Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tách dòng và biểu hiện gen VP1 của Enterovirus 71

Tuy nhiên, hệ thống này cũng có một số nhược điểm như: đối với gen có nguồn gốc từ eukaryote thì cần tạo dòng bằng cách dùng cDNA thay đổi codon hiếm ở gen ban đầu bằng codon phổ biến ở

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU

- Hệ thống phân tích DNA tự động (Beckman counter) - Máy gia nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) - Máy ly tâm lạnh (Gyrozen)

- Máy ly tâm thường (Hermle) - Máy chụp gel ChemiDoc (Biorad) - Máy soi gel (Bioblock Scientific) - Máy điện di (Amersham BioSciences) - Bộ điện di SDS-PAGE (Clever Scientific) - Bộ chạy Western Blotting (Biorad)

- Hệ thống sắc ký (GE Healthcare) - Máy ly tâm chân không RC1010 (Jouan) - Tủ an toàn pha mix PCR (ESCO)

- Tủ cấy vô trùng ADS (Laminare) - Tủ ấm 37 o C (Jouan)

- Tủ ấm lắc (Bioblock Scientific) - Máy đo nồng độ DNA (Pharmacia Biotech)

- DTT (0.1M) - Nước cất vô trùng - Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP) mix (10 mM) (dATP, dTTP, dCTP, dGTP 2.5 mM mỗi loại) - Nước cất vô trùng

- Dung dịch TAE 1X - Thuốc nhuộm huỳnh quang DTCS - Sodium acetate (3M)

Luận văn Thạc sỹ Vật liệu và phương pháp

- EDTA (0.1M) - Glycerol - Ethanol (70% và 95%) - Dung dịch Sample Loading Solution - Dầu khoáng

- Dung dịch Separation Buffer - Dung dịch CaCl2 (100 mM) - Glycerol 100 mM

- Kháng sinh Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml) - Môi trường BHI, BHIA (Oxoid)

- Môi trường S.O.C (Invitrogen) - Thang DNA 1kb (NEB)

- Thang Protein 10 – 200 kDa (Invitrogen) - Thang Protein 10 – 172 kDa (Invitrogen) - Enzyme Takara Ex Taq DNA Polymerase (5.0U/àl) (Takara) - Enzyme T4 DNA (5 U/àL) Ligase

- Enzyme ThermoScript RT (Invitrogen) - Kit QIAamp Viral RNA mini (Qiagen) - Kit QIA quick Gel Extraction (Qiagen) - Kit QIAprep Spin MiniPrep (Qiagen)

- Tế bào VERO: sử dụng để nhân bản virus EV71 - Tế bào E.coli Mach1 TM – T1 R (Invitrogen): sử dụng trong dòng hóa - Tế bào E.coli BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdSB (Rb-, mB-), gal, dcm

(DE3)] (Invitrogen): sử dụng trong biểu hiện protein

4 Plasmid: vector pET SUMO (Invitrogen)

5 Mồi dùng cho tổng hợp gen và giải trình tự

 Mồi dùng trong tổng hợp cDNA: mồi ngẫu nhiên Hexamer

 Mồi dùng trong tổng hợp gen VP1

Luận văn Thạc sỹ Vật liệu và phương pháp

 Mồi dùng trong giải trình tự (nhân gen trực tiếp trên Plasmid)

- Forward primer: pET_VP1 SUMO Forward (1 mM):

- Reverse primer: pET_VP1 T7 Reverse (1 mM):

- Đĩa nuôi cấy pettri - Tube Eppendorf cỏc loại: 200 àL, 500 àL, 1.5 mL, 2 mL - Tube giữ chủng đông sâu 1.8 mL

- Tube ly tâm 15mL, 50 mL - Đầu cụn cỏc loại: 10 àL, 20 àL, 200 àL, 1000 àL - Pipet nhựa các loại: 5 mL, 10 mL

