Phát hiện nhanh virus tả lợn châu phi (african swine fever virus asfv) bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp lamp

ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN NHANH VIRUS TẢ LỢN CHÂU PHI (AFRICAN SWINE FEVER VIRUS - ASFV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH ĐẠI ĐẲNG NHIỆT TRUNG GIAN VÒNG LẶP LAMP Sinh viên thực : Phạm Thị Thu Phương MSSV : 1711546604 GVHD :TS Phùng Thị Thu Hường TS Thân Văn Thái TP HCM, 2020 ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN NHANH VIRUS TẢ LỢN CHÂU PHI (AFRICAN SWINE FEVER VIRUS - ASFV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH ĐẠI ĐẲNG NHIỆT TRUNG GIAN VÒNG LẶP LAMP Sinh viên thực : Phạm Thị Thu Phương MSSV :1711546604 Lớp : 17DSH1A Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học GVHD :TS Phùng Thị Thu Hường TS Thân Văn Thái TP HCM, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Khoa Cơng nghệ Sinh học Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên: Phạm Thị Thu Phương MSSV: 1711546604 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 17DSH1A Đầu đề luận văn: Phát nhanh virus tả lợn Châu Phi (Afican Swine Fever Virus - ASFV) phương pháp khuếch đại trung gian vòng lặp LAMP Mục tiêu - Lựa chọn gen mục tiêu mồi phù hợp để phát triển phương pháp LAMP - Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP - Xác định tính đặc hiệu mồi - Đánh giá số ngưỡng phát phương pháp - Đánh giá độ nhạy lâm sàng LAMP với DNA gen ASFV Nội dung: - Nội dung 1: Phát triển tối ưu quy trình phát ASFV LAMP - Nội dung 2: Khảo sát độ đặc hiệu giới hạn phát phản ứng - Nội dung 3: Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu lâm sàng phương pháp Thời gian thực hiện: tháng 06/2020 đến tháng 09/2020 Người hướng dẫn chính: TS Phùng Thị Thu Hường Người hướng dẫn phụ: TS Thân Văn Thái Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày BỘ MÔN tháng năm 2020 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành trang bị cho kiến thức đầy đủ trang thiết bị giúp đỡ suốt trình học tập nâng cao trình độ nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam hỗ trợ mẫu suốt thời gian làm khố luận Tơi xin cảm ơn TS Phùng Thị Thu Hường, TS Thân Văn Thái, Th.S Trần Hồng Diễm chị kĩ thuật viên Trần Thị Hậu tận tuỵ hướng dẫn, động viên khích lệ tinh thần suốt thời gian làm khố luận Bên cạnh thầy đã tận tình bảo hướng dẫn tơi tìm hướng nghiên cứu, tìm kiếm tài liệu, xử lí phân tích số liệu, giải vấn đề nhờ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể anh, chị phịng thí nghiệm sinh học phân tử Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành bạn sinh viên K17 đồng hành tạo điều kiện, giúp đỡ, động viên trình làm đề tài Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ gia đình ln bên cạnh khích lệ tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi để tơi có thời gian tập trung thực đề tài Trong trình thực luận văn, thân cố gắng hồn thiện, chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Vì tơi mong nhận dẫn, đóng góp q Thầy Cơ bạn đọc để khóa luận hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Phạm Thị Thu Phương Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT v SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix ĐẶT VẤN ĐỀ x CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Dịch tả lợn Châu phi (African swine fever - ASF) 1.1.1 Dịch tễ bệnh 1.1.2 Thực trạng ASF 1.2 Tổng quan virus 1.2.1 Tên khoa học vị trí virus ASFV hệ thống phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái ASFV 1.2.3 Genomic ASFV 1.2.4 Cơ chế gây bệnh ASFV 1.