiều hạt giảm Vậy yếu tố hạn hán ảnh hưởng trực tiếp đến trình sinh trưởng phát triển giống đậu tương DT22, giới hạn sống giống đậu tương DT22 điều kiện xử lý khô hạn nhiệt độ: 33oC, độ ẩm: 55%, ánh sáng: 14h/10h sáng/tối, không bổ sung nước 12 ngày, sau ngày gây hạn sinh trưởng phát triển chậm Khơng tạo kịp sau 11 ngày gây hạn, ngừng phát triển không phục hồi sau 12 ngày gây hạn 56 Từ kết xử lý hạn với giống đậu tương ĐT22, đề xuất đánh giá biểu gen đích mức độ mRNA, protein gia tăng tích luỹ hàm lượng glycine betain dịng đậu tương chuyển gen chịu hạn điều kiện thí nghiệm gây hạn nhân tạo sau 9-12 ngày gây hạn 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA Trong promoter cảm ứng khơ hạn điều khiển hoạt động gen codA Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống thuốc K326 thu 19 dịng, có 12 dịng xuất băng vạch có kích thước đoạn gen codA gen bar phản ứng PCR với cặp mồi codA F/R Bar F/R Kết xử lý hạn định lượng GB chứng minh dịng thuốc chuyển gen có khả chịu hạn nhân tạo cao so với đối chứng không chuyển gen Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 thu 23 dịng T0, có 10 dịng dương tính với thuốc diệt cỏ 250mg/l dịng xuất băng vạch có kích thước đoạn gen codA gen bar phản ứng PCR với cặp mồi CodA F/R Bar F/R Bước đầu đánh giá kiểm tra dòng T1 chuyển gen codA phản ứng PCR thuốc diệt cỏ 250mg/l, thu dịng dương tính với PCR thuốc diệt cỏ Xác định tiêu liên quan đến tính chống chịu với strees mơi trường: độ dài rễ, trọng lương tươi, trọng lượng khô từ xây dựng phương pháp đánh giá dịng chuyển gen chịu hạn điều kiện phịng thí nghiệm KIẾN NGHỊ Tiếp tục đánh giá kiểm tra dòng đậu tương T1, T2 hệ sau thuốc diệt cỏ phản ứng PCR với cặp mồi codA F/R Bar F/R Xác định có mặt gắn kết ổn định gen chuyển dòng đậu tương chuyển gen Southern blot đánh giá biểu gen mức độ phiên mã biểu protein đích điều kiện xử lý hạn Định lượng hàm lượng GB dòng đậu tương chuyển gen, xác định khả hoạt động gen codA điều khiển promoter cảm ứng khô hạn rd29A Đánh giá kiểm tra đậu tương chuyển gen hệ T1 điều kiện xử lý stress môi trường 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Văn Điền Giáo Trình Cây Đậu Tương nhà xuất nơng nghiệp, 2007 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo, (2013) “Nghiên cứu biến nạp gene liên quan dến khả kháng hạn kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22.” Tạp Chí KHCN Bộ NNPTNT, vol Lê Tiến Dũng, Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Trần Phan Lam Sơn, (2013) “Những kết gần nghiên cứu chức gen đậu tương điều kiện khô hạn.” Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc, pp 747–751 Nguyễn Tiến Dũng, Ngơ Xn Bình, Hà Văn Chiến, Nguyễn Xuân Đồng, (2010) “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen số giống đậu tương [Glycine Max (L.) Merr.] Của việt nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens.” Tạp Chí Nơng Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, vol 11, pp 69– 74 Nguyễn Thị Thu Hiền "Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt Virus H5N1 vào đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật“ Luận án tiến sĩ 2014 Trần Thị Cúc Hòa, (2008) “Hiệu tạo dòng đậu tương biến đổi gene từ giống MTĐ 176, HL 202 Maverick William 82 phương pháp nốt mầm qua trung gian Agrobacterium Tumefaciens.” Tạp Chí Nơng Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, vol 1, pp 14–19 Trần Thị Cúc Hòa, (2013) “Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng ruồi đục thân sâu đục quả.” Hội Thảo Quốc Gia Khoa Học Cây Trồng Lần Thứ Nhất, pp 441–446 Trần Thị Cúc Hòa, Phạm Trung Nghĩa, Trần Ngọc Thạch, Hồ Thị Huỳnh Như, Lã Cao Thắng, Trần Thanh Hải, Nguyễn Trần Hải Bằng, Võ Thị Kiều Trang (2015) “Tạo dòng đậu tương chuyển gene kháng sâu chịu