PHƯƠNG PHÁP

Hỳt 560 àl Buffer AVL vào 5.6 àl hạt Carrier mang RNA (đó chuẩn bị trước) vào tube 1.5ml Hỳt 140 àl dịch bệnh phẩm cỳm (tế bào C4) vào tube trờn Mix đều trong 15 giây Ủ ở nhiệt độ phòng (15 o C – 25 o C) trong 10 phút Ly tâm tube trong thời gian ngắn để cỏc giọt đọng trờn nắp ống về đỏy ống Thờm 560 àl Ethanol (96- 100%) vào mẫu và mix bằng vortex trong 15 giây Sau đó ly tâm trong thời gian ngắn để giọt đọng trờn nắp ống về đỏy ống Hỳt cẩn thận 630 àl dung dịch ở bước phía trên sang cột QIA amp mini (ống 2 ml đã bao gồm trong bộ Kit) Đóng nắp ống và ly tâm 6000 xg (8000 rpm) trong 1 phút Đặt cột QIA amp mini trong ống thu hồi 2 ml và loại bỏ ống chứa dịch lọc đi qua Mở cột QIA amp mini cẩn thận và lặp lại bước 6 Mở cột QIA amp mini và thờm 500 àl Buffer AW1 Đúng nắp và ly tâm 6000 xg (8000 rpm) trong 1 phút Đặt cột QIA amp mini trong ống thu hồi 2 ml và loại bỏ ống chứa dịch lọc đi qua Mở cột QIA amp mini và thờm 500 àl Buffer AW2 Đóng nắp và ly tâm ở tốc độ 20.000 xg (14.000 rpm) trong 3 phút Ly tâm thêm ở tốc độ 20.000 xg (14.000 rpm) trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Buffer AW2 Đặt cột QIA amp mini trong ống thu hồi 1.5 ml Loại bỏ tube chứa dịch lọc đi qua Mở nắp cột QIA amp mini và thờm 60 àl Buffer AVE Đúng nắp và ủ ở nhiệt độ

Luận văn Thạc sỹ Vật liệu và phương pháp phòng 1 phút Ly tâm ở 20.000 xg (14.000 rpm) trong 1 phút Bảo quản ở nhiệt độ - 20 o C hoặc – 70 o C

2 Tạo cDNA từ RNA của Enterovirus 71

Nguyên tắc hoạt động của mồi Random hexamer:

Mồi Random hexamer là những đoạn oligonucleotide gồm 6 nucleotide với trình tự ngẫu nhiên Chúng bám lên nhiều điểm khác nhau dọc theo suốt sợi mRNA và tổng hợp nên những đoạn cDNA ngắn phủ khắp sợi mRNA khuôn mẫu Radome hexamer thích hợp cho những sợi mRNA đích dài hoặc có nhiều cấu trúc thứ cấp gây cản trở cho oligo T hoạt động hiệu quả [42]

Hình 16: Tổng hợp cDNA từ mồi Random Hexamer Primer

Hốn hợp phản ứng gồm: 9 àl RNA mẫu, 1 àl Hexamer, 2 àl dNTPs (10mM), 4 àl Buffer 5X, 1 àl DTT 0.1M, 1 àl nước vụ trựng, 1 àl RNase OUT, 1 àl Thermoscript RT Chạy ở nhiệt độ 65 o C trong 5 phút, 25 o C trong 10 phút, 65 o C trong 60 phút, 85 o C trong 5 phút, 4 o C trong 10 phút, 37 o C trong 20 phút Bảo quản ở - 20 o C

3 Nhân đoạn gen VP1 từ cDNA

Thành phần phản ứng: 2.5 àl Buffer 1X, 2àl dNTP Mix 0.8mM, 1.5àl VP1F1v1 primer 0.6 àM, 1.5àl VP1R891v1 primer 0.6 àM, 0.25àl Takara Extaq 0.06 U/àl, 2à cDNA và bổ sung ED đến thể tớch cuối cựng 25 àl Chương trỡnh nhiệt: 35 chu kỳ cho 95 o C trong 2 phút, 95 o C trong 1 phút, 55 o C trong 1 phút, 72 o C trong 2 phút, 72 o C trong 20 phút, kết thúc giữ lạnh 4 o C

Luận văn Thạc sỹ Vật liệu và phương pháp 4 Điện di sản phẩm PCR

Pha dung dịch TAE 1X: cho 10 ml TAE 10X và 90 ml nước cất vào ống đong và trộn đều Đổ gel agarose 1%: tùy vào kích thước bể điện di và bản gel mà sử dụng lượng agarose và thể tích TAE 1X hợp lý Trộn đều và đun sôi agarose trong lũ vi song Làm nguội đến 50 o C và cho 3 àl Ethidium Bromide vào lắc đều Sau đú đổ vào khuôn đã cài sẵn răng lược Để gel đông và ổn định hoàn toàn (từ 20 phút đến 1 giờ) Gỡ lược nhẹ nhàng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ ngập mặt gel bằng đệm TAE 1X Tra mẫu: tùy vào mục địch điện di (kiểm tra, thôi gel lấy mẫu) và tùy vào nồng độ DNA mà người ta lấy 1 lượng mẫu thích hợp Trước khi tra vào giếng, trộn DNA với màu Điện di: điện di được tiến hành ở hiệu điện thế 95V, cường độ dòng điện 208 mA, trong khoảng 25 – 30 phút Quan sát sự di chuyển màu để biết khi nào cần ngừng điện di