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp LAMP 1.3.1 Lịch sử hình thành 1.3.2 Đặc điểm 1.3.3 Nguyên lí hoạt động 1.4 Các nghiên cứu nước ii 1.4.1 Trong nước 1.4.2 Ngoài nước 10 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Thời gian địa điểm 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.3 Vật liệu nghiên cứu 12 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 12 2.3.2 Hóa chất 13 2.3.3 Vật liệu sinh học 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 14 2.4.1 Phương pháp xác định trình tự thành phần phản ứng LAMP 14 2.4.2 PCR kiểm chứng trình tự mồi trình tự gen mục tiêu tổng hợp cho phản ứng LAMP 15 2.4.3 Phương pháp phát trình tự đặc trưng ASFV LAMP 16 2.4.4 Phương pháp đọc kết LAMP 17 2.4.5 Phương pháp khảo sát thành phần phản ứng LAMP 19 2.4.6 Khảo sát điều kiện phản ứng 20 2.4.7 Khảo sát tính đặc hiệu mồi phản ứng LAMP 21 2.4.7.4 Phương pháp tổng hợp cDNA từ mẫu RNA 24 2.4.8 Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết kiểm tra mồi thành phần phản ứng LAMP 25 3.2 Kết tối ưu điều kiện phản ứng LAMP 26 3.3 Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP 31 3.3.1 Kết khảo sát giới hạn phát với DNA tổng hợp 31 iii 3.3.2 Khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP với mẫu DNA gen tách chiết từ ASFV 31 3.4 Tính đặc hiệu phản ứng LAMP 32 3.5 Độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng phản ứng LAMP 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 iv TÓM TẮT Virus tả lợn Châu Phi (African swine fever virus) tác nhân gây nên bệnh dịch tả Châu Phi lợn Đây bệnh truyền nhiễm với khả lây lan lớn Lợn mắc bệnh có biểu lâm sàng ủ rủ, sốt cao, có tỉ lên tử vong lên tới 100 % Hiện có nhiều hướng nghiên cứu phương pháp phát ASFV PCR, ELISA, v.v Trong PCR kỹ thuật sinh học phân tử phịng thí nghiệm để khuếch đại đoạn trình tự DNA mục tiêu Theo đó, phương pháp realtime PCR (qPCR) xem tiêu chuẩn vàng sinh học phân tử để phát mầm bệnh Tuy nhiên kỹ thuật qPCR đòi hỏi thiết bị gia nhiệt đắt tiền hoạt động với chu trình nhiệt khác nhau, nhiều thời gian phải thực mơi trường phịng thí nghiệm Trong thời gian gần đây, kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt có kỹ thuật LAMP quan tâm phát triển nghiên cứu phát loại mầm bệnh LAMP sở hữu tất ưu điểm PCR với độ nhạy, độ đặc hiệu cao Mặt khác LAMP yêu cầu thiết bị kỹ thuật đơn giản, cho kết vịng 30 - 60 phút quan sát mắt thường, có khả cao để phát triển quy trình phát bệnh nhanh thực địa Vì vậy, chúng tơi thực đề tài “Phát nhanh virus tả lợn Châu Phi (Afican Swine Fever Virus) phương pháp khuếch đại trung gian vòng lặp LAMP” Luận văn thực việc ứng dụng phương pháp LAMP để nhận biết nhanh ASFV với kết đạt tháng là: chọn lựa trình tự mục tiêu gen Toipoimerse II ASFV tối ưu quy trình phản ứng LAMP với thời gian 30 phút, nhiệt độ 60 oC, nồng độ mồi tối ưu 0,8 μM FIP/BIP, 0,1 μM F3/B3 LoopF/LoopR 0,2 μM, giới hạn phát phản ứng gen mục tiêu giới hạn phát DNA gen HAD50/ml Xác định tính chuyên biệt cao mồi thiết kế cho Toipoimerse II ASFV phương pháp LAMP với chủng virus gần gũi PRRSV, CSFV chủng vi khuẩn phổ biến môi trường S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes V Parahaemolyticus Phương pháp LAMP tối ưu luận văn có khả phát trình tự mục tiêu ASFV với độ nhạy 100 % độ đặc hiệu 100 % mẫu bệnh lâm sàng thu nghiên cứu v SUMMARY African swine fever (ASF) that is caused by the ASF virus (ASFV) is a highly contagious haemorrhagic viral disease of domestic