Trong nghiên cứu này, qui trình RTLAMP được tối ưu có khả năng phát hiện EV71 và CA16 với giới hạn 1 fg đối với EV71 và 10 fg đối với CA16; Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ cố định (60°C) trong 35 phút; Kết quả có thể được xác định bằng mắt thường thông qua màu sắc của phản ứng thể hiện tiềm năng ứng dụng cao của phương pháp đối với chẩn đoán bệnh tại chỗ.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 18 Phát nhanh Enterovirus 71 Coxsackievirus A16 phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp (RT-LAMP) Trần Hồng Diễm*, Phùng Thị Thu Hường Viện Kĩ thuật Công nghệ cao, Đại học Nguyễn Tất Thành * thdiem@ntt.edu.vn Tóm tắt Bệnh tay chân miệng (TCM), thường gặp trẻ tuổi, gây chủng vi rút thuộc họ enterovirus, hai tác nhân Coxsackievirus A16 (CVA16) Enterovirus 71 (EV71) EV71 CVA16 gây nên biến chứng viêm não, viêm tiêm, dẫn đến tử vong Cho đến nay, chưa có vắc xin thuốc đặc hiệu trị EV71 CVA16 Vì việc phát chẩn đốn nhanh hai loại vi rút cấp thiết Phương pháp phát bệnh chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng, kĩ thuật sinh học phân tử RT-PCR tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán TCM Tuy nhiên, RT-PCR đòi hỏi thiết bị phức tạp, đắt tiền thực điều kiện phịng thí nghiệm Trong đó, RT-LAMP thừa hưởng tất ưu điểm RT-PCR độ nhạy, tính đặc hiệu; nữa, kĩ thuật lại đơn giản dễ thực Trong nghiên cứu này, qui trình RTLAMP tối ưu có khả phát EV71 CA16 với giới hạn fg EV71 10 fg CA16; phản ứng thực nhiệt độ cố định (60°C) 35 phút; kết xác định mắt thường thơng qua màu sắc phản ứng thể tiềm ứng dụng cao phương pháp chẩn đoán bệnh chỗ ® 2021 Journal of Science and Technology - NTTU Tổng quan Tay chân miệng (TCM) bệnh truyền nhiễm phổ biến trẻ nhỏ với triệu chứng đặc trưng sốt, loét miệng mụn nước bàn tay bàn chân [1] Bệnh chủ yếu hai tác nhân thuộc họ enterovirus gây human enterovirus 71 (EV71) coxsackievirus A16 (CVA16) [1] Đây loại bệnh có khả lây lan nhanh tạo thành dịch bệnh có khả dẫn đến tử vong với biến chứng nặng liên quan đến viêm màng não, viêm tim, viêm phổi cấp [1-3] Vì việc phát phân biệt nhanh nhiễm EV71 CVA16 để đưa phương pháp điều trị lâm sàng kiểm soát bệnh kịp thời cấp thiết chưa có vắc xin thuốc kháng vi rút đặc hiệu cho trường hợp nhiễm nặng Hiện nay, chẩn đốn EV71 CVA16 phịng thí nghiệm bao gồm phân lập vi rút, phát kháng thể Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 18.12.2020 Được duyệt 31.05.2021 Cơng bố 15.07.2021 Từ khóa EV71, CA16, RT-LAMP, isothermal đặc hiệu với vi rút phát trình tự gen vi rút kĩ thuật khuếch đại axit nucleic [4,5] EV71 CVA16 phân lập từ nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau, cần (1 - 2) tuần để có kết [5] Các xét nghiệm IgM dựa kĩ thuật miễn dịch enzym phát triển [5-6], xét nghiệm đòi hỏi thiết bị chuyên dụng cần mẫu huyết thanh, khó thu thập từ bệnh nhân trẻ sơ sinh Các xét nghiệm PCR phiên mã ngược (RT-PCR) realtime RT-PCR (RT-qPCR) xem tiêu chuẩn vàng chẩn đoán phát EV71 CVA16 Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi thiết bị chuyên dụng, đắt tiền kĩ thuật viên có kinh nghiệm, thực khu vực thí nghiệm chuyên biệt, hạn chế chẩn đoán trực tiếp Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) phương pháp khuếch đại Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 nhanh chóng đơn giản mô tả lần vào năm 2000 [7] Phương pháp hoạt động nguyên tắc phản ứng dịch chuyển sợi với cấu trúc vòng lặp lại, toàn phản ứng khuếch đại diễn liên tục điều kiện đẳng nhiệt [7] Trước đây, phương pháp LAMP để phát loại vi rút khác phát triển, bao gồm vi rút sốt xuất huyết type (1 4) [8], vi rút viêm não Nhật Bản [9], vi rút cúm