5 Tinh sạch sản phẩm từ gel agarose [33]

Sau khi điện di, dưới tia tử ngoại sẽ thấy những băng DNA kích thước khác nhau trên gel agarose (nếu phản ứng PCR không đặc hiệu), dựa vào kích thước của DNA chuẩn có thể chọn được băng DNA đích mong muốn Vì vậy, cần tiến hành tinh sạch DNA từ bản gel để thu được sản phẩm DNA đích

Thông thường DNA được tinh sạch từ bản gel agarose theo hướng dẫn của các hãng sản xuất Kit tinh sạch, Kit của các hãng khác nhau có thể có một vài điểm khác nhau Ở đây tinh sạch DNA của hãng Fermentas (QIA quick Gel Extraction Kit) đã được sử dụng

Cắt gel mang gen đớch cho vào ống tube 2 ml Cho 600 – 800 àl Buffer QG vào tube chưa gel Ủ ở 50 o C trong 10 phút trên block nhiệt đến khi gel tan hết Thi thoảng mix hoặc vortex để gel tan nhanh Sau khi gel tan hết, kiểm tra lại xem hỗn hợp dung dịch trong tube là màu vàng hay không (giống màu vàng của Buffer QG ban đầu) Nếu có màu xanh của gel thì cho thêm Buffer QG vào để dung dịch thành màu vàng Đặt cột lọc QIA quick vào tube 2 ml (kèm trong bộ Kit) Cho mẫu vào cột QIA quick và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút (thể tích mẫu lớn có thể lặp lại bước này nhiều lần) Loại bỏ dịch lọc và đặt cột lọc lại tube ban đầu Thờm 500 àl

Luận văn Thạc sỹ Vật liệu và phương pháp

QG vào cột lọc và ly tõm 10.000 rpm trong 1 phỳt Bước rửa, cho 750 àl Buffer PE vào cột lọc và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút Chú ý sau khi cho Buffer PE vào để yên 2 đến 5 phút rồi mới ly tâm Ly tâm lại 10.000 rpm trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa Chuyển cột lọc sang tube 1.5 ml (ghi tên mẫu trên ống) Cho 25 – 50 àl Buffer EB hoặc nước cất vào giữa cột lọc Để yờn 1 phỳt sau đú ly tõm 10.000 rpm trong 1 phút Bảo quản ở - 20 o C

6 Nối sản phẩm DNA sau tinh sạch vào vector pET SUMO

Thành phần phản ứng: 2 àl DNA mẫu, 1 àl Ligation Buffer 10X, 2 àl pET SUMO (25ng/àl), 2 àl T4 DNA Ligase, bổ sung nước cất vụ trựng đến thể tớch cuối cựng 10 àl Ủ ở nhiệt độ phũng 45 phỳt, bảo quản ở nhiệt độ -20 o C

7 Tạo tế bào khả nạp

Hút toàn bộ dịch nuôi cấy tế bào vào ống ly tâm 50 ml, giữ trong đá khoảng 20 phút Bắt đầu từ bước này tế bào phải luôn giữ lạnh ở 4 o C Ly tâm 4500 rpm, 4 o C, 10 phút Đổ bỏ dịch phần môi trường phía trên, giữ lại phần cặn lắng Huyền phù cặn lắng trong 20 ml CaCl2 100 mM (đã hấp khử trùng và làm lạnh 4 o C) cho tới khi các tế bào tách rời nhau Lưu ý không dùng pipette hút nhả quá mạnh Ly tâm 4500 rpm, 4 o C, 10 phút Thu cặn và huyền phù cặn trong 2 ml CaCl2 100mM + Glycerol 20% (đã hấp khủ trùng và làm lạnh 4 o C) cho đến khi các tế bào tách rời nhau Chia đều dịch tế bào vào cỏc tube (mỗi tube 100 àl) Giữ chủng và bảo quản ở -80 o C Lưu ý các tube giữ chủng nên làm lạnh trước ở 4 o C

8 Biến nạp r-pET SUMO vào E.coli Mach1 TM – T1 R

Lấy tube tế bào khả nạp từ tủ -80 o C và nhanh chóng đặt lên đá Ly tâm nhanh tube chứa sản phẩm nối, đặt vào đỏ Nhẹ nhàng hỳt 100 àl tế bào khả nạp cho vào tube 1.5 ml, nhanh chúng đặt lờn đỏ Hỳt 5 àl sản phẩm nối cho vào tube chứa tế bào khả nạp, khuấy nhẹ bằng đầu côn Lưu ý tuyệt đối không được trộn bằng pipette Sử dụng 2 àl Puc19 plasmid (10 g/àl) (trờn mụi trường chứa ampicillin) làm chứng dương cho sản phẩm biến nạp Ủ trên đá 30 phút Sốc nhiệt tế bào trong 2 phút, 42 o C, khụng lắc Sau đú chuyển ngay vào đỏ Thờm 250 àl mụi trường S.O.C (đó ủ ở 37 o C) vào mỗi tube Nuụi lắc 125 rpm ở 37 o C khoảng 1 giờ Trải 150 hoặc 200 àl dịch tế bào trên đĩa thạch chứa môi trường BHI chọn lọc (kháng sinh kanamycin 50