and wild pigs The clinical symptoms of ASF are that the infected pigs are droopy and can develop a high fever with up to 100% mortality rate Currently, there have been many methods to detect the ASFV infection such as PCR and ELISA PCR is the basic biomolecular technique in laboratory to amplify a targeted sequence of DNA Nowadays, realtime PCR (qPCR) has been widely considered as the biomolecular gold standard for detecting pathogens However, it requires expensive thermalcyclers operateing with different heat cycles, which takes time and has to be conducted in a centralized laboratory Recently, isothermal amplification techniques including LAMP method have being developed broadly to detect various pathogens LAMP has all the advantages of PCR with a high sensitivity and specificity Meanwhile, LAMP just requires a simple heat incubator and the results that can be observed with the naked eye can come within only 30-60 minutes Therefore, LAMP is highly suitable for development of a rapid test to diagnose an interested disease Consequently, we conducted the study entitled "Rapid detection of the African swine fever virus by Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)” The thesis was carried out within months using LAMP method to rapidly detect ASFV The results achieved over three months are that (i) selecting the targeted gene which is Topoisomerase II gene and optimizing the reaction incubation process of 30 minutes, 60 ˚C with the optimal concentration of primers are 0.8 μM FIP/BIP, 0.1 μM F3/B3 and LoopF/LoopR is 0.2 μM The detection limit of the LAMP reaction is copy of the targeted gene and HAD50/ml of the ASFV genomic-DNA; (ii) confirming the high specificity of the ASFV's Topoisomerase II-designed primers for LAMP reaction with closely related strains of ASFV such as PRRSV, CSFV and some strains of bacteria common in the environment such as S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes V Parahaemolyticus Finally, the LAMP method developed in this study successfully detected the targeted sequence of ASFV with 100 % sensitivity and 100 % specificity in the clincal samples collected vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hiển vi virus ASFV Hình 1.2 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp LAMP Hình 2.1 Sơ đồ hoạt động mồi LAMP 14 Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 16 Hình 2.3 Màu phản ứng LAMP 19 Hình 3.1 Kết kiểm tra thành phần phản ứng 25 Hình 3.2 Kết khảo sát mồi lần 1, quan sát màu sắc phản ứng 27 Hình 3.3 Kết khảo sát thời gian cho phản ứng LAMP 28 Hình 3.4 Kết khảo sát nhiệt tối ưu cho phản ứng LAMP 29 Hình 3.5 Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP với DNA mục tiêu dạng tổng hợp 31 Hình 3.6 Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP với DNA gen virus 32 Hình 3.7 Kết khảo sát tính đặc hiệu phương pháp LAMP tối ưu 33 Hình 3.8 Khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng phản ứng LAMP (trước phản ứng) 34 Hình 3.9 Khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng phản ứng LAMP (sau phản ứng) 34 vii Chương Kết thảo luận CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết kiểm tra mồi thành phần phản ứng LAMP Hình 3.1 Kết kiểm tra thành phần phản ứng Trong đó: (A) Kết màu phản ứng LAMP, (B) Kết điện di phản ứng so với kết PCR mồi F3,B3 Trình tự gen Toipoimerse II tổng hợp ASFV lựa chọn làm gen mục tiêu để thực phản ứng LAMP, phản ứng thực 2X warmstart colorimetric LAMP mastermix xuất chất thị pH Kết kiểm