gia cầm H5 H7 [10], vi rút cúm đại dịch H1N1 năm 2009 [11], vi rút Marburg [12], vi rút Ebola [13], vi rút gây bệnh lở mồm long móng [14], vi rút herpes simplex [14] Tất xét nghiệm cho thấy độ đặc hiệu, hiệu độ nhạy cao tương đương cao so với xét nghiệm PCR Đồng thời lượng sản phẩm LAMP tạo phản ứng có khả làm thay đổi pH phản ứng, việc kết hợp thị pH phản ứng đọc nhanh kết phản ứng mắt thường với thay đổi màu phản ứng Những nghiên cứu trước cho thấy tiềm LAMP phương pháp chẩn đoán thường quy bệnh truyền nhiễm vi rút phịng thí nghiệm bệnh viện Trong nghiên cứu này, phương pháp RT-LAMP nhắm vào gen VP1 EV71 CVA16 19 phát triển đánh giá sơ mẫu RNA bệnh phẩm, kết xét nghiệm quan sát trực tiếp mắt thường thông qua diện chất thị màu pH có phản ứng Kết chứng minh RT-LAMP có độ nhạy độ đặc hiệu cao, trở thành phương pháp thay hữu ích chẩn đốn lâm sàng Phương pháp 2.1 Thiết kế mồi Trình tự gen VP1 có tính phân biệt cao serotypes Enterovirus, VP1 lựa chọn làm trình tự mục tiêu phát EV71 CVA16 Trình tự VP1 EV71 CVA16 phân tích NCBI BLAST xác định vùng trình tự bảo tồn Vùng trình tự bảo tồn cho mục tiêu EV71 CVA16 phân tích phần mềm thiết kế mồi LAMP – PrimerExplorer V5, mồi sau thiết kế, kiểm tra tính đặc hiệu khả hoạt động eLAMP NCBI BLAST Trình tự mồi đoạn trình tự mục tiêu khuếch đại thể Bảng 1, tổng hợp IDT (Singapore) sử dụng cho tồn nghiên cứu Bảng Các trình tự sử dụng nghiên cứu Tên EV71_F3_1 EV71_B3_1 EV71_FIP_1 EV71_BIP_1 EV71_LoopF_1 EV71_LoopR_1 CA16_F3_1 CA16_B3_1 CA16_FIP_1 CA16_BIP_1 CA16_LoopF_1 CA16_LoopR_1 EV71_gblock Trình tự 5’-3’ TTGTCCCACAATTGCTCCA CCGAATGTGGGATATCCGTC GTGGCGGTTTGCCATGCAAG-TATGTTTGTGCCACCTGGAG ACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCT-ATAAGCACTCGCAGGTGAC CCCTAGAATCAGGCTTAGGGG CCCTCCATCGCAGGTTTCAG TTTAGCCGTGCCGGTCTT GCAGTAATTGGGGGACTAGC TCCCATCAGGTCGATGTCCCAA-TACAATGCCCACCACAGGT CTGCGGCGGAAATGCGAATT-CCATTGGGTTTGGCTACGA AACCATCTGTGTTCTGTGT GTTTACCTACATGCGTTTTGA ACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCT CCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCTGATTCTAGGG AATCCCTTGCATGGCAAACCGCCACTAACCCCTCGGTTTTTGTCAAG CTGTCAGACCCTCCATCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGC GAGTGCTTATCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAAC ACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACAT GATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTGGGGACCTCCAAGTCCAAGT Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 14 20 CA16_gblock ACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTCAGGGCG TGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAA CCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTGCCAGTCGCA CAGCGATCACCACTCTTGGGAAATTTGGACA TAGTCACAGATTGGGTACTGGTATTGTACCAGCACTACAAGCCGCGG AGACAGGGGCGTCGTCTAATGCTAGTGACAAGAACCTCATTGAGAC TAGATGTGTGTTGAACCATCACTCCACACAGGAGACAGCCATTGGGA ATTTCTTTAGCCGTGCCGGTCTTGTCAGTATTATTACAATGCCCACCA CAGGTACACAGAACACAGATGGTTATGTAAATTGGGACATCGACCT GATGGGATATGCTCAGCTGCGGCGGAAATGCGAATTGTTTACCTACA TGCGTTTTGACGCTGAATTCACATTTGTCGTAGCCAAACCCAATGGT GAGCTAGTCCCCCAATTACTGCAGTACATGTATGTCCCACCAGGGGC TCCGAAACCTACCTCCAGAGACTCGTTTGCCTGGCAGACTGCTACCA ACCCATCTGTGTTTGTGAAAATGACGGACCCACCAGCTCAAGTGTCA GTCCCCTTCATGTCACCAGCTAGTGCATACC 2.2 Tách chiết RNA vi rút Mẫu RNA vi rút cung cấp Viện Pasteur Tp HCM, tách chiết phương pháp Trizol định lượng Nanodrop máy Genova Plus Life Science Spectrophotomete Mẫu RNA tách chiết sau kiểm tra nồng độ độ tinh lưu trữ 80 C để sử dụng cho phản ứng LAMP 2.3 Phản ứng LAMP Hỗn hợp phản ứng 15 µL gồm µL mẫu, hỗn hợp mồi (0,3 µM F3 B3, 0,6 µM LoopF v LoopR, 2,4 àM FIP v BIP), 7,5 àL WarmStartđ Colorimetric LAMP 2X Master Mix (NEB, UK) nước sinh học phân tử Các phản ứng LAMP ban đầu ủ 65 0C vòng 45 phút Sản phẩm phản ứng LAMP nghiên cứu ghi nhận quan sát màu phản ứng nhuộm huỳnh quang Theo đó, màu hồng sáng phản ứng ban đầu thay đổi thành vàng với phản ứng dương giữ nguyên màu sắc ban đầu với phản ứng âm Đồng thời, sản phẩm LAMP quan sát nhuộm chất phát huỳnh quang SYBR soi ánh sáng 460 nm 2.4 Khảo sát điều kiện phản ứng Enzyme Bst DNA polymerase có dải nhiệt độ hoạt động kéo dài, dải nhiệt độ thích hợp cho phản ứng LAMP từ (55 - 70) 0C nhiệt độ tối ưu cho trình bắt cặp kéo dài tạo sản phẩm LAMP Trong nghiên cứu này, nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khảo sát khoảng (55 - 70) 0C, mốc nhiệt độ cách 0C Kết xác định màu sắc phản ứng soi SYBR Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian phản ứng LAMP tiến hành khảo sát khoảng (5 - 70) phút phản ứng, khoảng cách phút Các điều kiện khác không thay đổi, kết kiểm tra màu sắc nhuộm SYBR 2.5 Phương pháp khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP Nồng độ RNA ban đầu EV71 CA16 xác định máy nanodrop (Genova Plus, Jenway, UK), sau mẫu RNA pha loãng theo bậc 10 nồng độ cuối (107 - 10-1) fg tiến hành thực phản ứng với điều kiện thành phần theo nghiên cứu trước Sản phẩm phân tích màu sắc sau phản ứng nhuộm SYBR 2.6 Khảo sát tính đặc hiệu mồi phản ứng LAMP Trong khảo sát này, RNA Enterovirus khác có gen gần gũi đồng thời tác nhân gây bệnh TCM với triệu chứng gây bệnh gần tương đồng với EV71 CA16 dùng làm mục tiêu cho phản ứng LAMP để kiểm tra tính đặc hiệu mồi đặc trưng cho EV71 CVA16 Kết 3.1 Kết kiểm tra mồi thành phần phản ứng LAMP Trình tự gen VP1 tổng hợp EV71 CVA16 lựa chọn làm gen mục tiêu để thực phản ứng LAMP, phản ứng thực 2X warmstart colorimetric LAMP mastermix xuất chất thị pH Kết kiểm tra cho thấy sau phản ứng 45 phút 65 0C có thay đổi từ màu hồng sang vàng mẫu dương chứa gen mục tiêu dạng tổng Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 21 hợp, giữ nguyên màu hồng mẫu âm (Hình 1) Sự thay đổi màu sắc cho thấy sản phẩm khuếch đại tạo quan sát mắt thường, chứng minh mồi lựa chọn cho phản ứng LAMP phát thành công trình tự mục tiêu EV71 CVA16 Mặt khác, kết phản ứng quan sát phương pháp nhuộm SYBR Quan sát Hình cho thấy, kết phản ứng LAMP phát quang nhuộm SYBR quan sát đèn LED bước sóng 460 nm, chứng âm khơng thể tín hiệu phát quang Vì mồi chọn với thành phần phản ứng áp dụng cho khảo sát Hình Kết khảo sát thời gian phản ứng quan sát màu sắc sau phản ứng soi SYBR Trong đó: A EV71; B CA16 Hình Kết kiểm tra mồi quan sát màu sắc SYBR EV71 CA16 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ, thời gian tối ưu cho phản ứng LAMP Theo Hình quan sát kết so SYBR, sản phẩm khuếch đại phản ứng nhìn thấy thời gian 20 phút hai mục tiêu EV71 CA16, 20 phút thời gian ủ tối thiểu để tạo thay đổi màu sắc; ra, khoảng (35 - 45) phút có thay đổi màu phản ứng rõ quan sát mắt thường Vì thời gian 35 phút thời gian tối ưu lựa chọn áp dụng cho khảo sát cho EV71 CVA16 Nhiệt độ phản ứng từ (55 - 70) 0C với thời gian phản ứng tối ưu 35 phút Theo kết khảo sát, sản phẩm LAMP quan sát SYBR EV71 nhiệt độ 55 0C nhiệt độ 57 0C CA16, nhiên phải từ nhiệt độ 59 0C - 60 0C, thay đổi màu sắc phản ứng thể rõ ràng quan sát mắt thường (Hình 3) Nhiệt độ 60 0C nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP nghiên cứu này, đồng thời nhiệt độ sử dụng cho thí nghiệm Hình Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng quan sát màu sắc sau phản ứng soi SYBR Trong đó: A EV71; B CA16 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 22 3.3 Giới hạn phát phương pháp LAMP Giới hạn phát phản ứng khảo sát với mẫu