Luận văn Thạc sỹ Vật liệu và phương pháp àg/ml đối với pET SUMO, ampicillin 100 àg/ml đối với pUC19) đó được ủ ấm trước trong 30 phút Ủ qua đêm ở 37 o C

9 Tách plasmid từ E.coli Mach1 TM – T1 R [31]

Hút 2 ml môi trường E.coli đã nuôi qua đêm Sau đó ly tâm 10.000 rmp trong 3 phỳt để thu cặn tế bào Tỏi huyền phự cặn tế bào trong 250 àl Buffer P1

Thờm 250 àl Buffer P2 và trộn kỹ bằng invert (đảo qua đảo lại) 4 đến 6 lần Thờm 350 àl Buffer N3 và trộn ngay tức thỡ, kỹ bằng invert 4 đến 6 lần Ly tõm 13.000 rpm trong 10 phút Hút dịch nổi từ bước 5 cho vào cột QIAprep Spin bằng gạn hoặc pipette

Ly tâm loại bỏ dịch nước thải ở 13.000 rpm trong 30 giây đến 60 giây Rửa cột

QIAprep Spin bằng cỏch cho 750 àl Buffer PE và ly tõm 13.000 rpm trong 30 giõy đến 60 giây Ly tâm tiếp 13.000 rpm trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Buffer còn lại

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

TẠO DÒNG GEN VP1

Để có được gen VP1, trước hết chúng tôi phải nuôi virus EV71 trong tế bào VERO và tách bộ gen RNA của virus, sau đó bộ gen RNA sợi đơn của virus được sử dụng để tổng hợp cDNA nhờ mồi Random Hexamer, gen VP1 được khuếch đại từ cDNA bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen VP1

Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại bằng cặp mồi trên được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Kết quả cho thấy, một băng rõ nét với kích thước khoảng 900 bp tương ứng với kích thước mong đợi (891 bp) (Hình 19)

Hình 19 Kiểm tra kết quả phân lập đoạn gen VP1 từ RNA của EV71

Giếng 1,2: sản phẩm PCR, Giếng M: thang DNA

Với kết quả này chứng tỏ gen VP1 với kích thước 891 đã được khuếch đại thành công Để thu được gen VP1 có độ tinh sạch cao và nồng độ mong muốn, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm này trên gel agarose 1% với lượng DNA cao hơn (20 àl) và ở 7 giếng (Hỡnh 20), sau đú cắt gel chứa DNA mục tiờu và tinh sạch sản phẩm từ gel

Luận văn Thạc sỹ Kết quả và biện luận

Hình 20 Điện di tinh sạch gen VP1

Giếng 1-7: sản phẩm PCR, Giếng M: thang DNA 1 kb Để xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA mục tiêu, sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đo kiểm tra ở bước sóng 260 nm và 280 nm

Kết quả đo, nồng độ DNA đạt yêu cầu CDNA = 48 ug/ml, độ tinh sạch cao A260/A280 = 1.8 và lẫn tạp protein thấp (Cprotein = 0.1 mg/ml)

Từ các kết quả trên cho thấy, đoạn gen mục tiêu đã đạt nồng độ và độ tinh sạch như mong đợi Sản phẩm này được sử dụng làm nguyên liệu để nối vào vector tạo dòng

2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen VP1

2.1 Nối gen VP1 vào vector pET SUMO

Sản phẩm VP1 tinh sạch được sử dụng để nối vào vector pET SUMO (Invitrogen) Phản ứng nối xảy ra nhờ sự bắt cặp bổ sung giữa đầu dính 3’A trên sản phẩm PCR với đầu dính 3’T trên vector pET SUMO nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase (Invitrogen) [17]

Sau khi thực hiện phản ứng nối, sản phẩm thu được là vector tái tổ hợp pET SUMO-VP1 Sản phẩm này được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình biến nạp vào tế bào khả nạp E.coli Mach1 TM – T1 R

2.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp E.coli Mach1 TM – T1 R

Quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp chủng E.coli Mach1 TM – T1 R được thực hiện bằng phương pháp hóa biến nạp Môi trường chọn lọc các