tra cho thấy sau phản ứng 45 phút 65 ⁰C có thay đổi từ màu hồng sang vàng mẫu dương tính chứa gen mục tiêu dạng tổng hợp, giữ nguyên màu hồng mẫu âm tính Hình 3.1 (A) Sự thay đổi màu sắc cho thấy sản phẩm khuếch đại tạo quan sát mắt thường, chứng minh mồi lựa chọn cho phản ứng LAMP phát thành cơng trình tự mục tiêu ASFV Mặt khác, kết phản ứng quan sát phương pháp điện di gel agarose Quan sát Hình 3.1 (B) cho thấy, kết phản ứng LAMP dãy smear dài với nhiều vạch kích thước khác mẫu dương tính có DNA mục tiêu so với chứng âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, đồng thời sản phẩm phản ứng PCR hiển thị vạch khoảng 200 bp so với thang DNA chuẩn (đúng với kích thước vạch 200 bp sản phẩm) Vì mồi chọn với thành phần phản ứng áp dụng cho khảo sát 25 Chương Kết thảo luận 3.2 Kết tối ưu điều kiện phản ứng LAMP 3.2.1 Kết khảo sát nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng Nồng độ mồi phản ứng LAMP thực theo nghiệm thức Bảng 2.10, khảo sát thực lần, kết trình bày Bảng 3.1 Hình 3.2 Bảng 3.1 Kết khảo sát mồi lần lặp lại FIP/BIP(µM) 0,8 LKS 1,6 LOOP 2,4 F/LOOP 3,2 R F3/ B3 0,1 3 3 + + + + + + + + + ‒ ‒ ‒ 0,2 0,2 + + + + + + + + + ‒ ‒ ‒ 0,4 0,3 + + + + + + + + + ‒ ‒ ‒ 0,6 0,4 + + + ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ 0,8 Trong +: thể phản ứng xảy ‒: thể phản ứng không xảy 26 ‒ Chương Kết thảo luận Hình 3.2 Kết khảo sát mồi lần 1, quan sát màu sắc phản ứng, số điều kiện thể nghiệm thức phản ứng Bảng 2.10 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 nghiệm thức khảo sát Trong đó: (A) Trước phản ứng, (B) Sau phản ứng Kết phản ứng cho thấy, với nghiệm thức số (F3/B3 có nồng độ 0,1 µM, nồng độ FIP/BIP có nồng độ 0,8 µM LoopF/LoopR có nồng độ 0,2 µM), nghiệm thức với nồng độ mồi thấp cho kết màu sắc phản ứng sau phản ứng rõ nét, thấp lần so với nồng độ mồi nghiên cứu trước Kết khảo sát đồng ba lần lặp lại Vì thế, nồng độ mồi nghiệm thức (F3/B3 có nồng độ 0,1 µM, nồng độ FIP/BIP có nồng độ 0,8 µM LoopF/LoopR có nồng độ 0,2 µM) 23 sử dụng cho phản ứng LAMP nghiên cứu 3.2.2 Kết khảo sát thời gian cho phản ứng LAMP Thời gian kéo dài phản ứng LAMP định tới số lượng DNA sản phẩm hình thành phản ứng Khảo sát thời gian phản ứng LAMP khảo sát khoảng thời gian mà phản ứng LAMP bắt đầu có tượng đổi màu từ hồng sang vàng với phản ứng dương tính giữ nguyên màu hồng phản ứng âm tính, diện chất thị màu pH - phenolred Kết khảo sát cho trình bày Bảng 3.2 Hình 3.3 27 Chương Kết thảo luận Bảng 3.2 Kết khảo sát thời gian ba lần lặp lại Thời gian khảo sát(phút) Chứng âm 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 70 Trong Lần lặp lại − − − − − − − − − + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +: thể phản ứng xảy ‒: thể phản ứng khơng xảy Hình 3.3 Kết khảo sát thời gian cho phản ứng LAMP Trong đó: (A) Kết quan sát màu sắc, (B) Kết sản phẩm LAMP quan sát điện di 28 Chương Kết thảo luận Theo quan sát kết điện di, sản phẩm khuếch đại phản ứng nhìn thấy thời gian 10 phút, nhiên 15 phút thời gian ủ tối thiểu để tạo thay đổi màu sắc, bên cạnh thời 20 - 30 phút cho thấy thay đổi màu phản ứng khoảng thời gian rõ quan sát mắt thường, kết đồng lần lặp lại phản ứng Qua kết khảo sát thời gian 30 phút, phản ứng LAMP cho kết màu kết điện di rõ Vì thời gian 30 phút thời gian tối ưu lựa chọn áp dụng cho khảo sát 3.2.3 Kết khảo sát nhiệt độ Nhiệt độ phản ứng khảo sát khoảng 55 - 70 ⁰C, thời gian phản ứng 30 phút tối ưu trước đó, phản ứng lập lại lần Kết khảo sát trình bày Bảng 3.3 Hình 3.4 Hình 3.4 Kết khảo sát