hạn.” Chuyên Đề Nghiên Cứu Phát Triển Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp Tháng 6/2015, pp 19–26 59 Nguyễn Thị Thúy Hường “phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam” Luận án tiến sĩ 2011 10 Trần Thị Phương Liên, (2010) “Protein tính chống chịu thực vật.” NXB Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Hà Nội 11 Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Tường Vân, Nông Văn Hải, Chu Hồng Hà, (2010) “Tách dịng xác định trình tự cDNA gen GS1 đậu tương (Glycine Max L.).” Công Nghệ Sinh Học, vol 8, No 3A, pp 499– 504 12 Bùi Phương Thảo, Lê Thị Thủy, Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà, Trần Thanh Thu, G.Angeneon, Lê Văn Sơn , (2009) “Nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gene mang cấu trúc biểu gene mã hóa kháng nguyên HA Virus A/H5N1.” Hội Nghị KHCN Toàn Quốc Thái Nguyên, pp 868–872 13 Lê Thị Thủy, Lê Văn Sơn, Bùi Phương Thảo, Chu Hoàng Hà, (2010) “Nghiên cứu tái sinh đậu tương (Glycine Max L.) thơng qua nách mầm hạt Chín.” Tạp Chí KHCN ĐH Quốc Gia HN, vol 26, No 2S, pp 247–254 Tiếng Anh 14 Alia, Hayashi H, Chen THH, Muratat N, “Transformation with a gene for choline oxidase enhances the cold tolerance of arabidopsis during germination and early growth.” Plant Cell Environ, vol 21, pp 232–239 15 Allakhverdiev, Suleyman I., Dmitry A Los, Prasanna Mohanty, Yoshitaka Nishiyama, Murata, Norio., (2007) “Glycinebetaine alleviates the inhibitory effect of moderate heat stress on the repair of photosystem II during photoinhibition.” Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, vol 1767, No 12, pp 1363–1371 16 Ashraf, M., (2009) “Biotechnological approach of improving plant salt tolerance using antioxidants as markers.” Biotechnology Adv, vol 27, pp 84– 93 60 17 Bai Xianquan, Qiuyun Wang, Chengcai Chu, (2008) “Excision of a selective marker in transgenic rice using a novel creloxp system controlled by a floral specific promoter.” Transgenic Research, vol 17, No 6, pp 1035–1043 18 Berry JA, and Björkman O., (1980) “Photosynthetic response and adaptation to temperature in higher plants.” Annu Rev Plant Physiol, vol 31, pp 491–543 19 Bohnert, H J., (1995) “Adaptations to environmental stresses.” The Plant Cell Online, vol 7, no 7, pp 1099–1111 20 Boynton John E.Nicholas W.Gillham, Elizabeth H Harris, Jonathan P Holesr, Anita, M.Johnson, Allan R.jones, Barbara L.randoph-Anderson, Dminiqe Robertson, Ted M klien, Katherine B Shark, John C Sanfor, (1988) “Chloroplast transformation in chlamydomonas with high velocity microprojectiles.” Science, vol 1482 21 Cerezini Paula, Lima Santos, Antonio Eduardo Pípolo, Mariangela Hungria, Marco Antonio Nogueira, (2017) “Water restriction and physiological traits in soybean genotypes contrasting for nitrogen fixation drought tolerance.” Scientia Agricola, vol 74, No 2, pp 110–117 22 Crossway Anne, Oakes Janette V., Irvine Jonathan M., Ward Barney, Knauf Vic C., Shewmaker C K (1986) “Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.” MGG Molecular & General Genetics, vol 202, No 2, pp 179–185 23 Dang, Wei, and Zhi ming Wei, (2007) “An optimized agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes.” Plant Science, vol 173, Elsevier B.V., pp 381–389 24 Davey Michael R., Anthony Paul, Power J Brian, Lowe Kenneth C (2005) “Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.” Biotechnology Advances, vol 23, No , pp 131–171 25 Depicker, A., Herman, L; Jacobs, A; Schell, J; (1985) “Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the Agrobacterium plant cell interaction.” Mol Gen Genet, vol 201, p 477484 61 26 Fukuda, Y., (1933) “Cytogenetical studies on the wild and cultivated manchurian soybeans (GlycineL.).” Japanese Journal of