Luận văn Thạc sỹ Kết quả và biện luận khuẩn lạc mang pET SUMO-VP1 tái tổ hợp là môi trường thạch BHIA có bổ sung kanamycin (50 àg/ml) Sau khi nuụi ở nhiệt độ 37 o C qua đờm, nếu xuất hiện khuẩn lạc mọc trên môi trường thì có thể kết luận vector pET SUMO có sự đóng vòng và quá trình hóa biến nạp đã diễn ra Ngược lại, nếu pET SUMO không có sự đóng vòng hoặc vector tái tổ hợp mang gen VP1 không chui vào trong tế bào chất của

E.coli March1 TM T1 R thì trên môi trường chọn lọc sẽ không xuất hiện khuẩn lạc Điều này có nghĩa rằng, khi tế bào chủ mang pET SUMO-VP1 tái tổ hợp đóng vòng thì gen kháng kanamycin trên vector sẽ hoạt động và có thể kháng lại kanamycin, và ngược lại vector không đóng vòng thì gen kháng kanamycin sẽ bất hoạt và tế bào chủ sẽ bị tiêu diệt

Quá trình đóng vòng của vector pET SUMO có thể diễn ra theo 3 chiều hướng trong quá trình ghép nối gen VP1 vào vector pET SUMO như sau:

- Vector pET SUMO tự đóng vòng - Gen VP1 nối đúng chiều vào vector pET SUMO - Gen VP1 nối ngược chiều vào vector pET SUMO Nếu diễn ra theo một trong 3 chiều hướng trên thì khuẩn lạc đều có thể xuất hiện trên môi trường chọn lọc

Chúng tôi biến nạp vector tái tổ hợp pET SUMO-VP1 (mang gen kháng kanamycin) và plasmid pUC19 (đối chứng mang gen kháng ampicillin) vào tế bào khả nạp E.coli Mach1 TM – T1 R Plasmid pUC19 đối chứng với mục đích kiểm tra hiệu quả biến nạp Sau quá trình hóa biến nạp, các tế bào được biến nạp với plamid pET SUMO-VP1 được sàng lọc trên các môi trường thạch BHIA chứa kanamycin 50 àg/ml trong khi cỏc thể biến nạp được biến nạp với plasmid pUC19 được sàng lọc trờn mụi trường BHIA chứa ampicillin 100 àg/ml, nuụi ở 37 0 C, qua đờm

Sau khi nuôi các thể biến nạp qua đêm, trên đĩa môi trường BHIA chứa kháng sinh ampicillin xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng, điều này chứng tỏ tế bào khả nạp đã đạt yêu cầu trong quá trình xử lý thành tế bào nên hiệu suất biến nạp cao

Trên 2 đĩa BHIA chưa kháng sinh kanamycin cũng xuất hiện các khuẩn lạc trắng

Luận văn Thạc sỹ Kết quả và biện luận nhưng với số lượng thấp hơn nhiều so với đĩa chứa ampicillin Như vậy, có thể nhận định hiệu suất nối gen mục tiêu vào vector pET SUMO có giới hạn nên số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thấp Các khuẩn lạc này được cho là chứa vector ở dạng đóng vòng

2.3 Kiểm tra kết quả nối VP1 vào pET SUMO Để xác định các khuẩn lạc mọc trên môi trường chứa kanamycin có mang vector tái tổ hợp pET SUMO-VP1 hay vector tự đóng vòng mà gen mục tiêu chưa chèn được vào Chúng tôi tiến hành tách các khuẩn lạc này và nuôi trên môi trường BHI lỏng cú bổ sung kanamycin (50 àg/ml) qua đờm, sau đú tỏch plasmid và nhõn đoạn gen VP1 nhờ mồi đặc hiệu

- Forward primer: pET_VP1 SUMO Forward (10mM):

- Reverse primer: pET_VP1 T7 Reverse (10mM):

TINH CHẾ PROTEIN VP1

Hình 26 Phát hiện protein VP1 tái tổ hợp Giếng 4 và 9: pha cặn

Giếng 5: thể vùi hòa tan trong Urea Giếng 1, 2, 3, 6, 7, 8: pha hòa tan và thử nghiệm hòa tan thể vùi ở các điều kiện khác nhau

Với kết quả này cho thấy protein VP1 dung hợp thẻ 6xHis đã được biểu hiện thành công Đây là cơ sở để cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu ở mức độ lớn hơn để phục vụ cho quá trình tinh chế tiếp theo

II TINH CHẾ PROTEIN VP1

Do protein biểu hiện trong tế bào E.coli chủ yếu nằm ở dạng thể vùi, nên để thu nhận và tinh sạch protein đạt hiệu quả cao chung tôi đã tiến hành thử nghiệm nhiều phương pháp khác nhau Đối với hòa tan thể vùi thực hiện thay đổi nhiều lần thành phần, nồng độ, độ pH của dung dịch hòa tan Đối với tinh sạch protein chúng tôi đã thử nghiệm chạy sắc kí với các dung dịch Binding Buffer và Elution Buffer có thành phần, nồng độ các chất và pH khác nhau để tìm ra điểm tối ưu nhất cho quá trình bắt cặp protein VP1 tái tổ hợp với giá thể, cũng như dung ly protein này khỏi cột Cuối cùng chúng tôi đã thu được kết quả như sau