nhiệt tối ưu cho phản ứng LAMP Trong đó: (A) Kết quan sát màu sắc sau 30 phút phản ứng, (B) Kết điện di sản phẩm LAMP tạo thành 29 Chương Kết thảo luận Bảng 3.3 Kết khảo sát nhiệt độ ba lần lặp lại Nhiệt độ khảo sát (⁰C) Chứng âm 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Trong Lần lặp lại + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +: thể phản ứng xảy quan sát màu sắc phản ứng -: thể phản ứng không xảy quan sát màu sắc phản ứng Theo kết khảo sát, khoảng nhiệt từ 50 ⁰C, sản phẩm LAMP quan sát điện di, nhiên phải từ nhiệt độ 59 - 60 ⁰C, thay đổi màu sắc phản ứng thể rõ ràng quan sát mắt thường, kết đồng lần lặp lại khảo sát Cùng với dẫn nhà sản xuất nghiên cứu trước (nhiệt độ tối ưu phản ứng LAMP vào khoảng 60 - 65 ⁰C), nhiệt độ ⁰C nhiệt độ tối ưu cho phản ứng nghiên cứu này, đồng thời nhiệt độ sử dụng cho thí nghiệm 30 Chương Kết thảo luận 3.3 Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP 3.3.1 Kết khảo sát giới hạn phát với DNA tổng hợp Hình 3.5 Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP với DNA mục tiêu dạng tổng hợp Trong đó: (A) màu sắc trước phản ứng, (B) màu sắc sau phản ứng Giới hạn phát phản ứng khảo sát với DNA mục tiêu tổng hợp ban đầu có nồng độ 3.109 pha loãng bậc nồng độ 3.105, 3.104, 3.103, 3.102, 3.101, 3, 2, 3.10-1, 3.10-2 thực phản ứng LAMP với điều kiện phản ứng tối ưu trước để khảo sát giới hạn phát phản ứng Kết khảo sát Hình 3.5 cho thấy, phản ứng LAMP phát DNA tổng hợp có phản ứng, sản phẩm thể màu sắc âm tính phản ứng có số lượng DNA mục tiêu bé (Hình 3.5) 3.3.2 Khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP với mẫu DNA gen tách chiết từ ASFV Mẫu DNA gen ASFV có nồng độ ban đầu tương đương 103 HAD50/ml, pha loãng theo bậc 10 nồng độ 102, 101, 1, 10-1 để kiểm tra giới hạn phát phản ứng Kết cho thấy, phản ứng LAMP tối ưu nghiên cứu phát thành công DNA gen phản ứng nồng độ HAD50/ml 31 Chương Kết thảo luận Hình 3.6 Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng LAMP với DNA gen virus Trong đó: (A) Màu sắc trước phản ứng, (B) Màu sắc sau phản ứng 3.4 Tính đặc hiệu phản ứng LAMP Tính đặc hiệu mồi dành cho phản ứng LAMP đánh giá việc thực phản ứng với chủng virus gần gũi bao gồm virus PRRSV gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn virus CFSV gây bệnh tả lợn cổ điển Hai loại bệnh vốn phổ biến lợn với triệu chứng lâm sàng có nhiều điểm tương đồng với tả lợn Châu Phi Kết khảo sát cho thấy phương pháp LAMP tối ưu nghiên cứu phân biệt trình tự gen mục tiêu ASFV so với hai loại virus gần gũi này, thể kết phản ứng LAMP âm tính RNA cDNA từ PRRSV CFSV (Hình 3.7, ống số 2, 3, 4, 5) Ngồi ra, phản ứng LAMP tạo tín hiệu âm tính cho chủng vi khuẩn phổ biến môi trường bao gồm S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes V parahaemolyticus (Hình 3.7, ống 6, 7, 8, 9, 10) Kết cho thấy, mồi lựa chọn thực phương pháp LAMP tối ưu có tính chuyên biệt cao cho ASFV 32 Chương Kết thảo luận Hình 3.7 Kết khảo sát tính đặc hiệu phương pháp LAMP tối ưu Trong đó: mẫu – ASFV, – RNA PRRSV, – cDNA PRRSV, – RNA CSFV, – cDNA CSFV, – S enterica, – S aureus, – S P aeruginosa, – L monocytogenes, 10 – V parahaemolyticus chứng âm (A) Màu sắc trước phản ứng, (B) Màu sắc sau phản ứng 3.5 Độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng phản ứng LAMP Bảng 3.4 Kết so sánh kỹ thuật qPCR LAMP Kết qPCR LAMP TỔNG DƯƠNG TÍNH ÂM TÍNH SỐ DƯƠNG TÍNH (n = 29) 29 29 ÂM TÍNH (n = 16) 16 16 TỔNG (n = 45) 29 16 45 Độ nhạy 100 % Độ đặc hiệu 100 % 33 Chương Kết thảo luận Hình 