Botany, vol 6, pp 489–506 27 Gorhan, John., (1995) “Betaines in higher plants ”– Biosynthesis and Role in Stress Metabolism 28 Haldimann, P., and U Feller, (2004) “Inhibition of photosynthesis by high temperature in oak (Quercus Pubescens L.) leaves grown under natural conditions closely correlates with a reversible heat-dependent reduction of the activation state of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase.” Plant, Cell and Environment, vol 27, No 9, pp 1169–1183 29 Haldimann, Pierre, and Urs Feller, (2005) “Growth at moderately elevated temperature alters the physiological response of the photosynthetic apparatus to heat stress in pea (Pisum Sativum L.) leaves.” Plant, Cell and Environment, vol 28, No 3, pp 302–317 30 Hamilton, E W., and S a Heckathorn, (2001) “Mitochondrial adaptations to naCl Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins, whereas complex II is protected by proline and betaine.” Plant Physiology, vol 126, No 3, pp 1266–1274 31 Hansen, Geneviève, and Martha S Wright, (1999) “Recent advances in the transformation of plants.” Trends in Plant Science, vol 4, No 6, pp 226–231 32 Havaux, M., et al., (1996) “Thylakoid membrane stability to heat stress studied by flash spectroscopic measurements of the electrochromic shift in intact potato leaves: influence of the xanthophyll content.” Plant, Cell and Environment, vol 19, No 12, pp 1359–1368 33 Holmström KO, Somersalo S, Mandal A, Palva ET, Welin B, (2000) “Improved tolerance to salinity and low temperature in transgeneic tobacco producing glycine betaine.” J Exp Bot, vol 51, pp 177–185 34 Hooykaas, P J J., and R A Schilperoort, (1992) “Agrobacterium and plant genetic engineering.” Plant Mol Biol., vol 19, pp 15–38 35 Hymowitz, T., and C A Newell, (1981) “Taxonomy of the genus glycine, domestication and uses of soybeans.” Econ Bot, vol , pp 272–288 62 36 Chen THH, and Murata N., (2002) “Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes.” Current Opinion in Plant Biology, vol 5, pp 250–257 37 Chen WP, Li PH, Chen THH, (2000) “glycinebetaine increases chilling tolerance and reduces chilling-induced lipid peroxidation in zea mays l.” Plant Cell Environ, vol 23, pp 609–618 38 Ikuta S, Mamura S, Misaki H, Horiuti Y, (1977) “Purification and characterization of choline oxidase from arthrobacter globiformis.” J Biochem, vol 82, pp 1741–1749 39 Iqbal Z., Lateef M., Jabbar A., Muhammad G., Khan, M N (2005) “Anthelmintic activity of calotropis procera (Ait.) ait f flowers in sheep.” Journal of Ethnopharmacology, vol 102(2) 40 James, J A., and B H Lee, (1997) “Glucoamylases: microbial sources, industrial applications and molecular biology - a review.” Journal of Food Biochemistry, vol 21, No 1, pp 1–52 41 Kaeppler, H F., Somers, D A., Rines, H W., Cockburn, A F (1992) “Silicon carbide fiber-mediated stable transformation of plant cells.” Theoretical and Applied Genetics, vol 84, No 5–6, pp 560–566 42 Khan MS, Zaidi A, Wani PA, Ahemad M, Oves M., (2009) “Functional diversity among plant growth-promoting rhizobacteria In: khan ms, zaidi a, musarrat j (Eds) microbial strategies for crop improvement.” Springer, pp 105– 132 43 Kiyosue Tomohiro, Yamaguchi-Shinozaki Kazuko; Shinozaki Kazuo, (1993) “Characterization of two cDNAs (ERD11 and ERD13) for dehydrationinducible genes that encode putative glutathione s-transferases in arabidopsis thaliana l.” FEBS Letters, vol 335, No 2, pp 189–192 44 Komari Toshihiko, Hiei Yukoh, Saito Yasuhito, Murai Nobuhiko, Kumashiro Takashi, (1996) “Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers.” The Plant Journal, vol 10, No 1, pp 165–174 63 45 Lv S, Young A, Zhang K, Wang L, Zhang J, (2007) “ Increase of glycinebetaine synthesis improves