1 Hòa tan protein ở dạng thể vùi

- Thể vùi được rửa bằng buffer chứa NaCl 0.5M và Na3PO4 0.02M, ly tâm 13.000 rpm, thu phần cặn Cặn được hòa tan trong dung dịch Binding buffer gồm:

Na3PO4 0.02M, NaCl 0.5 M, Imidazole 0.015M và Urea 8M Ly tâm ở 13.000 rpm

Luận văn Thạc sỹ Kết quả và biện luận trong 15 phỳt và thu phần dung dịch loại bỏ cặn Hỳt 15àl dịch hũa tan này điện di SDS-PAGE kiểm tra khả năng hòa tan

Hình 27 Kiểm tra khả năng hòa tan thể vùi Giếng 1: thể vùi hòa tan trong dung dịch Binding buffer chứa Urea 8M Giếng M: thang protein 10 – 200 kDa

Kết quả điện di trên gel xuất hiện một băng đậm với kích thước khoảng 50 kDa

Như vậy có khẳng định thể vùi hòa tan tốt trong dung dịch Binding Buffer chứa Urea 8M Dịch protein sau khi hòa tan thể vùi được làm nguyên liệu sử dụng cho sắc ký nhằm tinh sạch protein

Mục đích của tinh sạch protein là để thu được sản phẩm protein mục tiêu tinh khiết tạo điều kiện cho quá trình thử nghiệm hoạt tính sau này Do protein VP1 biểu hiện ở dạng dung hợp (His)6, nên khi protein này qua cột vùng (His)6 sẽ liên kết với Nikel và được giữ lại trong cột còn các protein khác sẽ bị rửa ra ngoài Khi cho dung dịch Elution Buffer qua cột sẽ làm liên kết giữa (His)6 và Nikel yếu và protein dung hợp (His)6 được dung ly ra ngoài

Chúng tôi sử dụng cột sắc ký HisTrap HP (GE Healthcare) để tinh sạch sản phẩm protein VP1 tái tổ hợp Quá trình thực hiện như sau :

Luận văn Thạc sỹ Kết quả và biện luận

Mẫu được nạp vào cột HisTrap HP với tốc độ nạp mẫu 1 ml/phút Đường UV lên pick có chiều cao khoảng 200 mAU có thể nhận định ban đầu trong dung dịch mẫu có protein Trong quá trình này các protein VP1 dung hợp (His)6 sẽ liên kết với Nikel gắn trên giá thể của cột HisTrap Các protein còn lại sẽ được đẩy ra ngoài

Sau khi xuất hiện pick UV lên 200 mAU chúng tôi tiến hành thu mẫu ngay ở phân đoạn này để kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE

Sau khi mẫu qua hết cột thì thực hiện rửa cột bằng dung dịch Binding Buffer với tốc độ dòng 1 ml/phút đến khi đường UV trở về 0 mAU Sau đó, dung ly protein mục tiêu bằng dung dịch Elution Buffer Khi dung dịch Elution Buffer đi vào cột các protein dung hợp (His)6 gắn trên cột Nikel sẽ được đẩy ra ngoài Kết quả cho thấy xuất hiện một đường UV lên chiều cao khoảng 300mAU (Hình 28)

Hình 28 kết quả dung ly protein VP1 tái tổ hợp

Khi bắt đầu xuất hiện pick UV lên 300mAU chúng tôi tiến hành thu mẫu ngay và điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE

3 Kiểm tra độ tinh sạch của protein Để đánh giá độ tinh sạch của protein, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di SDS-PAGE với các mẫu đã thu ở 2 phân đoạn trong quá trình sắc kí ̴ 300 mAU

Luận văn Thạc sỹ Kết quả và biện luận

Hình 29 Kiểm tra độ tinh sạch của protein VP1 tái tổ hợp Giếng 1-2: protein thu ở phân đoạn nạp mẫu

Giếng 3-4: protein thu ở phân đoạn dung ly bằng Elution Buffer Giếng M: thang protein 10 – 200 kDa Ở phân đoạn nạp mẫu (giếng 1 và 2) xuất hiện nhiều vạch protein với kích thước khác nhau mà không thấy xuất hiện vạch kích thước khoảng 50 kDa Điều này chứng tỏ các protein dung hợp (His)6 đã được gắn vào cột Nikel, và các protein tạp đã được rửa khỏi cột Ở phân đoạn dung ly bằng dung dịch Elution Buffer (giếng 3 và 4) xuất hiện một vạch đậm nét với kích thước khoảng 50 kDa, trong khi chỉ có một vạch mảnh với kích thước khoảng 100 kDa Điều này chứng tỏ sản phẩm protein thu được lẫn ít protein tạp và đạt độ sạch như mong đợi Sản phẩm protein này có thể sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính tiếp theo.