3.8 Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu lâm sàng phản ứng LAMP (trước phản ứng) Hình 3.9 Khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng phản ứng LAMP (sau phản ứng) Độ nhạy xét nghiệm LAMP đánh giá cách sử dụng DNA tách chiết từ 45 mẫu máu toàn phần huyết thu trực tiếp từ cá thể lợn, cung cấp xác định Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Trong đó, có 29 mẫu dương 16 mẫu 34 Chương Kết thảo luận âm xác nhận kỹ thuật qPCR (kết cung cấp từ Học viện Nông nghiệp Việt Nam) Kết cho thấy kết phản ứng LAMP tương đồng với kết qPCR cung cấp với 29 mẫu dương thể qua đổi màu sang vàng phản ứng (Hình 3.9) đồng thời khơng có thay đổi màu sắc mẫu âm (Hình 3.8) Kết (Bảng 3.4) cho thấy độ nhạy độ đặc hiểu phản ứng LAMP nghiên cứu 100 % (Bảng 3.4) 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Luận văn phát triển tối ưu thành cơng quy trình phát nhanh African swine fever virus – ASFV phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp LAMP Các điều kiện tối ưu tổng hợp Bảng điều kiện nồng độ tối ưu thành phần phản ứng LAMP Bảng Điều kiện nồng độ tối ưu thành phần phản ứng LAMP Nồng độ thành phần phản ứng Điều kiện phản ứng FIP BIP F3 B3 Loop F Loop R Thời gian phản ứng Nhiệt độ phản ứng 0,8 µM 0,8 µM 0,1 µM 0,1 µM 0,2 µM 0,2 µM 30 phút 60 oC Giới hạn phát phương pháp DNA mục tiêu dạng tổng hợp HAD50/ml DNA gen tách chiết trực tiếp từ virus ASFV Bộ mồi lựa chọn có tính chun biệt cao so với chủng virus gần gũi vốn dễ nhầm lẫn với ASFV PRRSV gây bệnh hội chứng suy giảm sinh sản hô hấp, CFSV gây bệnh sốt tả lợn cổ điển chủng vi khuẩn phổ biến mơi trường có khả xuất cao thể vật chủ S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes V Parahaemolyticus Phương pháp LAMP nghiên cứu thực đơn giản, dễ thao tác, kết quan sát trực tiếp mắt thường với độ nhạy 100 %, độ đặc hiệu 100 % 45 mẫu bệnh phẩm thu Đề nghị Tiếp tục thử nghiệm phương pháp LAMP nhiều mẫu bệnh phẩm, mở rộng đối tượng nghiên cứu Phát triển phương pháp LAMP ASFV với DNA không tách chiết Tiếp tục nghiên cứu, thử nghiệm thiết kế mồi cho nhiều trình tự gen ASFV VP72, VP73 Chuẩn hóa quy trình thực phản ứng 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abrams CC, Goatley L, Fishbourne E, et al Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fever virus isolate OUR T88/3 decreases its ability to protect against challenge with virulent virus Virology 2013;443(1):99105 Ge S, Li J, Fan X, et al Molecular Characterization of African Swine Fever Virus, China, 2018 Emerg Infect Dis 2018;24(11):2131-2133 Thornton PK Livestock production: recent trends, future prospects Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 2010;365(1554):2853-2867 Martínez-Avilés M, Iglesias I, De La Torre A Evolution of the ASF Infection Stage in Wild Boar Within the EU (2014-2018) Frontiers in veterinary science 2020;7:155 Ge S, Li J, Fan X, et al Molecular characterization of African swine fever virus, China, 2018 Emerging infectious diseases 2018;24(11):2131 Dee SA, Bauermann FV, Niederwerder MC, et al Survival of viral pathogens in animal feed ingredients under transboundary shipping models PLoS One 2018;13(3):e0194509 Zhou X, Li N, Luo Y, et al Emergence of African swine fever in China, 2018 Transboundary and emerging diseases 2018;65(6):1482 Mazur-Panasiuk N, Żmudzki J, Woźniakowski G African Swine Fever Virus Persistence in Different Environmental Conditions and the Possibility of its Indirect Transmission J Vet Res 2019;63(3):303-310 Sánchez-Cordón