drought tolerance in cotton.” Mol Breed, vol 20, pp 233–248 46 Ma XL, Wang YJ, Xie SI, Wang C, Wang W, (2007) “Glycinebetaine application ameliorates negative effects of drought stress in tobacco.” Russ J Plant Physiol, vol 54, pp 472–479 47 McCue KF, and Hanson AD., (1990) “Drought and salt tolerance: towards understanding and application.” Trends Biotechnol, vol 8, pp 358–362 48 McKersie, Bryan D., and Ya’acov Y Leshem, (1994) “Stress and stress coping in cultivated plants.” Igarss 2014, No 49 Nishiyama Y, Yamamoto H, Allakhverdiev SI, Inaba M, Yokota A, Murata N, (2001) “Oxidative stress inhibits the repair of photodamage to the photosynthetic machinery.” EMBO J, vol 20, pp 5587–5594 50 Nyyssölä Antti, Kerovuo Janne, Kaukinen Pasi, Von Weymarn Niklas, Reinikainen Tapani (2000) “Extreme halophiles synthesize betaine from glycine by methylation.” Journal of Biological Chemistry, vol 275, No 29, pp 22196–22201 51 Papageorgiou GC, and Murata N., (1995) “The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygene-evolving photosystem II complex.” Photosynth Res, vol 44, pp 243–252 52 Park, Eung-Jun, Zoran Jeknic, Atsushi Sakamoto, Jeanine DeNoma, Raweewan Yuwansiri, Norio Murata, Tony H H Chen, (2004) “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage.” The Plant Journal, vol 40, pp 474–487 53 Park, Eung-Jun, Zoran Jeknic, Pino, Norio Murata, Tony H H Chen,“Glycinebetaine accumulation is more effective in chloroplasts than in the cytosol for protecting transgenic tomato plants against pbiotic stress.” Plant Cell Environ, vol 30, pp 994–1005 54 Parrott, W A., Williams E G Hildebrand D F., Collins G B., (1989) “Effect of genotype on somatic embryogenesis from immature cotyledons of soybean.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, vol 16, No 1, pp 15–21 64 55 Prasad TK, Anderson MD, Martin BA, Stewart CR, (1994) “Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogene peroxide.” Plant Cell, vol 6, pp 65–74 56 Quan R, Shang M, Zhang H, Zhao Y, Zhang J, “Engineering of enhanced glycinebetaine synthesis improves drought tolerance in maize.” Plant Biotechnol J, vol 2, pp 477–486 57 Quan R, Shang M, Zhang H, Zhao Y, Zhang J, “Improved chilling tolerance by transformation with betA gene for the enhancement of glycinebetaine synthesis in maize.” Plant Sci, vol 166, pp 141–149 58 Rathinasabapathi, B, Burnet M, Russell B L, Gage D A, Liao P C, Nye G J, Scott P, Golbeck J H, Hanson, A D., (1997) “Choline monooxygenase, an unusual iron-sulfur enzyme catalyzing the first step of glycine betaine synthesis in plants: prosthetic group characterization and cDNA cloning.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 94, No 7, pp 3454–8 59 Sakamoto, Atsushi, and Norio Murata, (2000) “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in plants: current status and implications for enhancement of stress tolerance.” J Exp Bot, vol 51, pp 81–88 60 Sakamoto, Atsushi, and Norio Murata, (2002) “The role of glycine betaine in the protection of plants from stress: clues from transgeneic plants.” Plant Cell Environ, Vol 25, pp 163–171 61 Sakamoto Atsushi, Alia, Murata Norio (1998) “Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold.” Plant Mol Bio, vol 138, pp 1011–1019 62 Salmenkallio-Marttil M., Aspegren K S, Kurtn U, Mannonen L, Ritala A, Teeri T H, (1995) “Transgenic barley ( hordeum vulgate l ) by eleetroporation of protoplasts.” Plant Cell Reports, Vol 15, pp 301–304 63 Salvucci, M E., (2004) “Relationship between the heat tolerance of photosynthesis and the thermal stability of rubisco activase in plants from contrasting thermal environments.” Plant Physiology, vol 134, No 4, pp 1460–1470 65 64 Sawahel W., (2003) “Improved performance of