Luận văn Thạc sỹ Kết luận và đề nghị

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Với những kết quả nghiên cứu bước đầu, chúng tôi đã thu được một số thành công nhất định:

- Đoạn gen VP1 đã được phân lập từ chủng Enterovirus 71 phân nhóm C4 (VND11/202N2) và nối thành công vào vector pET SUMO tạo vector tái tổ hợp pET SUMO-VP1 Vector tái tổ hợp này sau đó đã được biến nạp và nhân lên trong tế bào E.coli Mach1 TM – T1 R để bảo quản cũng như làm nguồn nguyên liệu cung cấp plasmid tái tổ hợp cho các nghiên cứu biểu hiện tiếp theo

- Chúng tôi đã biểu hiện thành công protein VP1 tái tổ hợp trong tế bào E.coli DE3 (BL21) Protein tái tổ hợp biểu hiện chủ yếu nằm ở dạng thể vùi Chúng tôi đã khảo sát các điều kiện biểu hiện và tìm được điều kiện biểu hiện tối ưu protein VP1 tái tổ hợp ở nồng độ IPTG tối ưu 0.6 mM và ở thời điểm 3 giờ sau cảm ứng

- Đã xây dựng được quy trình tinh chế protein VP1 tái tổ hợp với hàm lượng và độ tinh sạch như mong đợi Thể vùi đã được hòa tan trong dung dịch chứa

Na3PO4 0.02M, NaCl 0.5 M, Imidazole 0.015M và Urea 8M Protein VP1 tái tổ hợp được rửa giải khỏi cột Nikel bằng dung dịch chứa Na3PO4 0.02M, NaCl 0.5 M, Imidazole 0.5M và Urea 8M

Kết quả đạt được là thu protein VP1 có hoạt tính sinh học Do đó, chúng tôi đề nghị tiếp tục tái gấp cuộn và thử nghiệm hoạt tính của protein VP1 tái tổ hợp tiến tới những ứng dụng sâu hơn

1 Bộ Y tế Hướng dẫn Chẩn đoán, điều trị bệnh tay-chân-miệng Ban hành kèm theo Quyết định số: 1732 /QĐ-BYT ngày 16 tháng 5 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Y tế

2 Cao Đăng Nguyên, Đỗ Qúi Hải (2002), Công nghệ protein, Nhà xuất bản Đại học Huế

3 N.T.H.Thanh., et al., (2010), Bệnh tay chân miệng ở người năm 2008 do virus đường ruột tuy 71 và virus Coxsackie A16, Tạp chí Y học dự phòng,

4 Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Huy Alas vi rút gây bệnh cho người Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ (2010) tr 190

5 PGS.TS Trần Đình Bình - Bộ môn Vi sinh vật Y học, Trường Đại học Y Dược Huế Coxsackievirus và bệnh tay chân miệng Thông tin khoa học 2011

6 Trần Ngọc Hữu 2012 Đặc điểm dịch tễ học bệnh tay chân miệng ở 20 tỉnh thành phía Nam Việt Nam, giai đoạn 2005-2011 Tạp chí ung thư học Việt

7 Amersham pharmacia biotech, pGEX vectors (GST Gene Fusion System),

Third Edition, Rev 2, 18-1123-20 (http://www.amershambiosciences.com)

8 Amersham, GST Gene Fusion System Handbook, Edition AA, 18-1157- 58

9 Cardosa, M.J., et al., Molecular epidemiology of human enterovirus 71 strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region: comparative analysis of the VP1 and VP4 genes Emerg Infect Dis, 2003 9(4): p 461-8

10 Chan, Y.F and S AbuBaker, Recombinant human enterovirus 71 in hand, foot and mouth disease patients Emerg Infect Dis, 2004 10(8): p 1468-70

11 Chen, H.L., et al., Expression of VP1 protein in the milk of transgenic mice: a potential oral vaccine protects against enterovirus 71 infection Vaccine,

12 Chen, X., et al., A new baculovirus of cultured shrimps Sci China C Life Sci, 1997 40(6): p 630-5

13 De Jesus, N.H., Epidemics to eradication: the modern history of poliomyelitis Virol J, 2007 4: p 70

14 Fernandez, J.M and J.P Hoeffler, Gene expression systems : using nature for the art of expression1999, San Diego: Academic Press xii, 480 p