P, Montoya M, Reis A, Dixon L African swine fever: A reemerging viral disease threatening the global pig industry The Veterinary Journal 2018;233:41-48 10 Alonso C, Borca M, Dixon L, Revilla Y, Rodriguez F, Escribano J ICTV virus taxonomy profile: Asfarviridae Journal of General Virology 2018;99 11 Le VP, Jeong DG, Yoon S-W, et al Outbreak of African Swine Fever, Vietnam, 2019 Emerging Infectious Disease journal 2019;25(7):1433 12 Galindo I, Alonso C African Swine Fever Virus: A Review Viruses 2017;9(5) 13 Fukui T, Doi Y Cloning and analysis of the poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyhexanoate) biosynthesis genes of Aeromonas caviae J Bacteriol 1997;179(15):4821-4830 14 Alejo A, Matamoros T, Guerra M, Andrés G A Proteomic Atlas of the African Swine Fever Virus Particle Journal of virology 2018;92(23):e01293-01218 15 McKillen J, Hjertner B, Millar A, et al Molecular beacon real-time PCR detection of swine viruses J Virol Methods 2007;140(1-2):155-165 16 Sakurai A, Shibasaki F Updated values for molecular dơiagnosis for highly pathogenic avian influenza virus Viruses 2012;4(8):1235-1257 37 17 Bista BR, Ishwad C, Wadowsky RM, et al Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of BK Virus Journal of Clinical Microbiology 2007;45(5):1581-1587 18 Savan R, Igarashi A, Matsuoka S, Sakai M Sensitive and rapid detection of edwardsiellosis in fish by a loop-mediated isothermal amplification method Appl Environ Microbiol 2004;70(1):621-624 19 Ikadai H, Tanaka H, Shibahara N, et al Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method J Clin Microbiol 2004;42(6):2465-2469 20 Peralta MdlÁM, García ARR, Clavel JLR, et al Stem Population and Tissue Replacement of Urochloa in Different Phenological Stages American Journal of Plant Sciences 2020;11(8):1296-1306 21 Pan IC, De Boer CJ, Hess WR African swine fever: application of immunoelectroosmophoresis for the detection of antibody Canadian journal of comparative medicine : Revue canadienne de medecine comparee 1972;36(3):309-316 22 Giménez-Lirola LG, Mur L, Rivera B, et al Detection of African Swine Fever Virus Antibodies in Serum and Oral Fluid Specimens Using a Recombinant Protein 30 (p30) Dual Matrix Indirect ELISA PLoS One 2016;11(9):e0161230 23 James HE, Ebert K, McGonigle R, et al Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification J Virol Methods 2010;164(1-2):6874 24 Wang D, Yu J, Wang Y, et al Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and visual LAMP assay for detection of African swine fever virus (ASFV) J Virol Methods 2020;276:113775 25 Inglis PW, Pappas MdCR, Resende LV, Grattapaglia D Fast and inexpensive protocols for consistent extraction of high quality DNA and RNA from challenging plant and fungal samples for high-throughput SNP genotyping and sequencing applications PloS one 2018;13(10):e0206085-e0206085 38 Ý kiến giảng viên hướng dẫn: TP HCM, ngày … tháng … năm 20… 39 ... văn: Phát nhanh virus tả lợn Châu Phi (Afican Swine Fever Virus - ASFV) phương pháp khuếch đại trung gian vòng lặp LAMP Mục tiêu - Lựa chọn gen mục tiêu mồi phù hợp để phát triển phương pháp LAMP. .. TẮT LAMP: Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ASFV: Virus gây bệnh tả lợn Châu Phi (African swine fever virus) ASF: Bệnh tả lợn Châu Phi. .. trình nhiệt, công cụ hiệu với tiềm ứng dụng cao việc phát nhanh trình tự nucleocid mục tiêu Trước thực tế trên, thực đề tài: ? ?Phát nhanh virus tả lợn Châu Phi (African Swine Fever Virus - ASFV) phương