transgeneic glycienebetaine accumulating rice plants under drought stress.” Biologia Plantarum, vol 47, pp 39–44 65 Shirasawa K, Takabe T, Kishitani S, (2006) “Accumulation of glycinebetaine in rice plants that overexpress choline monooxygenease from spinach and evaluation of their tolerance to abiotic stress.” Ann Bot, vol 98, pp 565–571 66 Su J, Hirji R, Zhang L, He C, Selvaraj G, Wu R, (2006) “Evaluation of the stress-inducible production of choline oxidase in transgeneic rice as a strategy for producing the stress protectant glycine betaine.” J Exp Bot, vol 57, pp 1129–1135 67 Szabados L, and Savoure A., (2009) “Proline: a multifunctional amino acid.” Trends Plant Sci, vol 15, pp 89–97 68 Takabe Teruhiro, Hayashi Y, Tanaka A, Takabe T, Kishitani S, (1998) “Evaluation of glycinebetaine accumulation for stress tolerance in transgeneic rice plants in: proceedings of international workshop on breeding and biotechnology for environmental stress in rice.” Hokkaido Agricultural Experiment Station, Sapporo, pp 63–68 69 Thomashow MF., (1999) “Plant cold acclimation: freezing tolerance genees and regulatory mechanisms.” Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, Vol 50, pp 571–599 70 Wyn Jones RG, (1984) “Phytochemical aspects of osmotic adaptation.” Recent Adv Phytochem, vol 18, pp 55–78 71 Yamaguchi-Shinozaki K, Koizumi M, Urao S, Shinozaki K, (1992) “Molecular cloning and characterization of cDNAs for genes that are responsive to desiccation in arabidopsis thaliana: sequence analysis of one cDNA clone that encodes a putative transmembrane channel protein.” Plant Cell Physio, vol 33, pp 217–224 72 Yamaguchi-Shinozaki, K., and K Shinozaki, (1993) “Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29 gene of arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants.” Molecular & General Genetics : MGG, vol 236, No 2–3,, pp 331–340 66 73 Yan, H., and C M Rommens, (2006) “Transposition-based plant transformation.” Plant Physiology, vol 143, No 2, pp 570–578 74 Yang W.J., Rich P.J., Axtell J.D., Wood K.V., Bonham C.C., Ejeta G., Mickelbart M.V., Rhodes D, (2003) “Genotypic variation for glycinebetaine in sorghum.” Crop Sci, vol 43, pp 162–169 75 Yang, Xinghong, Xiaogang Wen, Hongmei Gong, Qingtao Lu, Zhipan Yang, Yunlai Tang, Zheng Liang, Congming Lu, (2007) “Genetic engineering of the biosynthesis of glycinebetaine enhances thermotolerance of photosystem II in tobacco plants.” Planta, vol 225, No 3, pp 719–733 76 Yang, Xinghong, Zheng Liang, Congming Lu, (2005) “Genetic engineering of the biosynthesis of glycinebetaine enhances photosynthesis against high temperature stress in transgenic tobacco plants.” Plant Physiology, vol 138, No 4, pp 2299–2309 77 Yukawa Kiyoshi, Kaku Hisatoshi, Tanaka Hiroshi, Koga-Ban Yasunori, Fukuda Masao (2007) “characterization and host range determination of soybean super virulent Agrobacterium Tumefaciens KAT23.” Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol 71, No 7, pp 1676–1682 78 Zeng P., Vadnais D A., Zhang Z., Polacco J C., (2004) “Refined glufosinate selection in Agrobacterium-Mediated transformation of soybean [Glycine Max (L.) Merrill].” Plant Cell Reports, vol 22, No 7, pp 478–482 79 Nguyen HT, Babu RCBlum, A (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular genetics considerations” Crop Sci 37: 1426-14 80 Taylor HM Burnett E, Booth GD (1978) “Taproot elongation rates of soybeans” Z Acker-und Pflanzenbau Bd 146 81 Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC (1984) “Taproot elongation rates of soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting depth” Crop Sci 24: 916-920 82 Huck MG, Ishihara K, Peterson C.M and Ushijima T (1983) “Soybean adaptation to water stress at selected