15 Fikrig, E., et al., Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA Science, 1990 250(4980): p 553-6

16 Invitrogen (2006, Ni-NTA purification system for purification of polyhistidine-containing recombinant proteins, User manual, Invitrogen corporation, USA

17 Invitrogen 2010 Champion™ pET SUMO Protein Expression System For high-level expression and enhanced solubility of recombinant proteins in E coli and cleavage of native protein Catalog no K300-01

18 K.P Chan, KT Goh, C Y Chong, ES Teo, G Lau, A E Ling (2003), Epidemic hand, footh and mouth disease caused by human Enterovirus 71 Singapore,

19 Kaelin, W.G., Jr., et al., Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastoma-binding protein with E2F-like properties Cell, 1992 70(2): p 351-64

20 Ke, Y.Y., Y.C Chen, and T.H Lin, Structure of the virus capsid protein VP1 of enterovirus 71 predicted by some homology modeling and molecular docking studies J Comput Chem, 2006 27(13): p 1556-70

21 Kew, O.M., et al., Prolonged replication of a type 1 vaccine-derived poliovirus in an immunodeficient patient J Clin Microbiol, 1998 36(10): p

22 Lightner D.V (1996), a handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for for disease of cultured penaeid shrimp, World aquaculture Society, Baton Rouge, Lousiana, USA

23 McMinn, P.C., An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance FEMS Microbiol Rev, 2002 26(1): p 91-

24 Mierendorf R., Yeager K., Novy R (1994), “pET system: Your choice for expression”, News letter of Novagen Inc., 1(1)

25 Nasri, D., et al., Basic rationale, current methods and future directions for molecular typing of human enterovirus Expert Rev Mol Diagn, 2007 7(4): p 419-34

26 New England Biolabs (2005), Tools for Protein Research, New England

27 New England Biolabs, IMPACTTM I: One-step protein purification system,

Purification of recombinant by a self- cleavable affinity tag, version 1.8, New England Biolabs Inc., Ipswich, USA

28 Nilsson, J., et al., Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins Protein Expr Purif, 1997 11(1): p

29 Novagen (2006), pET System Manual, TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA

30 Ooi, M.H., et al., Clinical features, diagnosis, and management of enterovirus 71 Lancet Neurol, 2010 9(11): p 1097-105

32 QIAGEN 2007 QIAamp® Viral RNA Mini Handbook

33 QIAGEN 2008 QIAquick® Gel Extraction Handbook

34 Qi-han LI, et al., Genetic analysis of the VP1 region of human enterovirus 71 strains isolated in Fuyang, China, during 2008

35 Shi, M., et al., Expression of enterovirus 71 capsid protein VP1 in Escherichia coli and its clinical application Braz J Microbiol, 2013 44(4): p 1215-22

36 Shih, S.R., et al., Expression of capsid [correction of caspid] protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71 infection J Med Virol,

37 Solomon, T., et al., Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71 Lancet Infect Dis, 2010 10(11): p 778-90

38 Tee, K.K., et al., Evolutionary genetics of human enterovirus 71: origin, population dynamics, natural selection, and seasonal periodicity of the VP1 gene J Virol, 2010 84(7): p 3339-50

39 Tu, P.V., et al., Epidemiologic and virologic investigation of hand, foot, and mouth disease, southern Vietnam, 2005 Emerg Infect Dis, 2007 13(11): p

40 Tung, W.S., et al., DNA vaccine constructs against enterovirus 71 elicit immune response in mice Genet Vaccines Ther, 2007 5: p 6

41 The QIAexpressionistTM (2003), A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, Fifth edition, QIAGEN, Germany

42 ThermoFisher Scientific User Guide: Random Hexamer Primer Catalog number: SO142

43 Western Blotting Handbook and Troubleshooting Guide 44 WHO (World Health Organization) 2011.A Guide to Clinical Management and Public Health Response for Hand, Foot and Mouth Disease (HFMD)

45 Zhang, Y.X., et al., Construction and characterization of an infectious cDNA clone of enterovirus type 71 subgenotype C4 Virus Genes, 2013 47(2): p

46 http://www.uniprot.org/uniprot/Q66478

Luận văn Thạc sỹ Phụ lục

1 Trình tự VP1 phân nhóm C4 phân lập ở Việt Nam

GGAGATAGGGTGGCAGATGTGATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACGGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGTATGATTGAGACACGCTGTGTTCTCAACTCGCACAGTACAGCAGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGGGCGGGATTAGTTGGAGAGATAGATCTCCCTCTTGAGGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCGCAAATGCGTAGAAAGGTAGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCTACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCTAGGGAATCCCTTGCATGGCAAACCGCCACTAACCCCTCAGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTCAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCGTTAAGCCAACTGGTGCCAGTCGCACAGCGATCACCACTCTT