RNA ban đầu có nồng độ 107 fg, mẫu RNA pha loãng thành 10 cấp nồng độ (107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100, 10-1) fg, thực phản ứng LAMP với điều kiện phản ứng tối ưu trước để khảo sát giới hạn phát phản ứng Kết khảo sát Hình cho thấy, phản ứng LAMP phát 10 fg có phản ứng EV71, 100 fg tổng hợp CA16, sản phẩm thể màu sắc âm tính phản ứng có nồng độ RNA mục tiêu bé Thảo luận 3.4 Hoạt động LAMP RNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm RNA gen EV71 CA16 cung cấp Viện Pasteur Tp HCM tách chiết trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm, kiểm tra xác nhận phương pháp RT-qPCR RNA dùng để làm mạch khuôn cho phương pháp LAMP Kết cho thấy, phương pháp LAMP tối ưu nghiên cứu có khả phát RNA gen EV71 CA16 (Hình 5), đồng thời phân biệt với loại EVs gần gũi gây bệnh TCM Quan sát màu phản ứng cho thấy thay đổi màu sắc từ hồng sang vàng phản ứng chứa RNA mục tiêu, màu phản ứng giữ nguyên phản ứng âm TCM Enterovirus gây bệnh truyền nhiễm có khả lây từ người sang người, có khả bùng phát thành dịch bệnh Trong EV71 CVA16 gây bệnh thần kinh nặng với đường lây phức tạp, diễn tiến nhanh tử vong cao Đến khơng có vắc xin thuốc chống vi rút đặc hiệu cho EV71 CVA16 Các phương pháp phát phịng thí nghiệm bao gồm phân lập vi rút từ nuôi cấy tế bào, xét nghiệm kháng thể huyết thanh, phát axit nucleic RT-PCR Việc phân tích ni cấy tế bào dựa huyết thường tốn nhiều thời gian phức tạp, hai phương pháp khơng phù hợp để chẩn đoán khẩn cấp giai đoạn sớm bệnh TCM Mặc dù RT-PCR hệ thống sẵn có nhanh nay, cần (6 - 7) để có kết quả, khó đáp ứng nhu cầu chẩn đốn cấp cứu Do đó, việc phát sớm chẩn đốn nhanh có ý nghĩa quan trọng việc phòng ngừa, điều trị bệnh, đặc biệt nước phát triển Trong nghiên cứu này, phát triển RTLAMP, đó, ba cặp mồi xác định bổ sung cho tám vùng riêng biệt trình tự đích Hơn nữa, với hoạt động kết hợp enzyme chép ngược Bst DNA polymerase, trình tự RNA mục tiêu sau khuếch đại đẳng nhiệt Việc phát EV71 CVA16 từ mẫu lâm sàng với RT-LAMP cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, nhạy hiệu quả, đồng thời giảm thiểu lây nhiễm chéo hoạt động bước Quy trình LAMP tối ưu có khả phát trình tự mục tiêu EV71 CA16 với giới hạn phát fg EV71 10 fg CA16, phản ứng thực nhiệt độ cố định 60 0C thời gian 35 phút Do đó, phương pháp RT-LAMP dường phương pháp đầy hứa hẹn áp dụng rộng rãi phát thường quy lâm sàng Hình Kết LAMP với RNA gen tách chiết từ EV71 CA16 Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, đề tài mã số 2020.01.010 /HĐ-NCKH Hình Kết khảo sát giới hạn phát phương pháp LAMP mục tiêu dạng tổng hợp EV71 CA16 Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 23 Tài liệu tham khảo Zhang, Y et al An outbreak of hand, foot, and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China J Clin Virol 44, 262-267 (2009) Ang, L W et al Epidemiology and control of hand, foot and mouth disease in Singapore, 2001-2007 Ann Acad Med Singap 38, 106-112 (2009) Li, L et al Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen, People’s Republic of China J Clin Microbiol 43, 3835-3839 (2005) Nie, K et al Evaluation of a Direct Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method without RNA Extraction for the Detection of Human Enterovirus 71 Subgenotype C4 in Nasopharyngeal Swab Specimens PLOS ONE 7, e52486 (2012) Development of an IgM-capture ELISA for Coxsackievirus A16 infection - Abstract - Europe PMC https://europepmc.org/article/med/20970457 Xu, F et al Performance of Detecting IgM Antibodies against Enterovirus 71 for Early Diagnosis PLOS ONE 5, e11388 (2010) Notomi, T et al Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Research 28, e63–e63 (2000) Parida, M et al Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay J Clin Microbiol 43, 2895-2903 (2005) Liu, Y., Chuang, C.