stages of growth” Plant Physiol 73: 422-427 67 83 Purcell LC, King CA (1996) “Drought and nitrogen source effects on nitrogen nutrition, seed growth, and yield in soybean” J Plant Nutr 19: 969-99 84 King CA, Purcell LC (2005) “Inhibition of N2 fixation in soybean is associated with elevated ureides and aminoacids” Plant Physiol 137: 13891396 85 Sinclair TR., Purcell L.C, King CA., Sneller CH., Chen P, Vadez V (2007) “Drought tolerance and yield increase of soybean resulting from improved symbiotic N fixation” Field Crops Res 101: 68-7 86 Tran LS, Mochida K (2010) “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions” Funct Integr Genomics ;10(4):447-62 87 ISAAA, Brief 52: Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016, ISAAA briefs; 2016 68 PHỤ LỤC Môi trường nuôi khuẩn Yeast extract peptone (YEB) đặc Yeast extract peptone (YEP) lỏng yeast extract (10 g/l) + NaCl (5 g/l) + tryptone ( 10 g/l) + 15g/l Bacto agar, pH = yeast extract (10 g/l ) + NaCl (5 g/l) + tryptone(10 g/l), pH = Môi trường chuyển gen thuốc Mơi trường Nhiễm khuẩn(½ MS) Thành phần ½ MS pH 5,8 Bổ sung: 0,02g/l Acetosyringone Tiền nuôi cấy (MS1) MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar, pH 5,8 Đồng nuôi cấy (MS2) MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar, pH 5,8 Bổ sung: 0,02g/l Acetosyringone Chọn lọc tạo chồi (MS3) Chọn lọc (MS4) MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar, pH 5,8 Bổ sung: 500mg/l Cefotaxime + 2mg/l ppt MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 0,1mg/l IBA + 8g/l Agar, pH 5,8 Bổ sung: 500mg/l Cefotaxime + mg/l ppt Môi trường gây hạn nhân tạo thuốc Môi trường Thành phần Cảm ứng tạo chồi MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar + 2,5% PEG 8000 +1mg/l ppt, pH 5,8 Tạo rễ MS + 0,1mg/l IBA + 20g/l Sucrose + 8g/l Agar + 2,5% PEG 8000 +1mg/l ppt, pH 5,8 69 Môi trường chuyển gen Đậu tương Môi trường Thành phần Gieo hạt (GM) 3,052g/l Muối B5 + 20 g/l Sucrose + 2,5 g/l gellan, pH = 5,8 có bổ sung 1ml/l vitaminB5 1000X Nhiễm khuẩn (CCM lỏng) 0,316g/l Muối B5 + 1,7 mg/l BAP + 3,9g/l MES + 0,25mg/l GA3 +30 g/l Sucrose, pH = 5,4 có bổ sung: 0,04g/l Acetosyringone + 154mg/l dithiothreitol + 400 mg/l L-cysteine +158 mg/l Sodium thiosulfate + 1ml/l vitaminB5 1000X +1,67 mg/l BAP +0,25mg/l GA3 Đồng nuôi cấy (CCM 0,316g/l Muối B5 + 1,7 mg/l BAP + 3,9g/l MES + đặc) 0,25mg/l GA3 +30 g/l Sucrose + g/l Agar, pH = 5,4 có bổ sung: 0,04g/l Acetosyringone + 1ml/l vitaminB5 1000X +1,67 mg/l BAP +0,25mg/l GA3 Diệt khuẩn tạo đa chồi 3,052g/l Muối B5 + 0,59g/l MES +30 g/l Sucrose + g/l (SIM) Agar, pH = 5,8 có bổ sung: 1,67 mg/l BAP + 500mg/l Cefotaxim + 1ml/l vitaminB5 1000X Tái sinh hoàn chỉnh 4,3g/l MS + 0,59g/l MES + 30 g/l Sucrose + 200ml/l (SEM) nước dừa + 2,5 g/l gellan, pH = 5,8 có bổ sung: 500mg/l Cefotaxim + 1ml/l vitaminB5 1000X + 500mg/l GA3 + 100mg/l IAA + 200ml/l Nước dừa + 50mg/l LAsparagine monohydrate Ra rễ (RM) 4,3g/l MS + 20 g/l Sucrose + 0,59g/l MES + 2,5 g/l gellan, pH = 5,8 có bổ sung: 250mg/l Cefotaxim + 0,1mg/l IBA + 1ml/l vitaminB5 1000X + 50mg/l LAsparagine monohydrate ... mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp GB, tăng khả chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi .18 Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt mầm đậu tương giới 23 Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên. .. chuyển hóa thành GB cần xúc tác enzyme choline oxidase (COD) mã hóa gen codA nên chọn gen codA làm gen mục tiêu để nghiên cứu Gen codA có kích thước phân tử 1641 bp, mã hóa cho choline oxidase có... 37 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .38 3.1 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A 38 3.1.1 PCR nhân promoter rd29A từ Arabidopsis