-K & Chen, W.-J In situ reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification (in situ RT-LAMP) for detection of Japanese encephalitis viral RNA in host cells J Clin Virol 46, 49-54 (2009) 10 Postel, A et al Evaluation of two commercial loop-mediated isothermal amplification assays for detection of avian influenza H5 and H7 hemagglutinin genes J Vet Diagn Invest 22, 61-66 (2010) 11 Ma, X.-J et al Visual detection of pandemic influenza A H1N1 Virus 2009 by reverse-transcription loopmediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye J Virol Methods 167, 214-217 (2010) 12 Kurosaki, Y., Grolla, A., Fukuma, A., Feldmann, H & Yasuda, J Development and evaluation of a simple assay for Marburg virus detection using a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification method J Clin Microbiol 48, 2330-2336 (2010) 13 Kurosaki, Y et al Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification J Virol Methods 141, 78-83 (2007) 14 Reddy, A K., Balne, P K., Reddy, R K., Mathai, A & Kaur, I Loop-mediated isothermal amplification assay for the diagnosis of retinitis caused by herpes simplex virus-1 Clin Microbiol Infect 17, 210-213 (2011) Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 24 Rapid detection of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 by reverse transcriptase loop mediated isothermal amplification (RT-LAMP) Diem Hong Tran*, Huong Thi Thu Phung Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University * thdiem@ntt.edu.vn Abstract Hand, foot and mouth disease (HFMD) is caused by many types of human enterovirus, in which human enterovirus 71 (EV71) and coxsackievirus A16 (CVA16) are the two main etiological agents HFMD is common in children under years old and EV71 and CVA16 can cause complications such as encephalitis, myositis leading to death An effective drug or vaccine against EV71 and CVA16 infection is currently not available For early treatment it is desirable to accurately and quickly determine the pathogen type of HFMD Current detection methods are mainly based on clinical symptoms, and RT-PCR is the gold standard for diagnosing However, RTPCR requires complicated, expensive equipment and specialized lab environments Meanwhile, an isothermal nucleic acid amplification method called RT-LAMP has all the benefits of RT-PCR in terms of sensitivity, specificity but with easier technology and low cost In this study, the optimized RT-LAMP method has been able to detect EV71 and CA16 specific sequences with detection limit of fg for EV71 and 10 fg for CA16 The reaction is performed at a single temperature of 60 0C for 35 minutes; the visible results can be determined by means of the reaction's colour, indicating that the method is highly suitable for point-of-care detection Keywords EV71, CA16, RT-LAMP, isothermal Đại học Nguyễn Tất Thành ... tối ưu có khả phát trình tự mục tiêu EV71 CA16 với giới hạn phát fg EV71 10 fg CA16, phản ứng thực nhiệt độ cố định 60 0C thời gian 35 phút Do đó, phương pháp RT-LAMP dường phương pháp đầy hứa... tiêu khuếch đại thể Bảng 1, tổng hợp IDT (Singapore) sử dụng cho toàn nghiên cứu Bảng Các trình tự sử dụng nghiên cứu Tên EV71_F3_1 EV71_B3_1 EV71_FIP_1 EV71_BIP_1 EV71_LoopF_1 EV71_LoopR_1 CA16_F3_1... ngược Bst DNA polymerase, trình tự RNA mục tiêu sau khuếch đại đẳng nhiệt Việc phát EV71 CVA16 từ mẫu lâm sàng với RT-LAMP cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, nhạy hiệu quả, đồng thời giảm